R儀為德國Eppendorf公司 產(chǎn)品。
[0050] 實施例1金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取
[0051] 取過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌ATCC25923菌液（0D_大約為2. 0)離心得沉淀；用 TE溶液懸浮，然后加入10%的SDS溶液和20mg/mL的蛋白酶K，37°C水浴30min ;加入5mol/ L的NaCl溶液和CTAB-NaCl溶液，充分混合，65°C保溫10min ;加入等體積的酚、氯仿和異戊 醇的混合液（體積比為25:24:1)，混合后離心，將上清液轉(zhuǎn)至一新的離心管中；加入等體積 的上述酚、氯仿和異戊醇混合液，混合后離心，將上清液轉(zhuǎn)至一新的離心管中；加入0. 6倍 體積的異丙醇，輕輕混合至DNA沉淀，離心去上清；用體積濃度70%的乙醇溶液洗滌沉淀， 然后去上清，待沉淀風(fēng)干后加入30uL雙蒸水，得到金黃色葡萄球菌基因組DNA，結(jié)果如圖1 所示。
[0052] 實施例2纖黏蛋白原凝集素 A基因 clfA的擴增
[0053] 根據(jù)NCBI上公布的金黃色葡萄球菌中clfA基因序列信息（序列號Z18852)， 設(shè)計引物 MG-ClaF(5' -GCGGTCGACATGAATATGAAGAAAAAAG-3'）（同源序列位置為 Z18852 的 302-319)和 MG-ClaR2(5' -TTACCCGGGCAACCTACCTTACACCCT-3'）（同源序列位置為 Z18852 的3275-3292)用于擴增clfA基因全長序列，pMG-ClaF和pMG-ClaR2中分別引入Sal I和 Sma I酶切位點；以實施例1所述提取的金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，以MG-CLaF和 MG-CLaR2為引物擴增該菌的黏附素基因 clfA，反應(yīng)產(chǎn)物預(yù)期長度為3008bp。
[0054] PCR 反應(yīng)程序：94°C :2min ;35 個循環(huán)（94°C :15s ;58°C :30s ;68°C :90s) ;68°C : 5min〇
[0055] 退火溫度58°C擴增特異性最好，擴增片段與預(yù)期大小相符，初步推測為目標(biāo)片段。 純化PCR產(chǎn)物，測序，比對發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物為目標(biāo)基因 clfA，與其同源性為100 %，結(jié)果如圖 2所示。
[0056] 實施例3重組質(zhì)粒pMG36c-clfA的構(gòu)建
[0057] 1.試驗方法
[0058] 1. 1金黃色葡萄球菌黏附素基因 clfA PCR產(chǎn)物膠回收切膠，稱重，按1:3比例 (mg :uL)加入extraction Buffer，50°C水浴，使膠體融化；將混合液轉(zhuǎn)入spon column內(nèi)， 靜止lmin，12000rpm離心1~2min，棄去接液管內(nèi)液體；加入500uL Extraction buffer， 12000rpm離心1~2min，棄接液管中液體；加入750uL wash buffer，12000rpm離心1~ 2min，棄接液管中液體；再次12000rpm，離心3~4min，將spon column轉(zhuǎn)移到1. 5mL離心 管中；開蓋放置1~2min，向spon column加入20uL雙蒸水；12000rpm離心lmin，離心管 中含有PCR產(chǎn)物。
[0059] 1.2PCR產(chǎn)物雙酶切
[0060] 酶切體系以及反應(yīng)條件如下：Sal I :luL ;Sma I :luL ;1· 5XT buffer :3uL ;BSA : 2uL ;PCR :5uL ;水：8uL。37°C lh，后加入4~5uL Loading buffer用來停止反應(yīng)，將酶切 產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠試劑盒回收，獲得純化的酶切產(chǎn)物。
[0061] L 3乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒pMG36c雙酶切
[0062] 將1~1. 5mL過夜培養(yǎng)的JM109細(xì)菌菌液于12000rpm離心lmin，棄去上清液；加 入250uL細(xì)胞Resuspension Buffer，重懸細(xì)菌菌體沉淀；加入250uL細(xì)胞Lysis Buffer， 輕柔顛倒4~6次；加入350uL Neutralization Buffer，輕柔顛倒4~6次，于12000rpm 離心10min ;將上清液轉(zhuǎn)移到Spin column內(nèi)，于12000rpm離心lmin，并棄去管內(nèi)液體；向 Spin column 內(nèi)加入650uL Wash Buffer，于 12000rpm離心 lmin，并棄去管內(nèi)液體；向 Spin column內(nèi)加入650uL Wash Buffer，于12000rpm離心lmin，并棄去管內(nèi)液體；再次12000rpm 離心3~5min，然后將spin column轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中；向spin column內(nèi)加入50uL 雙蒸水，靜止lmin ;于12000rpm離心lmin，離心管內(nèi)為質(zhì)粒，將質(zhì)粒-20°C保存。將獲得的 質(zhì)粒利用Sal I和Sma I酶切，采用瓊脂糖凝膠試劑盒回收，獲得純化的質(zhì)粒pMG36c雙酶 切產(chǎn)物。
[0063] 1. 4重組質(zhì)粒構(gòu)建
[0064] 采用高效連接試劑盒，將上述PCR產(chǎn)物和載體pMG36c的酶切回收產(chǎn)物用于連接； 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，采用氯霉素抗性進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)化子； 采用粗提質(zhì)粒方法（液體培養(yǎng)的菌體200uL加入1. 5mL離心管中，12000rpm，離心lmin，棄 上清液；加入30uL溶液I打勻，使菌懸浮，用槍來回吸打；加入30uL等體積的氯仿/苯酚的 混合液；加入Loading Buffer 5uL左右；充分混合后離心12000rpm，6~lOmin，取上清液 的藍(lán)色部分，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳），驗證是否連接成功；提取重組質(zhì)粒，采用單酶切以及 雙酶切驗證，對重組質(zhì)粒進(jìn)行驗證。
[0065] 2.試驗結(jié)果
[0066] 采用粗提質(zhì)粒的方法，快速，便于篩選。轉(zhuǎn)化子3粗提的質(zhì)粒明顯滯后于空載體 pMG36c質(zhì)粒，初步表明連接成功，結(jié)果如說明書附圖3所示。
[0067] 將轉(zhuǎn)化子3采用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取質(zhì)粒，質(zhì)粒明顯滯后于空載體pMG36c質(zhì) 粒，初步表明連接成功，結(jié)果如說明書附圖4所示。
[0068] 重組質(zhì)粒單酶切后明顯滯后于pMG36c空載體單酶切；重組質(zhì)粒雙酶切后，獲得兩 條條帶，分別與PCR產(chǎn)物和pMG36c單酶切片段大小一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名 為pMG36C-clfA，結(jié)果如說明書附圖5所示。
[0069] 實施例4重組菌的構(gòu)建
[0070] 1.試驗方法
[0071] 1. 1抗生素篩選濃度的確定：
[0072] 1. 1. 1液體濃度篩選
[0073] 挑取乳酸乳球菌MG1363單菌落分別接種于含有不同濃度氯霉素（Oyg/mL~ 8 μ g/mL)的液體MRS培養(yǎng)基中30 °C靜止培養(yǎng)。
[0074] 1. 1. 2固體濃度篩選
[0075] 挑取MRS平板上活化的乳酸乳球菌菌落，在含有不同濃度氯霉素（0 μ g/mL~ 8 μ g/mL)的固體MRS培養(yǎng)基上劃線30°C靜止培養(yǎng)。
[0076] 1. 2乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
[0077] 挑取平板上的乳酸乳球菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；將2mL新鮮 菌液接種到50mL新鮮的MRS培養(yǎng)基中，30°C靜止培養(yǎng)，測定0D600達(dá)到0. 5 ;4°C 6000g離 心5min收集菌體，棄上清，用預(yù)冷的Electroporation Buffer重懸菌體，然后離心；再用冰 預(yù)冷的Electroporation Buffer洗兩次，將菌體重懸在Electroporation Buffer中并使 0D600達(dá)到0. 45,分裝到離心管中，每管50uL ;菌懸液在45°C溫育20min，然后在冰上放置 10min ;將50uL菌懸液和1. 0 μ g (5uL左右）的DNA混合，轉(zhuǎn)入0. 2cm的電轉(zhuǎn)杯；設(shè)置電轉(zhuǎn)參 數(shù)：1200-1800v進(jìn)行電擊；立即加入950uL的milk medium，置于30°C靜止培養(yǎng)復(fù)壯3h ;將 復(fù)壯后的菌液梯度稀釋，涂布在含有合適抗生素濃度（Cm 5 μ g/mL)的MRS平板上，每板涂 布200uL，置于30°C靜止培養(yǎng)2~3天。
[0078] 1. 3轉(zhuǎn)化子的篩選：
[0079] 1. 3. 1抗性篩選
[0080] 選取轉(zhuǎn)化的單菌落30個（重組質(zhì)粒）、10個（空質(zhì)粒），平板先放在4°C保存；將上 述單菌落先接種到?jīng)]有加抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；菌長出后，再取部分菌液接種到含 有抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；其余菌液，一部分加入甘油，進(jìn)行保存；另一部分放在4°C 待用；觀察乳酸乳球菌在含有抗生素培養(yǎng)基中生長情況，如生長，選擇進(jìn)行菌落PCR。
[0081] 1.3.2PCR 擴增
[0082] 菌落PCR，在最初95°C變性時，可增加反應(yīng)由2min增至lOmin ;PCR反應(yīng)程序、反應(yīng) 體系如實施例2所述。
[0083] 2.試驗結(jié)果
[0084] 2. 1抗生素篩選濃度結(jié)果
[0085] 液體濃度篩選：抗性濃度為5 μ g/mL，固體濃度篩選：抗性濃度為5 μ g/mL。
[0086] 2· 2轉(zhuǎn)化子篩選結(jié)果
[0087] 抗性篩選：將重組質(zhì)粒pMG36C_clfA轉(zhuǎn)化到乳球菌感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)3 天，長出轉(zhuǎn)化子，