Jak/STAT通道在細(xì)胞生長、增殖和存活中具有重要的作用。本發(fā)明利用蛋白免疫 印跡研究LD030對(duì)Panel細(xì)胞Jak/STAT磷酸化的影響。
[0118] 用濃度為20μΜ和50μΜ的LD030處理細(xì)胞4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)和48小 時(shí)。處理后，收集細(xì)胞并在緩沖液（50mMTris-HClpH7.5、100mMNaCl、5mMEDTA、40mM NaP207、l%TritonX-100、lmM二硫蘇糖醇、200μΜNa3V04、100yM苯甲基磺酰基氟化物、 2以8/1111亮抑酶肽、4以8/1]11抑肽酶和0.7以8/1]11胃蛋白酶抑制劑）中裂解。分析染色蛋 白（BioRad，500-0006)以調(diào)整蛋白濃度。將等量蛋白（50yg/泳道）用于10%SDS-聚 丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF)膜上。用抗p-Jak2的抗體（Cell signaling制造，3771)、p_Stat3 的抗體（Cellsignaling制造，9131)和α-微管蛋白的 抗體（ZymedLaboratories制造，32-2500)處理該膜。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECLPlus)檢測 系統(tǒng)（Amersham制造）檢測可見蛋白條帶。
[0119] 上述試驗(yàn)用20μΜ和50μΜ的LD030分別處理的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果見圖23和24所 示。如圖23所示，其中采用20μΜ的LD030處理Panel細(xì)胞4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、48小 時(shí)并用蛋白質(zhì)電泳測定每個(gè)區(qū)間的p-jak2、p-stat3(tyr705)、p-JNK、P-p38和微管蛋白， 與空白對(duì)照對(duì)比時(shí)，LD030處理24小時(shí)和48小時(shí)顯著降低p-jak2和p-stat3 (tyr705)， 而P-P38蛋白表達(dá)增加。因而表明LD030處理下調(diào)Jak、Stat3-相關(guān)通道，以及上調(diào)p-JNK 和p-p38。如圖24所示，其中采用50μΜ的LD030處理Panel細(xì)胞4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、 48小時(shí)并用蛋白質(zhì)電泳測定每個(gè)區(qū)間的p-jak2、p_stat3 (tyr705)、pc-raf、p_ERK、p-JNK、 p38、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白B1和微管蛋白，與空白對(duì)照對(duì)比，LD030處理24小時(shí) 和48小時(shí)顯著降低p-jak2(磷酸化酪氨酸激酶2)、p-stat3(tyr705,轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)蛋白3 的磷酸化和活化）、p-c-raf(磷酸化原癌基因絲氨酸，蘇氨酸激酶）和p-ERK(胞外信號(hào)磷 酸化調(diào)節(jié)激酶），而處理會(huì)增加P-JNK(磷酸化c-JUNN-末端激酶）和p-p38 (有絲分裂活 化蛋白激酶）的表達(dá)，并降低細(xì)胞周期蛋白D1和細(xì)胞周期蛋白B1在48小時(shí)的表達(dá)。微管 蛋白表達(dá)作為內(nèi)參基本沒有變化。
[0120] 上述結(jié)果表明LD030可能以下列信號(hào)傳導(dǎo)通道和蛋白作為革E1向：（1)Jak_stat3通 道，其中革巴向蛋白為磷酸化jakl、jak2 和stat3(p-jakl、p_jak2 和p_stat3)。（2)C_raf通 道，其中革巴向蛋白為磷酸化c-raf和ERK(pc-raf、p-ERK)。（3)細(xì)胞凋亡通道，其中革巴向蛋 白為磷酸化的P38和JNK(p-p38、p-JNK)。
[0121] 基于3-D結(jié)構(gòu)電腦樽擬的親和計(jì)筧
[0122] 采用iGEMDOCK模擬軟件獲得Rac-Ι蛋白的3維結(jié)構(gòu)，如圖8所示。也模擬連接 LD030與Rac-Ι的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)于LD030和Rac-Ι之間的親和，親和力計(jì)算為-146,表現(xiàn)為強(qiáng) 結(jié)合能。因在RH0信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，Rac-Ι為磷酸化激酶，故LD030可能會(huì)通過結(jié)合Rac-1 阻斷經(jīng)過RH0途徑的信號(hào)傳導(dǎo)。
[0123]LD030相關(guān)化合物對(duì)癌癥細(xì)朐系的影響
[0124] 采用MTT分析法檢測用本發(fā)明不同的LD030相關(guān)化合物處理后的細(xì)胞活力。處理 的細(xì)胞系為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、HepG2細(xì)胞和Panel細(xì)胞。
[0125]MTT保存液配置：將0. 5gMTT溶解于100ml磷酸緩沖液（PBS)，用0. 22μm膜過濾 除菌，得到0. 5 %MTT溶液，在-20 °C下避光保存。
[0126] MTT操作溶液配置：用無菌PBS稀釋10倍MTT保存液，得到MTT操作溶液。
[0127] 1640完全培養(yǎng)基配置：向1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一定量的小牛血清（FBS)從而 使培養(yǎng)基含有體積比10%的FBS。然后加入一定量的雙抗（即，青霉素和鏈霉素），使最終 濃度為青霉素100單位/ml和鏈霉素100 μg/ml。
[0128] 試驗(yàn)過程如下：
[0129] (1)取胰蛋白酶消化過的對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為6X104個(gè)細(xì)胞 /ml，然后在96孔板的每個(gè)孔中加入受測的100μ1細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)密度為6000個(gè)細(xì)胞/孔。 邊緣孔加入無菌PBS。
[0130] (2)將96孔板放到含有5% 0)2的37°C培養(yǎng)箱中并過夜培養(yǎng)。
[0131] (3)將被測化合物溶解于200 μ1DMS0得到5mg/ml溶液并稀釋得到100 μΜ、 10 μ Μ、1 μ Μ和0. 1 μ Μ的溶液。每三個(gè)重復(fù)孔中均加入100 μ 1的一種溶液。設(shè)定含有細(xì)胞 而不含本發(fā)明化合物的對(duì)照孔以及不含細(xì)胞的空白孔。
[0132] (4)將96孔板放到含有5% 0)2的37°C培養(yǎng)箱中并培養(yǎng)48小時(shí)。每天在顯微鏡 下檢查細(xì)胞。
[0133] (5)培養(yǎng)48小時(shí)后，離心去除培養(yǎng)液。每孔加入100 μ 1 MTT操作溶液，并繼續(xù)培 養(yǎng)4h〇
[0134] (6)終止培養(yǎng)，小心除去培養(yǎng)基。然后每孔加入100 μ 1 DMS0并在振蕩器上低速振 動(dòng)l〇min使得所有晶體完全溶解。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測儀器在0D570nm下測定每孔的吸 光度值，得到不同濃度不同化合物對(duì)細(xì)胞生長的抑制率。
[0135] 不同濃度的不同化合物對(duì)Panel細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞的生長抑制效果分 別如表1、表2和表3所不。
[0136] 表1對(duì)Panel細(xì)胞的效果（抑制百分比）
[0137]
[0138] 表2.對(duì)HepG2細(xì)胞的效果（抑制百分比）
[0139]
[0141] 表3.對(duì)A549細(xì)胞的效果（抑制百分比）
[0142]
[0143] 上述結(jié)果表明大部分化合物在10μΜ或100μΜ對(duì)抑制癌癥細(xì)胞生長具有顯著效 果。一些這些化合物，諸如化合物L(fēng)D012,對(duì)Α549具有高于90%的抑制率。
[0144] 雖然在優(yōu)選實(shí)施例中已經(jīng)描述并指出本發(fā)明的基本的新型特點(diǎn)，但是可以理解的 是，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的精髓下仍可以在所述的實(shí)施例的形式和細(xì)節(jié)上作各 種刪除、替代和改變。本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，其僅作為例子，但是可以在由所附專利權(quán) 利要求定義的保護(hù)范圍內(nèi)以各種方式修改。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化合物，其包含抑制癌癥細(xì)胞生長的性質(zhì)W及一種選自由式（I)、（II)、（III)、 (IV)組成的組的式：其中，X、X'為0、S或NR;R1和R2獨(dú)立為氨、面素、-0H、-甜、=0、C1-C5烷基、C1-C5 烷氧基、對(duì)甲基苯橫酷基、燒控取代娃氧基或Cl-巧烷基氨基；R3、R4和R5獨(dú)立為氨、面 素、-0H、-SH、Cl-巧烷基、Cl-巧烷氧基、甲基苯橫酷基、甲娃烷基或Cl-巧烷基氨基；R為 烷基或氨。2. 權(quán)利要求1所述化合物，其為式（I)并具有W下結(jié)構(gòu)：3. 權(quán)利要求1所述的化合物，其為式（II)并具有W下結(jié)構(gòu)：4. 權(quán)利要求I所述的化合物，其為式（II)并具有W下結(jié)構(gòu)：6'5. 權(quán)利要求1所述的化合物，其為式（IV)并具有W下結(jié)構(gòu)：6. 權(quán)利要求1所述的化合物，其為：7. -種用于治療癌癥的方法，包含給需要治療的人施予權(quán)利要求1所述的化合物。8. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述化合物為：9. 權(quán)利要求8所述的方法，其中所述癌癥為肺癌、肝癌、乳腺癌、腦瘤或者膜腺癌。10. 權(quán)利要求9所述的方法，其中所述癌癥為肝癌或膜腺癌。11. 一種用于調(diào)節(jié)Rffi)途徑的方法，包含將具有Rffi)途徑的細(xì)胞與權(quán)利要求6所述的化 合物接觸的步驟。
【專利摘要】用作抗癌試劑的羊毛甾醇衍生物，其可能通過作用于RHO途徑，能夠抑制肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的生長。這些羊毛甾醇衍生物可以化合物L(fēng)D030代表。
【IPC分類】A61K31/58, A61P35/00, A61K31/695, C07J71/00
【公開號(hào)】CN105377372
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480007139
【發(fā)明人】劉昕, 謝偉東
【申請(qǐng)人】廣州如親醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2014年1月27日
【公告號(hào)】EP2986343A1, US20160009756, WO2014117710A1