瓜蔞桂枝湯在制備治療缺血性腦卒中后遺癥藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥研究領(lǐng)域，具體設(shè)及一種瓜萎桂枝湯在制備缺血性腦卒中后遺癥 藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦血管疾病是我國的第Ξ位致死因素。其中，腦卒中包括出血卒中（腦出血)、缺 血性卒中（腦梗塞)，二者都是血管病變引起的，因此，患者大多有高血壓病史或其它血管病 史，如高血脂、糖尿病、動脈硬化等。腦卒中的后遺癥期臨床主要表現(xiàn)為偏擁、失語、意識精 神障礙等，使其致殘率占各種疾病的第一位，對人類危害極大，嚴(yán)重的威脅著中老年人的生 命和健康。該病的預(yù)防和治愈仍是國內(nèi)外臨床難題。
[0003] 腦卒中的常規(guī)藥物治療主要是通過控制或管理血壓，使血壓穩(wěn)定在相對合理的范 圍，W防止血壓過高造成出血復(fù)發(fā)，或過低再發(fā)腦梗塞。近年來研究證實(shí)，神經(jīng)保護(hù)劑的干 預(yù)可阻斷腦缺血瀑布反應(yīng)的不同環(huán)節(jié)，保護(hù)仍有活力的神經(jīng)元，延長腦細(xì)胞缺血耐受時間 和治療窗，逆轉(zhuǎn)半暗帶，減小梗死體積。盡管國內(nèi)外學(xué)者對腦卒中藥物的動物研究和臨床實(shí) 驗方面取得了許多喜人的成果，但臨床應(yīng)用的療效尚未取得突破性進(jìn)展。
[0004] 中藥具有整體調(diào)節(jié)、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)。用中藥復(fù)方治療腦卒中，多W桂風(fēng)化濕、 活血化疲、益腎通絡(luò)、滋養(yǎng)肝腎、調(diào)理脾胃、補(bǔ)血養(yǎng)陰，柔潤筋脈等為組方原則，擁有良好的 市場前景與獨(dú)特優(yōu)勢。由于中風(fēng)后遺癥是一種需要長期治療的疾病，中成藥成了許多患者 的首選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種瓜萎桂枝湯在制備治療缺血性腦卒中后遺癥藥物中 的應(yīng)用，其通過重劑使用天花粉，利用天花粉中活性成分與缺血性腦卒中腦組織中神經(jīng)損 傷細(xì)胞內(nèi)抗巧超載藥物祀點(diǎn)的相互作用，逆轉(zhuǎn)腦組織神經(jīng)損傷細(xì)胞內(nèi)巧超載的現(xiàn)象，W緩 解腦卒中后遺癥中神經(jīng)損傷的現(xiàn)象，并具有修復(fù)作用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種瓜萎桂枝湯在制備缺血性腦卒中腦神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用，其是將傳統(tǒng)瓜萎桂枝 湯中天花粉的用量提高5倍作為藥物配方，用于制備治療缺血性腦卒中后遺癥中腦神經(jīng)損 傷方面的藥物；其藥物配方具體為天花粉30g、桂枝9g、巧藥9g、甘草6g、生姜9g、大要12 枚。
[0007] 所述藥物的使用方法是用水煎煮后，每日分兩次服用；或按藥物劑量制備成顆粒 劑，每日沖服；W15天為一療程，服用兩個療程。
[0008] 瓜萎桂枝湯（即括樓桂枝湯）是《金匿要略》治療柔疫的方劑，W天花粉(瓜萎根)加 桂枝湯組成。柔疫之病是因外感風(fēng)寒，過汗或誤下，耗拐津液，致筋脈失養(yǎng)所造成的。桂枝 湯解肌桂邪，天花粉能滋養(yǎng)津液而潤燥養(yǎng)筋、舒緩筋脈，W治柔疫。湯本求真氏說："瓜萎根 治因虛熱，臟器組織燥枯，而于外表發(fā)輕微強(qiáng)直性疫李，于里現(xiàn)口燥口渴及其他之癥狀。" 缺血性腦卒中的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，巧對細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和存活很重要，細(xì)胞內(nèi) 巧超載是缺血性神經(jīng)元調(diào)亡過程中的關(guān)鍵因素，也是各種有害因素致神經(jīng)元死亡的最后共 同通路。巧超載可W通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生氧自由基、引起線粒體損傷W及激活蛋白 激酶等Ξ種途徑引起神經(jīng)元死亡。
[0009] 本發(fā)明創(chuàng)新性運(yùn)用中醫(yī)經(jīng)典方瓜萎桂枝湯，即將其君藥天花粉采取重劑臨床應(yīng) 用，由原方的6g增加至30g，用于治療腦卒中后遺癥，利用其活性成分與缺血性腦卒中腦組 織中神經(jīng)損傷細(xì)胞內(nèi)抗巧超載藥物祀點(diǎn)的相互作用，逆轉(zhuǎn)腦組織神經(jīng)損傷細(xì)胞內(nèi)巧超載的 現(xiàn)象，W緩解腦卒中后遺癥中神經(jīng)損傷的現(xiàn)象，并具有修復(fù)作用。將本發(fā)明瓜萎桂枝湯化裁 方用于200余例腦卒中后遺癥患者，跟蹤近7年進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，患者服藥后癥狀減輕， 肢體運(yùn)動能力和大腦認(rèn)知功能有所改善，療效確切。
【附圖說明】
[0010] 圖1為不同處理組對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織皮質(zhì)和紋狀體中游離 Ca2+的影響。
[0011] 圖2為天花粉蛋白與不同祀標(biāo)的結(jié)合模式圖，其中AWNR2A為祀標(biāo)，BWNR2B為 祀標(biāo)，CWFKBP12為祀標(biāo)，DWCalnodulin為祀標(biāo)。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 中醫(yī)治病在于查因、辨證、用藥；而能否取效，Ξ個環(huán)節(jié)缺一不可。臨證之際常量穩(wěn) 投，自是溫和平當(dāng)，對于新發(fā)之疾病的輕癥、保健調(diào)理用藥則可W取效；而對于急重癥、頑疾 非W大劑重用難救其危、難愈其頑。中醫(yī)在臨證時不僅要重視處方中藥味的慎重選擇，而且 對藥味用量應(yīng)該進(jìn)行仔細(xì)斟酌，故有"中醫(yī)不傳之秘在于量"之說，可見，同一味藥物由于用 量不同也可能改變處方的治療作用和療效。
[0013] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0014] 實(shí)驗材料 SPF級雄性SD大鼠，體重250 ± 20g，上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司出品；瓜萎根(天花 粉)、桂枝、白巧、甘草、干姜、大要購于福建祥安藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢測符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。
[0015] 分組與給藥 將40只大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分為模型組、假手術(shù)組、給藥組A和給藥組B。 給藥組A使用瓜萎桂枝湯原方(天花粉6g，桂枝9g，巧藥9g，甘草6g，生姜9g，大要12枚)， 給藥組B使用增大天花粉用量的化裁方(天花粉30g，其余藥味用量與原方相同)，按臨床劑 量折合成大鼠劑量，用水煎煮兩次合并混勻制成水煎劑；模型組與假手術(shù)組均給予生理鹽 水。每日1次，連續(xù)給藥15天。
[0016] 實(shí)驗方法 3.1大鼠腦缺血再灌注模型制作 采取線栓法制作大腦中動脈閉塞/再灌注模型。具體步驟如下：大鼠術(shù)前禁食12h，自 由飲水。用10%水合氯醒3ml/kg行腹腔注射麻醉。純性分離右側(cè)頸總動脈（CCA)、頸外動 脈巧CA)、和頸內(nèi)動脈（CA)，并小屯、分離迷走神經(jīng)，分別電凝ECA分支枕動脈和甲狀腺上動 脈。在距CCA分叉大約1cm處結(jié)扎ECA近屯、端，電凝遠(yuǎn)屯、端。用無創(chuàng)小動脈夾夾閉CCA,在ECA殘端距CCA分叉3mm處剪一小口，將線栓(用前泡1%肝素生理鹽水)經(jīng)ECA插入ICA，線 栓頭端距CCA分叉處約18mm，此時進(jìn)線有輕微阻力，栓線正好插至煩內(nèi)的大腦前動脈，堵住 大腦中動脈(MCA)開口，制成MCAO模型。造模后化，W半劑量10%水合氯醒再次麻醉動物， 拔出線栓，結(jié)扎ECA殘端。術(shù)后22-26Γ條件下飼養(yǎng)大鼠，自由進(jìn)食水。假手術(shù)組除不在頸 內(nèi)動脈插入線栓外，其余步驟與上述相同。
[0017] 腦組織細(xì)胞游離巧離子測定 3. 2. 1腦組織單細(xì)胞懸液制備 動物造模24h后按3mL/kg用10%水合氯醒腹腔注射麻醉，下開煩剝離大鼠全腦，取缺 血側(cè)大腦半球(每只動物控制取相同部位相同重量)，冰PBS沖洗2-3次，洗去血污，剪碎成 0. 5-lmm3大小，置于20-30倍0. 25%膜酶中，37°C水浴25min，W完全DMEM培養(yǎng)基終止消化， 吸管吹打數(shù)次，過200目篩網(wǎng)，100化pm離屯、5min，棄上清，沉淀用冰PBS反復(fù)洗涂2-3次， 離屯、去上清，加DMEM培養(yǎng)基重懸備用。
[0018] 細(xì)胞懸液行臺吩藍(lán)染色，檢查細(xì)胞成活率，要求達(dá)到95%W上。并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)， 調(diào)整細(xì)胞濃度為1〇6個/mL左右。
[0019] 3. 2. 2巧光負(fù)載及Ca2+計算 將上述細(xì)胞懸液在37°C下預(yù)溫5min后加入化ra-3/AM(終濃度為4μΜ) ;37°C解育 30min(96孔板，每孔200μL)，使化ra-3/AM進(jìn)入細(xì)胞與胞內(nèi)游離巧結(jié)合。另外取同一細(xì) 胞懸液標(biāo)本不負(fù)載化ra-3/AM作為空白對照管。（每例動物做2個復(fù)孔，及負(fù)載和不負(fù)載， 即每例動物的細(xì)胞懸液分為4份） 巧光測定采用化ermo全波長掃描多功能酶標(biāo)儀測定，測定時W激發(fā)波長為506nm，發(fā) 射波長為526nm，分別測定F、F"_、Fmm。F為506nm激發(fā)波長測得的巧光強(qiáng)度值；Fm。、為最 大巧光強(qiáng)度值，即加入化itonX-100 (終濃度為0. 01%~0. 1%)后所測得的巧光強(qiáng)度值；Fmm 為最小巧光強(qiáng)度值，即在Fm。、基礎(chǔ)上加入EGTA(終濃度為5nM)后所測得的巧光強(qiáng)度值。
[0020] [Ca2+]i=Kd(F-Fmin)/ (Fmax-F)(單位：nM); Kd=325nM，為化ra-3與Ca2+的解離常數(shù)； 公式中所用的值均為減去未負(fù)載化ra- 3/AM的細(xì)胞中測得的F、Fm。,、Fmi。值。
[0021] 天花粉中活性成分與抗巧超載藥物祀點(diǎn)的相互作用 為進(jìn)一步研究天花粉與抗巧超載藥物祀標(biāo)的相互作用情況，將從天花粉中提取出的 天花粉蛋白作為此藥的代表性活性成分，WN-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA)亞基NR2A、 NR2B，巧調(diào)神經(jīng)憐酸酶CaN，巧調(diào)蛋白CaM為祀標(biāo)，用計算機(jī)模擬預(yù)測天花粉蛋白與抗巧超 載藥物祀標(biāo)的相互作用情況，W闡明其作用原理。
[0022] 采用蛋白對接軟件ZD0CK，傅立葉變換（FFT)方法進(jìn)行剛性對接，對接結(jié)構(gòu)采用幾 何互補(bǔ)、去溶劑化能和靜電相互作用進(jìn)行打分篩選。將天花粉蛋白，分別對接至巧超載祀標(biāo) NR2A，NR2B、F邸P12和化Imo化lin，每次對接總共產(chǎn)生3600個結(jié)構(gòu)構(gòu)象，挑打分最好的構(gòu)象 進(jìn)行結(jié)合模式分析。 陽〇2引實(shí)驗結(jié)果 首先進(jìn)行瓜萎桂枝湯對缺血性腦卒中模型動物MCA0大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)巧超載的 藥效學(xué)實(shí)驗，采用巧光顯微鏡（100X)進(jìn)行觀察。圖1為不同處理組對MCA0模型大鼠腦組 織皮質(zhì)和紋狀體中游離Ca2+的影響。
[0024] 由圖1可W看出，給藥組A和給藥組B均可降低腦缺血再灌注模型大鼠急性期腦 組織游離巧離子含量，說明瓜萎桂枝湯具有逆轉(zhuǎn)缺血性腦卒中腦組織細(xì)胞內(nèi)巧超載的作 用，而重用30g天花粉的瓜萎桂枝湯化裁方的給藥組B效果最好效果更顯著。
[0025] 天花粉蛋白與不同祀標(biāo)的結(jié)合模式見圖2,其中AWNR2A為祀標(biāo)，BWNR2B為祀 標(biāo)，CWFKBP12為祀標(biāo)，DW化Ino化lin為祀標(biāo)，二者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基用sticks形 式標(biāo)示；所得Zrank值見表1。 陽026] 表1天花粉蛋白與祀標(biāo)的結(jié)合的Zrank值
ZRank Score值越負(fù)越好，代表二者的結(jié)合能力越強(qiáng)。
[0027] 由圖2及表1可見，天花粉蛋白與NR2A、NR2B、CaN、CaM四種抗腦神經(jīng)損傷細(xì)胞內(nèi) 巧超載祀蛋白均有非常強(qiáng)的相互作用。因此，方劑中重用天花粉，可增加有效成分的含量， 提升方劑的藥力。
[0028] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種瓜蔞桂枝湯在制備治療缺血性腦卒中后遺癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于：將傳 統(tǒng)瓜蔞桂枝湯中天花粉的用量提高5倍作為藥物配方，用于制備治療缺血性腦卒中后遺癥 中腦神經(jīng)損傷方面的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種瓜蔞桂枝湯在制備治療缺血性腦卒中后遺癥藥物中的應(yīng)用，其具體是將傳統(tǒng)瓜蔞桂枝湯中天花粉的用量提高5倍作為藥物配方，用于制備治療缺血性腦卒中后遺癥中腦神經(jīng)損傷方面的藥物。其主要是利用天花粉中活性成分與缺血性腦卒中腦組織中神經(jīng)損傷細(xì)胞內(nèi)抗鈣超載藥物靶點(diǎn)的相互作用，逆轉(zhuǎn)腦組織神經(jīng)損傷細(xì)胞內(nèi)鈣超載的現(xiàn)象，以緩解腦卒中后遺癥中神經(jīng)損傷的現(xiàn)象，并具有修復(fù)作用。
【IPC分類】A61P25/28, A61P9/10, A61K36/9068
【公開號】CN105412897
【申請?zhí)枴緾N201610018923
【發(fā)明人】陳立典, 龐文生, 胡娟, 韓靜, 張繼州
【申請人】福建中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2016年1月13日