下,接受Ad35-RSV.F或Ad26-RSV.F的動物的 肺及鼻中不存在攻擊病毒的復(fù)制,與投藥途徑及劑量無關(guān)。
[0160] 此等數(shù)據(jù)令人驚訝地證實(shí)編碼RSVF蛋白質(zhì)的基于Ad26及基于Ad35的載體各自在 棉鼠攻擊實(shí)驗(yàn)中提供完全保護(hù),與載體的投藥途徑無關(guān)。此種情況出乎意料,因?yàn)樗_的 基于腺病毒的RSV疫苗(其基于其他血清型)中無一者已證實(shí)在肌肉內(nèi)接種疫苗后具有完全 保護(hù)。
[0161] 在實(shí)驗(yàn)期間,在免疫接種之前(第0天)、免疫接種后4周(第28天)及攻擊當(dāng)天(第49 天)獲取血液樣品。在中和測試中針對RSV特異性抗體的誘導(dǎo)來測試血清(圖13)。在免疫接 種之前,在任何棉鼠中均未檢測到病毒中和抗體。所有腺病毒載體免疫接種策略與投藥途 徑無關(guān),明顯誘導(dǎo)高VNA效價,其隨著時間推移而保持穩(wěn)定。此等數(shù)據(jù)令人驚訝地證實(shí)編碼 RSVF蛋白質(zhì)的基于Ad26及基于Ad35的載體各自在棉鼠免疫接種實(shí)驗(yàn)中提供病毒中和抗體 的高效價,與載體的投藥途徑無關(guān)。
[0162] 為評估在經(jīng)RSVA2攻擊后Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F疫苗的單次免疫接種是否可 能導(dǎo)致疫苗增強(qiáng)疾病,在感染后5天進(jìn)行肺的組織病理學(xué)分析(圖14)。與經(jīng)rAd-e免疫接種 或虛擬免疫接種的動物相比,使用rAd26 .RSV.F或rAd35 .RSV.F的單次免疫接種在經(jīng) rAd26.RSV.F或rAd35.RSV.F免疫接種的動物中產(chǎn)生類似的免疫病理學(xué)評分,如上述初打-加打免疫接種實(shí)驗(yàn)中所觀測。顯然,未觀測到疾病惡化,與使用FI-RSV初打的動物形成對 比。經(jīng)rAd載體免疫接種的動物的組織病理學(xué)評分與虛擬感染的動物相當(dāng)。
[0163] 總之,所有單次劑量接種疫苗策略均產(chǎn)生抗RSV攻擊復(fù)制的完全保護(hù),誘導(dǎo)強(qiáng)病毒 中和抗體,且不展示增強(qiáng)病變。
[0164] 實(shí)例6.具有變體(諸如RSVF的片段)或具有替代性啟動子的載體顯示類似免疫原 性
[0165] 已使用表達(dá)野生型RSVF的載體進(jìn)行上述實(shí)例。已在rAd35中構(gòu)建F的其他截短或 修飾形式,從而提供腺病毒載體中RSVF片段的實(shí)施例。F的此等截短或修飾形式包括缺少 細(xì)胞質(zhì)域及跨膜區(qū)(亦即僅保留胞外域片段)的RSV-F截短形式,及細(xì)胞質(zhì)域及跨膜區(qū)截短 且胞外域中具有另一內(nèi)部缺失且添加Ξ聚化域的RSV-F片段形式。此等載體與具有全長F蛋 白質(zhì)的rAd35.RSV.F相比未改良反應(yīng)。
[0166] 另外,已構(gòu)建具有驅(qū)使野生型RSVF表達(dá)的不同替代性啟動子的其他rAd35載體。
[0167] 已在小鼠模型中比較RSV.F的修飾形式及啟動子變體的免疫原性且與表達(dá)野生型 F的Ad35.RSV.F相比。具有此等F變體或啟動子變體的所有Ad35載體均顯示與Ad35.RSV.F相 同數(shù)量級的反應(yīng)。
[0168] 實(shí)例7.在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內(nèi)免疫接種后抗RSV感染的短期保護(hù)
[0169] 此實(shí)驗(yàn)確定在棉鼠模型中由表達(dá)RSV-F蛋白質(zhì)的腺病毒載體迅速發(fā)起保護(hù)的潛 力。為此目的,在第0天或第21天,通過單次肌肉內(nèi)注射10 7、108或109個病毒粒子(VP)的帶有 全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體(Ad35.RSV.F)或無轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體(Ad26e)對實(shí)驗(yàn) 組中的棉鼠(每組8只棉鼠)免疫接種。經(jīng)RSVA2(104個空斑形成單位(P化))鼻內(nèi)感染的動 物用作抗攻擊復(fù)制的保護(hù)的陽性對照,眾所周知的是,經(jīng)RSV病毒初次感染防止二次攻擊復(fù) 制(Prince丄abInvest1999,79:1385-1392)。在免疫接種后屯周(第49天)或四周,使用1 X105p化的空斑純化RSVA2經(jīng)鼻內(nèi)攻擊棉鼠。在感染后5天(RSV攻擊病毒達(dá)成峰值效價的 時間點(diǎn))處死棉鼠(Prince丄abInvest1999,79:1385-1392),且通過病毒空斑滴定來測定 肺RSV效價及鼻RSV效價(Prince等人1978,AmJPathology93,711-791)。圖16展示在接受 無轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體的動物中觀測到肺中及鼻中的高RSV病毒效價,分別為4.8+/-0.11logiopfu/g及5.1+/-0.321ogi日時u/g。相比之下,接受高劑量(109vp)Ad35.RSV.F載體免 疫接種的所有動物在免疫接種后7周受到抗肺RSV效價及鼻RSV效價的完全保護(hù)且在免疫接 種后4周受到近乎完全的保護(hù)。較低劑量的Ad35.RSV.F載體在免疫接種后4周及7周賦予抗 肺RSV效價的完全保護(hù)及抗鼻效價的部分保護(hù)。在攻擊當(dāng)天(第49天)獲取血液樣品。在中和 測試中針對RSV特異性抗體的誘導(dǎo)來測試血清(圖17)。使用Ad載體免疫接種誘導(dǎo)劑量依賴 性VNA效價。圖18展示對照動物在實(shí)驗(yàn)期間不具有病毒中和抗體,但在使用107至109vp Ad35.RSV.F免疫接種后28天或49天在動物中誘導(dǎo)高VNA效價。在免疫接種之前,在任何棉鼠 中均未檢測到病毒中和抗體。使用腺病毒載體免疫接種誘導(dǎo)劑量依賴性VNA效價,其高于初 次鼻內(nèi)RSV感染所產(chǎn)生的中和效價或與其相當(dāng)。此實(shí)驗(yàn)清楚指示表達(dá)RSV-F的Ad35迅速發(fā)起 抗攻擊病毒復(fù)制的保護(hù)。
[0170] 實(shí)例8.在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內(nèi)免疫接種后抗RSV亞群A及亞群B感 染的保護(hù)
[0171] RSV病毒株可分成兩個亞群:亞群A及亞群B。此亞型分類是基于高變G糖蛋白抗原 性的差異。F蛋白質(zhì)的序列高度保守,但亦可歸入上述亞群A及亞群B中。專利申請案0200E0 P00描述經(jīng)Ad-RSV.F載體免疫接種的小鼠的血清亦能夠活體外交叉中和B1病毒株。圖19清 楚展示源于經(jīng)Ad35.RSV-FA2免疫接種的棉鼠的棉鼠血清在免疫接種后第49天展示抗RSV Long(亞群A)及Bwash(亞群B,ATCC編號1540)的高VNA效價。使用107及108vp的低腺病毒載體 劑量在棉鼠中測定抗亞群A或B攻擊的活體內(nèi)保護(hù)。為此目的,將棉鼠分配于實(shí)驗(yàn)組中,每組 8只棉鼠。第0天,通過肌肉內(nèi)注射10 7或108個病毒粒子(VP)的帶有全長RSVF(A2)基因的腺 病毒載體(Ad35.RSV.F)或無轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體(Ad26e)對動物免疫接種。經(jīng)RSVA2(104 個空斑形成單位(P化))鼻內(nèi)感染的動物用作抗攻擊復(fù)制的保護(hù)的陽性對照。第49天,使用 l〇5pfuRSV-A2(RSV-A亞群)或RSV-B15/97(RSV-B病毒株)鼻內(nèi)攻擊動物。
[0172]圖20展示在接受無轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體的動物中觀測到肺中的高RSV病毒效價。 相比之下,在接受Ad35.RSV.F載體免疫接種的動物的肺及鼻組織中不可檢測到攻擊病毒。 當(dāng)使用RSV-A2或RSV-B15/97攻擊時,對于保護(hù)未觀測到差異。107及108vp的Ad35.RSV.FA2 展示抗肺攻擊復(fù)制的完全保護(hù)。圖21展示在接受無轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體的動物中觀測到鼻 中的高RSV病毒效價。108vp的Ad35.RSV.Fa2展示抗鼻攻擊病毒復(fù)制的部分保護(hù)。當(dāng)使用RSV-A2或RSV-B15/97攻擊時,對于保護(hù)未觀測到差異。在實(shí)驗(yàn)期間,第28天及攻擊當(dāng)天(第49 天)獲取血液樣品。在中和測試中針對RSV特異性抗體的誘導(dǎo)來測試血清。圖22展示在實(shí)驗(yàn) 時程中的病毒中和效價且顯示對照動物在實(shí)驗(yàn)期間不具有病毒中和抗體。動物在使用1〇8 或107vpAd35.RSV.F免疫接種后28天誘導(dǎo)高VNA效價。
[0173]實(shí)例9.在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內(nèi)免疫接種后抗高攻擊劑量的RSV-A2的保護(hù)
[0174] 此實(shí)例確定與1X10?化RSV-A2的標(biāo)準(zhǔn)劑量相比,抗5X105p化的高攻擊劑量的保 護(hù)。該研究將棉鼠錄入實(shí)驗(yàn)組中,每組8只棉鼠。第0天,通過肌肉內(nèi)注射10 7或108個病毒粒子 (VP)的低劑量的帶有全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體(Ad35.RSV.F)或無轉(zhuǎn)基因的腺病毒 載體(Ad26e)對動物免疫接種。經(jīng)RSVA2(104個空斑形成單位(P化))鼻內(nèi)感染的動物用作 抗攻擊復(fù)制的保護(hù)的陽性對照。在感染后5天處死棉鼠,且通過病毒空斑滴定來測定肺RSV效價及鼻RSV效價。圖23展示在接受無轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體的動物中,較高攻擊劑量比標(biāo)準(zhǔn) 攻擊劑量誘導(dǎo)較高肺病毒負(fù)荷。接受l〇8vpAd35.RSV.F載體免疫接種的動物在肺中受到抗 標(biāo)準(zhǔn)及較高RSV攻擊效價的完全保護(hù)。圖24展示接受108或107vpAd35.RSV.F載體免疫接種 的動物在鼻中受到抗標(biāo)準(zhǔn)及較高RSV攻擊效價的部分保護(hù)。
[0175] 實(shí)例10.初打Ad26 .RSV.F且加打重組F蛋白質(zhì)在小鼠模型中產(chǎn)生向化1偏斜的反應(yīng)
[0176]在此實(shí)例中,查明在初打Ad26.RSV.F后的免疫反應(yīng)是否可通過加打輔助型重組 RSVF蛋白質(zhì)來增強(qiáng)。為此目的,將小鼠分配于實(shí)驗(yàn)組中,每組7只小鼠。第0天,通過肌肉內(nèi) 注射l〇w個病毒粒子(VP)的帶有全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體(Ad26.RSV.F)或PBS對動 物免疫接種。第28天,動物肌肉內(nèi)加打相同劑量的相同載體或輔助型RSVF蛋白質(zhì)(全長;融 合后構(gòu)形:post-F) (W2種劑量:5yg及0.扣g)。圖25清楚展示源于經(jīng)Ad26.RSV-FA2免疫接種 且加打輔助型RSVF的小鼠的血清在免疫接種后12周展示抗RSV-ALong(亞群A)的高VNA效 價。圖26展示經(jīng)Ad26.RSV-FA2免疫接種且加打輔助型RSVF蛋白質(zhì)的小鼠的血清中的IgG2a/ IgGl比率。高比率指示Thl平衡的反應(yīng),而低比率指示向Th2偏斜的反應(yīng)。顯然,經(jīng) Ad26.RSV.F免疫接種且加打Ad26.RSV.F或RSVF蛋白質(zhì)的動物產(chǎn)生高IgG2a/IgGl比率,而 經(jīng)FI-RSV或RSVF蛋白質(zhì)免疫接種的對照小鼠(無腺病毒載體的情形)誘導(dǎo)低比率。由于RSV 疫苗強(qiáng)烈需要向化1偏斜的反應(yīng)W避免在攻擊后增強(qiáng)疾病,故當(dāng)施用Ad26.RSV.F初打時,可 將蛋白質(zhì)免疫接種的化2偏斜反應(yīng)向化1反應(yīng)引導(dǎo)。圖27展示源于經(jīng)Ad26.RSV-FA2免疫接種 且加打輔助型RSVF蛋白質(zhì)的小鼠的脾臟中的細(xì)胞反應(yīng)。可清楚觀測到加打輔助型RSVF蛋 白質(zhì)亦將大大增強(qiáng)細(xì)胞反應(yīng)?;谏鲜鰧?shí)例中所述的先前實(shí)驗(yàn),預(yù)期用Ad35替代Ad26將得 到類似結(jié)果。
[0177] 表1.序列
[017引沈QIDN0:1:RSV融合蛋白質(zhì)(Genba址AC083301.1)氨基酸序列:
[0179]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗,其包含血清型35重組人類腺病毒,該重組人類腺 病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核酸。2. 如權(quán)利要求1所述的疫苗,其中該重組腺病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)的核酸,該RSVF 蛋白質(zhì)包含SEQIDNO: 1的氨基酸序列。3. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗,其中該編碼RSVF蛋白質(zhì)的核酸是針對在人 類細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。4. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗,其中該編碼RSVF蛋白質(zhì)的核酸包含SEQID NO: 2的核酸序列。5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗,其中該重組人類腺病毒的腺病毒基因組的E1 區(qū)中具有缺失、E3區(qū)中具有缺失或E1區(qū)與E3區(qū)中均具有缺失。6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗,其中該重組腺病毒的基因組在5'末端包含序 列CTATCTAT。7. -種對受試者接種抗RSV疫苗的方法,該方法包含向該受試者投與如前述權(quán)利要求 中任一項(xiàng)所述的疫苗。8. 如權(quán)利要求7所述的方法,其中該疫苗是經(jīng)肌肉內(nèi)投與。9. 如權(quán)利要求7或8所述的方法,其中如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的疫苗是投與該受 試者一次以上。10. 如權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的方法,其另外包含向該受試者投與包含血清型26 重組人類腺病毒的疫苗,該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核酸。11. 如權(quán)利要求7或8所述的方法,其是由向該受試者單次投與該疫苗組成。12. 如權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)所述的方法,其另外包含向該受試者投與RSVF蛋白質(zhì)。13. -種減少受試者的RSV感染和/或復(fù)制的方法,其包含通過肌肉內(nèi)注射向該受試者 投與包含血清型35重組人類腺病毒的組合物,該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)或 其片段的核酸。14. 一種經(jīng)分離的宿主細(xì)胞,其包含血清型35重組人類腺病毒,該重組人類腺病毒包含 編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核酸。15. -種制造抗呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的方法,其包含提供包含編碼RSVF蛋白質(zhì) 或其片段的核酸的血清型35重組人類腺病毒,使所述重組腺病毒在宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中增 殖,分離并純化該重組腺病毒,并將該重組腺病毒調(diào)配于醫(yī)藥學(xué)上可接受的組合物中。16. -種經(jīng)分離的重組核酸,其形成血清型35重組人類腺病毒的基因組,該重組人類腺 病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核酸。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種抗呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗,該疫苗包含血清型重組人類腺病毒,該重組人類腺病毒包含編碼RSV?F蛋白質(zhì)或其免疫活性部分的核酸。
【IPC分類】A61P31/14, A61K39/155
【公開號】CN105431169
【申請?zhí)枴緾N201380014951
【發(fā)明人】K·拉多塞維奇, J·H·H·V·屈斯泰, J·維林加, M·N·維佐約阿特莫佐
【申請人】克魯塞爾荷蘭公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2013年3月21日
【公告號】CA2867950A1, CA2867955A1, CN104334188A, EP2827894A1, EP2827895A1, WO2013139911A1, WO2013139916A1