14作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時；
[0037] 轉(zhuǎn)染液制備；取兩只EP管，制備W下兩液（為轉(zhuǎn)染每IOcm培養(yǎng)皿的細(xì)胞所用的 量，24孔板所用的量根據(jù)培養(yǎng)基量計算）
[0038] A液：用Opti-MEM培養(yǎng)基（GIBCO)稀釋質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，終量1500 U 1。
[0039] B 液：用 Opti-MEMl (GIBCO) 470 U 1 稀釋 30 U 1 Lipofectamine2000 (Invitrogen)， 輕輕混勻，終量1500 U 1。
[0040] 靜置5分鐘后，將A液一滴一滴的輕輕加到B液中，邊加邊混勻。室溫中置10-15 分鐘。建議質(zhì)粒 DNA(ii g)與 Lipofectamine2000(y 1)使用比例為 1 ;21:3。
[0041] 轉(zhuǎn)染；把A/B復(fù)合物緩緩加入到含有12毫升含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 (GIBCO)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，充分混勻后37°C溫箱放置4~6小時，吸除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基， 換入正常含有10 %血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[004引 做將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸干，加入100 裂解緩沖液（Promega試劑盒里有自帶），4°C 搖晃裂解30分鐘左右，然后用槍頭吹吸混勻后，將孔內(nèi)裂解液及細(xì)胞碎片移到1. 5ml EP管 中；
[0043] (4) 4°C 12000巧m離必1分鐘，取上清待測；
[0044] 巧）英光檢測反應(yīng)體系；每個樣品中加入50 y 1 Luciferase AssayReagentII, LAR II和10 U 1細(xì)胞裂解液，用槍頭吹吸3次，放入機(jī)器讀取第一個英光值；然后取出來，再加 入50 U 1 Stopfe 01(，度試劑，用槍頭吹吸3次，再放入機(jī)器讀取第二個英光值；
[0045] 度)24孔板中剩余的細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白定量后用于Western Blot分析。
[0046] (C)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：
[0047] 為了檢測PtpA對JNK和p38信號通路是否有抑制作用，我們使用了雙英光素酶報 告體系（Promega)，并進(jìn)一步用Western Blot方法檢測了磯酸化JNK和磯酸化p38蛋白水 平的變化（圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PtpA可W明顯的抑制RacL61激活的JNK和p38信號通 路，而且當(dāng)PtpA發(fā)生D126A突變時，即PtpA失去活性時，其對信號通路的抑制作用也隨之 消失。Western Blot結(jié)果顯示當(dāng)PtpA存在時JNK和p38的磯酸化水平會降低，也就說明信 號通路被抑制；相反，不轉(zhuǎn)染PtpA或者轉(zhuǎn)染突變PtpA時信號通路的激活不會受到影響。
[0048] 實(shí)施例2重組BCG菌株促進(jìn)細(xì)胞因子分泌
[0049] (A) P化A基因敲除方法：
[0050] (1)將PJV53質(zhì)粒（Addgene)電轉(zhuǎn)到BCG感受態(tài)中，在含有卡郝霉素的 Middlebrook 7H10 AgaHBD)平板上篩選陽性克隆；
[0051] (2)挑取陽性克隆，接種于含有卡郝霉素抗性的Middlebrook 7H9度D)培養(yǎng)基中 37攝氏度培養(yǎng)20天，離必收獲攜帶pJV53k的BCG并制備感受態(tài)待用；
[00閲 做合成PtpA基因上游（AB)基因片段

[005引 （4)將上述基因片段AD電轉(zhuǎn)到步驟似準(zhǔn)備的BCG感受態(tài)中；在含有潮霉素抗性 的Middlebrook 7H10平板上篩選陽性克?。?br>[0057] 巧)Southern Blot法鑒定陽性克隆，獲得重組BCG。
[0058] 度）細(xì)胞因子檢測方法
[0059] 1)巨瞻細(xì)胞細(xì)胞因子檢測方法：用化ISA的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的濃 度；QRT-PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞因子的mRNA水平。
[0060] 2)小鼠脾臟細(xì)胞因子檢測方法：將野生型BCG或重組BCG感染后的小鼠脾臟進(jìn)行 研磨，提取細(xì)胞總RNA，然后用QRT-PCR法檢測各細(xì)胞因子的mRNA水平。
[006。 3)小鼠血液細(xì)胞因子檢測方法：摘眼球法取野生型BCG或敲除了 PtpA的BCG感 染后的小鼠血液，用IL-^b ELISA試劑盒檢測血液中細(xì)胞因子的濃度。
[0062] (C)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
[0063] 為了檢測PtpA對于JNK和p38信號通路下游細(xì)胞因子的影響，我們分別用野生型 BCG(WT BCG)和敲除了 PtpA的BCG(P化A邸-BCG)感染巨瞻細(xì)胞U937,分別在感染不同時 間點(diǎn)（Oh,化，地，化，2地，4她）收取細(xì)胞培養(yǎng)基和U937細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基直接用于化ISA實(shí) 驗(yàn)，U937細(xì)胞提取總mRNA后用QRT-PCR法檢測細(xì)胞因子mRNA水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： 與野生型BCG感染結(jié)果對比，敲除了 P化A BCG感染U937細(xì)胞2小時后細(xì)胞因子TNF (腫瘤 壞死因子，Tumor necrosis factor)和IL-I目的總mRNA水平明顯更高，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果 也同樣證實(shí)敲除了 PtpA的BCG感染U937細(xì)胞后會有更多的TNF和IL-I目分泌出來（圖 2)。
[0064] 進(jìn)一步建立動物模型實(shí)驗(yàn)，通過QRT-PCR法我們發(fā)現(xiàn)敲除了 PtpA的BCG感染的小 鼠脾臟內(nèi)細(xì)胞因子TNFJL-I目和IL-I化的mRNA水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型BCG感染的小鼠，此 外我們用化ISA實(shí)驗(yàn)檢測了小鼠血液中IL-I化的蛋白水平變化，結(jié)果與QRT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果相同。因此，小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致：即與野生型BCG相比，重組BCG會 明顯促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌（圖3)。
[0065] 雖然本發(fā)明已W較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該W權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組卡介苗，其特征在于，敲除卡介苗中編碼PtpA蛋白的基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組卡介苗，其特征在于，所述PtpA蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1 所示。3. -種構(gòu)建權(quán)利要求1所述重組卡介苗的方法，是將卡介苗中編碼PtpA蛋白的基因進(jìn) 行敲除。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，通過同源重組敲除BCG中編碼PtpA蛋白 的基因。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包含以下步驟： (1) 將PJV53質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到BCG感受態(tài)中，篩選陽性克?。凰鰌JV53質(zhì)粒在BCG中轉(zhuǎn)錄 表達(dá)促進(jìn)外源片段同源重組的酶； (2) 挑取陽性克隆，培養(yǎng)富集并制備感受態(tài)待用； (3) 合成序列如SEQIDNO. 4所示的帶有篩選標(biāo)記的ptpA上下游基因融合片段AD; (4) 將上述基因片段AD電轉(zhuǎn)到步驟（2)準(zhǔn)備的BCG感受態(tài)中；利用潮霉素抗性篩選陽 性克?。? (5) 鑒定陽性克隆，獲得敲除了PtpA的重組BCG。6. 權(quán)利要求1所述重組卡介苗在促進(jìn)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述重組卡介苗在制備結(jié)核病疫苗中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組卡介苗及其構(gòu)建與應(yīng)用，屬于微生物學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次確定了敲除結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白PtpA獲得的重組BCG菌株可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞及小鼠的細(xì)胞因子分泌。本發(fā)明成果可為新的更為高效的BCG重組疫苗的構(gòu)建提供思路，尤其在BCG疫苗開發(fā)和臨床應(yīng)用等方面將有著廣闊的前景。
【IPC分類】A61P31/06, C12N15/74, A61K39/04
【公開號】CN105477631
【申請?zhí)枴緾N201410482225
【發(fā)明人】劉翠華, 汪靜, 李冰曦, 葛浦浦
【申請人】中國科學(xué)院微生物研究所
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2014年9月19日