自溶性微針透皮貼片及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于經(jīng)皮給藥技術(shù)領(lǐng)域中的自溶性微針，特別涉及自溶性微針透皮貼片及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前大多數(shù)的疫苗都是采用皮下或肌肉注射的方式進行接種，存在疼痛、需專業(yè) 人員操作、疫苗的藥代動力學(xué)曲線不理想、注射針的重復(fù)使用會引發(fā)傳染病的傳播等問題。 因此順應(yīng)性好、方便、高效、安全的新型疫苗遞送系統(tǒng)的研究一直是疫苗領(lǐng)域的熱點。經(jīng)皮 免疫（Transcutaneousimmunization，TCI)是指局部應(yīng)用疫苗抗原和（或）佐劑于皮膚 表面以引起免疫反應(yīng)。皮膚是疫苗免疫的一個理想部位，其中含有比肌肉、皮下組織中更 豐富的抗原呈遞細胞（Antigenpresentingcells,APCs)。表皮中富含的朗格罕斯細胞 (Langerhanscells,LCs)及真皮中富含的樹突狀細胞（dermaldendriticcells.dDCs)， 形成獨特強有力的免疫識別、應(yīng)答和效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。但是，傳統(tǒng)的透皮技術(shù)僅適用于脂溶性小分 子藥物，生物大分子藥物的經(jīng)皮給藥難以實現(xiàn)。因此經(jīng)皮免疫的關(guān)鍵之處在于如何將足夠 量的疫苗抗原和佐劑透過角質(zhì)層傳遞至皮膚中的免疫細胞。
[0003] 基于BioMEMS技術(shù)開發(fā)的微針陣列經(jīng)皮給藥技術(shù)是藥物釋放領(lǐng)域的重大技 術(shù)突破，它結(jié)合了注射和經(jīng)皮給藥兩大優(yōu)勢，為經(jīng)皮免疫提供了新的可能性。微針 (Microneedles)長度小于1_，其穿刺皮膚可產(chǎn)生微米級藥物運送通道，允許大分子通過。 控制微針的高度可使其穿刺深度不接觸到神經(jīng)末梢，無痛無血就可使生物大分子實現(xiàn)皮內(nèi) 釋放。自溶性微針（self-dissolvingmicroneedles)是近幾年來出現(xiàn)的一種新型微針。其 采用可溶于水的聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)等高分子材料作為微針 的基質(zhì)，藥物分散在基質(zhì)中，微針刺入皮膚后可溶解于皮膚組織液中，從而被機體吸收。與 早期的硅或金屬微針相比，自溶性微針應(yīng)用于皮膚后能夠溶解于其中，無需后續(xù)的處置和 回收過程，而且降低了材料和工藝的成本。另外，由于采用醫(yī)用材料，使最終獲得藥監(jiān)部門 批準的可能性大大增加。因此，自溶性微針已成為當今微針技術(shù)的發(fā)展趨勢。
[0004] 目前，研究表明微針介導(dǎo)的疫苗經(jīng)皮免疫傾向于誘導(dǎo)更強的輔助性T細胞2(Th2) 型體液免疫應(yīng)答，對許多疾病而言，輔助性T細胞l(Thl)型的細胞免疫應(yīng)答也是必須的 (J.Control.Release，2010,147 :326 - 332;PlosOne, 2009, 4:47-73)。因此需要選擇合適 的佐劑來提高經(jīng)皮免疫所誘導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)應(yīng)答，實現(xiàn)體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)的 平衡。目前自溶性微針普遍采用聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)、聚乙烯 醇（PVA)等作為基質(zhì)，其本身不具備佐劑的作用，佐劑的添加來自其他外源性材料。額外添 加的佐劑會帶來成本增加以及微針的成型性和機械強度變差的問題。此外，目前常用的佐 劑包括鋁佐劑、脂質(zhì)體、弗氏佐劑、粘膜免疫佐劑、CpG序列、細胞因子以及納米粒子佐劑，但 是上市的人用疫苗佐劑經(jīng)美國FDA批準的只有鋁佐劑。鋁佐劑主要誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，而 細胞免疫很弱，無法解決經(jīng)皮免疫中細胞免疫弱的問題。新型疫苗遞送系統(tǒng)的研究開發(fā)致 力于解決上述問題，達到有效、安全、穩(wěn)定、經(jīng)濟的目的。
[0005] 危險信號模式理論為我們提供了全新的視野。PollyMatzinger于1994年提出危 險信號模式理論，在該模式中，免疫系統(tǒng)的功能是參與識別危險信號分子與非危險信號分 子。細胞損傷釋放的危險信號分子可以激活A(yù)PC進而有效的激活T/B細胞產(chǎn)生相應(yīng)的免疫 應(yīng)答。內(nèi)源性危險信號具有交叉遞呈抗原，誘導(dǎo)細胞免疫的特性，提示內(nèi)源性危險信號可作 為疫苗佐劑誘導(dǎo)特異性的細胞免疫應(yīng)答。
[0006]KAScheibner等發(fā)現(xiàn)高分子量透明質(zhì)酸的降解片段即低分子量透明質(zhì)酸是一個 內(nèi)源性危險信號（theJournalofImmunology, 2006, 177:1272-1281)。當機體組織受損， 商分子量透明質(zhì)酸（分子量200萬~600萬）在氧自由基以及酶的作用下解聚為低分子量 透明質(zhì)酸（分子量20萬）。低分子量透明質(zhì)酸與TLR-2作用后，以依賴于MyD88/IL-lR相 關(guān)激酶、TNFR相關(guān)因子-6、蛋白激酶Cζ、NF-κB的方式進行信號傳導(dǎo)，激活機體的天然免 疫應(yīng)答；高分子量透明質(zhì)酸則抑制TLR-2的信號傳導(dǎo)。透明質(zhì)酸是細胞外基質(zhì)的重要成分， 它是構(gòu)成皮膚、玻璃體關(guān)節(jié)滑液和軟骨組織的重要成分，具有獨特的理化性質(zhì)和生物學(xué)功 能。透明質(zhì)酸中的重復(fù)二糖單元在所有物種和組織中都是一致的，因此不導(dǎo)致透明質(zhì)酸分 子自身的免疫排斥。低分子量透明質(zhì)酸（分子量〈100萬）是透明質(zhì)酸的降解產(chǎn)物，具有完 整的透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)，生物活性高，無毒副作用，目前主要在各類化妝品中用于保濕、抗衰老、 曬后修復(fù)等。研究結(jié)果表明，寡聚透明質(zhì)酸（分子量〈10, 〇〇〇)能夠明顯增強滅活HAV抗原 的免疫應(yīng)答，具有強的免疫佐劑作用，其免疫佐劑效應(yīng)優(yōu)于鋁佐劑（細胞與分子免疫學(xué)雜 志，2008, 24:183-185)。
[0007]GeoffreyBJ等發(fā)現(xiàn)（theJournalofImmunology, 2002, 168:5233-5239)，可溶 性硫酸肝素利用TLR4激活樹突狀細胞。硫酸肝素是一種酸性多糖，位于細胞膜和細胞外 基質(zhì)。硫酸肝素的降解產(chǎn)物，即低分子量硫酸肝素，能夠活化樹突狀細胞。目前，低分子量 硫酸乙酰肝素被認為是一種新型抗血栓和抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物，具有很強的抗血栓和抗腫瘤活 性，調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化等作用，無明顯毒副作用。研究結(jié)果表明，低分 子量硫酸乙酰肝素與乙肝表面抗原混合后，經(jīng)鼻腔、肌肉及皮下注射3種途徑免疫小鼠，既 能有效增強特異性體液免疫應(yīng)答，又能顯著誘導(dǎo)CTL細胞免疫效應(yīng)，是一種優(yōu)于鋁佐劑的 潛在人用疫苗佐劑（中國生物制品學(xué)雜志，2011，24 :5-9)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的之一是克服現(xiàn)有的注射接種疫苗的缺點，提供一種適合于經(jīng)皮免疫 的自溶性微針疫苗透皮貼片，從而實現(xiàn)順應(yīng)性好、方便、高效、安全的疫苗遞送。
[0009] 本發(fā)明的目的之二是提供一種自溶性微針疫苗透皮貼片的制備方法。
[0010] 本發(fā)明是將內(nèi)源性的寡聚透明質(zhì)酸和/或低分子量的硫酸乙酰肝素同時作為自 溶性微針透皮貼片中的微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑，不用添加外源性佐劑來增強抗原的免疫 原性，解決了現(xiàn)有經(jīng)皮免疫技術(shù)難以誘導(dǎo)Thl型細胞免疫的問題。
[0011] 本發(fā)明的自溶性微針透皮貼片是由微針基質(zhì)材料、疫苗、疫苗佐劑和疫苗保護劑 構(gòu)成，其中，所述的微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑均為寡聚透明質(zhì)酸、低分子量的硫酸乙酰肝素 或其組合。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，其中，疫苗在所述的自溶性微針透皮貼片中所占的 百分含量為總重量的0.001%~10%，疫苗保護劑在所述的自溶性微針透皮貼片中所占的 百分含量為總重量的0. 01 %~30%，微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑在所述的自溶性微針透皮 貼片中所占的百分含量為總重量的60%~99. 98%。優(yōu)選地，疫苗在所述的自溶性微針透 皮貼片中所占的百分含量為總重量的〇. 01 %~1 %，疫苗保護劑在所述的自溶性微針透皮 貼片中所占的百分含量為總重量的〇. 1%~20%，微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑在所述的自溶 性微針透皮貼片中所占的百分含量為總重量的80%~99. 8%。
[0013] 所述的疫苗保護劑選自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚 糖、糊精、人血清白蛋白、明膠、精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、 賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-絡(luò)氨酸、苯丙氨酸中的至少一種。優(yōu)選地，所述的疫苗保護劑選 自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精中的至少一種。進一步優(yōu) 選地，所述的疫苗保護劑選自蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精中的至少一種。
[0014] 本發(fā)明的自溶性微針透皮貼片中的寡聚透明質(zhì)酸和/或低分子量的硫酸乙酰肝 素同時作為微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑使用。與分子量較大的透明質(zhì)酸和硫酸乙酰肝素相 t匕，分子量小于10, 〇〇〇的寡聚透明質(zhì)酸和分子量小于10, 〇〇〇的低分子量的硫酸乙酰肝素 具有更好的佐劑作用，因此本發(fā)明中采用重均分子量在10, 〇〇〇以內(nèi)的寡聚透明質(zhì)酸和重 均分子量在10, 〇〇〇以內(nèi)的低分子量的硫酸乙酰肝素。作為微針基質(zhì)材料而言，寡聚透明質(zhì) 酸和低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量越小，制得的微針硬度越強；重均分子量越大， 微針的機械強度及韌性越強。因此寡聚透明質(zhì)酸和低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量 越小，用于刺入皮膚的微針越硬，越容易刺入皮膚，但是機械強度也隨之降低，保存及刺入 皮膚時容易折斷。由此，本發(fā)明優(yōu)選使用的是寡聚透明質(zhì)酸的重均分子量的范圍是5000〈 重均分子量〈10, 〇〇〇,低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量的范圍是4000〈重均分子量 <10,000〇
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述的自溶性微針透皮貼片的規(guī)格為每平方厘米含 有16~484根微針，微針的高度在150~1000微米之間，針尖的直徑在100納米~20微 米之間，微針的最大截面的錐角是20~60度。優(yōu)選地，所述的自溶性微針透皮貼片的規(guī)格 為每平方厘米含有36~256根微針，微針的高度為300~800微米，針尖的直徑為500納 米~10微米，微針的最大截面的錐角是30~50度