專(zhuān)利名稱：具有與之融合的肽蛋白酶抑制劑的蛋白酶及其變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于多種洗滌組合物中的新型蛋白酶/蛋白酶抑制劑融合蛋白，所述組合物，及其生產(chǎn)方法。所述融合蛋白有利于改善目的蛋白酶的產(chǎn)量，控制抑制劑/蛋白酶的化學(xué)計(jì)量，生產(chǎn)更穩(wěn)定的蛋白酶，并進(jìn)而生產(chǎn)出更穩(wěn)定的制劑，同時(shí)，可在洗滌過(guò)程中提供活性蛋白酶。
背景技術(shù)：
酶構(gòu)成了天然存在的蛋白的最大一類(lèi)。每一種通常都能催化(即能夠加速一種反應(yīng)而又不會(huì)被消耗)一種不同類(lèi)型的化學(xué)反應(yīng)。一種被稱為蛋白酶的酶，因其具有能將一種化合物水解(即分解)成兩種或兩種以上較簡(jiǎn)單化合物而廣為人知。通過(guò)將天然存在的蛋白酶和蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)的蛋白酶作為添加劑加入洗衣洗滌制劑中而使上述水解蛋白的能力得到利用。盡管采用了各種酶，但很多衣物上的污漬是蛋白類(lèi)的，而且，廣特異性蛋白酶可顯著改善對(duì)此類(lèi)污漬的清除能力。
上述蛋白酶源于生物來(lái)源，其結(jié)果是，必須將其與其所存在的生物環(huán)境分離。
一種肽或蛋白的氨基酸序列，決定著該肽或蛋白的特性。例如，根據(jù)其在氨基酸序列上的位置和變化的性質(zhì)，甚至一個(gè)氨基酸的改變就能使一種酶失活。已做過(guò)改變蛋白酶的野生氨基酸序列以改進(jìn)其性能的嘗試。
蛋白酶特性變得顯著的一種場(chǎng)合是在用于洗滌組合物中時(shí)。例如，如果一種洗滌組合物(例如，洗衣洗滌劑)中含有多種酶的話，可以獲得更大的洗滌能力，所述酶為蛋白酶、脂酶、淀粉酶、過(guò)氧化物酶、和/或纖維素酶。所述含有蛋白酶的洗滌組合物的一個(gè)問(wèn)題是，存在于該組合物中的蛋白酶在貯存期間會(huì)降解其它酶，甚至是降解蛋白酶自身。
洗滌組合物中的蛋白酶抑制劑酶被洗滌組合物中的蛋白酶降解的問(wèn)題通過(guò)幾種方法得以解決，其中包括將蛋白酶抑制劑用于該組合物中。有時(shí)，在加工組合物的過(guò)程中，或在加工蛋白酶的過(guò)程中加入可逆蛋白酶抑制劑，以阻止與貯存相關(guān)的降解。不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，有必要提供一種抑制劑，該抑制劑能在貯存組合物期間抑制蛋白酶，但又能使蛋白酶在洗滌環(huán)境下具有活性。
例如，含有蛋白酶抑制劑的含蛋白酶洗滌組合物披露于以下文獻(xiàn)中于1986年1月28日授予Bruno等的US4,566,985(含有苯甲酰胺氫鹵化物的液體洗滌組合物)；由Cardinali等于1990年7月4日公開(kāi)的歐洲專(zhuān)利公開(kāi)No.376,705(使用低級(jí)脂肪醇和低級(jí)羧酸鹽以及主要為非離子型的表面活性劑系統(tǒng))；由Aronson等于1990年8月8日公開(kāi)的歐洲專(zhuān)利公開(kāi)No.381,262(使用能夠反應(yīng)的多元醇和硼化合物的混合物)；1992年10月30日公開(kāi)的WO92/19707(含取代偏硼酸的液體洗滌劑)于1990年3月13日授予Hessel等的美國(guó)專(zhuān)利US4,908,150；于1990年11月14日公開(kāi)的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)流水號(hào)90/870212；于1993年1月12日授予Estell的US5,178,789(使用一種能與酶結(jié)合的抑制劑的液體洗滌劑，例如，用火雞卵粘蛋白作為可逆抑制劑，在有枯草蛋白酶的條件下穩(wěn)定酶)；Feder和Kochavi(FR2084751)披露了一種可逆堿性蛋白酶抑制劑，據(jù)說(shuō)可以穩(wěn)定存在于洗滌劑中的第二種酶；于1991年8月13日授予Estell的US5,039,446(使用具有一定解離常數(shù)的抑制劑的液體洗滌劑)；和Panandiker等(US5,422,030)披露了一種用于在洗衣洗滌劑中穩(wěn)定酶的芳族硼酸酯。
蛋白類(lèi)蛋白酶抑制劑蛋白類(lèi)蛋白酶抑制劑通常為長(zhǎng)肽(通常超過(guò)28個(gè)氨基酸)，它與蛋白酶的活性位點(diǎn)結(jié)合并抑制其活性?？筛鶕?jù)一級(jí)氨基酸序列同源性(Laskowski,M.,Jr,和I.Kato，“蛋白酶的蛋白抑制劑”，生物化學(xué)年度綜述(1980)49:593-626)將所述抑制劑分成幾個(gè)家族(家族Ⅰ至Ⅸ)。其中，所述抑制劑包括通常被稱作家族Ⅵ的抑制劑，這類(lèi)抑制劑包括水蛭蛋白酶抑制劑和大麥胰凝胰乳蛋白酶抑制劑，還包括家族Ⅲ抑制劑，如鏈霉菌屬枯草蛋白酶抑制劑(SSI)和漿鏈絲菌素。
例如，Mikkelsen在WO92/03529(Novo Nordisk)中披露了蛋白類(lèi)蛋白酶抑制劑，包括SSI和大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑，這些抑制劑在Mikkelsen’s制劑中被說(shuō)成能穩(wěn)定脂酶和纖維素酶，能在室溫下進(jìn)行數(shù)日的蛋白分解作用。不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，正如Mikkelsen所說(shuō)，很多天然抑制劑都具有這樣的對(duì)蛋白酶的高親和性，以至于受抑制的復(fù)合體在被稀釋于洗衣機(jī)中時(shí)不能解離。據(jù)Mikkelsen披露，改變家族Ⅵ抑制劑(據(jù)說(shuō)該抑制劑為脯氨酸的低級(jí)抑制劑)的P4-P3′位置可降低其對(duì)所述蛋白酶的親和力，但未提供支持這一說(shuō)法的數(shù)據(jù)。
Halkier等在WO93/20175(Novo Nordisk)中披露了家族Ⅵ抑制劑，該抑制劑使用位于P1和P4位置上的脯氨酸和位于P2和P3位置上的氨基酸殘基。據(jù)說(shuō)這種變化可降低對(duì)蛋白酶的親和力，這是因?yàn)楦淖兞嗽撘种苿┲械纳鲜霭被?。提供了多種此類(lèi)變體的Kd值。
另一個(gè)例子是，Nielsen等(WO93/17086)披露了改變家族Ⅲ抑制劑的P6-P3′位置，包括P1位上的脯氨酸，據(jù)說(shuō)可降低該抑制劑對(duì)蛋白酶的親和力。Nielsen還大體上披露了以下枯草蛋白酶抑制劑；Novo,Carlsberg,BPN′,309,147和168。未披露氨基酸序列改變與抑制作用的關(guān)系的細(xì)節(jié)。
蛋白酶生產(chǎn)包括用于洗滌組合物中的蛋白酶的蛋白酶生產(chǎn)，提出了其自身的特殊問(wèn)題。例如，蛋白酶生產(chǎn)會(huì)受到在發(fā)酵或純化過(guò)程中自身蛋白分解作用的局限。
向洗滌組合物、發(fā)酵液或純化混合物中添加蛋白酶抑制劑需要購(gòu)買(mǎi)并添加過(guò)量的抑制劑，其加入的時(shí)機(jī)通常是在生產(chǎn)過(guò)程中蛋白酶的水解作用已經(jīng)發(fā)生的時(shí)刻。
作為在發(fā)酵步驟中添加的一個(gè)例子，由Nagase & Co.申請(qǐng)的
公開(kāi)日為1971年12月30日的德國(guó)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)2,131,451中披露了一種生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法。據(jù)說(shuō)，該方法需要加入0.1-12％的水溶性硼酸鹽作為抑制劑。據(jù)說(shuō)，這些硼酸鹽可增強(qiáng)其過(guò)濾活性，并因此提高酶的產(chǎn)量。不過(guò)，已認(rèn)識(shí)到在特定的水平上，硼酸鹽實(shí)際上能降低酶的產(chǎn)量。
作為在發(fā)酵步驟添加的另一個(gè)例子，
公開(kāi)日為1989年11月30日的日本專(zhuān)利公開(kāi)J01-296987，披露了一種方法，該方法包括在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生蛋白酶的微生物，所述培養(yǎng)基中含有一種對(duì)蛋白酶具有親和性的物質(zhì)。
最后，在由Novo Nordisk A/S于1993年7月8日公開(kāi)的WO93/13125中，Joergensen等披露了一種在液體生產(chǎn)介質(zhì)中生產(chǎn)“易失活蛋白”的方法，該方法是這樣實(shí)現(xiàn)的在所述生產(chǎn)階段“連續(xù)并可逆地保護(hù)”所述蛋白免于失活，然后將該蛋白脫保護(hù)，并回收蛋白制品。據(jù)說(shuō)，所用的抑制劑是SSI和水蛭蛋白酶抑制劑。據(jù)說(shuō)，該方法可用于通過(guò)使蛋白可逆地失活而提高該蛋白的產(chǎn)量。
上述方法可能需要添加昂貴、無(wú)效的外源材料，需要做進(jìn)一步的處理，并使得該方法難以控制。其相關(guān)技術(shù)未強(qiáng)調(diào)抑制活體內(nèi)蛋白酶的必要性。
最近，本領(lǐng)域披露了活體內(nèi)生產(chǎn)抑制劑和蛋白酶的必要性，但在本領(lǐng)域中尚未出現(xiàn)此類(lèi)方法的實(shí)例。存在著若干與活體內(nèi)生產(chǎn)抑制劑和蛋白酶相關(guān)的缺陷。例如，在抑制劑的表達(dá)是受與蛋白酶表達(dá)相同的控制因子控制的情況下，會(huì)偶然發(fā)生蛋白酶和抑制劑的表達(dá)處于相同水平的現(xiàn)象，不過(guò)，這種現(xiàn)象是不可預(yù)測(cè)的。本領(lǐng)域證實(shí)了這樣的認(rèn)識(shí)，即使某種方法在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上是成功的，大規(guī)模生產(chǎn)(例如用于商業(yè)用途)并不一定可行。首先，控制因子的表達(dá)(因?yàn)樗鼈兙哂邢嗤腄NA序列)會(huì)發(fā)生重組，特別是當(dāng)有關(guān)基因是由質(zhì)粒攜帶時(shí)更是如此，會(huì)使所述基因中的一個(gè)缺失，改變其凈化學(xué)計(jì)量。其次，一個(gè)基因相對(duì)其它基因的位置可能使得一個(gè)基因比其它基因更便于表達(dá)。第三，基因、蛋白酶或抑制劑上的特定核苷酸序列可以“加速或減緩”這些基因的翻譯，影響表達(dá)水平的差異。第四，兩個(gè)不同(而且可能是競(jìng)爭(zhēng)性)的基因的高水平表達(dá)會(huì)造成其它問(wèn)題需要大量的兩種不同轉(zhuǎn)錄物，每一種轉(zhuǎn)錄物需要其自身的成套正調(diào)節(jié)蛋白，如RNA聚合酶和∑因子。另外，在很多系統(tǒng)中，兩種蛋白的每一種必須通過(guò)細(xì)胞分泌器以高水平分泌。因此，由于上述原因，該方法相當(dāng)不可預(yù)料。
如果能夠在原位獲得天然抑制劑，則可實(shí)現(xiàn)費(fèi)用的節(jié)約和產(chǎn)量的提高。如果這種蛋白酶生產(chǎn)生物可以在產(chǎn)生蛋白酶的同時(shí)產(chǎn)生適量(從化學(xué)計(jì)量上講)的抑制劑，自身蛋白分解作用就可以減弱或消除。
業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明方法從化學(xué)計(jì)量上講能同時(shí)生產(chǎn)蛋白酶和抑制劑，因此克服了本領(lǐng)域中所存在的上述問(wèn)題。
本發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供制備含有蛋白酶的組合物的改進(jìn)方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)蛋白酶的方法，該方法能以較高產(chǎn)量和/或較高純度和/或更便于純化和/或更穩(wěn)定的組合物蛋白酶制劑進(jìn)行生產(chǎn)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在活體內(nèi)，以及在組合物的生產(chǎn)、包裝和/或貯存過(guò)程中控制蛋白酶蛋白酶抑制劑的化學(xué)計(jì)量的方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的是生產(chǎn)一種蛋白酶生產(chǎn)生物，該生物可在產(chǎn)生蛋白酶的同時(shí)，產(chǎn)生適量(化學(xué)計(jì)量)的抑制劑，從而減弱或消除自身蛋白水解作用。
另一個(gè)目的是生產(chǎn)在活體內(nèi)就已被蛋白酶抑制劑穩(wěn)定了的蛋白酶，這一穩(wěn)定過(guò)程優(yōu)選在翻譯之后盡早進(jìn)行。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供表達(dá)系統(tǒng)和基因，該表達(dá)系統(tǒng)和基因可降低質(zhì)?；虮磉_(dá)系統(tǒng)發(fā)生重組或去穩(wěn)定的可能性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供融合蛋白，該蛋白可避免以高于其它蛋白的速率表達(dá)的抑制劑或蛋白酶的諸多缺陷。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是在活體內(nèi)以一種蛋白形式提供蛋白酶和蛋白酶抑制劑，其中，該蛋白酶在洗滌過(guò)程中變得有活性。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供可用于包括液體和顆粒洗衣洗滌劑和洗滌添加劑在內(nèi)的液體和固體洗滌組合物中的融合蛋白。
通過(guò)以下說(shuō)明可以更好地理解本發(fā)明的上述及其它目的。
概述本發(fā)明涉及融合蛋白，該融合蛋白的第一部分為一種蛋白酶，優(yōu)選為枯草蛋白酶，更優(yōu)選為Alcalase、Esperase、SavinaseMaxatase、Maxacal和Maxapem 15、BPN、BPN′和/或其變體；第二部分為一種蛋白類(lèi)酶抑制劑，優(yōu)選為SSI、水蛭蛋白酶抑制劑、火雞卵粘蛋白、CMTI、和/或其變體，更優(yōu)選為一種對(duì)所述蛋白酶部分專(zhuān)一的抑制劑；以及選擇性的第三部分為介于所述蛋白酶和抑制劑之間的肽接頭。
本發(fā)明還涉及編碼所述融合蛋白的基因，含有這些基因和/或融合蛋白的細(xì)胞，以及生產(chǎn)上述基因、融合蛋白、和/或含有該融合蛋白和/或基因的方法。
本發(fā)明還涉及含有上述融合蛋白和/或其變體的組合物，優(yōu)選為洗滌組合物。
說(shuō)明所述新型蛋白酶/抑制劑融合蛋白含有兩種具有商業(yè)價(jià)值的蛋白。這種融合蛋白可減弱或避免通常與蛋白酶和抑制蛋白的雙重表達(dá)相關(guān)的一切無(wú)法預(yù)料的化學(xué)計(jì)量。
本發(fā)明可使用多種細(xì)菌蛋白酶中的任一種，包括源于芽胞桿菌的蛋白酶。后者包括Savinase、枯草蛋白酶BPN′、Alcalase及其衍生物，以及多種抑制劑中的任一種，包括SSI及其它鏈霉菌屬枯草蛋白酶抑制劑、水蛭蛋白酶抑制劑、大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑、及其變體。
本發(fā)明還可采用多種宿主中的任一種，包括原核和真核微生物，以及植物；例如，其它芽胞桿菌，釀酒酵母(Saccharomyces cereviseae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉屬；和植物，如大麥、蕃茄、馬鈴薯、大豆、苜蓿、煙草、玉米或其它。優(yōu)選地，使所述基因表達(dá)因子適合所述宿主作最大的表達(dá)，這屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)范圍。術(shù)語(yǔ)定義在本文中，“洗滌方法”或“洗滌”是指用于清洗物品或表面等的方法或過(guò)程。因此，在自動(dòng)洗衣機(jī)中洗滌衣物是一種洗滌方法；將洗滌組合物稀釋于桶中、并用拖把、海綿或抹布清洗表面是一種洗滌方法；人們洗手是一種洗滌方法；將衣物浸泡在裝有洗滌組合物和水的洗滌盆中是一種洗滌方法；將洗滌組合物放入便池中，并在隨后沖洗廁所是一種洗滌方法；以上所列是示例性的，而不是窮舉。讀者可以設(shè)想出很多種其它洗滌方法。
在本文中，“化學(xué)計(jì)量”是指摩爾比。該比例可以為1∶1(等摩爾)、2∶1、3∶2、1∶3或以摩爾比表示的任何其它比例。因此，預(yù)計(jì)一種“化學(xué)計(jì)量”的融合蛋白具有固定的抑制劑與蛋白的摩爾比，而無(wú)論這一比例的數(shù)值如何。
在本文中，“基因”、“載體”、“質(zhì)?！?、“基因組”、或“染色體”具有本領(lǐng)域公認(rèn)的含義。不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，有關(guān)如何使用采用了質(zhì)粒等的表達(dá)系統(tǒng)的介紹，就足以教會(huì)本領(lǐng)域技術(shù)人員如何使用其它系統(tǒng)，無(wú)論該系統(tǒng)是基于基因組的、質(zhì)粒的等，無(wú)論其被用于原核生物或真核生物，也無(wú)論該異源宿主是細(xì)菌、真菌，植物等。
在本文中，“變體”是指氨基酸序列不同于其野生型的酶。
在本文中，“基因”是指編碼一種特定蛋白或融合蛋白的基因。
在本文中，“融合蛋白”一詞具有本領(lǐng)域公認(rèn)的含義，即兩種蛋白作為一個(gè)氨基酸鏈表達(dá)，通常受一個(gè)調(diào)控因子控制。例如，在過(guò)去若干年里，融合蛋白已被用于多種目的(Sambrook,J.,E.F.Fritsch,和TManiatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，1989，冷泉港出版社)。目前，可以購(gòu)買(mǎi)到用于融合技術(shù)的表達(dá)載體，以生產(chǎn)感興趣的蛋白(參見(jiàn)Sigma產(chǎn)品目錄，Sigma-Aldrich公司，芝加哥，Ⅲ，1996)。
融合蛋白可以避免一種蛋白比另一種蛋白更多地表達(dá)的一切缺陷或使這一缺陷盡量減少。融合蛋白使得菌株能夠同時(shí)合成特別選擇的摩爾量的蛋白酶和抑制劑。例如，可以構(gòu)建所述融合蛋白，以得到等摩爾量的蛋白酶和抑制劑，或兩倍于蛋白酶摩爾量的抑制劑等。因此，有可能在盡可能早的時(shí)候最大限度地保護(hù)蛋白酶不發(fā)生自我水解作用，即在體內(nèi)翻譯之后馬上進(jìn)行。
另外，還預(yù)計(jì)除所述融合蛋白之外還可用相同細(xì)胞生產(chǎn)其它蛋白酶和/或蛋白酶抑制劑，其編碼基因或位于與融合蛋白基因相同的質(zhì)粒上，或位于同時(shí)存在于所述細(xì)胞中的不同質(zhì)粒上，或位于質(zhì)粒上而所述融合蛋白基因是染色體基因，或?yàn)樗黾?xì)胞染色體的一部分。另外，人們可以生產(chǎn)出一種蛋白酶，該蛋白酶具有對(duì)另一種蛋白酶專(zhuān)一的抑制劑，或一種蛋白酶，該蛋白酶具有對(duì)融合蛋白中的蛋白酶專(zhuān)一的抑制劑。該融合蛋白可以含有一個(gè)或幾個(gè)相同和不同的蛋白酶部分，并可以含有一個(gè)或幾個(gè)相同或不同的抑制劑部分，只要該融合蛋白至少含有一個(gè)蛋白酶部分和至少一個(gè)抑制劑部分即可。
本文中所提供的所有百分比均為重量百分比，所有測(cè)定均在25℃下進(jìn)行，除非另有說(shuō)明。所引用的一切文獻(xiàn)都以其整體形式收作本文的參考文獻(xiàn)。蛋白酶通過(guò)本發(fā)明方法制備的蛋白酶可以源于動(dòng)物、植物或微生物。其來(lái)源并不特別重要其活性是最重要的。已知的絲氨酸蛋白酶通常被歸類(lèi)為枯草蛋白酶家族和胰蛋白酶家族，而胰蛋白酶家族包括諸如胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。用于生產(chǎn)上述每一種酶的蛋白酶抑制劑可以進(jìn)行選擇，以適應(yīng)所生產(chǎn)的每一種酶的類(lèi)型。無(wú)論上述蛋白酶的來(lái)源如何，均可通過(guò)在異源宿主中表達(dá)進(jìn)行制備。所述宿主可以是動(dòng)物、植物、微生物；優(yōu)選為植物或微生物，更優(yōu)選為微生物。
優(yōu)選已知的絲氨酸蛋白酶。特別優(yōu)選獲自枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)和/或地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)的細(xì)菌絲氨酸蛋白酶。
上述優(yōu)選蛋白酶的非限定性例子包括Novo Industriews A/S的Alcalase、Esperase、Savinase(哥本哈根，丹麥)，GCI的Maxatase、Maxacal和Maxpem 15(蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)的Maxacal(Delft，荷蘭)，和由Sigma化學(xué)公司出售的枯草蛋白酶BPN和BPN′。優(yōu)選蛋白酶還有修飾過(guò)的細(xì)菌絲氨酸蛋白酶，如由Genencor國(guó)際公司(南舊金山，加利弗尼亞)生產(chǎn)的蛋白酶，該蛋白酶披露于
公開(kāi)日為1988年1月7日的由Wells等發(fā)明的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)251,446中，該蛋白酶在本文中被稱為“蛋白酶B”；于1991年7月9日授予Venegas的美國(guó)專(zhuān)利US5,030,378，涉及一種修飾過(guò)的細(xì)菌絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶在本文中被稱作“蛋白酶A”；以及披露于被收作本文參考文獻(xiàn)的
公開(kāi)日為1995年4月20日的WO95/10615中的蛋白酶。優(yōu)選蛋白酶選自下列一組Savinase、Maxacal、Alcalase、BPN′、蛋白酶A和蛋白酶B、披露于WO95/10615(同上)中的蛋白酶，及其混合物。這些蛋白及其基因序列在本領(lǐng)域中是公知的。例如，枯草蛋白酶Carlsberg的氨基酸序列由Smith,E.L.,Delange,R.J Evans,W.H.Landon,M.,和Markland,F.S.，進(jìn)一步披露于生物與化學(xué)雜志第243卷，pp.2184-2191(1968)，該文被收作本文的參考文獻(xiàn)。
因此，本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案涉及包括作為其第一部分的枯草蛋白酶的融合蛋白，包括通過(guò)使編碼該酶的各種核苷酸序列突變，由此改變?cè)撁傅陌被嵝蛄卸揎椷^(guò)的酶。本發(fā)明的修飾過(guò)的枯草蛋白酶(以下稱“枯草蛋白酶變體”)與野生型枯草蛋白酶相比具有改進(jìn)的特性。蛋白酶抑制劑本文所采用的“肽蛋白酶抑制劑”一詞，是指一切能在體內(nèi)與蛋白酶融合的該蛋白酶的蛋白水解活性的多肽或蛋白可逆抑制劑。通常，這樣的抑制劑具有25個(gè)以上的氨基酸，因此，其長(zhǎng)度足以使其本身被稱為蛋白。
優(yōu)選地，該抑制劑部分能抵御其相關(guān)蛋白酶的水解作用。
令人驚奇的是，將Ki值小于大約1×10-4的蛋白酶抑制劑與蛋白酶融合可改善蛋白酶部分的特性并改進(jìn)其生產(chǎn)工藝。以這種方式實(shí)現(xiàn)的蛋白酶和抑制劑的“共生產(chǎn)”，還使得融合蛋白生產(chǎn)生物所產(chǎn)生的蛋白酶或許對(duì)細(xì)胞有較小的毒性。并非囿于任何理論，看起來(lái)所述“共生產(chǎn)的”抑制劑限制了蛋白酶的自發(fā)水解作用(即自我破壞)，和/或可能還限制了蛋白酶對(duì)生物的破壞和/或其它破壞性作用。
優(yōu)選Ki小于大約1×10-4M的抑制劑，所述Ki值優(yōu)選小于大約1×10-5M，最優(yōu)選小于大約1×10-6M。Ki值是用已知方法測(cè)定的。例如，蛋白酶枯草蛋白酶BPN′的潛在抑制劑是基于其抑制琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe對(duì)硝基苯胺水解作用的能力進(jìn)行評(píng)估的，如DelMar在介紹一種類(lèi)似于枯草蛋白酶BPN′的蛋白酶胰凝乳蛋白酶時(shí)所披露的[DelMar等，分析生物化學(xué)，(1979)99,316-320]。用A.Goldstein所披露的方法(普通生理學(xué)雜志，27:529-580(1944)，“酶-抑制劑-底物反應(yīng)機(jī)理”)分析服從于Michaelis Menten條件的速率，以測(cè)定Ki值。
本文所采用的“可逆抑制劑”一詞是指能與蛋白酶分離，以恢復(fù)其蛋白水解活性的蛋白酶抑制劑，包括(但不限于)競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性和無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如Mahler等在“生物化學(xué)”，第二版(由Harper & Row于1971年出版)，第295-299頁(yè)中所披露的，該書(shū)被收作本文的參考文獻(xiàn)。
根據(jù)所選擇的蛋白酶，可以用已知方法選擇蛋白酶抑制劑?，F(xiàn)有的蛋白酶可以劃分為絲氨酸、羧基、半胱氨酸和金屬蛋白酶。對(duì)以上類(lèi)型還可以細(xì)分。例如，絲氨酸蛋白包括胰蛋白酶、枯草蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和“彈性蛋白酶類(lèi)”蛋白酶。用于生產(chǎn)上述每一種酶的蛋白酶抑制劑可以選擇，以適應(yīng)所生產(chǎn)的每一種酶。
由于枯草蛋白酶和枯草蛋白酶突變型是優(yōu)選的蛋白酶，優(yōu)選的抑制劑可抑制在上文所披露的優(yōu)選范圍內(nèi)的蛋白酶。因此，更優(yōu)選的酶抑制劑包括卵粘蛋白、水蛭蛋白酶抑制劑和SSI等。優(yōu)選的抑制劑披露于以下參考文獻(xiàn)中，這些文獻(xiàn)均被收作參考文獻(xiàn)S.Obata,S.Taguchi,I.Kumagai，和K.Miura，“編碼鏈霉菌屬枯草蛋白酶抑制劑(SSI)的基因的分子克隆和核苷酸序列測(cè)定”，生物化學(xué)雜志，105:367-371(1989)；H.Rink,M.Liersch,P.Sieber，和F.Meyer，“來(lái)自Leech醫(yī)用水蛭的編碼蛋白酶抑制劑水蛭蛋白酶抑制劑C的基因的DNA合成大片段方法，及其在大腸桿菌中的表達(dá)”，核酸研究，12:6369-6387(1984)，M.W.Empie和M.Laskowski,Jr.，在禽卵粘蛋白第三結(jié)構(gòu)域中的單殘基取代的熱動(dòng)態(tài)及動(dòng)力學(xué)對(duì)抑制劑與絲氨酸蛋白酶相互作用的影響“，生物化學(xué)，21:2274-2284(1982)。
不過(guò)，其它蛋白酶抑制劑也是公知的，并可以用已知能與蛋白酶結(jié)合的較短片段方便地進(jìn)行制備。這些片段可與適當(dāng)長(zhǎng)的選擇性接頭結(jié)合，以便將所述抑制劑定位于所述蛋白酶的活性位點(diǎn)上。如果使用短的肽抑制劑，所述融合蛋白可以含有其重復(fù)單位，或者在該融合蛋白上可以存在一個(gè)或幾個(gè)相同或不同的蛋白肽抑制劑。
因此，另有以下抑制劑可用于本發(fā)明中由29個(gè)氨基酸組成的南瓜胰蛋白酶抑制劑CMTⅠⅠ，該抑制劑是胰蛋白酶和枯草蛋白酶的抑制劑(J.Otlewski,T.Zbyryt,I.Krokoszynska,和T.Wilusz，“用南瓜抑制劑抑制絲氨酸蛋白酶”，生物化學(xué)，Hoppe-Seyler,371:589-594(1990))?？梢允褂肅MTⅠ及其它這樣的抑制劑，或?qū)ζ浼右愿倪M(jìn)，以產(chǎn)生蛋白酶專(zhuān)一性(J.Rozyoki,G.Kupryszewski,K.Roika,URagnarsson,T.Zbyryt,I.Krokoszynska和T.Wilusz，“具有彈性蛋白酶抑制活性的筍瓜胰蛋白酶抑制劑Ⅲ(CTMⅠ-Ⅲ)類(lèi)似物”，生物化學(xué)，Hoppe-Seyler,375:289-291(1994))。位于抑制劑和蛋白酶之間的選擇性連接肽另外，優(yōu)選通過(guò)一個(gè)可水解的連接氨基酸鏈將抑制劑連接在蛋白酶上，由該氨基酸鏈將蛋白酶和抑制劑分開(kāi)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)位于蛋白酶和抑制劑之間的接頭序列，以實(shí)現(xiàn)多種不同目的。例如，可以把氨基酸殘基設(shè)計(jì)成蛋白水解的良好底物；還可將其氨基酸序列設(shè)計(jì)成有利于蛋白酶和抑制劑的翻譯后分離，或優(yōu)化抑制劑相對(duì)蛋白酶的結(jié)合或活性位點(diǎn)的位置。
優(yōu)選的是，上述選擇性連接肽的長(zhǎng)度可達(dá)20個(gè)氨基酸。優(yōu)選該連接肽部分易于為蛋白酶裂解。
進(jìn)行表達(dá)的方法本發(fā)明使用蛋白融合技術(shù)，以便在化學(xué)計(jì)量水平上共生產(chǎn)蛋白酶和抑制劑。用一組基因表達(dá)信號(hào)來(lái)指導(dǎo)融合基因的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)由蛋白酶和抑制劑組成的融合蛋白的翻譯。
本發(fā)明還涉及編碼所述融合蛋白的基因。優(yōu)選地，該融合蛋白基因具有不同的遺傳因子，這些因子具有同源重組的能力。與現(xiàn)有技術(shù)不同的是，本發(fā)明可能希望在相同的遺傳控制下共生產(chǎn)兩種蛋白(蛋白酶和抑制劑)，由此避免了額外的控制因子，這樣有更多的機(jī)會(huì)使抑制劑和蛋白酶的產(chǎn)量不同，并可導(dǎo)致基因組、質(zhì)粒或載體的重組。
編碼所述蛋白酶和抑制劑的基因可以是天然產(chǎn)生的，也可以通過(guò)合成方法獲得。舉例來(lái)說(shuō)，只要有一小段基因序列，人們就可以用PCR方法定位并克隆表達(dá)所述蛋白的基因。另外，由克隆或其部分制備大基因的方法是已知的。在本文中，在用“小”和“大”表達(dá)DNA序列或基因的長(zhǎng)度時(shí)，是指可靠制備所述序列或基因的難度。因此，“小”序列可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可靠地制備，不出誤差。通常，“小”基因是用PCR方法制備的用不了幾個(gè)不同的步驟即可可靠地拷貝出整個(gè)基因。不過(guò)，“大”序列或基因不能用簡(jiǎn)單的方法可靠地制備出來(lái)，而通常需要PCR和連接幾個(gè)基因片段，因?yàn)椴豢赡苡靡粋€(gè)PCR步驟進(jìn)行可靠地制備。
一個(gè)載體、質(zhì)粒、染色體或基因組可以含有一個(gè)以上的融合蛋白基因；它還可以在所述融合蛋白區(qū)以外含有一個(gè)或幾個(gè)其它的蛋白酶或抑制劑基因。它可以含有一種融合蛋白和一種蛋白酶，或一種融合蛋白和一種蛋白類(lèi)抑制劑。優(yōu)選地，它含有一種融合蛋白和一種蛋白類(lèi)抑制劑。
對(duì)完整基因或其一部分進(jìn)行誘變的方法在本領(lǐng)域中也是公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易得到若干介紹誘變方法的參考文獻(xiàn)。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，特別重要的是調(diào)節(jié)有關(guān)融合蛋白的基因表達(dá)。例如，人們可以通過(guò)遺傳工程方法生產(chǎn)出一種微生物，使其含有每一種蛋白的全套基因，包括基因調(diào)控序列。這些基因調(diào)控序列源于感興趣的蛋白酶和抑制劑基因或源于其它基因。
優(yōu)選地，表達(dá)的調(diào)控是由同一基因的調(diào)控因子執(zhí)行的，以指導(dǎo)整個(gè)基因的表達(dá)。用一套基因表達(dá)信號(hào)指導(dǎo)融合基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致由蛋白酶和抑制劑組成的融合蛋白的翻譯。
表達(dá)本發(fā)明的蛋白是通過(guò)已知方法用已知的原材料制備的。例如，用作原材料的很多質(zhì)?？捎缮虡I(yè)途徑獲得。例如，M13、pUC19以及很多其它質(zhì)粒都是可以購(gòu)買(mǎi)到的原材料(參見(jiàn)Sigma產(chǎn)品目錄，Sigma-Aldrich公司，芝加哥，Ⅲ.1996)。另外，技術(shù)人員可以得到用于克隆和PCR方法的手冊(cè)，這使得制備感興趣的基因的工作變得比較容易。
利用諸如Kunkel誘變方法的標(biāo)準(zhǔn)方法可以方便地制備出感興趣的更多的蛋白突變體。進(jìn)行制備/純化的方法本發(fā)明方法包括生產(chǎn)和提取含有蛋白酶/蛋白酶抑制劑的融合蛋白。
優(yōu)選的是，抑制劑部分的Ki值小于大約1×10-4。優(yōu)選能產(chǎn)生含有蛋白酶抑制劑和蛋白酶的融合蛋白的方法。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選的化學(xué)計(jì)量為1∶1至大約3∶1(抑制劑蛋白酶)，優(yōu)選為3∶2至大約3∶1(抑制劑蛋白酶)，更優(yōu)選為大約2∶1(抑制劑蛋白酶)。
用于生產(chǎn)融合蛋白的方法優(yōu)選使用能產(chǎn)生所述融合蛋白的微生物。涉及微生物的生產(chǎn)通常用一種發(fā)酵液來(lái)生長(zhǎng)該微生物，隨后進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)純化步驟，以提取所述蛋白酶/蛋白酶抑制劑?？筛鶕?jù)所用微生物的類(lèi)型和發(fā)酵條件從發(fā)酵液或微生物中獲取融合蛋白。決定使用哪一種提取方法屬于技術(shù)人員的知識(shí)范圍。
優(yōu)選方法利用枯草芽胞桿菌和/或地衣芽胞桿菌細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中發(fā)酵。人們可以選擇性地將蛋白酶抑制劑加入發(fā)酵液中和隨后將蛋白酶抑制劑(從發(fā)酵液中帶來(lái)和/或另行添加)用于酶純化步驟中。不過(guò)，對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施來(lái)說(shuō)，這并不是關(guān)鍵。
本發(fā)明用于生產(chǎn)蛋白酶的方法優(yōu)選包括(a)在發(fā)酵液中生長(zhǎng)一種能表達(dá)蛋白酶/抑制劑融合蛋白的生物；和(b)通過(guò)一個(gè)或幾個(gè)步驟純化所述蛋白酶/抑制劑，以便濃縮在步驟(a)中產(chǎn)生的蛋白酶/抑制劑。
更優(yōu)選的方法所使用的融合蛋白的蛋白酶與抑制劑的“摩爾比”至少約為1∶1。
優(yōu)選方法用枯草芽胞桿菌在步驟(a)的發(fā)酵液中生產(chǎn)蛋白酶/抑制劑。
同樣優(yōu)選的是，用本發(fā)明方法制備出干燥或濃縮液體形式的蛋白酶/抑制劑。實(shí)施例以下實(shí)施例是說(shuō)明性的，其用意不在于限定本發(fā)明，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本說(shuō)明書(shū)、以下的實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)，在不經(jīng)過(guò)多實(shí)驗(yàn)或脫離權(quán)利要求書(shū)的構(gòu)思和范圍的前提下對(duì)蛋白酶、蛋白酶抑制劑和融合蛋白進(jìn)行更換。實(shí)際上，本說(shuō)明書(shū)及以下的實(shí)施例為技術(shù)人員如何利用本發(fā)明提供了指南。
很多已知的原材料被用于這些實(shí)施例中。這些材料中的一些可以由商業(yè)途徑獲得。例如，CJ236和JM101是已知的大腸桿菌菌株，pUB110是已知的質(zhì)粒，而且，Kunkel誘變方法在本領(lǐng)域中也是眾所周知的(例如，參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)。
本發(fā)明的融合蛋白可以通過(guò)表達(dá)系統(tǒng)并通過(guò)各種方法在各種宿主中進(jìn)行制備，這些方法屬于分子生物學(xué)、生物化學(xué)或與生物技術(shù)相關(guān)的其它領(lǐng)域的技術(shù)人員的實(shí)踐范圍。
融合蛋白的制備例1．構(gòu)建合成水蛭蛋白酶抑制劑基因?qū)⑾挛膶⒁榻B的M13mp19的衍生物mPG296用作合成水蛭蛋白酶基因的克隆載體。M13mp19的修飾物mPG296僅僅是一種方便的原材料，預(yù)計(jì)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用M13mp19作為原材料重復(fù)該實(shí)施例。
mPG296是通過(guò)對(duì)M13mp19進(jìn)行寡核苷酸定向誘變而構(gòu)建的，使用的寡核苷酸為5′TAA ACA ACT TTC AAC AGT CTC GAG ACT AGT TTC AGCGGA GTG AGA ATA 3′(序列1)，通過(guò)誘變使mPG296上的編碼成熟噬菌體蛋白pⅢ的第二和第三個(gè)氨基酸殘基的序列之間出現(xiàn)SpeⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)。
水蛭蛋白酶抑制基因是通過(guò)3輪PCR組建的(然后再連接到mPG296DNA上)。首先，用具有以下序列的核苷酸進(jìn)行PCR5′TAC TTC ACT CTG CAT TAC CCG CAG TAC GAC GTT TACTTC CTG CCG GAA GGT TCT CCT GTT ACT CTG GAC CTG CGTTAC 3′(序列2)和5′CAG AGT AAC AGG AGA ACC TTC CGG CAG GAA GTA AACGTC GTA CTG CGG GTA ATG CAG AGT GAA GTA TTC ACG AGC
3′(序列3)。通過(guò)以下過(guò)程進(jìn)行25輪PCR在94℃下變性1分鐘，在45℃下退火1分鐘，在72℃下延伸1分鐘。
將10μl PCR產(chǎn)物用于含有以下兩種寡核苷酸的第二種100μl PCR反應(yīng)液中5′AA TTC ACT GAA TTT GGT TCT GAA CTG AAA TCT TTC CCAGAA GTT GTT GGT AAA ACT GTT GAC CAG GCT CGT GAA 3′(序列4)和5′G ATC CTA ACC AAC ATG CGG AAC ATG GTT AAC AAC GTTAGT ACC TGG GTT GTA GAA AAC ACG AAC ACG GTT GTA ACGCAG GTC 3′(序列5)。這一過(guò)程可將DNA延長(zhǎng)至包括基因5′和3′末端。
由于上述寡核苷酸在其末端不具備完整的限制位點(diǎn)，要用以下寡核苷酸通過(guò)第三輪PCR加入EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)(由此可對(duì)該基因進(jìn)行亞克隆5′GAT TAC GAA TTC ACT GAA TTT GGT TCT GAA 3′(序列6)和5′TCT AGA GGA TCC TAA CCA ACA TGC GGA 3′(序列7)。
用10μg蛋白酶K處理該P(yáng)CR產(chǎn)物，用苯酚/氯仿混合物萃取2次，用10μg酵母tRNA、300mM乙酸鈉(pH6)和2倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀。將該DNA重新懸浮于水中，并用EcoRⅠ和BamHⅠ消化。
用苯酚/氯仿萃取消化產(chǎn)物，乙醇沉淀，并重新懸浮于水中。然后將所得到的DNA連接到經(jīng)適當(dāng)純化的EcoRⅠ、BamHⅠ消化過(guò)的mPG296 DNA上。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)JM101。在平板中含有異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)和X-gal，以區(qū)分藍(lán)色噬斑(Lac+)和透明噬斑(Lac-)。
篩選透明噬斑，尋找含有帶有Hpal位點(diǎn)的插入片段的DNA。發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)陽(yáng)性噬菌體DNA。DNA序列分析證實(shí)了水蛭蛋白酶抑制劑DNA的存在。隨后，將一種這樣的噬菌體稱作mPG1023。
例2．構(gòu)建合成水蛭蛋白酶抑制劑基因的另一種方法作為例1中所述方法的一種替代方案，可以用以下序列代替第二種PCR中的寡核苷酸(序列4、5)5′GAT TAC GAA TTC ACT GAA TTT GGT TCT GAA CTG AAATCT TTC CCA GAA GTT GTT GGT AAA ACT GTT GAC CAG GCTCGT GAA 3′(序列8)和5′TCT AGA GGA TCC TAA CCA ACA TGC GGA ACA TGG TTAACA ACG TTA GTA CCT GGG TTG TAG AAA ACA CGA ACA CGGTTG TAA CGC AGG TC 3′(序列9)該方法可以省略例1所述的第三輪PCR。用類(lèi)似于例1的方法對(duì)這里所說(shuō)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、消化和連接，得到相同的重組噬菌體。
例3．構(gòu)建合成SSI基因同樣用PCR方法構(gòu)建編碼成熟SSI的合成基因。由于SSI基因大于水蛭蛋白酶抑制劑基因，用下列寡核苷酸將該基因克隆在兩個(gè)PCR片段5′TCC GAC GAA TTC GAT GCT CCT TCT GCA CTT TAT GCACCT TCA GCA TTA GTT TTA ACA GTT 3′(序列10)5′CCT GAA AGA GCA GTA ACT CTT ACA TGT GCT CCA GGCCCT TCT GGT ACA CAT CCA GCA GCT 3′(序列11)5′ACC TCC TAC TGC AGC TAA ATC TGC ACA TGC AGA GCCAGC TGC TGG ATG TGT 3′(序列12)5′TAC TGC TCT TTC AGG TGC AGC TGT CGT AGC GCT AACTCC TTT ACC AAC TGT TAA AAC TAA 3′(序列13)5′GAT TTA GCT GCA GTA GGA GGT GAC TTA AAC GCA TTAACA CGT GGT GAA GAC GTT ATG TGT 3′(序列14)5′GTT GAT GGA GTT TGG CAA GGT AAA CGC GTA TCT TATGAA CGT GTA TTT TCA AAT GAA TGT 3′(序列15)5′TGT CCA AAG CTT GGA TCC TTA AAA TGC AAA TAC AGAAGA GCC ATG AGC GTT CAT TTC ACA TTC ATT TGA AAA 3′(序列16)5′CCA AAC TCC ATC AAC AGT CAG TAA TAC AGG ATC ATAAAC CAT TGG ACA CAT AAC GTC TTC 3′(序列17)
在四個(gè)不同的PCRs中，以上寡核苷酸成對(duì)使用序列10與序列13，序列11與序列12，序列14與序列17，和序列15與序列16。
將前兩種PCR產(chǎn)物各10.6μl混合，并用于100μl PCR反應(yīng)體系中。為了獲得足夠量的DNA，準(zhǔn)備8支PCR試管。對(duì)第三和第四個(gè)PCR的PCR產(chǎn)物作類(lèi)似地處理。用蛋白酶K處理該P(yáng)CR產(chǎn)物，用苯酚/氯仿萃取，并用乙醇沉淀。
用EcoRⅠ和PstⅠ處理序列10-13的產(chǎn)物，并用PstⅠ和HindⅢ處理序列14-17的產(chǎn)物。在進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀之后，將這些DNA連接于用相同的限制酶消化過(guò)的pUC19 DNA上。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，在含有XGAL和IPTG的氨芐青霉素平板上選擇。
培養(yǎng)白色菌落，以便制備DNA。通過(guò)限制性分析和DNA測(cè)序鑒定該DNA。質(zhì)粒pPG1364含有由寡核苷酸序列10-13編碼的合成SSI部分基因。質(zhì)粒pPG1366含有由寡核苷酸序列14-17編碼的SSI部分基因。
為了構(gòu)建編碼成熟SSI的完整合成基因，用EcoRⅠ、BglⅠ和PstⅠ消化pPG1364。用EcoRⅠ、PstⅠ和XbaⅠ消化pPG1366。連接這些DNA。質(zhì)粒pPG1371含有組裝的合成SSI基因，并含有pPG1366的大的PstⅠEcoRⅠ片段和pPG1364的小的EcoRⅠPstⅠ片段。將pPG1371用于以后的工作中。
例4．構(gòu)建以枯草蛋白酶基因?yàn)榛A(chǔ)的表達(dá)質(zhì)粒該表達(dá)質(zhì)粒源于pPG580，其制備方法如下pPG580是用于生產(chǎn)人甲狀旁腺素的34個(gè)氨基酸殘基的片段的質(zhì)粒的衍生物(為了由枯草芽胞桿菌中分泌人甲狀旁腺素的34個(gè)氨基酸的片段，優(yōu)化其信號(hào)序列裂解位點(diǎn)，Saunders等，基因，102:277-282(1992))。pPG580由四部分組成。
首先，pPG580含有一個(gè)解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)枯草蛋白酶基因，其旁側(cè)為HindⅢ位點(diǎn)，用以下寡核苷酸通過(guò)PCR制備。
序列185′AGA TCC AAG CTT TTC CGC AAT FAT ATC ATC ATT 3′和序列195′GGA TTC AAG CTT TGC TCA GTT TTG CTT CTG 3′除第一個(gè)堿基對(duì)外，pPG580含有Vasantha等所示的全部枯草蛋白酶基因序列(源于解淀粉芽胞桿菌的編碼堿性蛋白酶和中性蛋白酶的基因含有一個(gè)大的開(kāi)放讀框，位于編碼信號(hào)序列和成熟蛋白的片段之間，細(xì)菌學(xué)雜志，159:811-819,1984)。
其次，鄰近枯草蛋白酶基因的3′末端的是pBS+(由位于加拿大LaJolla的Stratagene出售)的一個(gè)片段(即其開(kāi)始部分)，該片段從HindⅢ位點(diǎn)至pBS+XbaⅠ位點(diǎn)的長(zhǎng)度大約為3.2kbp。
第三，在接近XbaⅠ位點(diǎn)處插入一個(gè)大的pUB110片段。(pUB110的核苷酸序列某些沉默特征與復(fù)制及其調(diào)控相關(guān)。McKenzie等，質(zhì)粒，15:93-103,1986)。該片段從pUG110 XbaⅠ位點(diǎn)至BamHⅠ位點(diǎn)的長(zhǎng)度為4.3kbp。因此，在pPG580上不存在從BamHⅠ向后到XbaⅡ的324bp的pUB110片段。
第四，pUB110的BamHⅠ位點(diǎn)不再完整，而是與由Saunders等所披露的32bp合成序列的BglⅡ位點(diǎn)(優(yōu)化人甲狀旁腺素的34個(gè)氨基酸片段從枯草芽胞桿菌中分泌的信號(hào)序列裂解位點(diǎn)，Saunders等，基因，102:277-282,1991)。這32bp的序列如下序列205′AAG CTT CAG GAT GTT CAT AAT TTT TAA AGA TC 3′由此得到質(zhì)粒pPG580。
對(duì)pPG580進(jìn)行修飾，以便進(jìn)一步利用。通過(guò)用EcoRⅠ和BamHⅠ消化消除BamHⅠ位點(diǎn)和EcoRⅠ位點(diǎn)。然后在有連接酶緩沖液的條件下將該消化產(chǎn)物與T4 DNA聚合酶和脫氧核苷三磷酸一起培養(yǎng)。所得到的質(zhì)粒以下被稱作pPG1301，該質(zhì)粒缺乏BamHⅠ或EcoRⅠ位點(diǎn)，并將其用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101。單鏈DNA是用獲得了pPG1301的CJ236宿主制備的，將其稱作菌株P(guān)G1229。
通過(guò)寡核苷酸定向誘變修飾pPG1301，以提供一個(gè)跟隨所述信號(hào)序列編碼區(qū)的EcoRⅠ位點(diǎn)，和一個(gè)跟隨翻譯終止編碼區(qū)的BamHⅠ位點(diǎn)。該誘變是用以下寡核苷酸實(shí)施的5′GCC CAG GCG GCA GGG GAA TTC AAA TCA AAC GGG GAA 3′(序列21)
和5′GCG GCA GCT CAG TAA GGA TCC AAC ATA AAA AAC CGG C3′(序列22)。通過(guò)用以上兩個(gè)寡聚體進(jìn)行誘變而修飾過(guò)的質(zhì)粒被稱作pPG1315。其中，僅用序列21誘變過(guò)質(zhì)粒(因此，僅整合了BamHⅠ位點(diǎn))，所得質(zhì)粒以下被稱為pPG1306。
所述誘變是用KuKel方法實(shí)施的(見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)。質(zhì)粒pPG1315含有EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)。pPG1315是插入了合成SSI基因的表達(dá)載體。
例5．能生產(chǎn)枯草蛋白酶和SSI作為融合蛋白的枯草芽胞桿菌菌株通過(guò)插入一個(gè)EcoRⅠ限制位點(diǎn)修飾質(zhì)粒pPG1306，該位點(diǎn)插在編碼枯草蛋白酶的最后一個(gè)氨基酸的序列之后。這種修飾使得所產(chǎn)生的融合蛋白含有枯草蛋白酶。在標(biāo)準(zhǔn)誘變中使用以下寡核苷酸5′GTA CAG GCG GCA GCT CAG GAA TTC TAG TAA GGA TCCAAC ATA A 3′(序列23)所得到的質(zhì)粒被稱為pPG1391。將一個(gè)含有EcoRⅠ、BamHⅠ SSI基因的pPG1371片段亞克隆到EcoRⅠ、BamHⅠ消化過(guò)的pPG1391中，得到質(zhì)粒pPG1509。
例6．編碼水蛭蛋白酶抑制劑枯草蛋白酶融合蛋白的基因?qū)?lái)自例1的mPG1023亞克隆(一種包括含有水蛭蛋白酶抑制劑基因的BamHⅠ EcoRⅠ片段的噬菌體DNA)亞克隆到pPG1315的BamHⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)之間，得到質(zhì)粒pPG1317。然后將一個(gè)來(lái)自pPG1317的含有EcoRⅠ、BamHⅠ水蛭蛋白酶抑制劑基因的片段亞克隆到EcoRⅠ、BamH消化的pPG1391中，得到質(zhì)粒pPG1500。pPG1500是編碼兩種成熟蛋白的枯草蛋白酶/水蛭蛋白酶抑制劑基因融合體。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)PG632，得到表達(dá)該融合蛋白的細(xì)菌。該菌株被稱為PG1604。
下表中歸納了在以上實(shí)施例中所述的質(zhì)粒和表達(dá)系統(tǒng)。表中所列不是限定性的，而只是為閱讀本說(shuō)明書(shū)的技術(shù)人員提供一些指導(dǎo)。
表1來(lái)自實(shí)施例中的質(zhì)粒和芽胞桿菌屬菌株概述

*存在于大腸桿菌中的該質(zhì)粒的保藏號(hào)為ATCC保藏號(hào)98025例7．融合蛋白的發(fā)酵和純化融合蛋白的制備如下。在含有卡那霉素(50μg/ml)的2×YT培養(yǎng)基(1.6％胰化蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％氯化鈉)中培養(yǎng)細(xì)胞。沉淀所述細(xì)胞，并收集其上清液。用三氯乙酸沉淀1ml樣品。通過(guò)SDS凝膠電泳分離蛋白，并進(jìn)行吸印，以便用抗熱變性的枯草蛋白酶的抗血清進(jìn)行Wstern印跡分析。該抗血清能識(shí)別大于來(lái)自PG1198和PG1604的樣品中的枯草蛋白酶的蛋白。這一結(jié)果是融合蛋白所預(yù)期的。另外，存在由該抗血清識(shí)別的枯草蛋白酶大小的蛋白。這一結(jié)果表明，該融合蛋白已受到某種程度的蛋白水解作用，枯草蛋白酶部分與抑制劑部分發(fā)生了分離。
用標(biāo)準(zhǔn)方法純化所述蛋白(參見(jiàn)，S.Hirono,K.T.Nakamura,Y.Litaka,和Y.Mitsui，“枯草蛋白酶BPN′和其蛋白抑制劑鏈霉菌屬枯草蛋白酶抑制劑的復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)”，分子生物學(xué)雜志，131:855-869(1979)，通過(guò)凝膠過(guò)凝純化該復(fù)合體。
例8．融合蛋白抑制作用的鑒定檢測(cè)含有所述融合蛋白的芽胞桿菌屬發(fā)酵上清液的蛋白酶活性和蛋白酶抑制劑活性。
A．SSI抑制枯草蛋白酶BPN′和BPN′的Y217L衍生物。在對(duì)照中，將SSI與蛋白酶混合，并在室溫下培養(yǎng)15分鐘。然后，用DelMar,E.G.,C.Largman,J.W.Brodrick和M.C.Geokas披露的方法測(cè)定蛋白酶活性(分析生物化學(xué)，第99卷，pp.316-320(1979))。加入0.1M Tris、pH8.6、10mM CaCl2溶液，將體積調(diào)至990μl。加入10μl N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-對(duì)硝基苯胺(20mg/ml)，開(kāi)始反應(yīng)。通過(guò)410nm處的吸收增加測(cè)定反應(yīng)速度。
測(cè)定PG1198和PG1604培養(yǎng)上清液抑制BPN′的Y217L衍生物的能力。兩種情況下均未見(jiàn)顯著的抑制?？赡苡械囊种颇芰Σ蛔鉖G1181的10％,PG1181產(chǎn)生SSI作為一種單一的蛋白。
另外，測(cè)定PG1198和PG1604培養(yǎng)上清液產(chǎn)生蛋白酶的能力。在任何情況下均未見(jiàn)明顯的蛋白酶活性?？赡苡械牡鞍酌富钚粤浚萈G1106的蛋白酶活性低100倍。PG1106產(chǎn)生枯草蛋白酶作為單一蛋白。
缺乏顯著的抑制劑活性和蛋白酶活性這一事實(shí)與蛋白酶/抑制劑融合蛋白的形成吻合，其中，抑制劑部分和蛋白酶部分的活性相互抵消。這一解釋被Western印跡結(jié)果(上文)所加強(qiáng)，Western印跡證實(shí)了融合蛋白的產(chǎn)生。
B．由于希望把融合蛋白加入洗衣制品中，因此，還要測(cè)定在洗衣機(jī)環(huán)境下的穩(wěn)定性。
通過(guò)測(cè)定隨時(shí)間變化的蛋白酶活性監(jiān)測(cè)融合蛋白的穩(wěn)定性。如果蛋白酶和抑制劑的活性穩(wěn)定，則蛋白酶的活性水平隨時(shí)間推移是穩(wěn)定的。不過(guò)，如果抑制劑被融合蛋白中的蛋白酶水解，蛋白酶的活性將會(huì)提高。將PG1198和PG1604培養(yǎng)上清液與液體洗滌組合物混合，該液體組合物是按以下配方制備的

該組合物占總樣品體積的。將15μl樣品與975μl 0.1M Tris HCl,pH8.6,0.01M CaCl2混合。在室溫下將該稀釋液溫育30分鐘。在溫育之后加入底物，并測(cè)定蛋白酶的量。
例9．貯存穩(wěn)定性在31℃下，在有標(biāo)準(zhǔn)洗滌制劑的情況下，在1天內(nèi)PG1198中的蛋白酶活性提高到PG1106對(duì)照的蛋白酶活性的15％。PG1604的蛋白酶活性提高的更為緩慢，這與我們的發(fā)現(xiàn)相吻合，即在上述條件下SSI比水蛭蛋白酶抑制劑更穩(wěn)定。不過(guò)，在31℃下經(jīng)過(guò)14天以后，PG1604的蛋白酶活性為PG1106蛋白酶活性的14％。因此，PG1198和PG1604最初具有極小量的蛋白酶活性。在有洗滌劑的條件下進(jìn)行溫育時(shí)，抑制劑部分變得不穩(wěn)定，產(chǎn)生可檢測(cè)到的蛋白酶活性。這再次加強(qiáng)了上述結(jié)論，即產(chǎn)生了預(yù)計(jì)的融合蛋白，它含有蛋白酶部分和抑制劑部分，這兩部分的活性相互抵消。
例10．CMTⅠ型抑制劑融合蛋白A．使用上述方法，將一個(gè)CMTⅠ-Ⅰ(抑制劑)基因整合到枯草蛋白酶抑制劑質(zhì)粒中，以便表達(dá)CMTⅠ融合蛋白。
B．對(duì)上述質(zhì)粒的CMTⅠ-Ⅰ部分進(jìn)行誘變，將P1氨基酸變成纈氨酸。
例11．CMTⅢ型抑制劑融合蛋白A．用上述方法將一個(gè)CMTⅠ-Ⅲ(抑制劑)基因插入枯草蛋白酶質(zhì)粒，以便表達(dá)CMTⅠ蛋白。
B．對(duì)所述質(zhì)粒的CMTⅠ-Ⅲ部分進(jìn)行誘變，將P1氨基酸變成纈氨酸。
并非囿于任何理論，可對(duì)以上數(shù)據(jù)作如下合理化處理產(chǎn)生了融合蛋白，而且，其活性數(shù)據(jù)表明，蛋白酶和抑制劑部分看上去結(jié)合正確。另外，上述結(jié)果還與蛋白酶隨時(shí)間推移水解抑制劑的認(rèn)識(shí)吻合。上述結(jié)果還與我們的其它結(jié)果一致，該結(jié)果表明，在有蛋白酶和洗滌劑的條件下，SSI比水蛭蛋白酶抑制劑更穩(wěn)定。
因此，證實(shí)了所述融合蛋白在特性上類(lèi)似于，并起天然蛋白酶和抑制劑的作用，盡管事實(shí)上是一種融合蛋白，與之比較的是不作為融合蛋白表達(dá)的同一種蛋白酶和抑制劑。
例12其它突變所述融合蛋白可以在該融合蛋白的蛋白酶部分或抑制劑部分有所變化。例如，此時(shí)SSI是抑制劑，以下變體是用上述標(biāo)準(zhǔn)方法制備的。本發(fā)明的變體示于下表中。
在說(shuō)明特定突變時(shí)，給出的是抑制劑的序列，而不是融合蛋白的。這是為了方便確定突變相對(duì)于存在于天然抑制劑中的原始氨基酸的位置。因此，就本實(shí)施例而言，先給出天然野生型氨基酸，其次為位置編號(hào)，再次為取代的氨基酸。因此，M73D表示。作為第73位氨基酸(位置73)出現(xiàn)在天然抑制劑中的甲硫氨酸(M)被天冬氨酸(D)所取代。這種變化可以穩(wěn)定抑制劑和/或優(yōu)化其Ki。其編號(hào)與常用于SSI的編號(hào)(Obata等，同上)相應(yīng)，不考慮存在于本文中所披露的SSI“野生型”-樣變體和SSI變體的氨基末端的4個(gè)額外的氨基酸。表2單突變變體D83C-變體1M73D-變體4M73P-變體27表3雙突變變體M73D D83C-變體2M73P D83C-變體3M70Q D83C-變體5表4三點(diǎn)突變變體M73P D83C S98A-變體6M73P Y75A D83C-變體7M73P D83C S98V-變體8M70Q M73P D83C-變體9M73P V74A D83C-變體10M73P V74F D83C-變體11M70Q D83C S98A-變體12G47D M70Q D83C-變體13G47D D83C S98A-變體14G47D M73P D83C-變體15G47D M73D D83C-變體16表5四點(diǎn)突變變體M70Q M73P V74F D83C-變體17M70Q M73P V74W D83C-變體18M70Q M73P D83C S98A-變體19G47D M73P V74F D83C變體20G47D M73P V74W D83C-變體21G47D M73P D83C S98A-變體22表6五點(diǎn)突變變體G47D M70Q M73P V74F D83C-變體23G47D M70Q M73P V74W D83C-變體24G47D M73P M74F D83C S98A-變體25G47D M73P V74W D83C S98A-變體26這些有用的突變?yōu)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員提供了指南，他們可以利用這些例子，以及現(xiàn)有技術(shù)的指導(dǎo)，制備對(duì)感興趣的蛋白酶作過(guò)修飾的其他變體。
為此另外預(yù)計(jì)本領(lǐng)域技術(shù)人員可能希望制備本發(fā)明融合蛋白的抗體。這種抗體可以用已知方法制備。
例如，可將本發(fā)明的融合蛋白注射到諸如小鼠和兔子等的合適的哺乳動(dòng)物受試對(duì)象體內(nèi)。合適的方法包括按照一種方案在有佐劑的條件下反復(fù)注射所述免疫原，由此促進(jìn)抗體在血清中的生成?？梢杂帽景l(fā)明的化合物作抗原，通過(guò)免疫測(cè)定方法(該方法在本領(lǐng)域已標(biāo)準(zhǔn)化)方便地測(cè)定所述免疫血清的效價(jià)。
所獲得的上述抗血清可以直接使用，或通過(guò)以下方法獲得單克隆抗體收集免疫動(dòng)物的外周血淋巴細(xì)胞或脾臟，并使抗體生產(chǎn)細(xì)胞永生化，然后用標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定技術(shù)鑒定合適的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。
然后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法將所述多克隆或單克隆制劑用于監(jiān)測(cè)本發(fā)明的表達(dá)。因此，還期望可用上述抗體制備一種試劑盒，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員將其用于測(cè)定表達(dá)水平等。
還可用標(biāo)準(zhǔn)連接方法將上述抗體和諸如閃爍成像標(biāo)記物(例如Tc-99或1-131)或熒光標(biāo)記物的標(biāo)記物連接。所述標(biāo)記過(guò)的抗體還可用于競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)，如用于測(cè)定Ki值的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。Ⅴ．洗滌組合物在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，將一種或幾種有效量的融合蛋白加入用于清潔多種需要肽污漬清除的表面的組合物中。這種洗滌組合物包括用于清洗硬表面的洗滌組合物，其形式不受限制(例如，液體和顆粒)；用于清洗織物的洗滌組合物，其形式不受限制(例如，顆粒、液體和條狀制劑)；洗碟組合物(其形式不受限制)；口腔清潔組合物，其形式不受限制(例如，牙粉、牙膏和漱口制劑)；牙齒清潔組合物，其形式不受限制(例如，液體、片劑)；和隱形眼鏡清潔組合物，其形式不受限制(例如，液體、片劑)；除此前所述的融合蛋白之外，上述洗滌組合物還含有一種或幾種與蛋白酶抑制劑相容的洗滌組合物材料。本文所說(shuō)的“洗滌組合物材料”是指根據(jù)所期望的洗滌組合物的具體類(lèi)型和產(chǎn)品的形式(例如，液體，顆粒，棒，噴霧劑，條，膏，凝膠)選擇的液體、固體或氣體材料，這些材料也與用于該組合物中的融合蛋白相容。洗滌組合物材料的具體選擇通過(guò)考慮待清洗的表面材料，在使用時(shí)所希望的用于洗滌條件的該組合物的形式(例如通過(guò)清洗洗滌劑用途)可以方便地完成。
本文所說(shuō)的“非織物洗滌組合物”包括硬表面洗滌組合物、洗碗組合物、口腔清潔組合物、牙齒清潔組合物和隱形眼鏡清洗組合物。A．抑制劑本文所說(shuō)的“相容的”一詞，是指洗滌組合物材料不會(huì)將融合蛋白的蛋白水解活性降低至在正常使用條件下蛋白酶不像希望的那樣有效的程度。下面將對(duì)具體的洗滌組合物材料做詳細(xì)說(shuō)明。
在本文中，“有效量的融合蛋白”是指實(shí)現(xiàn)特定洗滌組合物所需的酶促活性所需要的融合蛋白量。這種有效量便于被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，而且，取決于多種因素，如所使用的特定的融合蛋白，洗滌用途，洗滌組合物的具體組成，以及需要液體或干燥(例如，顆粒、棒)組合物等。優(yōu)選地，該洗滌組合物含有大約0.0001％至大約10％的一種或幾種本發(fā)明的融合蛋白，更優(yōu)選為大約0.001％至大約1％，進(jìn)一步優(yōu)選為大約0.01％至大約0.1％。下面將更詳細(xì)地說(shuō)明可以使用本發(fā)明融合蛋白的各種洗滌組合物的若干例子。本文所采用的份數(shù)、百分比和比例均為以重量計(jì)，除非另有說(shuō)明。
本發(fā)明的融合蛋白可被用于各種洗滌組合物中。這種融合蛋白可與各種常用成分一起使用，以提供完全制備的硬表面清潔劑、洗碗組合物、和織物洗滌組合物等。所述組合物可以為液體、顆粒、和棒狀形式等。可將所述組合物制備成諸如現(xiàn)代“濃縮”洗滌劑的形式，其含有重量百分比高達(dá)30-60％的表面活性劑。B．表面活性劑本發(fā)明的洗滌組合物可選擇性地，而且優(yōu)選地含有各種陰離子型、非離子型、兩性離子型等表面活性劑。這些表面活性劑的用量通常為所述組合物的大約5％至大約35％。1．陰離子型表面活性劑可以使用的一種類(lèi)型的陰離子型表面活性劑包括烷基磺酸酯。這種表面活性劑是理想的，因?yàn)檫@種表面活性劑可用可更新的非石油材料制成?？梢杂门队诩夹g(shù)文獻(xiàn)中的已知方法制備烷基磺酸酯。例如，可以按照“美國(guó)油類(lèi)化學(xué)家協(xié)會(huì)雜志”52(1975),pp.323-329上所記載的方法用氣態(tài)SO3對(duì)直鏈C8-C20羧酸酯進(jìn)行磺化。合適的原始材料包括諸如源于牛脂、棕櫚油和椰子油等的天然脂肪物質(zhì)。
優(yōu)選的烷基磺酸酯表面活性劑，特別是用于洗衣目的的表面活性劑，包括烷基磺酸酯表面活性劑。合適的鹽包括諸如鈉、鉀和鋰鹽的金屬鹽，和取代的或非取代的銨鹽，如甲基-、二甲基-、三甲基和季銨陽(yáng)離子，例如，四甲基銨和二甲基啶鎓，和源于諸如單乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的鏈烷醇胺的陽(yáng)離子。優(yōu)選地，所述表面活性劑含有C10-C16烷基，和甲基、乙基或丙基。特別優(yōu)選的是，所述甲基磺酸酯具有C14-C16烷基。
烷基硫酸鹽表面活性劑是用于本發(fā)明的另一種重要的陰離子型表面活性劑。這種表面活性劑在與多羥基脂肪酸酰胺(見(jiàn)下文)組合使用時(shí)可產(chǎn)生良好的總體清潔能力，在很寬的溫度、濃度和洗滌時(shí)間范圍內(nèi)產(chǎn)生良好的油/脂清除力。上述表面活性劑或其水溶性鹽或酸的結(jié)構(gòu)式為ROSO3M；其中R優(yōu)選為C10-C24烴基，優(yōu)選為具有C10-C20烷基部分的烷基或羥烷基，更優(yōu)選為C12-C18烷基或羥烷基，而M是H或陽(yáng)離子，例如，堿金屬陽(yáng)離子(例如，鈉、鉀、鋰)，取代或非取代的銨陽(yáng)離子，如甲基-，二甲基-和三甲基銨以及季銨陽(yáng)離子，例如，四甲基銨和二甲基啶鎓，和源于諸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺的鏈烷醇胺的陽(yáng)離子，及其混合物等。一般，對(duì)于較低的洗滌溫度(例如，低于大約50℃)來(lái)說(shuō)，優(yōu)選C12-C16烷基鏈，而對(duì)于較高的洗滌溫度(例如，高于大約50℃)來(lái)說(shuō)，優(yōu)選C16-C18烷基鏈。
烷基烷氧基化硫酸鹽表面活性劑是另一類(lèi)有用的陰離子型表面活性劑。這種表面活性劑通常為式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中，R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羥烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥烷基，A是一個(gè)乙氧基或丙氧基單位，m大于0，通常為大約0.5至大約6，更優(yōu)選為大約0.5至大約3，而M是H或陽(yáng)離子，例如，該陽(yáng)離子可以是金屬陽(yáng)離子(例如，鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、等)，銨或取代銨陽(yáng)離子。本文還涉及烷基乙氧基化硫酸鹽以及烷基丙氧基化硫酸鹽。取代銨陽(yáng)離子的具體例子包括甲基-、二甲基-、三甲基銨和季銨陽(yáng)離子，如四甲基銨、二甲基基啶鎓和源于諸如單乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺的鏈烷醇胺的陽(yáng)離子，及其混合物。代表性的表面活性劑有C12-C18烷基聚乙氧基化(1.0)硫酸鹽，C12-C18烷基聚乙氧基化(2.25)硫酸鹽，C12-C18烷基聚乙氧基化(3.0)硫酸鹽，和C12-C18烷基聚乙氧基化(4.0)硫酸鹽，其中，M通常選自鈉和鉀。
還可向本發(fā)明組合物中加入可用于此目的的其它陰離子型表面活性劑。這類(lèi)表面活性劑包括皂的鹽(例如，包括鈉、鉀、銨和取代銨鹽，如單-、二-和三乙醇胺鹽)，C9-C20直鏈烷基苯磺酸鹽，C8-C22一代或二代鏈烷磺酸鹽，C8-C24烯烴磺酸鹽，通過(guò)磺化堿土金屬檸檬酸鹽熱解產(chǎn)物而制備的磺化聚羧酸，例如，如在英國(guó)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)No.1,082,179中所述，烷基甘油磺酸鹽、脂肪酰甘油磺酸鹽、脂肪油酰甘油硫酸鹽、烷基苯酚環(huán)氧丙烷硫酸醚、石蠟磺酸鹽、烷基磷酸鹽、諸如?；惲虼蛩猁}的異硫代硫酸鹽、N-?；；撬猁}、甲基牛磺酸酰胺(tauride)的脂肪酸酰胺、烷基琥珀酰胺酸鹽和硫代琥珀酸鹽、硫代琥珀酸單酯(特別是飽和和不飽和C12-C18單酯)、硫代琥珀酸二酯(特別是飽和和不飽和C6-C14二酯)、N-?；“彼猁}、烷基多糖的硫酸鹽，如烷基聚葡糖苷的硫酸鹽(下文所披露的非離子型非硫酸化化合物)、支鏈一代烷基硫酸鹽、烷基聚乙氧基羧酸鹽，如式RO(CH2CH2O)kCH2COO-M+的羧酸鹽，其中，R是C8-C22烷基，k是0-10的整數(shù)，M是可溶性成鹽陽(yáng)離子，以及被羥乙磺酸酯化并被氫氧化鈉中和的脂肪酸，樹(shù)脂酸和氫化樹(shù)脂酸同樣適用，如松香、氫化松香，以及存在于浮油中或源于浮油的樹(shù)脂酸和氫化樹(shù)脂酸。進(jìn)一步的例子披露于“表面活性劑和洗滌劑”(第Ⅰ、和Ⅱ卷，作者Schwartz、Perry和Berch)中，在于1975年12月30日授予Laughlin等的US3,929,678的第23欄第58行至第29欄第23行中也大體上披露了多種上述表面活性劑(該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn))。2．非離子型洗滌表面活性劑合適的非離子型洗滌表面活性劑一般性地披露于1975年12月30日授予Laughlin等的US3,929,678的第13欄第14行至第16欄第6行，該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn)。下面將列舉典型的、非限定性的有用非離子型表面活性劑類(lèi)型。
1、烷基苯酚的聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷和聚環(huán)氧丁烷縮合物。一般，優(yōu)選聚環(huán)氧乙烷縮合物。這些化合物包括烷基苯酚與烯化氧的縮合產(chǎn)物，所述烷基酚具有一個(gè)含有大約6至大約12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)的烷基。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，環(huán)氧乙烷的添加量等于每摩爾烷基苯酚大約5至大約25摩爾環(huán)氧乙烷。這種類(lèi)型的市售非離子型表面活性劑包括由GAF公司出售的IgepalCO-630；和由Rohm & Haas公司出售的TritonX-45、X-114、X-100和X-102。這些化合物通常被稱作烷基苯酚烷氧基化物(例如，烷基苯酚乙氧基化物)。
2、脂族醇與大約1至大約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物。所述脂族醇的烷基鏈可以是直鏈的或支鏈的，一代的或二代的，通常含有大約8至大約22個(gè)碳原子。特別推薦具有含有大約10至大約20個(gè)碳原子的烷基與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，其比例為每摩爾醇與大約2至大約18摩爾環(huán)氧乙烷縮合。這種類(lèi)型的市售非離子型表面活性劑包括Tergitol15-S-9(C11-C15直鏈仲醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、Tergitol24-L-6NMW(C12-C14伯醇與6摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，具有窄的分子量分布)，這兩種產(chǎn)品均由Union Carbide公司出售；由殼牌化學(xué)公司出售的Neodol45-9(C14-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、Neodol23-6.5(C12-C13直鏈醇與6.5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、Neodol45-7(C14-C15直鏈醇與7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、Neodol45-4(C14-C15直鏈醇與4摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；和由寶潔(Procter & Gamble)公司出售的KyroEOB。這類(lèi)非離子型表面活性劑一般被稱為“烷基乙氧基化物”。
3、由聚環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合而生成的環(huán)氧乙烷與疏水性堿的縮合產(chǎn)物。上述化合物的疏水性部分的分子量?jī)?yōu)選為大約1500至大約1800，并具有水不溶性。向該疏水部分添加聚氧乙烯部分以增加該分子整體上的水溶性，而該產(chǎn)物的液體特性被保持到這樣的程度聚氧乙烯含量大約為該縮合產(chǎn)物總重量的50％，這相當(dāng)于與多達(dá)約40mol的環(huán)氧乙烷縮合。這種類(lèi)型化合物的例子包括由BASF出售的某些Pluronic表面活性劑。
4、環(huán)氧乙烷與由環(huán)氧丙烷和乙二胺反應(yīng)所產(chǎn)生的產(chǎn)物的縮合產(chǎn)物。該產(chǎn)物的疏水部分包括乙二胺和過(guò)量的環(huán)氧丙烷的反應(yīng)產(chǎn)物，通常其分子量為大約2500至大約3000。該疏水部分與環(huán)氧乙烷縮合至縮合產(chǎn)物含有重量百分比為大約40％至大約80％的聚氧乙烯的程度，其分子量為大約5,000至大約11,000。這種類(lèi)型的非離子型表面活性劑的例子包括由BASF出售的Tetronic化合物中的某一些。
5、半極性非離子型表面活性劑是一種特殊類(lèi)型的非離子型表面活性劑，它包括水溶性氧化胺，含有一個(gè)有大約10至大約18個(gè)碳原子的烷基部分和2個(gè)選自有大約1至大約3個(gè)碳原子的烷基和羥烷基的部分；含有一個(gè)有大約10至大約18個(gè)碳原子的烷基部分和2個(gè)選自有大約1至大約3個(gè)碳原子的烷基和羥烷基部分的水溶性氧化膦；和含有一個(gè)有大約10至大約18個(gè)碳原子的烷基部分和一個(gè)選自有大約1至大約3個(gè)碳原子的烷基和羥烷基部分的水溶性亞砜。
半極性非離子型洗滌表面活性劑包括氧化胺表面活性劑，具有烷基、羥烷基或烷基酚基或其混合物，所述基團(tuán)含有大約8至大約26個(gè)碳原子；羥基亞烷基或含有大約1至大約3個(gè)環(huán)氧乙烷基的聚環(huán)氧乙烷基。上述基團(tuán)可以相互連接，例如，通過(guò)氧或氮原子連接，以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
上述氧化胺表面活性劑特別包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C12烷氧基乙基二羥乙基氧化胺。
6．披露于1986年1月21日授予Llenado的US4,565,647中的烷基多糖，它具有一個(gè)疏水基團(tuán)和一個(gè)諸如聚葡糖苷、親水基團(tuán)的多糖；所述疏水基團(tuán)含有大約6至大約30個(gè)碳原子，優(yōu)選大約10至大約16個(gè)碳原子；所述多糖含有大約1.3至大約10個(gè)，優(yōu)選大約1.3至大約3個(gè)，最優(yōu)選大約1.3至大約2.7個(gè)糖單位。含有5或6個(gè)碳原子的一切還原糖均可使用，例如，可以用葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分取代葡糖基部分。(所述疏水基團(tuán)選擇性地結(jié)合于2-、3-、4-等位置上，由此形成與葡糖苷或半乳糖苷對(duì)應(yīng)的葡萄糖或半乳糖。)例如，糖間鍵可以位于后添加的糖單位的一個(gè)位置和前面的糖單位的2-、3-、4-和/或6-位之間。
可選擇性地，無(wú)多大必要地用一個(gè)聚氧化亞烴鏈連接所述疏水部分和多糖部分。優(yōu)選的烯化氧為環(huán)氧乙烷。典型的疏水基團(tuán)包括飽和或非飽和、支鏈或非支鏈的、包括大約8至大約18個(gè)碳原子，優(yōu)選大約10至大約16個(gè)碳原子的烷基。優(yōu)選地，該烷基是直鏈飽和烷基。該烷基可以含有多達(dá)3個(gè)左右的羥基和/或所述聚氧化亞烴鏈可以含有多達(dá)10個(gè)左右，優(yōu)選不到5個(gè)的烯化氧單位。合適的烷基多糖有辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、三癸基、四癸基、五癸基、六癸基、七癸基和八癸基二-、三-、四-、五-、和六葡糖苷、半乳糖苷、乳糖苷、葡萄糖、果糖苷、果糖和/或半乳糖。合適的混合物包括椰子烷基二-、三-、四-、和五-葡糖苷和牛脂烷基四-、五-、和六-葡糖苷。
優(yōu)選的烷基聚葡糖苷含有一個(gè)選自烷基、烷基苯基、羥烷基、羥烷基苯基及其混合物的封端基，其中，所述烷基含有大約10至大約18個(gè)，優(yōu)選大約12至大約14個(gè)碳原子；n是2或3，優(yōu)選2；t是0-10，優(yōu)選0；x是大約1.3至大約10，優(yōu)選大約1.3至大約3，最優(yōu)選大約1.3至大約2.7。所述糖基優(yōu)選源于葡萄糖。為了制備上述化合物，首先制備醇或烷基聚乙氧基醇，然后再與葡萄糖或葡萄糖源反應(yīng)，以生成葡糖苷(結(jié)合于1-位上)。后加上去的糖基單位通過(guò)其1-位與先有糖基單位的2、3-、4-和/或6-位，優(yōu)選主要為2-位連接。
7、優(yōu)選具有一個(gè)含有大約7至大約21個(gè)(優(yōu)選大約9至大約17個(gè))碳原子的脂肪酸酰胺表面活性劑。優(yōu)選的酰胺為C8-C20氨酰胺、單乙醇酰胺、二乙醇酰胺、和異丙醇酰胺。
3．陽(yáng)離子型表面活性劑本發(fā)明的洗滌劑組合物中還可含有陽(yáng)離子型表面活性劑。陽(yáng)離子型表面活性劑包括諸如烷基二甲基-銨鹵化物的銨表面活性劑，這種表面活性劑具有烷基、烷基芳基或芳基側(cè)鏈；羥化或氧化側(cè)鏈，包括纖維素或其它糖或糖樣部分的聚合物，優(yōu)選其分子量低于大約1000；而X是任意的相容性陰離子。
可用于本發(fā)明中的其它陽(yáng)離子型表面活性劑還披露于US4,228,044中，該專(zhuān)利于1980年10月14日授予Cambre，被收作本文的參考文獻(xiàn)。
4．其它表面活性劑可將兩性型表面活性劑加入本發(fā)明的洗滌組合物中。這種表面活性劑可被廣義地稱作仲胺或叔胺的脂族衍生物，或雜環(huán)仲胺或叔胺的脂族衍生物，其中，所述脂族基團(tuán)可以是直鏈的或支鏈的。所述脂族取代基之一至少含有大約8個(gè)碳原子，通常為大約8至大約18個(gè)碳原子，而且，至少有一個(gè)含有諸如羧基、磺酸根、硫酸根的陰離子型水溶性基團(tuán)。參見(jiàn)于1975年12月30日授予Laughlin等的US3,929,678的第19欄第18-35行(該專(zhuān)利被收作本文的參考資料)，例如，兩性型表面活性劑。
還可向本發(fā)明的洗滌組合物中加入兩性離子型表面活性劑。這種表面活性劑可被廣義地稱作仲胺和叔胺的衍生物，雜環(huán)仲胺和叔胺的衍生物，或季胺、季磷或叔锍化合物的衍生物。參見(jiàn)于1975年12月30日授予Laughlin等的US3,929,678的第19欄第38行至第22欄第48行(該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn))，例如，兩性離子型表面活性劑。
兩性型和兩性離子型表面活性劑通常與一種或幾種陰離子型和/或非離子型表面活性劑組合使用。
本發(fā)明的液體洗滌劑組合物還可以含有“酶活性加強(qiáng)量”的多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑。“酶加強(qiáng)”是指該組合物的配制者可以選擇一定量的多羥基脂肪酸酰胺加入該組合物中，由此提高該洗滌組合物的酶清潔性能。一般，對(duì)于常規(guī)量的酶而言，加入重量百分比大約為1％的多羥基脂肪酸酰胺即可加強(qiáng)酶的性能。
本發(fā)明的洗滌組合物通常含有重量百分比至少為大約1％的多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑，優(yōu)選至少為大約3％至大約50％，最優(yōu)選大約3％至大約30％的多羥基脂肪酸酰胺。
所述多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑的結(jié)構(gòu)式為

其中，R1是H，C1-C4烴基、2-羥基乙基、2-羥基丙基、或其混合物，優(yōu)選C1-C4烷基、更優(yōu)選C1或C2烷基，最優(yōu)選C1烷基(即甲基)；而R2是C5-C31烴基，優(yōu)選直鏈C7-C19烷基或亞烷基，更優(yōu)選直鏈C9-C17烷基或亞烷基，最優(yōu)選直鏈C11-C15烷基或亞烷基，或其混合物；Z是具有一個(gè)直鏈烴基鏈的多羥基烴基，至少有3個(gè)羥基直接與該鏈連接，或其烷氧基化衍生物(優(yōu)選乙氧基化或丙氧基化衍生物)。Z優(yōu)選為通過(guò)還原性胺化反應(yīng)由還原糖生成；更優(yōu)選為Z是glycityl。合適的還原糖包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖和木糖?？梢詫⒏咂咸烟怯衩滋菨{、高果糖玉米糖漿和高麥芽糖玉米糖漿以及上述單糖用作原材料。上述玉米糖漿可以產(chǎn)生用作Z的糖成分的混合物。應(yīng)當(dāng)理解的是，這并不意味著排除了其它合適的原材料。Z優(yōu)選選自-CH2-(CHOH)n-CH2OH、CH(CH2OH)-(CHOH)n-1-CH2OH、CH2-(CHOH-)2(CHOR′)(CHOH)-CH2OH，及其烷氧基衍生物，其中，n是3-5的整數(shù)，包括3和5，R′是H或雜環(huán)或脂族單糖。最優(yōu)選為glycityls，其中，n是4，特別是-CH2-(CHOH)4-CH2OH。
例如，在式(Ⅰ)中，R′可以是N-甲基、N-乙基、N-丙基、N-異丙基、N-丁基、N-2-羥乙基、或N-2-羥丙基。
例如，R2-CO-N＜可以是cocamide、硬脂酰胺、油酰胺、月桂酰胺、肉豆蔻酰胺、癸酰胺、棕櫚酰胺、牛脂酰胺等。
Z可以是1-deoxyglucityl、2-deoxyfructityl、1-deoxymaltityl、1-deoxylactityl、1-deoxygalactityl、1-deoxymannityl、1-deoxymaltotriotityl等。
制備多羥基脂肪酸酰胺的方法在本領(lǐng)域中是公知的。一般，可以這樣制備；通過(guò)一個(gè)還原性胺化反應(yīng)讓烷基胺與還原糖反應(yīng)，生成相應(yīng)的N-烷基多羥胺；然后通過(guò)一個(gè)縮合/胺化步驟讓N-烷基多羥胺與脂肪脂族脂或甘油三酯反應(yīng)，生成N-烷基、N-多羥基脂肪酸酰胺產(chǎn)物。例如，制備含有多羥基脂肪酸酰胺的方法披露于以下專(zhuān)利中于1959年2月18日公開(kāi)的、為T(mén)homas Hedley & Co.Ltd.所擁有的英國(guó)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)809,060，于1960年12月20日授予E.R.Wilson的US2,965,576，于1955年3月8日授予Anthony M.Schwartz的US2,703,798，和于1934年12月25日授予Piggatt的US1,985,424，以上每一份專(zhuān)利均被收作本文的參考文獻(xiàn)。
可用于本發(fā)明的非限定性表面活性劑實(shí)例包括C11-C18烷基苯磺酸鹽和一代及無(wú)規(guī)烷基硫酸鹽，結(jié)構(gòu)式為CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18二代(2,3)烷基硫酸鹽，其中，x和(y+1)是至少為大約7的整數(shù)，優(yōu)選至少大約為9，而M是水溶性陽(yáng)離子，特別是鈉，C10-C18烷基烷氧基硫酸鹽(特別是EO1-5乙氧基硫酸鹽)，C10-C18烷基烷氧基羧酸鹽(特別是EO1-5乙氧基羧酸鹽)，C10-C18烷基聚糖苷，及其相應(yīng)的硫酸化聚糖苷，C12-C18α磺化脂肪酸酯，C12-C18烷基和烷基苯酚烷氧基化物(特別是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜堿和硫代甜菜堿(“Sultaines”)，和C10-C18氧化胺等。本發(fā)明優(yōu)選烷基烷氧基硫酸鹽(AES)和烷基烷氧基羧酸鹽(AEC)。(根據(jù)配方設(shè)計(jì)師的意愿，將這些表面活性劑與上述氧化胺和/或甜菜堿或硫代甜菜堿表面活性劑組合使用也是優(yōu)選的。)在標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)中開(kāi)列有其它常用的表面活性劑，特別有用的表面活性劑包括披露于1993年3月16日授予Connor等的US5,194,639中的C10-C18N-甲基葡糖酰胺，該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn)。
可將多種可用于洗滌清洗組合物中的其它成分用于本發(fā)明的組合物中，包括其它活性成分、載體、水溶助長(zhǎng)劑、處理助劑、染料或色素、用于液體制劑的溶劑等。如果需要額外產(chǎn)生更多的泡沫，可將諸如C10-C16鏈烷醇酰胺的泡沫促進(jìn)劑加入該組合物中，其加入量通常為大約1％至大約10％。C10-C14單乙醇和二乙醇酰胺代表了這種泡沫促進(jìn)劑的一個(gè)典型的類(lèi)型。將所述泡沫促進(jìn)劑與諸如上述氧化胺、甜菜堿和硫代甜菜堿的高泡沫輔佐表面活性劑一起使用也是有利的。如果需要，可將諸如MgCl2和MgSO4等的可溶性鎂鹽力入，其添加量通常為大約0.1％至大約2％，以產(chǎn)生更多的泡沫。C．蛋白酶和其它酶配方設(shè)計(jì)師可能希望將諸如纖維素酶、脂酶、淀粉酶和蛋白酶的各種添加酶用于所述組合物中，其用量通常為大約0.001％至大約1％的重量百分比。各種織物護(hù)理酶在洗衣洗滌劑領(lǐng)域是眾所周知的。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物還含有一種性能加強(qiáng)量的洗滌劑相容性第二種酶。“洗滌劑相容性”是指與液體洗滌組合物的其它成分，如表面活性劑和洗滌助劑的相容性。所述第二種酶優(yōu)選選自脂酶、淀粉酶、纖維素酶及其混合物。所述“第二種酶”一詞排除了上述蛋白酶，因此，每一種組合物至少含有兩種類(lèi)型的酶，至少包括一種蛋白酶。用于該組合物中的第二種酶的量根據(jù)酶的類(lèi)型而有所不同。一般，所述第二種酶的用量?jī)?yōu)選為重量百分比大約為0.0001至0.3％，更優(yōu)選為0.001至0.1％?？梢允褂猛活?lèi)型酶(例如脂酶)或兩種或兩種以上類(lèi)型酶(例如纖維素酶和脂酶的混合物)?？梢允褂眉兓蚍羌兓问降拿?。
任何適用于液體洗滌組合物的脂解酶均可用于本發(fā)明組合物中。適用于本發(fā)明的脂酶包括源于細(xì)菌和真菌的脂酶。
合適的細(xì)菌脂酶包括由諸如施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)ATCC 19.154的假單胞屬微生物所產(chǎn)生的脂酶，如在英國(guó)專(zhuān)利1,372,034中所披露的，該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn)。合適的脂酶包括能與熒光假單胞菌(Pseudomonas flucorescens)IAM 1057所產(chǎn)生的脂酶的抗體發(fā)生陽(yáng)性免疫交叉反應(yīng)的脂酶。這種脂酶及其純化方法披露于日本專(zhuān)利申請(qǐng)53-20487(延遲
公開(kāi)日為1978年2月24日)。這種脂酶由日本名古屋的Amano藥品有限公司以脂酶P“Amano”為商標(biāo)出售，以下稱之為“Amano-P”。在使用Ouchiterlony披露的標(biāo)準(zhǔn)的和公知的免疫擴(kuò)散方法(Acta.Med Scan,133，第76-79(1950))時(shí)，所述脂酶應(yīng)表現(xiàn)陽(yáng)性免疫交叉反應(yīng)。這些酶及其與Amano-P的免疫交叉反應(yīng)還披露于1987年11月17日授予Thom等的US4,707,291中，該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn)。這些酶的典型例子有Amano-P脂酶、源于莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonas fragi)FERM P1339的脂酶(以Amano-B為商標(biāo)出售)、源于硝基還原假單胞菌解脂變種(Pseudomonasnitroreducens var.lipolyticum)FERM P 1338的脂酶(以Amano-CES為商標(biāo)出售)、由日本Tagata的Toyo Jozo公司出售的源于諸如粘稠色桿菌解脂變種(Chromobacter viscosum var.lipolyticum)NRRLB 3673的粘稠色桿菌(Chromobacter viscosun)的脂酶；和由美國(guó)的美國(guó)生化公司和荷蘭的Disoynth公司出售的粘稠色桿菌脂酶和源于唐菖蒲假單胞菌(Pseudomonas gladioli)的脂酶。
合適的真菌脂酶包括由疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)和疏棉狀高溫霉(Thermomyces lanuginosus)所產(chǎn)生的脂酶。最優(yōu)選的是用以下方法獲得的脂酶克隆源于疏棉狀腐質(zhì)霉的基因，并在米曲霉(Aspergillus oryzae)中表達(dá)該基因，如在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0258068(Novo Industries A/S)中所披露的，這種脂酶由Novo Nordisk A/S以Lipolase為商標(biāo)出售。
可將脂酶以每克大約10-18000，優(yōu)選大約60-6000脂酶單位(LU/g)用于所述組合物中。1個(gè)脂酶單位是指在固定氫離子濃度條件下每分鐘產(chǎn)生1mmol可滴定脂肪酸的脂酶量，其中，pH為9.0，溫度為30℃，底物是3.3 wt％橄欖油和3.3％阿拉伯膠的乳液，反應(yīng)是在有13mmol/l Ca++和20mmol/l NaCl的條件下，在5mmol/l Tris-緩沖液中進(jìn)行的。
任何適用于液體洗滌組合物的纖維素酶均可用于這些組合物中。適用于本發(fā)明的纖維素酶包括源于細(xì)菌和真菌的纖維素酶。優(yōu)選地，其最佳pH為5-9.5?？梢允褂弥亓堪俜直却蠹s為0.0001-0.1％的纖維素酶。
合適的纖維素酶披露于1984年3月6日授予Barbesgarrd的US4,435,307中，該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn)，其中披露了由Humicolainsolens產(chǎn)生的真菌纖維素酶。合適的纖維素酶同樣披露于GB-A-2,075,028,GB-A-2,095,275和DE-OS-2,247,832中。
所述纖維素酶的例子有由Humicola insolens(Humicola grisea varthermoidea)的菌株，特別是由腐質(zhì)霉屬菌株DSM 1800產(chǎn)生的纖維素酶，和由芽胞桿菌屬N或?qū)儆跉鈫伟鷮俚睦w維素酶212-生產(chǎn)菌產(chǎn)生的纖維素酶，以及從船蛆(Dolabella Auricula Solander)肝胰中提取的纖維素酶。
適用于液體洗滌組合物中的一切淀粉酶均可用于這些組合物中。例如，淀粉酶包括獲自地衣芽胞桿菌的特殊菌株淀粉酶，在英國(guó)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)No.1,296,839(Novo)中對(duì)此有更詳細(xì)的說(shuō)明。例如，解淀粉蛋白包括Rapidase(國(guó)際生物合成公司)和Termamyl(Novo Industries)。
可以使用重量百分比大約0.0001-0.55％，優(yōu)選0.0005-0.1％的淀粉酶。D．其它(選擇性)成分本發(fā)明的液體洗滌組合物可以含有水和其它溶劑作為載體。諸如甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇的低分子量伯醇或仲醇是合適的。優(yōu)選用一元醇溶解表面活性劑，不過(guò)，也可使用含有大約2至大約6個(gè)碳原子和大約2至大約6個(gè)羥基的多元醇(例如，1,3-丙二醇、乙二醇、甘油和1,2-丙二醇)。所述組合物可以含有大約5％至90％，一般為大約10％至大約50％的上述載體。
優(yōu)選將本發(fā)明洗滌組合物配制成這樣，使其在被用于水洗作業(yè)時(shí)洗滌水的pH為大約6.8至大約11.0。因此，成品通常要配制成在該范圍內(nèi)。將pH控制在推薦的使用水平上的方法包括使用緩沖液、堿、酸等，這類(lèi)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
可將諸如過(guò)碳酸鹽和過(guò)硼酸鹽之類(lèi)的各種漂白化合物用于上述組合物中，其用量通常為大約1％至大約15％的重量百分比。如果必要，上述組合物還可含有諸如四乙酰乙二胺、壬酰羥苯磺酸鹽之類(lèi)的漂白活化劑，這類(lèi)方法在本領(lǐng)域中也是公知的。其用量范圍通常為大約1％至大約10％的重量百分比。
還可將各種污垢釋放劑(特別是陰離子型低聚酯)、各種螯合劑(特別是氨基磷酸鹽和乙二胺二琥珀酸鹽)、各種粘土污垢清除劑(特別是乙氧基化四乙五胺)、各種分散劑(特別是聚丙烯酸鹽和聚天冬氨酸鹽)、各種增白劑(特別是陰離子型增白劑)、各種泡沫抑制劑(特別是硅氧烷和仲醇)和各種織物柔軟劑(特別是近晶粘土)等用于上述組合物中，其用量以重量百分比計(jì)大約1％至大約35％。標(biāo)準(zhǔn)的配方手冊(cè)和公開(kāi)的專(zhuān)利中包括上述常用材料的多種詳細(xì)說(shuō)明。
還可將酶穩(wěn)定劑用于所述洗滌組合物中。這些穩(wěn)定劑包括丙二醇(優(yōu)選為大約1％至大約10％)、甲酸鈉(優(yōu)選為大約0.1％至大約1％)和甲酸鈣(優(yōu)選為大約0.1％至大約1％)。
在制備本發(fā)明的硬表面洗滌組合物和織物洗滌組合物時(shí)，配方設(shè)計(jì)師可能希望采用各種助劑，其用量以重量百分比計(jì)大約為5％至大約50％。典型的助劑包括1-10微米沸石、諸如檸檬酸鹽和羥基琥珀酸鹽的聚羧酸鹽、層狀硅酸鹽和磷酸鹽等。其它常用助劑列于標(biāo)準(zhǔn)配方手冊(cè)中。
在本發(fā)明中，可以使用重量百分比大約為0-50％的洗滌助劑。可以使用無(wú)機(jī)以及有機(jī)助劑。使用時(shí)，所述組合物通常含有至少約1％的助劑。液體制劑優(yōu)選含有重量百分比大約為3％-30％，更優(yōu)選大約5-20％的洗滌助劑。
無(wú)機(jī)洗滌助劑包括但不限于多磷酸(如三聚磷酸、焦磷酸、和玻璃狀聚偏磷酸)的堿金屬、銨和鏈烷醇銨鹽，膦酸鹽、肌醇六磷酸，硅酸鹽、碳酸鹽(包括碳酸氫鹽和倍半碳酸鹽)、硫酸鹽和硅鋁酸鹽。還可使用硼酸鹽助劑，以及含有成硼酸鹽材料的助劑，后者可以在洗滌劑貯存或洗滌條件下產(chǎn)生硼酸鹽(以下統(tǒng)一稱之為“硼酸鹽助劑”)。優(yōu)選地，將非硼酸鹽助劑用于本發(fā)明的組合物中，該組合物準(zhǔn)備用于低于大約50℃，特別是低于大約40℃的洗滌條件下。
硅酸鹽助劑的例子有堿金屬硅酸鹽，特別是SiO2∶Na2O之比為1.6∶1-3.2∶1的硅酸鹽和層狀硅酸鹽，如披露于1987年5月12日授予H.P.Rieck的US4,664,839中的層狀硅酸鈉，該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn)。不過(guò)，也可使用諸如硅酸鎂的其它硅酸鹽，硅酸鎂可在顆粒狀制劑中起著膨松劑的作用，作為氧化漂白劑的穩(wěn)定劑，并作為泡沫控制系統(tǒng)的一種成分。
碳酸鹽助劑的例子有堿土和堿金屬碳酸鹽，包括碳酸鈉和倍半碳酸鈉，及其與超細(xì)碳酸鈣的混合物，正如在德國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2,321,001中的披露的(
公開(kāi)日為1973年11月15日)，該專(zhuān)利所公開(kāi)的內(nèi)容被收作本文的參考文獻(xiàn)。
可將硅鋁酸鹽助劑用于本發(fā)明中。在大部分現(xiàn)有上市的重役型顆粒洗滌組合物中，硅鋁酸鹽助劑是很重要的，而且，還可以作為液體洗滌制劑的一種突出的助劑成分。硅鋁酸鹽助劑包括具有以下經(jīng)驗(yàn)結(jié)構(gòu)式的化合物Mz(zAlO2·ySiO2)其中，M是鈉、鉀、銨或取代銨，z是大約0.5至大約2；而y是1；這種材料的鎂離子交換能力是每克無(wú)水硅鋁酸鹽至少相當(dāng)于大約50mgCaCO3的硬度。優(yōu)選的硅鋁酸鹽為具有如下結(jié)構(gòu)式的沸石助劑Naz[(AlO2)z(SiO2)y]·xH2O其中，z和y是至少為6的整數(shù)，z與y的摩爾比在1.0至大約0.5的范圍內(nèi)，而x是大約15至大約264的整數(shù)。
有用的硅鋁酸鹽離子交換材料可由商業(yè)途徑獲得。這種硅鋁酸鹽在結(jié)構(gòu)上可以為結(jié)晶形或非晶形，并可以是天然存在的硅鋁酸鹽或合成產(chǎn)生的。在于1976年10月12日授予Krummel等的US3,985,669中披露了一種生產(chǎn)硅鋁酸鹽離子交換材料的方法，該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn)。優(yōu)選的用于本發(fā)明的合成結(jié)晶硅鋁酸鹽離子交換材料以沸石A、沸石P(B)和沸石X的名稱出售。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)晶硅鋁酸鹽離子交換材料具有以下結(jié)構(gòu)式Na12[(AlO2)12(SiO2)12]·xH2O其中x是大約20至大約30，特別是大約27。這種材料被稱作沸石A。優(yōu)選地，所述硅鋁酸鹽具有大約0.1-10μm的粒度。
多磷酸鹽的例子有堿金屬三聚磷酸鹽，焦磷酸鈉、鉀和銨，正磷酸鈉和鉀，聚偏磷酸鈉，其中，聚合度為大約6至大約21，以及肌醇六磷酸的鹽。
磷酸助劑鹽的例子有乙烷1-羥基-1,1-二磷酸的水溶性鹽，特別是鈉和鉀鹽，亞甲基二膦酸的水溶性鹽，例如三鈉和三鉀鹽，以及取代亞甲基二膦酸的水溶性鹽，如三鈉和三鉀的亞乙基、異亞丙基、苯亞甲基和鹵代亞甲基磷酸鹽。上述類(lèi)型的磷酸助劑鹽披露于1964年12月1日和1965年10月19日授予Diehl的US3,159,581和US3,213,030中；于1969年1月14日授予Roy的US3,422,021中；于1986年9月3日和1969年1月14日授予Quimby的US3,400,148和US3,422,137中，以上內(nèi)容被收作本文參考。
優(yōu)選用于本發(fā)明目的的有機(jī)洗滌助劑包括多種聚羧酸鹽化合物。在本文中，“聚羧酸鹽”是指具有多個(gè)羧酸鹽基，優(yōu)選至少3個(gè)羧酸鹽基的化合物。
通?？梢运嵝孕问綄⒕埕人猁}助劑加入所述組合物中，但也可以中性鹽的形式加入。在以鹽的形式使用時(shí)，優(yōu)選諸如鈉、鉀和鋰的堿金屬或硅鋁酸鹽。
所述聚羧酸鹽助劑包括各種類(lèi)型的有用材料。一類(lèi)重要的聚羧酸鹽助劑包括醚聚羧酸鹽。業(yè)已披露了多種用作洗滌助劑的醚聚羧酸鹽。有用的醚聚羧酸鹽的例子包括氧聯(lián)二琥珀酸鹽，如在于1964年4月7日授予Berg的US3,128,287，和于1972年1月18日授予Lamberti等的US3,635,830中所披露的，這兩份專(zhuān)利均被收作本文的參考文獻(xiàn)。
可用作本發(fā)明助劑的一種特殊類(lèi)型的醚聚羧酸鹽包括具有以下通式的化合物CH(A)(COOX)-CH(COOX)-O-CH(COOX)-CH(COOX)(B)其中，A是H或OH；B是H或-O-CH(COOX)-CH2(COOX)；X是H或成鹽陽(yáng)離子。例如，如果在上面的通式中A和B均為H，則該化合物是氧聯(lián)二琥珀酸及其水溶性鹽。如果A是OH，B是H，則該化合物是酒石酸單琥珀酸(TMS)及其水溶性鹽。如果A是H,B是-O-CH(COOX)-CH2(COOX)，則該化合物是酒石酸二琥珀酸(TDS)及其水溶性鹽。特別推薦將以上助劑的混合物用于本發(fā)明中。特別優(yōu)選TMS和TDS的混合物，TMS與TDS的重量比為大約97∶3至大約20∶80。這些助劑披露于1987年5月5日授予Bush等的US4,663,071中。
合適的醚聚羧酸鹽還包括環(huán)狀化合物，特別是脂環(huán)化合物，如披露于以下美國(guó)專(zhuān)利中的脂環(huán)化合物US,3,923,679；3,835,163；4,185,635；4,120,874和4,102,903，以上專(zhuān)利均被收作本文的參考文獻(xiàn)。
其它有用的洗滌助劑包括由以下結(jié)構(gòu)所表示的醚羥基聚羧酸鹽HO-[C(R)(COOM)-C(R)(COOM)-O]n-H其中，M是H或陽(yáng)離子，其所產(chǎn)生的鹽是水溶性的，優(yōu)選堿金屬、銨或取代銨陽(yáng)離子，n是大約2至大約15(優(yōu)選地，n是大約2至大約10，更優(yōu)選地，n平均為大約2至大約4)，每一個(gè)R相同或不同，并選自H、C1-4烷基或C1-4烷基或C1-4取代烷基(R優(yōu)選為H)。
再有的其它醚聚羧酸鹽包括馬來(lái)酐與亞乙基或乙烯甲基醚的共聚物1,3,5-三羥基苯-2,4,6-三磺酸和羧甲基氧基琥珀酸。
有機(jī)聚羧酸鹽助劑還包括聚乙酸的各種堿金屬、銨和取代銨鹽。其例子包括乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸的鈉、鉀、鋰、銨和取代銨鹽。
還包括諸如苯六甲酸、琥珀酸、氧二琥珀酸、聚馬來(lái)酸、苯1,3,5-三甲酸和羧甲基氧基琥珀酸的聚羧酸及其可溶性鹽。
諸如檸檬酸及其可溶性鹽(特別是鈉鹽)的檸檬酸助劑對(duì)于重役型液體洗滌制劑而言特別重要，但也可用于顆粒狀組合物中。
其它羧化物助劑包括披露于1973年3月28日授予Diehl的US3,723,322中的羧化糖類(lèi)，該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn)。
同樣適用于本發(fā)明洗滌組合物中的有披露于于1986年1月28日授予Bush的US4,566,984中的3,3-二羧基-4-噁唑-1,6-己二酸鹽及相關(guān)化合物，該專(zhuān)利被收作本文參考文獻(xiàn)。有用的琥珀酸助劑包括C5-C20烷基琥珀酸及其鹽。這種類(lèi)型的特別優(yōu)選的化合物是十二碳烯基琥珀酸。烷基琥珀酸通常具有以下結(jié)構(gòu)式R-CH(COOH)CH2(COOH)即琥珀酸的衍生物，其中，R是烴，如C10-C20烷基或烯基，優(yōu)選為C12-C16，或者，R可以是被羥基、磺基、次磺基或砜取代基取代過(guò)的，如在上述專(zhuān)利中所披露的。
琥珀酸助劑優(yōu)選以其水溶性鹽的形式使用，包括鈉、鉀、銨和鏈烷醇銨鹽。
琥珀酸助劑的具體例子包括月桂基琥珀酸酯、肉豆蔻基琥珀酸酯、棕櫚基琥珀酸酯、2-十二碳烯基琥珀酸酯(優(yōu)選的)、和2-十五碳烯琥珀酸酯等。這一組的優(yōu)選助劑是月桂基琥珀酸酯，這類(lèi)助劑披露于于1986年11月5日公開(kāi)的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)86200690.5/0,200,263中。
有用的助劑的例子還包括羧甲基氧基丙二酸、羧甲基氧基琥珀酸、順-環(huán)-己烷六羧酸、順-環(huán)戊烷-四羧酸、水溶性聚丙烯酸(分子量超過(guò)大約2,000的聚丙烯酸還可被有效用作分散劑)的鈉和鉀鹽，以及馬來(lái)酐與乙烯甲基醚或乙烯的共聚物。
其它合適的聚羧酸鹽有披露于于1979年3月13日授予Crutchfield等的US4,144,226中的聚縮醛羧酸鹽，該專(zhuān)利被收作本文參考文獻(xiàn)。這種聚縮醛羧酸鹽可以通過(guò)在聚合條件下將二羥乙酸的酯和聚合啟動(dòng)劑放在一起而進(jìn)行制備。然后將所得到的聚縮醛羧酸鹽酯連接于化學(xué)穩(wěn)定的端基上，以便穩(wěn)定所述聚縮醛羧酸鹽，防止其在堿性溶液中迅速解聚，生成相應(yīng)的鹽，并加至表面活性劑上。
聚羧酸鹽助劑還披露于于1976年3月7日授予Diehl的US3,308,067中，該專(zhuān)利被收作本文參考文獻(xiàn)。所述材料包括諸如馬來(lái)酸、衣康酸和亞甲基丙二酸的脂族羧酸均聚和共聚物的水溶性鹽。
還可使用本領(lǐng)域已知的其它有機(jī)助劑。例如，可以使用具有長(zhǎng)鏈烴基的單羧酸及其可溶性鹽。其中包括通常被稱作“皂”的材料。通常使用C10-C20的鏈長(zhǎng)。該烴基可以是飽和的或不飽和的。
其它選擇性成分包括螯合劑、粘土污垢清除劑/抗再沉積劑、聚合分散劑、漂白劑、增白劑、泡沫抑制劑、溶劑和美觀劑。Ⅵ.組合物的實(shí)施例可將本發(fā)明的洗滌組合物配制成各種組合物，例如，配制成洗衣洗滌劑，以及硬表面清潔劑或洗碗組合物。
1．硬表面洗滌組合物在本文中，“硬表面洗滌組合物”是指用于清洗諸如地板、墻壁、浴室地磚的硬表面的液體和顆粒洗滌組合物。本發(fā)明的硬表面洗滌組合物含有有效量的本發(fā)明的一種或幾種融合蛋白，其用量?jī)?yōu)選為占該組合物活性劑重量的大約0.001％至大約10％，更優(yōu)選為大約0.01至大約5％，進(jìn)一步優(yōu)選為大約0.05％至大約1％。除了含有一種或幾種融合蛋白之外，這種硬表面洗滌組合物通常含有一種表面活性劑和一種水溶性螯合助劑。不過(guò)，在諸如噴霧窗戶清潔劑的某些特殊制品中，有時(shí)不采用表面活性劑，因?yàn)楸砻婊钚詣?huì)在玻璃表面上形成薄膜狀/條痕狀殘跡。
如有所述表面活性劑成分的話，其含量可以少到占本發(fā)明組合物的0.1％，但一般該組合物含有大約0.25％至大約10％，更優(yōu)選大約1％至大約5％的表面活性劑。
一般，該組合物含有大約0.5％至大約50％的洗滌助劑，優(yōu)選大約1％至大約10％。
優(yōu)選的pH在大約8-12的范圍內(nèi)。如果需要調(diào)節(jié)的話，可以使用諸如NaOH、Na2CO3或HCl的pH調(diào)節(jié)劑。
所述組合物中可以含有溶劑。有用的溶劑包括，但不限于乙二醇醚，如二亞乙基二醇-單己基醚、二亞乙基二醇-單丁基醚，乙二醇-單丁基醚，乙二醇-單己基醚、丙二醇-單丁基醚、二丙二醇-單丁基醚，和二醇，如2,2,4三甲基-1,3-戊二醇，和2-乙基-1,3-己二醇。在使用時(shí)，上述溶劑的添加量一般為大約0.5％至大約15％，優(yōu)選為大約3％至大約11％。
另外，可將諸如異丙醇或乙醇的強(qiáng)揮發(fā)性溶劑用于本發(fā)明組合物中，以便在將該組合物“全力”用于表面上之后，在不對(duì)該表面進(jìn)行漂洗的情況下加快該組合物從所述表面蒸發(fā)。在使用時(shí)，揮發(fā)性溶劑在該組合物的用量通常為大約2％至大約12％。
本發(fā)明的硬表面洗滌組合物實(shí)施方案用以下實(shí)例說(shuō)明。
例7-12液體硬表面洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分7 8 9 10 11 12例7的融合蛋白 0.05 0.50 0.02 0.03 0.10 0.03例10的融合蛋白 - - - -0.20 0.02Na2DIDA*EDTA**- - 2.90 2.90 - -檸檬酸鈉 - - - -2.90 2.90C12烷基苯磺酸鈉 1.95 - 1.95-1.95 -C12烷基硫酸鈉 -2.20-2.20 -2.20C12(乙氧基)硫酸鈉***-2.20-2.20 -2.20C12二甲基氧化胺 -0.50-0.50 -0.50枯烯磺酸鈉1.30 - 1.30-1.30 -己基卡必醇6.30 6.30 6.30 6.30 6.30 6.30水****平衡至100％*N-二乙二醇-N,N-亞胺二乙酸二鈉**乙二胺二乙酸四鈉***二乙二醇-單己基醚****所有配方均調(diào)至pH7在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可獲得大致相同的結(jié)果。
例13-18用于清洗硬表面和清除家具上霉菌的噴霧組合物實(shí)例編號(hào)成分 13 14 15 16 17 18例7的融合蛋白0.500.050.600.300.200.30例11的融合蛋白 - - - - 0.300.10辛基硫酸鈉 2.002.002.002.002.002.00十二烷基硫酸鈉 4.004.004.004.004.004.00NaOH 0.800.800.800.800.800.80硅酸鹽(Na) 0.040.040.040.040.040.04芳香劑 0.350.350.350.350.350.35水 平衡至100％制品的pH大約為7。
在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可獲得大致相同的結(jié)果。
2．洗碗組合物在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，洗碗組合物含有本發(fā)明的一種或幾種融合蛋白。在本文中，“洗碗組合物”是指用于洗碗的一切形式的組合物，包括，但不限于顆粒和液體形式。本發(fā)明洗碗組合物的實(shí)施方案用以下實(shí)例加以說(shuō)明。
例19-24洗碗組合物實(shí)例編號(hào)成分 19 20 21 22 23 24例7的融合蛋白 0.050.500.020.400.100.03例10的融合蛋白- - - - 0.400.02C12-C14N-甲基谷氨酰胺 0.900.900.900.900.900.90C12乙氧基(1)硫酸鹽12.00 12.00 12.00 12.00 12.00 12.002-甲基十一酸4.504.504.504.504.504.50C12乙氧基(2)羧酸鹽 4.504.504.504.504.504.50C12醇乙氧基化物(4) 3.003.003.003.003.003.00C12氧化胺 3.003.003.003.003.003.00枯烯磺酸鈉 2.002.002.002.002.002.00乙醇4.004.004.004.004.004.00Mg++(如MgCl2) 0.200.200.200.200.200.20Ca++(如CaCl2) 0.400.400.400.400.400.40水 平衡至100％將制品的pH調(diào)至7。
在以上實(shí)例中，所引用的或要指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
3．織物洗滌組合物在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，織物洗滌組合物含有一種或幾種本發(fā)明的融合蛋白。在本文中，“織物洗滌組合物”是指用于洗滌織物的一切形式的洗滌組合物，包括，但不限于顆粒、液體和棒狀形式。優(yōu)選的織物洗滌組合物為液體形式的組合物。
a．顆粒狀織物洗滌組合物本發(fā)明的顆粒狀織物洗滌組合物含有有效量的一種或幾種本發(fā)明融合蛋白，活性成分用量?jī)?yōu)選占該組合物的大約0.001％至大約10％，更優(yōu)選為大約0.005％至大約5％，進(jìn)一步優(yōu)選為大約0.01％至大約1％。除了一種或幾種融合蛋白外，所述顆粒狀織物洗滌組合物通常含有至少一種表面活性劑、一種或幾種助劑，并在某些場(chǎng)合下含有一種漂白劑。
本發(fā)明顆粒狀織物洗滌組合物的實(shí)施方案可用以下實(shí)例說(shuō)明。
例25-28顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分 25 26 27 28例7的融合蛋白 0.10 0.20 0.03 0.05例11的融合蛋白 -- 0.02 0.05C13直鏈烷基苯磺酸鹽22.0022.0022.0022.00磷酸鹽(如三聚磷酸鈉)23.0023.0023.0023.00碳酸鈉 23.0023.0023.0023.00硅酸鈉 14.0014.0014.0014.00沸石8.20 8.20 8.20 8.20螯合劑(二乙三胺五乙酸) 0.40 0.40 0.40 0.40硫酸鈉 5.50 5.50 5.50 5.50水平衡至100％在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例29-32顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分29 30 3132例7的融合蛋白 0.100.20 0.03 0.05例10的融合蛋白 - - 0.02 0.05C12烷基苯磺酸鹽 12.00 12.0012.00 12.00沸石A(1-10μm) 26.00 26.0026.00 26.002-丁基辛酸 4.004.00 4.00 4.00C12-C14二代(2,3)烷基 5.005.00 5.00 5.00硫酸鈉檸檬酸鈉 5.005.00 5.00 5.00熒光增白劑 0.100.10 0.10 0.10硫酸鈉 17.00 17.0017.00 17.00水和微量成分 平衡至100％在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例33-36顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分 33 34 35 36例7的融合蛋白 0.100.200.03 0.05例11的融合蛋白 - - 0.02 0.05C13直鏈烷基苯磺酸鹽22.00 22.00 22.0022.00磷酸鹽(如三聚磷酸鈉)23.00 23.00 23.0023.00碳酸鈉 23.00 23.00 23.0023.00硅酸鈉 14.00 14.00 14.0014.00沸石8.208.208.20 8.20螯合劑(二乙三胺五乙酸) 0.400.400.40 0.40硫酸鈉 5.505.505.50 5.50水 平衡至100％
在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例37-40顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分37 38 39 40例7的融合蛋白 0.100.200.030.05例10的融合蛋白 - - 0.020.05C12烷基苯磺酸鹽 12.00 12.00 12.00 12.00沸石A(1-10μm) 26.00 26.00 26.00 26.002-二丁基辛酸 4.004.004.004.00C12-C14二代(2,3)烷基 5.005.005.005.00硫酸鈉檸檬酸鈉 5.005.005.005.00熒光增白劑 0.100.100.100.10硫酸鈉 17.00 17.00 17.00 17.00水和微量成分平衡至100％在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例41-42顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分41 42直鏈烷基苯磺酸鹽 11.4 10.70牛脂烷基硫酸鹽 1.802.40C14-C15烷基硫酸鹽3.003.107倍乙氧基化C14-C15醇 4.004.0011倍乙氧基化牛脂醇 1.801.80分散劑 0.07 0.1硅氧烷液 0.800.80檸檬酸三鈉14.00 15.00檸檬酸 3.002.50沸石 32.50 32.10馬來(lái)酸丙烯酸共聚物 5.005.00二乙三胺五亞甲基膦酸 1.000.20例7的融合蛋白 0.300.30脂酶 0.360.40淀粉酶 0.300.30硅酸鈉 2.002.50硫酸鈉 3.505.20聚乙烯吡咯烷酮 0.300.50過(guò)硼酸 0.5 1苯酚磺酸鹽 0.1 0.2過(guò)氧化物酶 0.1 0.1微量成分 加至100 加至100在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例43-44顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分43 44直鏈C12烷基苯磺酸鈉6.5 8.0硫酸鈉 15.0 18.0沸石A 26.0 22.0次氮基三乙酸鈉 5.0 5.0聚乙烯吡咯烷酮 0.5 0.7四乙酰乙二胺3.0 3.0硼酸4.0 -過(guò)硼酸 0.5 1苯酚磺酸鹽 0.1 0.2例11融合蛋白0.4 0.4填料(例如，硅酸鹽；碳酸鹽； 加至100加至100芳香劑；水)在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例45壓緊型顆粒狀織物洗滌組合物成分重量％烷基硫酸鹽 8.0烷基乙氧基硫酸鹽2.03倍和7倍乙氧基化C25醇 6.0和C45醇的混合物多羥基脂肪酸酰胺2.5沸石17.0層狀硅酸鹽/檸檬酸鹽 16.0碳酸鹽 7.0馬來(lái)酸丙烯酸共聚物 5.0污垢釋放聚合物 0.4羧甲基纖維素0.4聚(4-乙烯吡啶)N-氧化物 0.1乙烯咪唑和乙烯吡咯烷酮共聚物0.1PEG2000 0.2Pro209Gln 0.5例7的融合蛋白 0.2纖維素酶0.2四乙酰乙二胺6.0過(guò)碳酸鹽22.0乙二胺二琥珀酸 0.3泡沫抑制劑 3.54,4′-二(2-嗎啉代-4-苯胺基-S-三嗪 0.25-6-基氨基)-芪-2,2′-二磺酸二鈉4,4′-二(2-硫代肉桂基)聯(lián)苯二鈉 0.05水、芳香劑和微量成分 加至100在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例46顆粒狀織物洗滌組合物成分 重量％直鏈烷基苯磺酸鹽7.6C16-C18烷基硫酸鹽 1.37倍乙氧基化C14-C15醇 4.0椰子-烷基-二甲基羥乙基氯化銨1.4分散劑 0.07硅氧烷液0.8檸檬酸三鈉 5.0沸石4A 15.0馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物 4.0二乙三胺五亞甲基膦酸0.4過(guò)硼酸 15.0四乙酰乙二胺5.0近晶粘土10.0聚環(huán)氧乙烷(MW300,000) 0.3例7的融合蛋白 0.4脂酶0.2淀粉酶 0.3纖維素酶0.2硅酸鈉 3.0碳酸鈉 10.0羧甲基纖維素0.2增白劑 0.2水、芳香劑和微量成分 加至100在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例47顆粒狀織物洗滌組合物成分 重量％直鏈烷基苯磺酸鹽 6.92牛脂烷基硫酸鹽 2.057倍乙氧基化C14-C15醇 4.4C12-C15烷基乙氧基硫酸鹽-3倍乙氧基化0.16沸石 20.2檸檬酸鹽 5.5碳酸鹽 15.4硅酸鹽 3.0馬來(lái)酸丙烯酸共聚物 4.0羧甲基纖維素 0.31污垢釋放聚合物 0.30例7的融合蛋白0.2脂酶 0.36纖維素酶 0.13四水過(guò)硼酸鹽 11.64一水過(guò)硼酸鹽 8.7四乙酰乙二胺 5.0二乙三胺五甲基膦酸 0.38硫酸鎂 0.40增白劑 0.19芳香劑、硅氧烷、泡沫抑制劑 0.85微量成分加至100在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。b．液體織物洗滌組合物本發(fā)明的液體織物洗滌組合物含有有效量的本發(fā)明的一種或幾種融合蛋白，優(yōu)選為活性成分占組合物重量的大約0.005％至大約5％，更優(yōu)選為大約0.01％至大約1％。上述液體織物洗滌組合物通常還另外含有一種陰離子型表面活性劑、一種脂肪酸、一種水溶性洗滌助劑和水。
本發(fā)明液體織物洗滌組合物的實(shí)施例如以下實(shí)例所示。
例48-52液體織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分 48 49 50 51 52例7的融合蛋白 0.05 0.03 0.30 0.03 0.10例10的融合蛋白- - -0.01 0.20C12-C14烷基硫酸鈉20.00 20.00 20.00 20.00 20.002-丁基辛酸 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉1.00 1.00 1.00 1.00 1.00C10醇乙氧基化物(3)13.00 13.00 13.00 13.00 13.00單乙醇胺2.50 2.50 2.50 2.50 2.50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1) 平衡至100％在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例53-57液體織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分 53 54 55 56 57例7的融合蛋白0.050.030.300.030.10例10的融合蛋白 - - - 0.010.20C12-C14烷基硫酸鈉 20.00 20.00 20.00 20.00 20.002-丁基辛酸 5.005.005.005.005.00檸檬酸鈉 1.001.001.001.001.00C10醇乙氧基化物(3) 13.00 13.00 13.00 13.00 13.00單乙醇胺 2.502.502.502.502 50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1) 平衡至100％
在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例58-59顆粒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分 5859C12-C14亞烷基琥珀酸 3.0 8.0檸檬酸一水合物 10.0 15.0C12-C15烷基硫酸鈉8.0 8.02倍乙氧基化C12-C15醇硫酸鈉 - 3.07倍乙氧基化C12-C15醇 - 8.05倍乙氧基化C12-C15醇 8.0 -二乙三胺五(亞甲基膦酸) 0.2 -油酸 1.8 -乙醇 4.0 4.0丙二醇 2.0 2.0例7的融合蛋白 0.2 0.2聚乙烯吡咯烷酮 1.0 2.0泡沫抑制劑 0.15 0.15NaOH 上調(diào)至pH7.5過(guò)硼酸 0.5 1苯酚磺酸鹽 0.1 0.2過(guò)氧化物酶 0.4 0.1水和微量成分 上調(diào)至100份在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例60-62液體織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分60 61 62檸檬酸 7.10 3.00 3.00脂肪酸 2.00 - 2.00乙醇 1.93 3.20 3.20硼酸 2.22 3.50 3.50單乙醇胺 0.71 1.09 1.091,2-丙二醇 7.89 8.00 8.00枯烯磺酸鈉 1.80 3.00 3.00甲酸鈉 0.08 0.08 0.08NaOH 6.70 3.80 3.80硅抗泡沫劑 1.16 1.18 1.18例7的融合蛋白 0.0145 --例10的融合蛋白 - 0.0145 -例11的融合蛋白 - - 0.0145脂酶 0.2000.200 0.200纖維素酶- 7.50 7.50污垢釋放聚合物 0.29 0.15 0.15抗泡沫劑 0.06 0.085 0.085增白劑36 0.095 - -增白劑3 - 0.05 0.05C12烷基苯磺酸 9.86 - -C12-C15烷基聚乙氧 13.80 18.00 18.00基化(2.5)硫酸鹽C12葡萄糖酰胺 - 5.00 5.00C12-C13烷基聚乙氧2.00 2.00 2.00基化物(9)水、芳香劑和微量成分 平衡至100％在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。C．棒狀織物洗滌組合物適用于手洗污染織物的本發(fā)明棒狀洗滌組合物含有有效量的本發(fā)明一種或幾種融合蛋白，優(yōu)選占組合物重量大約0.001％至大約10％，更優(yōu)選大約0.01％至大約1％。
本發(fā)明棒狀織物洗滌組合物的實(shí)施方案用以下實(shí)例說(shuō)明例63-66棒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分 63 64 65 66例7的融合蛋白 0.3- 0.1 0.02例10的融合蛋白 -- 0.4 0.03C12-C16烷基硫酸鈉 20.0 20.020.0 20.0C12-C14N-甲基葡糖酰胺 5.0 5.0 5.0 5.0C11-C13烷基苯磺酸鈉 10.0 10.010.0 10.0碳酸鈉25.0 25.025.0 25.0焦磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.0三聚磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.0沸石A(0.1-10) 5.0 5.0 5.0 5.0羧甲基纖維素 0.2 0.2 0.2 0.2聚丙烯酸酯(MW 1400)0.2 0.2 0.2 0.2椰子單乙醇酰胺 5.0 5.0 5.0 5.0增白劑，芳香劑 0.2 0.2 0.2 0.2CaSO41.0 1.0 1.0 1.0MgSO41.0 1.0 1.0 1.0水 4.0 4.0 4.0 4.0填料*平衡至100％*可選自諸如CaCO3、滑石、粘土和碴酸鹽之類(lèi)常用材料。
在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例67-70棒狀織物洗滌組合物實(shí)例編號(hào)成分 67 68 69 70例7的融合蛋白 0.3 - 0.1 0.02例11的融合蛋白 - 0.3 0.4 0.03C12-C16烷基硫酸鈉 20.020.020.0 20.0C12-C14N-甲基葡糖酰胺 5.0 5.0 5.0 5.0C11-C13烷基苯磺酸鈉10.010.010.0 10.0碳酸鈉 25.025.025.0 25.0焦磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.0三聚磷酸鈉7.0 7.0 7.0 7.0沸石A(0.1-10) 5.0 5.0 5.0 5.0羧甲基纖維素 0.2 0.2 0.2 0.2聚丙烯酸酯(MW 1400) 0.2 0.2 0.2 0.2椰子單乙醇酰胺5.0 5.0 5.0 5.0增白劑，芳香劑0.2 0.2 0.2 0.2CaSO41.0 1.0 1.0 1.0MgSO41.0 1.0 1.0 1.0水4.0 4.0 4.0 4.0填料*平衡至100％*可選自諸如CaCO3、滑石、粘土和碴酸鹽之類(lèi)的常用材料。
在以上實(shí)例中，所引用的或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。B．其它洗滌組合物除了上述討論過(guò)的硬表面洗滌、洗碗和織物洗滌組合物外，還可將本發(fā)明的一種或幾種融合蛋白加入多種其它洗滌組合物中，將這些組合物用于水解不溶性底物。上述其它洗滌組合物包括，但不限于口腔清潔組合物、牙齒清潔組合物和隱形眼鏡清洗組合物。
1．口腔清潔組合物在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，將從藥物學(xué)上講可以接受量的一種或幾種本發(fā)明融合蛋白加入用于清除牙齒上的肽污漬的組合物中。在本文中，“口腔清潔組合物”是指潔牙劑、牙膏、牙用凝膠、牙粉、漱口水、口腔噴霧劑、口腔凝膠、口香糖、錠劑、Sachets、片劑、生物凝膠、預(yù)防膏和牙齒治療溶液等。優(yōu)選地，所述口腔清潔組合物含有占該組合物重量大約0.0001％至大約20％，更優(yōu)選大約0.001％至大約10％，進(jìn)一步優(yōu)選大約0.01％至大約5％的一種或幾種本發(fā)明融合蛋白，以及一種可藥用的載體。在本文中，“可以藥用的”是指藥物、藥品或惰性成分，該術(shù)語(yǔ)所描述的成分適用于與人或低等動(dòng)物的組織接觸，而又不會(huì)產(chǎn)生過(guò)度的毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激、和變態(tài)反應(yīng)等，與合理的優(yōu)點(diǎn)/危害比相當(dāng)。
一般，所述口腔清潔組合物的口腔清潔成分的可以藥用的清潔載體成分通常占該組合物重量大約50％至大約99.99％，優(yōu)選為大約65％至大約99.99％，更優(yōu)選為大約65％至大約99％。
可以加入本發(fā)明口腔清潔組合物中的可以藥用的載體成分和選擇性成分為本領(lǐng)域技術(shù)人員能熟知?？捎糜诳谇磺鍧嵔M合物中的多種類(lèi)型的組合物、載體成分和選擇性成分披露于以下專(zhuān)利中于1992年3月17日授予Seibel的US5,096,700；于1991年7月2日授予Sampathkumar的US5,028,414；于1991年7月2日授予Benedict,Bush和Sunberg的US5,028,415；以上專(zhuān)利均被收作本文參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的口腔清潔組合物實(shí)施方案用以下實(shí)例說(shuō)明。
例71-74潔牙劑組合物實(shí)例編號(hào)成分 71 72 73 74例7的融合蛋白 2.0003.500 1.500 2.000山梨醇(70％水溶液) 35.000 35.000 35.000 35.000PEG-6*1.0001.000 1.000 1.000硅牙齒磨料**20.000 20.000 20.000 20.000氟化鈉 0.2430.243 0.243 0.243二氧化鈦0.5000.500 0.500 0.500糖精鈉 0.2860.286 0.286 0.286烷基硫酸鈉(27.9％水溶液)4.0004.000 4.000 4.000香味劑 1.0401.040 1.040 1.040羧基乙烯聚合物***0.3000.300 0.300 0.300角叉藻聚糖****0.8000.800 0.800 0.800水 平衡至100％*PEG-6=聚乙二醇，分子量為600。**被稱為Zeodent 119的沉淀硅，由J.M.Huber提供。***由B F.Goodrich化學(xué)公司提供的Carbopd。****由Hercules化學(xué)公司提供的Iota角叉藻聚糖在上述實(shí)施方案中，所引用或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例75-78漱口組合物實(shí)例編號(hào)成分 75 76 77 78例7的融合蛋白 3.00 7.50 1.00 5.00SDA 40醇 8.00 8.00 8.00 8.00香味劑0.08 0.08 0.08 0.08乳化劑0.08 0.08 0.08 0.08氟化鈉0.05 0.05 0.05 0.05甘油 10.0010.0010.0010.00甜味劑0.02 0.02 0.02 0.02苯甲酸0.05 0.05 0.05 0.05NaOH 0.20 0.20 0.20 0.20染料 0.04 0.04 0.04 0.04水 平衡至100％在上述實(shí)施方案中，所引用或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例79-82錠劑組合物實(shí)例編號(hào)成分 79 80 81 82例7的融合蛋白 0.010.03 0.10 0.02山梨醇 17.50 17.5017.5017.50甘露醇 17.50 17.5017.5017.50淀粉 13.60 13.6013.6013.60甜味劑1.201.20 1.20 1.20香味劑 11.70 11.7011.7011.70染料 0.100.10 0.10 0.10玉米糖漿 平衡至100％在上述實(shí)施方案中，所引用或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例83-86口香糖組合物實(shí)例編號(hào)成分 83 84 85 86例7的融合蛋白0.030.020.100.05山梨醇結(jié)晶 38.44 38.4038.40 38.40Paloja-T膠基*20.00 20.0020.00 20.00山梨醇(70％水溶液) 22.00 22.0022.00 22.00甘露醇 10.00 10.0010.00 10.00甘油 7.567.567.567.56香味劑 1.001.001.001.00*由L.A.Dreyfus公司提供在上述實(shí)施方案中，所引用或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。2．牙齒清潔組合物在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，用于清潔口腔的牙齒外側(cè)的牙齒清潔組合物含有本發(fā)明的一種或幾種融合蛋白。這種牙齒清潔組合物含有有效量的一種或幾種融合蛋白，優(yōu)選為占該組合物重量大約0.0001％至大約50％，更優(yōu)選為大約0.001％至大約35％，進(jìn)一步優(yōu)選為大約0.01％至大約20％的一種或幾種融合蛋白，以及一種牙齒清潔載體。諸如泡騰片劑的各種牙齒清潔組合物在本領(lǐng)域中是廣為人知的(例如，參見(jiàn)Young的美國(guó)專(zhuān)利US5,055,305，該專(zhuān)利被收作本文的參考文獻(xiàn))，并且通常適于加入一種或幾種融合蛋白，以便清除牙齒上的肽污漬。
本發(fā)明的牙齒清潔組合物實(shí)施方案用以下實(shí)例說(shuō)明。
例87-90雙層泡騰牙齒清潔片劑實(shí)例編號(hào)成分 87 88 89 90酸性層例10的融合蛋白1.0 1.5 0.01 0.05酒石酸 24.0 24.0 24.0 24.0碳酸鈉4.0 4.0 4.0 4.0氨基磺酸 10.0 10.0 10.0 10.0PEG20,000 4.0 4.0 4.0 4.0碳酸氫鈉 24.5 24 5 24.5 24.5過(guò)硫酸鉀 15.0 15.0 15.0 15.0酸式焦磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.0焦化硅2.0 2.0 2.0 2.0TAED*7.0 7.0 7.0 7.0蓖麻油酰硫代琥珀酸鹽 0.5 0.5 0.5 0.5香味劑1.0 1.0 1.0 1.0堿性層過(guò)硼酸鈉一水合物 32.0 32.0 32.0 32.0碳酸氫鈉 19.0 19.0 19.0 19.0EDTA 3.0 3.0 3.0 3.0三聚磷酸鈉 12.0 12.0 12.0 12.0PEG20,000 2.0 2.0 2.0 2.0過(guò)硫酸鉀 26.0 26.0 26.0 26.0碳酸鈉2.0 2.0 2.0 2.0焦化硅2.0 2.0 2.0 2.0染料/香味劑 2.0 2.0 2.0 2.0*四乙酰乙二胺在上述實(shí)施方案中，所引用或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。3．隱形眼鏡清潔組合物在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，隱形眼鏡洗滌組合物含有本發(fā)明的一種或幾種融合蛋白。這種隱形眼鏡清潔組合物含有有效量的一種或幾種融合蛋白，優(yōu)選為占該組合物重量大約0.01％至大約50％，更優(yōu)選為大約0.01％至大約20％，進(jìn)一步優(yōu)選為大約1％至大約5％的一種或幾種融合蛋白。諸如片劑和液體之類(lèi)的各種隱形眼鏡洗滌組合物劑型在本領(lǐng)域中廣為人知(例如，可參見(jiàn)以下專(zhuān)利于1989年9月5日授予Davies、Meaken和Rees的US4,863,627；于1988年5月24日再次授予Huth,Lam和Kirai的美國(guó)專(zhuān)利Re.32,672；于1986年9月2日授予Schafer的US4,609,493；于1987年9月1日授予Ogunbiyi和Smith的US4,690,793；于1986年9月30日授予Ogunbiyi、Riedhammer和Smith的US4,614,549；于1981年8月25授予Ogata的US4,285,738；以上每一份專(zhuān)利均被收作本文的參考文獻(xiàn))，而且，一般適于加入一種或幾種本發(fā)明蛋白，以便清除隱形眼鏡上的肽污漬。
本發(fā)明隱形眼鏡洗滌組合物實(shí)施方案用以下實(shí)例說(shuō)明。
例91-94加酶隱形眼鏡洗滌液實(shí)例編號(hào)成分 91 92 93 94例10的融合蛋白 0.01 0.5 0.1 2.0葡萄糖 50.00 50.0 50.0 50.0非離子型表面活性劑(聚氧 2.00 2.0 2.0 2.0乙烯/聚氧丙烯共聚物)陰離子型表面活性劑(聚氧 1.00 1.0 1.0 1.0乙烯/烷基苯基醚鈉硫酸酯)NaCl 1.00 1.0 1.0 1.0硼砂 0.30 0.3 0.3 0.3水平衡至100％在上述實(shí)施方案中，所引用或指明的任何融合蛋白用上述其它融合蛋白取代均可取得大致相同的結(jié)果。
例95將按例7方法制備Ki值為1×10-8的抑制劑用于例61的液體洗滌組合物中。對(duì)該組合物所做鑒定表明，在1個(gè)月之后該組合物仍有高于85％的蛋白酶活性。
在用于標(biāo)準(zhǔn)洗衣機(jī)并采用正常負(fù)荷和溫水的情況下，與不同之處僅在于使用了野生型抑制劑和標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶的類(lèi)似組合物相比，上述組合物具有改善了的污漬清除能力。
本申請(qǐng)中所引用的所有參考文獻(xiàn)均被收作本文的參考。
正如本領(lǐng)域所了解的，在DNA和氨基酸測(cè)定序方法中存在著偶然的誤差。因此，保藏材料中的編碼序列被收作本文的參考和對(duì)照，以免萬(wàn)一在本發(fā)明文字說(shuō)明的任何序列中出現(xiàn)誤差。還要指出的是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在按照本文字說(shuō)明再現(xiàn)申請(qǐng)人的工作時(shí)，使用常規(guī)方法可以發(fā)現(xiàn)任何測(cè)序錯(cuò)誤。保藏編號(hào)為ATCC No.69954,69955,和98025的材料并不意味著這些保藏材料是實(shí)施本發(fā)明所必須的。
盡管已對(duì)本發(fā)明的特定實(shí)施方案作了說(shuō)明，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯而易見(jiàn)的是，可在不超出本發(fā)明構(gòu)思和范圍的前提下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和改進(jìn)。在所附權(quán)利要求中，其用意是覆蓋屬于本發(fā)明范疇的一切上述改進(jìn)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人SAUNDERS,CHARLES W(ⅱ)發(fā)明名稱具有與之融合的肽蛋白酶抑制劑的蛋白酶及其變體(ⅲ)序列數(shù)量23(ⅳ)聯(lián)系地址(A)收件人THE PROCTER & GAMBLE COMPANY(B)街道11810 EAST MIAMI RIVER ROAD(C)城市ROSS(D)州OH(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編45061(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release #1.0,Version #1.30(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(lèi)號(hào)(ⅷ)律師/代理人資料(A)姓名HAKE,RICHARD A.
(B)注冊(cè)號(hào)37,343(C)文件/檔案號(hào)FUS(ⅸ)電訊資料(A)電話513-627-0087(B)傳真513-627-0260(2)序列1資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度48bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列1TAAACAACTT TCAACAGTCT CGAGACTAGT TTCAGCGGAG TGAGAATA48(2)序列2資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度78bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列2TACTTCACTC TGCATTACCC GCAGTACGAC GTTTACTTCC TGCCGGAAGG TTCTCCTGTT60ACTCTGGACC TGCGTTAC78(2)序列3資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度75bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列3CAGAGTAACA GGAGAACCTT CCGGCAGGAA GTAAACGTCG TACTGCGGGT AATGCAGAGT60GAAGTATTCA CGAGC75(2)序列4資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度74bp(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列4AATTCACTGA ATTTGGTTCT GAACTGAAAT CTTTCCCAGA AGTTGTTGGT AAAACTGTTG60ACCAGGCTCG TGAA74(2)序列5資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列5GTTGTAGAAA ACACGAACAC GGTTGTAACG CAGGTC36(2)序列6資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列6GATTACGAAT TCACTGAAT TGGTTCTGAA30(2)序列7資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列7
TCTAGAGGAT CCTAACCAAC ATGCGGA27(2)序列8資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度81bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列8GATTACGAAT TCACTGAATT TGGTTCTGAA CTGAAATCTT TCCCAGAAGT TGTTGGTAAA60ACTGTTGACC AGGCTCGTGA A81(2)序列9資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度89bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列9TCTAGAGGAT CCTAACCAAC ATGCGGAACA TGGTTAACAA CGTTAGTACC TGGGTTGTAG60AAAACACGAA CACGGTTGTA ACGCAGGTC89(2)序列10資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度60bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列10TCCGACGAAT TCGATGCTCC TTCTGCACTT TATGCACCTT CAGCATTAGT TTTAACAGTT60(2)序列11資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度60bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列11CCTGAAAGAG CAGTAACTCT TACATGTGCT CCAGGCCCTT CTGGTACCA TCCAGCAGCT60(2)序列12資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度51bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列12ACCTCCTACT GCAGCTAAAT CTGCACATGC AGAGCCAGCT GCTGGATGTG T51(2)序列13資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度60bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列13TACTGCTCTT TCAGGTGCAG CTGTCGTAGC GCTAACTCCT TTACCAACTG TTAAAACTAA60(2)序列14資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度60bp(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列14GATTTAGCTG CAGTAGGAGG TGACTTAAAC GCATTAACAC GTGGTGAAGA CGTTATGTGT60(2)序列15資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度60bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列15GTTGATGGAG TTTGGCAAGG TAAACGCGTA TCTTATGAAC GTGTATTTTC AAATGAATGT60(2)序列16資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度72bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列16TGTCCAAAGC TTGGATCCTT AAAATGCAAA TACAGAAGAG CCATGAGCGT TCATTTCACATTCATTTGAA AA72(2)序列17資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度60bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列17CCAAACTCCA TCAACAGTCA GTAATACAGG ATCATAAACC ATTGGACACA TAACGTCTTC60(2)序列18資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列18AGATCCAAGC TTTTCCGCAA TTATATCATT30(2)序列19資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列19GGATTCAAGC TTTGCTCAGT TTTGCTTCTG30(2)序列20資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列20AAGCTTCAGG ATGTTCATAA TTTTTAAAGA302)序列21資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36bp
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列21GCCCAGGCGG CAGGGGAATT CAAATCAAAC GGGGAA36(2)序列22資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列22GCGGCAGCTC AGTAAGGATC CAACATAAA AACCGGC37(2)序列23資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度42bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列23GTACAGGCGG CAGCTCAGGA ATTCTAGTAA GGATCCAACA TA4權(quán)利要求
1．一種洗滌劑相容性融合蛋白，它包括一個(gè)洗滌劑相容性蛋白酶部分和一個(gè)蛋白酶抑制劑部分，其中，所述蛋白酶和抑制劑由一個(gè)肽鏈連接在一起。
2．如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的蛋白酶抑制劑變體，其中，所述肽抑制劑部分是SSI或SSI的變體。
3．如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中，所述蛋白酶部分是堿性蛋白酶。
4．如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的抑制劑部分的Ki使得所述蛋白酶部分在洗滌組合物中受到抑制，并能在洗滌過(guò)程中提供游離的蛋白酶。
5．如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的融合蛋白，其為干燥形式或濃縮液體形式。
6．一種洗滌組合物，含有如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的一種或幾種融合蛋白。
7．編碼如權(quán)利要求1-6所述融合蛋白的DNA。
8．一種含有權(quán)利要求7所述DNA的表達(dá)系統(tǒng)，其中，該系統(tǒng)是含有編碼所述融合蛋白的質(zhì)粒的活的生物。
9．一種檢驗(yàn)試劑盒，含有如權(quán)利要求1所述的融合蛋白或該融合蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及及融合蛋白及其用途。本發(fā)明還涉及編碼所述融合蛋白的基因。本發(fā)明還涉及含有所述融合蛋白的用于洗滌的組合物。
文檔編號(hào)C11D3/386GK1238805SQ97199975
公開(kāi)日1999年12月15日 申請(qǐng)日期1997年9月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月24日
發(fā)明者C·W·桑德斯, J·M·麥西韋, J·M·阿姆普里斯特, R·S·楊奎斯特 申請(qǐng)人:普羅格特-甘布爾公司