用混合菌種發(fā)酵水產(chǎn)品下腳料的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體的說是一種利用混合菌種發(fā)酵水產(chǎn)品下腳料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們對健康和食品營養(yǎng)的需求越來越高，水產(chǎn)品以低脂肪、高蛋白、富含維生 素和礦物質(zhì)等特點而越來越受到人們的青睞，由此帶來水產(chǎn)品加工業(yè)的迅速發(fā)展壯大，產(chǎn) 量逐年提升。但在加工過程中，會產(chǎn)生大量的下腳料，如魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、魚內(nèi)臟、魚 骨、魚膽、魚漂、蝦殼、蟹殼、貝類及其殘留魚肉，其重量約占原料魚的40%?55%。這類下 腳料大部分被廢棄，不僅污染環(huán)境，還造成了資源的浪費。從資源利用的角度分析，水產(chǎn)品 下腳料中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和有用成分，如鰻骨、鰻頭等廢棄物中含有豐富的蛋白質(zhì)、磷 脂質(zhì)、軟骨素、維生素等，這些下腳料經(jīng)過微生物的發(fā)酵，可以成為很好的農(nóng)業(yè)肥料。
[0003] 近些年來，大量使用化肥帶來的環(huán)境污染、土壤板結(jié)、地方衰退、生態(tài)惡化等問題 日益嚴重，破壞了環(huán)境，影響了土壤肥力，降低了農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。微生物菌肥以投入低、產(chǎn)出 高且綠色無污染等優(yōu)點而成為發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的重要方向。菌肥的礦物質(zhì)含量和有機質(zhì)含量 都決定了菌肥的應用范圍和效果。優(yōu)良的菌種及發(fā)酵工藝是影響菌肥品質(zhì)的重要的因素。 目前，對微生物發(fā)酵生產(chǎn)菌肥的工藝優(yōu)化方面的研宄很多，但原料多局限于動物糞便糞、稻 殼、污泥和秸桿等，使用菌種單一，工藝優(yōu)化也多采用正交試驗進行，如曹慧玲等以新鮮牛 糞和稻殼粉為發(fā)酵原料，進行牛糞好氧發(fā)酵試驗，以正交試驗，探討生物有機肥生產(chǎn)的最佳 工藝條件。宋鵬等利用生活垃圾以及污泥混合物為原料，接入有機物料腐熟固體混合菌劑 和有益菌群混合菌懸液，生產(chǎn)微生物肥料。
[0004] 本發(fā)明以水產(chǎn)品下腳料為唯一原料，采用對下腳料有高效分解作用的多株菌進行 混合發(fā)酵，以游離氨基酸態(tài)氮含量為評價發(fā)酵的指標，對影響發(fā)酵的條件通過單因素試驗 及響應面法分析，確定發(fā)酵生產(chǎn)的最佳工藝條件，旨在為微生物菌肥的生產(chǎn)拓寬領(lǐng)域及提 供一定的理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種利用混合菌種發(fā)酵水產(chǎn)品下腳料的方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0007] 用混合菌種發(fā)酵水產(chǎn)品下腳料的方法，其特征在于：所述方法是利用組合菌種對 水產(chǎn)品下腳料進行發(fā)酵，具體步驟包括：
[0008] (1)種子培養(yǎng)：250mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取組合菌種各一 環(huán)，接入滅菌的種子培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30°C，203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對數(shù) 期取出；所述種子培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基；所述組合菌種為菌株a、菌株b、菌株c和菌 株d;所述菌株a為食酸菌、菌株b為假單胞菌、菌株c為黑曲霉、菌株d為酵母；
[0009] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：250mL錐形瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50mL，按5%接種量將發(fā)酵菌液接 入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C，120rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3d;所述發(fā)酵培養(yǎng)基按照重量百分比計 含有：10 %經(jīng)絞碎的水產(chǎn)品下腳料，90 %蒸餾水。
[0010] 本發(fā)明的另一技術(shù)方案是所述種子培養(yǎng)步驟中：所述菌株a為
[0011] 菌株a:熱帶假絲酵母Candidatropicalis、
[0012] 菌株b:羅倫隱球酵母Cryptococcuslaurentii、
[0013] 菌株c:枯草芽抱桿菌Bacillussubtilis、
[0014] 菌株d:賭樣芽抱桿菌Bacilluscereus〇
[0015] 優(yōu)化地，所述水產(chǎn)品下腳料包括魚鱗、魚皮及內(nèi)臟混合物。
[0016] 優(yōu)化地，所述種子培養(yǎng)步驟：250mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取菌 株a、菌株b各一環(huán)，菌株c、菌株d各兩環(huán)，接入滅菌的種子培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30°C， 203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對數(shù)期取出；所述種子培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基。
[0017] 優(yōu)化地，所述種子培養(yǎng)步驟：250mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取菌 株a、菌株b和菌株c各一環(huán)、菌株d兩環(huán)，接入滅菌的種子培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30°C， 203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對數(shù)期取出；所述種子培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基。
[0018] 優(yōu)化地，所述種子培養(yǎng)步驟：250mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取菌 株a-環(huán)，菌株b、菌株c、菌株d各兩環(huán)，接入滅菌的種子培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30°C， 203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對數(shù)期取出；所述種子培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基。
[0019] 優(yōu)化地，所述種子培養(yǎng)步驟：250mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取菌 株a-環(huán)，菌株b、菌株c、菌株d各兩環(huán)，接入滅菌的種子培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30°C， 203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對數(shù)期取出；所述種子培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基。
[0020] 本發(fā)明利用混合菌株直接發(fā)酵水產(chǎn)品下腳料的過程中無需添加任何其他輔助原 料，微生物即可良好生長，且發(fā)酵工藝簡單、發(fā)酵效果也非常顯著，解決了水產(chǎn)品資源浪費 和環(huán)境污染問題。
[0021] 本發(fā)明通過混合菌株發(fā)酵的單因素試驗和工藝優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，在混菌發(fā)酵水產(chǎn)品下腳 料的過程中，發(fā)酵條件對游離氨基酸態(tài)氮的含量有著重要的影響。本發(fā)明在單因素試驗基 礎(chǔ)上，對發(fā)酵溫度、接種量和轉(zhuǎn)速三個因素進行響應面法分析，建立二次多項數(shù)學模型得到 響應面立體圖，優(yōu)化后得到混合菌株的最佳的發(fā)酵條件為：轉(zhuǎn)速203rpm、接種量5%、溫度 30°C。經(jīng)過試驗，在上述發(fā)酵條件下發(fā)酵水產(chǎn)品下腳料，游離氨基酸態(tài)氮含量可達13. 865g/ L，較優(yōu)化前（12. 365g/L)提高了 12. 13%。發(fā)酵產(chǎn)物符合水溶性氨基酸肥料標準，也適合制 備微生物肥料。
[0022] 本發(fā)明由于利用了水產(chǎn)品加工下腳料，同時又可提高產(chǎn)品的附加值，因而具有較 好的市場開發(fā)前景。另外，微生物發(fā)酵過程中由于顯著減少了產(chǎn)生化學污染和病原菌污染 的機會，與動物源性蛋白和植物源性蛋白相比，品質(zhì)更穩(wěn)定、更安全、更可靠。
【附圖說明】
[0023] 圖1是游離氨基酸態(tài)氮標準曲線示意圖。
[0024] 圖2是轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液游離氨基酸態(tài)氮含量的影響示意圖。
[0025] 圖3是接種量對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響示意圖。
[0026] 圖4是溫度對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響示意圖。
[0027] 圖5是培養(yǎng)時間對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響示意圖。
[0028] 圖6是料液比對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響示意圖。
[0029]圖7是轉(zhuǎn)速與接種量對游離氨基酸態(tài)氮含量影響的響應面和等高線圖。
[0030] 圖8是轉(zhuǎn)速與溫度對游離氨基酸態(tài)氮含量影響的響應面和等高線圖。
[0031] 圖9是接種量與溫度對游離氨基酸態(tài)氮含量影響的響應面和等高線圖。
【具體實施方式】
[0032] 實施例1
[0033] 1、制備培養(yǎng)基
[0034] 菌種活化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物 技術(shù)有限公司。
[0035] 種子培養(yǎng)基：馬鈴薯液體培養(yǎng)基（將200g馬鈴薯去皮切碎，煮爛后取得土豆汁，加 入20g葡萄糖或者蔗糖，加水至lOOOmL)。
[0036] 發(fā)酵培養(yǎng)基：10%(w/v)經(jīng)絞碎的低值水產(chǎn)品，90%的蒸餾水。
[0037]2實驗方法
[0038]2. 1培養(yǎng)方法
[0039] 平板活化培養(yǎng)：28°C培養(yǎng)3d。
[0040] 種子培養(yǎng)：250mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取所述菌株a食酸菌、 菌株b假單胞菌、菌株c黑曲霉、菌株d酵母各一環(huán)，接入滅菌的種子培養(yǎng)基，用封口膜封 口，在28°C，120rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對數(shù)期取出。
[0041] 發(fā)酵培養(yǎng)：25〇1^錐形瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基5〇1^，按5%接種量將發(fā)酵菌液接入發(fā) 酵培養(yǎng)基中，在28°C，120rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3d。
[0042] 2. 2顯色劑的配制
[0043] 15. 00mL37%甲醛與7. 80mL乙酞丙酮混合，加水定容至lOOmL，劇烈振蕩使其反 應完全，放置12h后使用。
[0044] 2. 3游離氨基酸態(tài)氮含量的測定
[0045] 制作氨基酸態(tài)氮標準曲線。
[0046] 樣品測定：用移液槍吸取10.OmL發(fā)酵上清液于100mL容量瓶中，加水至刻度混勻， 再從中吸取5mL于50mL容量瓶中，加水至刻度，混勻備用。取備用樣品lmL于10mL比色管 中。加4.OmL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4.OmL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100°C 水浴中加熱15min。取出用水冷卻至室溫后，移入lcm比色杯內(nèi)，以零管為參比，于波長 400nm處測量吸光度值，并從標準曲線上查出相應的氮含量，乘以樣品在整個過程中的稀 釋倍數(shù)1000,最后折算成氮含量單位為g/L。
[0047] 2. 4影響發(fā)酵效果的單因素試驗
[0048] 將一定量的種子液接入盛有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中進行搖瓶發(fā)酵，以 游離氨基酸態(tài)氮含量為評價指標，分別探宄了轉(zhuǎn)速、水分含量、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時