專利名稱：生產(chǎn)l－谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-谷氨酸產(chǎn)生菌和使用該細(xì)菌通過發(fā)酵方法生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一種重要的食用、醫(yī)用氨基酸。
迄今，L-谷氨酸一直通過發(fā)酵方法生產(chǎn)，主要使用產(chǎn)L-谷氨酸的所謂棒狀細(xì)菌，它們屬于短桿菌屬或棒桿菌屬(氨基酸發(fā)酵，GakkaiShuppan Center，pp.195-215，1986)。作為這種棒狀細(xì)菌，從自然界中分離的野生型菌株和其突變體被用于提高產(chǎn)率。
另外，現(xiàn)在已經(jīng)公開了多種提高L-谷氨酸生成能力的技術(shù)，它們通過重組DNA技術(shù)改進(jìn)參與L-谷氨酸生物合成系統(tǒng)的酶的基因。例如，日本專利公開63-214189公開了通過改進(jìn)谷氨酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、順烏頭酸水合酶和檸檬酸合酶基因提高L-谷氨酸生成能力的技術(shù)。
另一方面，對L-蘇氨酸來說，已知可以使用破壞該氨基酸吸收系統(tǒng)的技術(shù)來增加該氨基酸的生成(Okamoto，K.et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，61(11)，1877-1882(1997))。
對于L-谷氨酸，已經(jīng)揭示了谷氨酸棒桿菌中L-谷氨酸吸收系統(tǒng)的基因簇(gluABCD操縱子)的結(jié)構(gòu)(Kronemeyer，W.et al.，J.Bacteriol.，177(5)，1152-1158(1995))。并且，Kronemeyer等構(gòu)建了一種菌株，其中缺失了由gluABCD操縱子編碼的L-谷氨酸吸收系統(tǒng)，并使用該菌株研究了L-谷氨酸的分泌。在該研究中，他們認(rèn)為谷氨酸棒桿菌的L-谷氨酸分泌不依賴于gluABCD，而依賴于其他吸收和分泌機(jī)制。此外，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了不是由gluABCD編碼的一種L-谷氨酸吸收系統(tǒng)(Burkovski，A.etal.，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，136，169-173(1996))。這些報(bào)導(dǎo)表明，即使在gluABCD操縱子編碼的L-谷氨酸吸收系統(tǒng)缺失時(shí)，培養(yǎng)基中L-谷氨酸的積累量也不受影響。因此，從未嘗試通過破壞gluABCD編碼的L-谷氨酸吸收系統(tǒng)來提高L-谷氨酸的生成能力。
本發(fā)明的目的是培育具有高的L-谷氨酸生成能力的細(xì)菌菌株，從而提供更有效的廉價(jià)生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，以便滿足對L-谷氨酸日益增長的需要量。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人進(jìn)行了大量研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與上述現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)論相反，一種gluABCD操縱子缺失的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀細(xì)菌具有較高的L-谷氨酸生成能力，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供(1)一種生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細(xì)菌，在培養(yǎng)基中生成和積累L-谷氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸，其中棒狀細(xì)菌中的L-谷氨酸吸收系統(tǒng)缺失或活性降低。(2)上述(1)的方法，L-谷氨酸吸收系統(tǒng)由gluABCD操縱子編碼。(3)上述(2)的方法，其中棒狀細(xì)菌中缺失了gluABCD操縱子的至少一種表達(dá)產(chǎn)物。(4)上述(3)的方法，其中棒狀細(xì)菌中至少缺失了gluA。(5)上述(4)的方法，其中棒狀細(xì)菌中g(shù)luA，gluB，gluC，gluD均缺失。
與傳統(tǒng)技術(shù)相比，本發(fā)明可以以較高的產(chǎn)率生產(chǎn)L-谷氨酸。
本發(fā)明中，“L-谷氨酸生成能力”是指本發(fā)明所用的棒狀細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中積累L-谷氨酸的能力。
以下詳述本發(fā)明。
本發(fā)明的棒狀細(xì)菌是具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細(xì)菌，其中L-谷氨酸吸收系統(tǒng)缺失或活性降低。
在本發(fā)明中屬于棒桿菌屬的細(xì)菌是伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊第8版599頁(1974)中限定的一組微生物。這些細(xì)菌是好氣，革蘭氏陽性，不抗酸，不形成芽胞的桿菌，包括曾被分類為短桿菌屬但現(xiàn)在已歸入棒桿菌屬的細(xì)菌(國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志，41，255(1981))，并包括與棒桿菌屬密切相關(guān)、屬于短桿菌屬和微桿菌屬的細(xì)菌。用于生產(chǎn)L-谷氨酸的優(yōu)選棒狀細(xì)菌的實(shí)例包括如下。
嗜乙酰乙酸棒桿菌醋谷棒桿菌Corynebacterium alkanolyticum美棒桿菌谷氨酸棒桿菌百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)Corynebacterium melassecola
Corynebacyerium thermoaminogenes力士棒桿菌Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒桿菌)黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)Brevibacterium immariophilum乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)玫瑰色短桿菌解糖短桿菌生硫短桿菌產(chǎn)氨短桿菌(產(chǎn)氨棒桿菌)Brevibacterium albumBrevibacterium cerinum嗜氨微桿菌具體而言，可舉出這些細(xì)菌的下列菌株嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷棒桿菌ATCC15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020，13032，13060百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacyerium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868Brevibacterinm divaricatum(谷氨酸棒桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13826，ATCC14067Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13655，ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產(chǎn)氨棒桿菌(產(chǎn)氨短桿菌)ATCC6871Brevibacterium album ATCC15111
Brevibacterium cerinum ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354棒狀細(xì)菌L-谷氨酸吸收系統(tǒng)的上述缺失或活性降低可以通過使用誘變處理或遺傳重組技術(shù)突變或破壞編碼吸收系統(tǒng)的基因來實(shí)現(xiàn)。“L-谷氨酸吸收系統(tǒng)缺失或活性降低”表示使吸收系統(tǒng)功能不正常，包括至少一種組成吸收系統(tǒng)的蛋白缺失或該蛋白的活性降低，兩種或多種蛋白缺失或活性降低。此外，“蛋白缺失”在本文中包括蛋白完全不表達(dá)和表達(dá)的蛋白功能不正常兩種情況。
編碼L-谷氨酸吸收系統(tǒng)的基因可以通過利用同源重組進(jìn)行基因置換來破壞。棒狀細(xì)菌染色體上的基因通過以下方法來破壞用含有缺失了其內(nèi)部序列的修飾基因(缺失型基因)的DNA轉(zhuǎn)化棒狀細(xì)菌，使缺失型基因和染色體上的正?；蛑g發(fā)生重組，因而吸收系統(tǒng)功能不正常。這種利用同源重組的基因破壞技術(shù)是成熟的技術(shù)，在上述技術(shù)中已有利用線性DNA、含有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒等的方法。優(yōu)選利用含有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法。
作為編碼L-谷氨酸吸收系統(tǒng)的基因，gluABCD操縱子是已知的(Kronemeyer，W.et al.，J.Bateriol.，177(5)，1152-1158(1995))。并且，不是由gluABCD操縱子編碼的L-谷氨酸吸收系統(tǒng)也是已知的(Burkovski，A.et al.，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.136，169-173(1996))。盡管這些基因中的任一個都可以被破壞，優(yōu)選由gluABCD操縱子編碼的吸收系統(tǒng)被破壞。
由于該操縱子的核苷酸序列是已知的(GenBank/EMBL/DDBJ登錄號X81191)，該操縱子或gluABCD操縱子中的每一個結(jié)構(gòu)基因都可以使用基于核苷酸序列制備的引物通過PCR從棒狀細(xì)菌染色體中分離出來。可以利用一種或多種限制酶從獲得的基因片段中切除一定的區(qū)域，或者缺失編碼區(qū)或啟動子等表達(dá)調(diào)控序列的至少一部分，以制備缺失型基因。
此外，缺失型基因也可以通過PCR獲得，將引物設(shè)計(jì)成缺失基因的一部分。例如，使用具有序列表序列1和序列2所所示核苷酸序列的引物，可以獲得缺失了一部分5′序列的gluD基因。此外，使用具有序列3和序列4所示核苷酸序列的引物，可以獲得缺失了一部分3′序列的gluA基因。利用通過上述引物獲得的缺失型gluA或gluD基因進(jìn)行基因置換，可以破壞gluA基因或gluD基因。并且，如果將這些缺失型gluA基因和缺失型gluD基因連接，將所獲得的融合基因用于基因置換，可以破壞gluA，gluB，gluC和gluD。此外，當(dāng)使用含有g(shù)luA基因(使用具有序列3和序列5所示核苷酸序列的引物獲得)的質(zhì)粒作為模板，具有序列6和序列7所示核苷酸序列的引物進(jìn)行PCR，并且擴(kuò)增產(chǎn)物環(huán)化時(shí)，可以獲得含有包括內(nèi)部序列缺失和5′區(qū)和3′區(qū)框內(nèi)連接的gluA基因的質(zhì)粒。使用該質(zhì)粒進(jìn)行基因置換時(shí)，只有g(shù)luA基因被破壞。
并且，也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法設(shè)計(jì)除上述實(shí)例以外的引物，使用這些引物破壞gluABCD操縱子中任何結(jié)構(gòu)基因?；蛘?，也可以通過缺失gluABCD操縱子的表達(dá)控制序列如啟動子使得基因無法表達(dá)，使吸收系統(tǒng)缺失。
盡管以下詳述的是gluABCD基因簇(以下稱為gluABCD基因)的基因置換，但任何結(jié)構(gòu)或表達(dá)控制序列均可以類似方式缺失。
宿主染色體上的gluABCD基因可以用缺失型gluABCD基因取代，如下所述。即通過插入溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)、缺失型gluABCD基因和表達(dá)對藥物如氯霉素、四環(huán)素和鏈霉素抗性的標(biāo)記基因構(gòu)建重組DNA，用該重組DNA轉(zhuǎn)化棒狀細(xì)菌。然后在溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)沒有功能的溫度下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌株，再在含有相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得其中重組DNA已經(jīng)整合到染色體DNA中的轉(zhuǎn)化菌株。
在這種菌株中，重組DNA如上所述整合到染色體中，引起本來位于染色體上的gluABCD基因序列的重組，染色體gluABCD基因和缺失型gluABCD基因的融合基因被插入到染色體中，在它們中間是重組DNA的其他部分(載體部分，溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)和藥物抗性標(biāo)記)。因此，由于在這種狀態(tài)下，正常gluABCD基因占優(yōu)勢，轉(zhuǎn)化子菌株表達(dá)L-谷氨酸吸收系統(tǒng)。
然后，為了在染色體上只留下缺失型gluABCD基因，通過兩個gluABCD基因的重組，從染色體DNA上消除一個拷貝的gluABCD基因和載體部分(包括所得敏感型復(fù)制起點(diǎn)和藥物抗性標(biāo)記)。發(fā)生重組時(shí)，染色體DNA上可以留下正常gluABCD基因，缺失型gluABCD基因被切除，或染色體DNA上可以留下缺失型gluABCD基因，正常gluABCD基因被切除。在兩種情況下，如細(xì)胞在溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)有功能的溫度下培養(yǎng)，切除的DNA被保留在細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上。當(dāng)細(xì)胞在溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)沒有功能的溫度下培養(yǎng)時(shí)，質(zhì)粒上的這種DNA從細(xì)胞內(nèi)消除。通過PCR、雜交等檢查染色體上的gluABCD基因結(jié)構(gòu)，可以證實(shí)留在染色體DNA上的基因。
當(dāng)這種gluABCD基因破壞的菌株在溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)有功能的溫度(如低溫)下培養(yǎng)時(shí)，gluABCD基因?qū)Ａ粼诩?xì)胞內(nèi)。當(dāng)它在溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)沒有功能的溫度(如高溫)下培養(yǎng)時(shí)，gluABCD基因?qū)募?xì)胞中消除。
具有在棒狀細(xì)菌中有功能的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的實(shí)例包括pHS4，pHSC4，pHS22，pHSC22，pHS23，pHSC23(參見日本專利公開(Kokoku)7-108228)等。在棒狀細(xì)菌中的這些溫度敏感型質(zhì)粒在約10到32℃的溫度下可以自主復(fù)制，但在約34℃或更高的溫度下不能自主復(fù)制。
如上所述破壞了染色體上的gluABCD基因后，優(yōu)選基因破壞菌株中引入recA-，因?yàn)橐雛ecA-可以防止低溫下培養(yǎng)時(shí)質(zhì)粒上的gluABCD基因再次整合到染色體中。
本發(fā)明的棒狀細(xì)菌中，除了L-谷氨酸吸收系統(tǒng)缺失或活性降低外，催化L-谷氨酸生物合成的酶可以具有提高的活性。催化L-谷氨酸生物合成的酶的說明性實(shí)例包括谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、順烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶等。
并且，在本發(fā)明的棒狀細(xì)菌中，通過從L-谷氨酸生物合成途徑分支催化產(chǎn)生非L-谷氨酸化合物的反應(yīng)的酶可以減少或缺失。通過從L-谷氨酸生物合成途徑分支催化產(chǎn)生非L-谷氨酸化合物的反應(yīng)的酶的說明性實(shí)例包括α-酮戊二酸脫氫酶、異檸檬酸裂合酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶、乙酰羥肟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氫酶等。
此外，通過向具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細(xì)菌中引入生物素活性抑制物如表面活性劑的熱敏突變，該細(xì)菌在生物素活性抑制物存在時(shí)在含有過量生物素的培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生L-谷氨酸(參見WO 96/06180)。作為這種棒狀細(xì)菌，可以提到WO 96/06180中公開的乳發(fā)酵短桿菌AJ13029菌株。AJ13029菌株于1994年9月2日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號為FERM P-14501。其后在1995年8月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號為FERM BP-5189。
當(dāng)具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細(xì)菌中L-谷氨酸吸收系統(tǒng)缺失或活性降低時(shí)，將其在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中可以積累L-谷氨酸。由于本發(fā)明的棒狀細(xì)菌中L-谷氨酸吸收系統(tǒng)缺失或活性降低，阻止了從細(xì)胞中分泌的L-谷氨酸再次被吸收進(jìn)細(xì)胞中。因此，培養(yǎng)基中的L-谷氨酸積累量增加了。根據(jù)本發(fā)明的方法，當(dāng)培養(yǎng)基中L-谷氨酸濃度高時(shí)，預(yù)期階段產(chǎn)率(interval yield)(一定的培養(yǎng)期間L-谷氨酸的積累量與糖的消耗量之比)會提高。具體來說，當(dāng)使用發(fā)酵期間在培養(yǎng)基中積累高濃度L-谷氨酸的高產(chǎn)菌株時(shí)，可以獲得顯著的效果。
用來通過本發(fā)明的微生物生產(chǎn)L-谷氨酸的培養(yǎng)基是普通培養(yǎng)基，含有所需的碳源、氮源、無機(jī)鹽以及其他痕量有機(jī)營養(yǎng)等等。碳源可以是糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物、糖蜜等；醇，如乙醇、肌醇；或有機(jī)酸，如乙酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸等。
氮源可以是無機(jī)銨鹽，如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨，氨，有機(jī)氮，如胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿和大豆水解物，氨氣，氨水等。
加入的無機(jī)離子(或其來源)是少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。至于微量有機(jī)營養(yǎng)，需要以合適的量加入所需的物質(zhì)如維生素B1、酵母提取物等。
優(yōu)選通過振蕩、攪拌通氣在好氣條件下培養(yǎng)16到72小時(shí)。培養(yǎng)溫度控制在30℃到45℃，pH控制在5到9。可以加入無機(jī)或有機(jī)酸性或堿性物質(zhì)、氨氣等調(diào)節(jié)pH。
從培養(yǎng)液中收集L-谷氨酸可以通過例如使用離子交換樹脂的方法、結(jié)晶等實(shí)現(xiàn)。具體來說，L-谷氨酸可以通過陰離子交換樹脂吸附或分離，或通過中和結(jié)晶。


圖1為破壞gluABCD基因的質(zhì)粒pTΔAD的構(gòu)建示意圖。
圖2為破壞gluA的質(zhì)粒pTΔA的構(gòu)建示意圖。
以下將參照具體實(shí)施例更具體地闡明本發(fā)明。
1.破壞gluABCD基因的質(zhì)粒的構(gòu)建為了使用溫度敏感型質(zhì)粒通過同源重組創(chuàng)建gluABCD基因被破壞的棒狀細(xì)菌菌株，構(gòu)建破壞gluABCD基因的質(zhì)粒。
首先，通過克隆具有5′序列缺失的gluD基因并將其與具有3′序列缺失的gluA基因連接構(gòu)建缺失型gluABCD基因。具體而言，由乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869(棒狀細(xì)菌的野生型菌株)的染色體DNA，通過PCR擴(kuò)增從gluD的BamHI位點(diǎn)到gluD下游約270bp的約300bp片段，使用具有序列1和2的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。該擴(kuò)增片段用BamHI和XbaI消化，所得片段與BamHI和XbaI消化的pHSG299(TakaraShuzo)用T4連接酶(Takara Shuzo)連接，獲得質(zhì)粒pHSGΔgluD。
然后，由乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，通過PCR擴(kuò)增從gluA上游約180bp的位點(diǎn)到gluA中的BamHI位點(diǎn)的約300bp片段，使用具有序列3和4的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。該擴(kuò)增片段用BamHI和EcoRI消化，所得片段與BamHI和EcoRI消化的pHSGΔgluD用T4連接酶連接，獲得質(zhì)粒pHSGΔgluAD。該質(zhì)粒中缺失了gluB和gluC，部分gluA和gluD被連接在一起。
然后，為了使pHSGΔgluAD在棒狀細(xì)菌中自主復(fù)制，來源于在棒狀細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)被引入到pHSGΔgluAD中的單一HincII酶切位點(diǎn)。具體而言，使用以下步驟。
含有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒pHSC4(見日本專利公開(kokai)5-7491)用BamHI和KpnI消化。所得DNA片段的兩個末端用平端化試劑盒(Takara Shuzo)平端化，與KpnI接頭(Takara Shuzo)連接，然后使其自身連接獲得pKCT4。PHSC4是按以下方法獲得。即，含有復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段被從質(zhì)粒pAJ1844(見日本專利公開(kokai)58-216199)切除，該質(zhì)粒具有來自pHM1519(K.Miwa et al.，Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)，日本專利公開(Kokai)58-77895)的復(fù)制起點(diǎn)，然后將片段與大腸桿菌質(zhì)粒pHSG298連接，獲得穿梭載體pHK4。該pHK4質(zhì)粒用羥胺處理，獲得修飾成溫度敏感型的質(zhì)粒pHS4。該溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)被從pHS4中切除，連接到pHSG398獲得pHSC4。攜帶pHSC4的大腸桿菌AJ12571于1990年10月11日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號為FERM P-11763。1991年8月26日根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號為FERM BP-3524。
如上所述制備的pKCT4中，來自pHM1519、被修飾成溫度敏感型的復(fù)制起點(diǎn)被插入pHSG399的KpnI位點(diǎn)。通過用KpnI消化pKCT4獲得含有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的片段，用平端化試劑盒(Takara Shuzo)平端化，然后與HincII消化的pHSGΔgluAD連接，獲得pTΔAD(圖1)。
2.破壞gluA基因的質(zhì)粒的構(gòu)建為了創(chuàng)建僅gluA基因被破壞的棒狀細(xì)菌菌株，構(gòu)建破壞gluA基因的質(zhì)粒。
由乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，通過PCR擴(kuò)增含有g(shù)luA基因的約1500bp DNA片段，使用具有序列3和5的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。該擴(kuò)增片段用EcoRI消化，然后與EcoRI消化的pHSG299(Takara Shuzo)用T4連接酶(Takara Shuzo)連接，獲得質(zhì)粒pHSGgluA。
然后，通過PCR擴(kuò)增除gluA基因內(nèi)部區(qū)域以外的gluA基因的5′和3′區(qū)以及載體區(qū)段，使用具有序列6和7的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，pHSGgluA作為模板。上述引物被設(shè)計(jì)成含有BglII識別序列。該擴(kuò)增片段用BglII消化，在T4連接酶存在時(shí)使其自身連接，獲得質(zhì)粒pHSGΔgluA。該質(zhì)粒含有g(shù)luA約730bp開放讀框中約250bp內(nèi)部序列的缺失，并且其5′和3′區(qū)域框內(nèi)連接在一起。
然后，為了使pHSGΔgluA在棒狀細(xì)菌中自主復(fù)制，來源于在棒狀細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)被引入到pHSGΔgluA中的單一KpnI酶切位點(diǎn)。具體而言，用KpnI消化pKCT4，獲得含有復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段，所獲得的片段被插入到pHSGΔgluA的KpnI位點(diǎn)，獲得pTΔA(圖2)。
3.創(chuàng)建gluABCD基因被破壞的菌株和gluA基因被破壞的菌株上述破壞基因的質(zhì)粒pTΔAD和pTΔA被引入野生型菌株乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869菌株，使用電脈沖法獲得ATCC13869/pTΔAD和ATCC13869/pTΔA。使用這些轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行基因破壞。
具體而言，ATCC 13869/pTΔAD和ATCC 13869/pTΔA在CM2B肉湯中25℃下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，接種到含有25μg/ml卡那霉素的CM2B培養(yǎng)基中。34℃下形成菌落的菌株是導(dǎo)入了質(zhì)粒的菌株，在該溫度下溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)沒有功能。然后，通過影印法獲得34°下對卡那霉素敏感的菌株。這些敏感菌株的染色體DNA以常規(guī)方式獲得。染色體上的gluABCD和gluA基因的結(jié)構(gòu)通過PCR和測序檢查，證實(shí)這些基因已用缺失型基因取代，含有缺失型基因的菌株分別被稱為ΔAD菌株和ΔA菌株。
ΔAD菌株和ΔA菌株分別命名為AJ13587和AJ13588，于1999年3月23日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Tbaraki-ken，Japan)，保藏號分別為FERM P-17327和FERM P-17328，于2000年2月14日根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號分別為FERM BP-7028和FERM BP-7029。
4.ΔAD菌株和ΔA菌株L-谷氨酸生成能力的評價(jià)生產(chǎn)L-谷氨酸的ΔAD菌株和ΔA菌株的培養(yǎng)如下進(jìn)行。在CM2B平板培養(yǎng)基中復(fù)蘇的菌株在兩種培養(yǎng)基中于31.5℃下培養(yǎng)，一種培養(yǎng)基在1升去離子水(在pH8.0時(shí)用氫氧化鉀制備)中含有80克葡萄糖、1克磷酸二氫鉀、0.4克7水硫酸鎂、30克硫酸銨、0.01克7水硫酸鐵、0.01克7水硫酸錳、15毫升大豆水解物溶液、200微克鹽酸硫胺素、3微克生物素和50克碳酸鈣，一種培養(yǎng)基另外還含有50克/升L-谷氨酸。培養(yǎng)后，測定培養(yǎng)基中積累的L-谷氨酸量和培養(yǎng)基稀釋51倍后在620納米的稀釋值。未添加L-谷氨酸的培養(yǎng)基的結(jié)果見表1。添加了L-谷氨酸的培養(yǎng)基的結(jié)果見表2。
表1
表2
*產(chǎn)量中未包括加入培養(yǎng)基中的L-谷氨酸。
這些結(jié)果表明，培養(yǎng)基中含有高濃度的L-谷氨酸時(shí)，ΔAD菌株和ΔA菌株的L-谷氨酸的積累量和產(chǎn)率都提高了。并且，即使在不含L-谷氨酸的培養(yǎng)基中，ΔA菌株的L-谷氨酸產(chǎn)率也提高了。
序列表(110)Ajinomoto Co.，Inc.(120)生產(chǎn)L-谷氨酸的方法(130)OP948(141)2000-03-(150)JP11-81693(151)1999-03-25(160)7(170)PatentIn Ver.2.0(210)1(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)1gactggcagg atcctgatta taagg 25(210)2(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)2cgcgtctaga ggcgcttgag caaatcgacc30(210)3(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)3aggtgaattc cggacaggat cggagactac 30(210)4(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)4ttgacttgcc ggatccggat ggtcc 25(210)5(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)5tcatgaattc ctcaccgttt tgaatgaggg 30(210)6(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)6gatgagatct cgttccaaca ggctcatcgc 30(210)7(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)7aagcagatct tcgtgtgttg ttcatggcgg 30
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細(xì)菌以便在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸，由培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸，其中棒狀細(xì)菌中的L-谷氨酸吸收系統(tǒng)缺失或活性降低。
2.權(quán)利要求1的方法，其中L-谷氨酸吸收系統(tǒng)由gluABCD操縱子編碼。
3.權(quán)利要求2的方法，其中棒狀細(xì)菌中缺失了gluABCD操縱子的至少一種表達(dá)產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中棒狀細(xì)菌中至少缺失了gluA。
5.權(quán)利要求4的方法，其中棒狀細(xì)菌中g(shù)luA、gluB、gluC和gluD均缺失。
全文摘要
本發(fā)明提供了更有效地生產(chǎn)L－谷氨酸的新方法,與常規(guī)方法比較費(fèi)用更低,該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L－谷氨酸生成能力的棒狀細(xì)菌以便在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L－谷氨酸,然后由培養(yǎng)基中收集L－谷氨酸,其中所述棒狀細(xì)菌中的L－谷氨酸吸收系統(tǒng)缺失或活性降低。
文檔編號C07K14/345GK1271018SQ00104818
公開日2000年10月25日 申請日期2000年3月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月25日
發(fā)明者木村英一郎, 中松亙, 倉橋修, 大瀧博美 申請人:味之素株式會社