專利名稱：N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記l－谷氨酸的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵和生物提取方法領(lǐng)域，尤其涉及穩(wěn)定性同位素標(biāo)記化合物的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)可采用有機(jī)合成法、微生物發(fā)酵及蛋白分解分離制備法等。采用合成法比較簡單，但需要光學(xué)拆分，使15N原料利用率比較低，成本上升。蛋白分解分離制備法常用于制備復(fù)合氨基酸，要分開所有氨基酸很困難。而采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)，目標(biāo)氨基酸大量富集，分離比較簡單，但由于發(fā)酵配方中有機(jī)氮源很難標(biāo)記，常常使L-谷氨酸-15N的豐度下降很多，達(dá)不到產(chǎn)品要求。目前，在15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)領(lǐng)域中還不見專利和文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種致在解決15N豐度下降的問題，并盡量提高15N利用率的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟(1)發(fā)酵菌株的選擇用于L-谷氨酸生產(chǎn)的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)、鈍齒棒桿菌(Corynebacterium)之一；(2)保藏斜面制備將上述發(fā)酵菌株接種于斜面，29～37℃恒溫培養(yǎng)8～20小時，得到保藏斜面，冷藏待用；(3)活化斜面制備將步驟(2)得到的保藏斜面接種于活化斜面，培養(yǎng)方法同步驟(2)；(4)種子培養(yǎng)將步驟(3)得到的活化斜面菌苔接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在29～37℃下?lián)u床培養(yǎng)8～20小時；(5)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加少量有機(jī)氮源；主要配方如下表所示說 明碳源 葡萄糖6～14g/dL或蔗糖12～25g/dL無機(jī)氮源 尿素0.2～1g/dL、氨水、液氨或氯化銨、硫酸銨、硝酸銨類銨鹽按碳氮比100∶15～30有機(jī)氮源 玉米漿、酵母膏、酪蛋白水解液或菌體水解液0～1mL/dL，使用的有機(jī)氮源中氨基氮濃度5～20g/dLMgSO4.7H2O 0.02～0.08g/dLMnSO4.H2O2～20mg/LFeSO4.7H2O 2～20mg/LVH 100～600μg/LVB150～1000μg/L(6)發(fā)酵工藝將步驟(4)培養(yǎng)好的種子按體積比2～10％接種于已滅菌的裝有步驟(5)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，搖床發(fā)酵控制條件為發(fā)酵初始溫度30～33℃，初始pH6.8～7.2，搖床轉(zhuǎn)速180～240r/min；在OD值凈增0.2～0.6(發(fā)酵液稀釋20倍時測定)將溫度升高到37～39℃，同時提高轉(zhuǎn)速到260～350r/min；在對數(shù)生長早期8～16小時加入0～0.3mL/dL左右的吐溫60，發(fā)酵全過程控制pH在微堿性，添加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨調(diào)節(jié)pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度2～5g/dL，發(fā)酵時間18～60小時；發(fā)酵罐控制條件為發(fā)酵初始溫度30～33℃，初始pH6.8～7.2，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.01～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％飽和度，通過聚醚類或硅酮類消泡劑消泡；在OD值凈增0.2～0.6(發(fā)酵液稀釋40倍時測定)將溫度升高到37～39℃，同時提高轉(zhuǎn)速保證溶解氧在30～50％飽和度；在對數(shù)生長早期5～16小時加入0～0.3mL/dL的吐溫60，發(fā)酵全過程控制pH在微堿性，添加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨調(diào)節(jié)pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度2～5g/dL，發(fā)酵時間18～60小時；(7)分離提取將步驟(6)培養(yǎng)好的發(fā)酵液，通過發(fā)酵液預(yù)處理，即添加草酸除去金屬離子，添加聚丙烯酰胺等絮凝劑、加熱除去蛋白，離心除菌體得到的上清液采用等電點沉淀、離子交換法等分部提取得到15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸溶液，通過真空濃縮趕氨并采用活性炭脫色、乙醇低溫結(jié)晶、真空干燥得到產(chǎn)品。
所述的步驟(1)中谷氨酸棒桿菌是指谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、AS1.805和它們的突變株之一，黃色短桿菌是指黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、TC2568溫度敏感突變株、TSH5459溫度敏感突變株和它們的突變株之一，乳糖發(fā)酵短桿菌是指乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、AJ11360和它們的突變株之一，北京棒桿菌是指北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)AS1.299、7338、S9114、WTH-1和它們的突變株之一，鈍齒棒桿菌是指鈍齒棒桿菌(Corynebacterium)AS1.542、B9和它們的突變株之一。
所述的步驟(5)發(fā)酵培養(yǎng)基中，玉米漿、菌體水解液等有機(jī)氮源添加極少量0～1mL/dL，使用的有機(jī)氮源中氨基氮濃度5～20g/dL，以使其對15N豐度的影響降低到最低限度；通過直接添加大量生長因子生物素和VB1來促進(jìn)生長，減少有機(jī)氮源的缺乏對菌體生長的影響。
所述的步驟(6)中溶解氧的控制通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓實現(xiàn)。
所述的步驟(6)中細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞轉(zhuǎn)型的控制通過在OD值凈增0.2～0.6時提高溫度、添加吐溫60等表面活性劑和提高溶氧來實現(xiàn)。
所述的步驟(6)中pH的控制通過流加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨來實現(xiàn)。
所述的步驟(6)中通過流加50g/dL葡萄糖溶液控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度2～5g/dL。
所述的步驟(7)中15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的提取工藝采用同位素分析專用質(zhì)譜儀或光譜分析法分析15N豐度。
如果采用常規(guī)發(fā)酵方法，15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸產(chǎn)品雖然相對較高，但15N豐度下降很大，往往下降3％以上，很難達(dá)到高豐度產(chǎn)品要求。采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵雖然對15N豐度影響不大，但產(chǎn)酸量太低使得15N原料利用率不高。通過改變發(fā)酵配方和工藝，本發(fā)明獲得的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸產(chǎn)量比采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酸量相應(yīng)提高10~50％以上，而15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸15N豐度下降可以減少到1％以下，有的甚至幾乎不下降，大大提高了15N原料利用率，減少了生產(chǎn)成本。同時，在保證產(chǎn)品15N豐度條件下，簡化發(fā)酵和提取工藝，由于原料得到充分利用大大節(jié)省了原料回收成本。本發(fā)明可利用低豐度和高豐度15N無機(jī)原料滿足不同豐度產(chǎn)品要求。
本發(fā)明利用微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)，控制有機(jī)氮源添加量，直接添加生產(chǎn)因子，通過物理條件控制細(xì)胞膜通透性，并采用低糖流加工藝改善產(chǎn)酸率。這樣可使15N原料得到有效利用，豐度下降不致于影響產(chǎn)品生產(chǎn)要求。本發(fā)明比傳統(tǒng)L-谷氨酸提取工藝要精細(xì)，并采用同位素專用質(zhì)譜儀或光譜法分析15N豐度，純度分析采用常規(guī)方法。
具體實施例方式
實施例1使用菌種為以黃色短桿菌為出發(fā)菌誘變選育獲得的溫度敏感突變株TC2568，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、搖瓶種子和發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。使用的種子和發(fā)酵初始配方如下表所示。
種子配方發(fā)酵初始配方葡萄糖 3.0g/dL 6.0g/dL尿素(豐度5.31％)0.5g/dL 0.5G/dL玉米漿 0.2mL/dL 0.05mL/dL
MgSO4·7H2O 0.04g/dL 0.06g/dLMnSO4·H2O 10mg/L 200mg/LFeSO4·7H2O 10mg/L 200mg/LVH 100μg/L 200μg/LVB1 150μg/L 350μg/L流加用葡萄糖濃度為50g/dL，流加用尿素濃度為20g/dL，都分開高壓滅菌，上述種子和發(fā)酵初始配方中尿素也分消。
將黃色短桿菌TC2568從斜面接種于上述種子培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝量20mL)，30℃、220rpm于巡回式搖床上培養(yǎng)10小時左右。按5％接種量將上述種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL裝量20mL，共接4瓶)，在33℃、220rpm條件下于巡回式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)10小時左右，當(dāng)PH下降到6.4左右時開始流加20g/dL尿素控制PH在微堿性。當(dāng)OD值凈增0.4左右時調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為37℃、轉(zhuǎn)速280rpm，直到發(fā)酵終了。發(fā)酵全過程通過流加50g/dL葡萄糖控制發(fā)酵液的殘?zhí)菨舛仍?g/dL左右，發(fā)酵培養(yǎng)42小時結(jié)束，發(fā)酵平均產(chǎn)酸64g/L。
將上述發(fā)酵液加熱半小時后離心分離(3000rpm，10分)，所得到的上清液用鹽酸調(diào)節(jié)PH至L-谷氨酸等電點，并放于冰箱等電結(jié)晶(過夜)。將過濾得到的晶體用水溶解后調(diào)PH2.0再上陽離子交換樹脂(H+型)吸附，水洗后用1N氨水洗脫，將得到的L-谷氨酸-15N單斑洗脫液濃度，再結(jié)晶并過濾得到的晶體真空干燥得到L-谷氨酸-15N固體4.37克。并將等電結(jié)晶的母液調(diào)PH2.0后上陽離子交換樹脂(H+型)吸附，水洗后用0.02N NH4Cl洗脫，將得到的L-谷氨酸-15N單斑洗脫液濃縮后再上柱，水洗將NH4Cl洗掉后再換0.5N氨水洗脫，洗脫液再重復(fù)按上述方法得到L-谷氨酸-15N固體1.22克?？偣驳玫?.59克產(chǎn)品，經(jīng)質(zhì)譜分析得到產(chǎn)品豐度5.29％，豐度下降0.377％。
如果將種子培養(yǎng)基中玉米漿改為2.0mL/dL，發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿改為1.0mL/dL，可以得到7.24克產(chǎn)品，但豐度只有4.74％，豐度下降10。73％。如果種子和發(fā)酵培養(yǎng)基中不加玉米漿，可以得到3.21克產(chǎn)品，豐度5.31％，豐度幾乎不下降。綜合考慮，本發(fā)明效果顯著。
實施例2使用菌種為以黃色短桿菌為出發(fā)菌誘變選育獲得的溫度敏感突變株TSH5459。15N原料改為98.32％豐度尿素，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、搖瓶種子和發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。使用的種子和發(fā)酵初始配方如下表所示。
種子配方發(fā)酵初始配方葡萄糖 3.0g/dL 8.0g/dL尿素(豐度5.31％) 0.55g/dL 0.55g/dL玉米漿 0.6mL/dL 0.1mL/dLMgSO4·7H2O 0.04g/dL 0.06g/dLMnSO4·H2O2mg/L 20mg/LFeSO4·7H2O 2mg/L 20mg/LVH 100μg/L 300μg/LVB1 150μg/L 450μg/L流加用葡萄糖濃度為50g/dL，流加用尿素濃度為22g/dL，都分開高壓滅菌，上述種子和發(fā)酵初始配方中尿素也分消。
將黃色短桿菌TSH5459從斜面接種于上述種子培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝量20mL)，31℃、220rpm于巡回式搖床上培養(yǎng)12小時左右。按5％接種量將上述種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL裝量20mL，共接6瓶)，在33℃、220rpm條件下于巡回式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)10小時左右，當(dāng)PH下降到6.4左右時開始流加22g/dL尿素，控制PH在微堿性。當(dāng)OD值凈增0.5左右時調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為37℃、轉(zhuǎn)速280rpm直至發(fā)酵終止。發(fā)酵全過程通過流加50g/dL葡萄糖控制發(fā)酵液的殘?zhí)菨舛葹?～3g/dL，發(fā)酵培養(yǎng)40～46小時。發(fā)酵平均產(chǎn)酸62g/L。
采用的分離提取方法同實施例1，最后共得到產(chǎn)品6.0克，經(jīng)質(zhì)譜分析得到產(chǎn)品豐度97.73％，產(chǎn)品純度99.44％，豐度下降0.6％，完全滿足產(chǎn)品生產(chǎn)要求。
權(quán)利要求
1.15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟(1)發(fā)酵菌株的選擇用于L-谷氨酸生產(chǎn)的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)、鈍齒棒桿菌(Corynebacterium)之一；(2)保藏斜面制備將上述發(fā)酵菌株接種于斜面，29～37℃恒溫培養(yǎng)8～20小時，得到保藏斜面，冷藏待用；(3)活化斜面制備將步驟(2)得到的保藏斜面接種于活化斜面，培養(yǎng)方法同步驟(2)；(4)種子培養(yǎng)將步驟(3)得到的活化斜面菌苔接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在29～37℃下?lián)u床培養(yǎng)8～20小時；(5)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加少量有機(jī)氮源；主要配方如下表所示說 明碳源 葡萄糖6～14g/dL或蔗糖12～25g/dL無機(jī)氮源 尿素0.2～1g/dL、氨水、液氨或氯化銨、硫酸銨、硝酸銨類銨鹽按碳氮比100∶15～30有機(jī)氮源 玉米漿、酵母膏、酪蛋白水解液或菌體水解液0～1mL/dL，使用的有機(jī)氮源中氨基氮濃度5～20g/dLMgSO4.7H2O 0.02～0.08g/dLMnSO4.H2O 2～20mg/LFeSO4.7H2O 2～20mg/LVH100～600μg/LVB1 50～1000μg/L(6)發(fā)酵工藝將步驟(4)培養(yǎng)好的種子按體積比2～10％接種于已滅菌的裝有步驟(5)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，搖床發(fā)酵控制條件為發(fā)酵初始溫度30～33℃，初始pH6.8～7.2，搖床轉(zhuǎn)速180～240r/min；在OD值凈增0.2～0.6(發(fā)酵液稀釋20倍測定)時將溫度升高到37～39℃，同時提高轉(zhuǎn)速到260～350r/min；在對數(shù)生長早期8～16小時加入0～0.3mL/dL左右的吐溫60，發(fā)酵全過程控制pH在微堿性，添加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨調(diào)節(jié)pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度2～5g/dL，發(fā)酵時間18～60小時；發(fā)酵罐控制條件為發(fā)酵初始溫度30～33℃，初始pH6.8～7.2，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.01～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％飽和度，通過聚醚類或硅酮類消泡劑消泡；在OD值凈增0.2～0.6(發(fā)酵液稀釋40倍測定)時將溫度升高到37～39℃，同時提高轉(zhuǎn)速保證溶解氧在30～50％飽和度；在對數(shù)生長早期5～16小時加入0～0.3mL/dL的吐溫60，發(fā)酵全過程控制pH在微堿性，添加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨調(diào)節(jié)pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度2～5g/dL，發(fā)酵時間18～60小時；(7)分離提取將步驟(6)培養(yǎng)好的發(fā)酵液，通過發(fā)酵液預(yù)處理，即添加草酸除去金屬離子，添加聚丙烯酰胺等絮凝劑、加熱除去蛋白，離心除菌體得到的上清液采用等電點沉淀、離子交換法等分部提取得到15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸溶液，通過真空濃縮趕氨并采用活性炭脫色、乙醇低溫結(jié)晶、真空干燥得到產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中谷氨酸棒桿菌是指谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、AS1.805和它們的突變株之一，黃色短桿菌是指黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、TC2568溫度敏感突變株、TSH5459溫度敏感突變株和它們的突變株之一，乳糖發(fā)酵短桿菌是指乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、AJ11360和它們的突變株之一，北京棒桿菌是指北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)AS1.299、7338、S9 114、WTH-1和它們的突變株之一，鈍齒棒桿菌是指鈍齒棒桿菌(Corynebacterium)AS1.542、B9和它們的突變株之一。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(5)發(fā)酵培養(yǎng)基中，玉米漿、菌體水解液等有機(jī)氮源添加極少量0～1mL/dL，使用的有機(jī)氮源中氨基氮濃度5～20g/dL，以使其對15N豐度的影響降低到最低限度；通過直接添加大量生長因子生物素和VB1來促進(jìn)生長，減少有機(jī)氮源的缺乏對菌體生長的影響。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(6)中溶解氧的控制通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓實現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(6)中細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞轉(zhuǎn)型的控制通過在OD值凈增0.2～0.6時提高溫度、添加吐溫60等表面活性劑和提高溶氧來實現(xiàn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(6)中pH的控制通過流加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨來實現(xiàn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(6)中通過流加50g/dL葡萄糖溶液控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度2～5g/dL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(7)中15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酸的提取工藝采用同位素分析專用質(zhì)譜儀或光譜分析法分析15N豐度。
全文摘要
本發(fā)明涉及
文檔編號C12P13/00GK1539984SQ20031010816
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者譚青喬, 呂志賢, 杜曉寧, 李良君, 梅叢笑, 侯靜華, 宋明鳴 申請人:上?；ぱ芯吭?br>