專利名稱：一種制造手性二氯菊酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及手性二氯菊酸的制備方法，特別提供了一種以生物催化劑動力學(xué)拆分法制造。
二氯菊酸(又稱DV菊酸，英文名稱Permethrinic acid)是合成擬除蟲菊酯農(nóng)藥的酸部分組成的重要中間化合物。二氯菊酸，即2,2-二甲基-3-(2,2-二氯乙烯基)環(huán)丙烷羧酸，如(Ⅰ)所示 因它的環(huán)丙烷環(huán)上存在兩個手性碳原子，因此有R(+)和S(-)兩種構(gòu)型，還有順式和反式兩種異構(gòu)，共有四種異構(gòu)體。作為擬除蟲菊酯農(nóng)藥的酸部組成，不同異構(gòu)體的二氯菊酸，其殺蟲效力表現(xiàn)出顯著的差異。其中手性R(+)二氯菊酸是有效體，而手性S(-)二氯菊酸是無效體；對順式和反式結(jié)構(gòu)，一般而言，R(+)-順-二氯菊酸效力最高，而則次之，然而對于某些特殊擬除蟲菊酯R(+)-反-二氯菊酸是不可或缺的。由手性催化劑催化環(huán)丙烷化雖然可以得到R(+)二氯菊酸，但尚難達(dá)到很高的光學(xué)活性。因此研究開發(fā)方便經(jīng)濟(jì)的生物催化劑拆分法制造R(+)二氯菊酸也成為一個重要途徑。
目前已報道的生物催化劑拆分法制備R(+)-反-二氯菊酸的方法有1．豬肝酯酶拆分法(M.Schneider et al.,Angew.Chem Int.Ed.Eg.,23:64(1984))。2．球形節(jié)桿菌(Arthobacter globiformis)及其酯酶拆分方法(光田賢等，(日)特開昭60-244296(1985),63-251099(1988))。豬肝酯酶拆分法，使用活力高的酶，得到了R(+)-二氯菊酸的光學(xué)活性(純度)達(dá)90％，但是，豬肝酯酶價格偏高，供生產(chǎn)使用有一定的限制，需通過酶固定化來解決。球形節(jié)稈菌酯酶拆分法，水解率18.0％時，二氯菊酸的R(+)-反/R(+)-順=88.9/11.1，但是，此菌種難以得到，而且未經(jīng)誘變或基因工程改造的菌株，活力比較低。
本發(fā)明的目的在于提供一種制造手性二氯菊酸的方法，其所生產(chǎn)出的手性二氯菊酸中R(+)-反-二氯菊酸具有較高的收率，并且方法簡單，適于工業(yè)化應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，以消旋的(±)-二氯菊酸酯為原料；以酯酶為催化劑，催化(±)-二氯菊酸酯不對稱水解反應(yīng)，反應(yīng)在緩沖溶液中或水中常溫攪拌或振蕩下進(jìn)行，其特征在于水解反應(yīng)中加入特定的添加物改變酶反應(yīng)的微環(huán)境，特定添加物為寡糖、多糖、非離子型表面活性劑之一種，其在反應(yīng)體系中的重量濃度在0.001～2％，最好在0.1～1％圍內(nèi)。
所述多糖可以為蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉子糖、葡聚糖、瓊脂糖、糊精，非離子表面活性劑可以為蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水山梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。
本發(fā)明所用的原料為消旋的二氯菊酸酯，如(Ⅱ)所示 R為C1-C4烷基及孟基，其順式與反式比例在10～90/90～10范圍內(nèi)，二氯菊酸酯在反應(yīng)溶液中重量濃度為0.1～40％，最好為1～10％。
本發(fā)明所用的脂酶(EC.3.1.1.1)是由新鮮的哺乳動物(如豬、馬、狗、兔等)的肝臟提取的酯酶粗提物，如日本天野酶公司的產(chǎn)品，美國Sigma化學(xué)公司的產(chǎn)品和本實驗室的提取物，或由細(xì)菌和酵母菌提取的酯酶粗提物。酯酶活力在0.1-20u(國際單位)/mg范圍內(nèi)。酯酶可以固態(tài)或液態(tài)形態(tài)使用，可以吸附或共價鍵合方法固定于無機(jī)成有機(jī)載體上使用，固定化酶便于酶回收反復(fù)使用，酯酶的用量為底物二氯菊酸酯的0.1～10％，最好0.5～5％。。
水解反應(yīng)的介質(zhì)為磷酸鹽、碳酸鹽、硼酸鹽的無機(jī)鹽緩沖溶液、的有機(jī)鹽緩沖溶液、蒸餾水或脫離子水；控制反應(yīng)溶液pH在3～11范圍內(nèi)，最好為6～8；水解反應(yīng)溫度在20～70℃范圍內(nèi)，最好為30～50℃；水解反應(yīng)時間，根據(jù)酶量添加物和反應(yīng)溫度等的不同，在6～96小時之間，最好8～72小時。
一般地為改進(jìn)酶的功能，如提高酶反應(yīng)速度和對映體選擇性，有二種途徑改變酶反應(yīng)的微環(huán)境或定位改變酶的某些氨基酸殘基(蛋白質(zhì)工程方法)。本發(fā)明通過加入特定的添加物寡糖及多糖化合物，可能經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)作用，提高了酯酶的對映體和非對映體的選擇性，從而改變了酶反應(yīng)的微環(huán)境，明顯地提高了酶反應(yīng)速度和對目的手性二氯菊酸的選擇性，在生產(chǎn)上可以方便地實施?？傊?，本發(fā)明方法所用的特定的改變酶反應(yīng)微環(huán)境的添加物，可以明顯地加快酯酶催化水解二氯菊酸酯的水解速度，同時可以提高對映體及非對映體的空間選擇性。對水解反應(yīng)速度可加快一倍以上，對R(+)-反-二氯菊酸在四種異構(gòu)體中的含量可提高20％以上。而且，這種通過添加物改變酶反應(yīng)微環(huán)境以提高酶的功能的方法，比之通過化學(xué)鍵合改變酶的某些氨基酸殘基以提高酶的功能的方法要簡便得多，更適合工業(yè)上應(yīng)用。下面通過實施例詳述本發(fā)明。
實施例1
取10ml0.1MNaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)置入一三角瓶中，加入消旋的二氯菊酸乙酯(順式/反式=40/60)1.20g(5.04mM)，非離子型表面活性劑tween80,50mg，豬肝酯酶(Sigma化學(xué)公司粗酶，活力20u/mg)100mg，于40℃下振蕩(～200轉(zhuǎn)/分)反應(yīng)24小時，加36％鹽酸，用4-甲基-2-戊酮萃取(10ml,2次)。萃取液用HPCL法(C18柱，6.4×200mm，甲醇/水=1∶1,PH3,1ml/min,254nm)，測定反應(yīng)生成的二氯菊酸和未水解的二氯菊酸乙酯的含量，由之計算水解率為35.37％。之后，向萃取液中加入等體積1N NaOH，搖動分相，使水解生成的二氯菊酸形成鈉鹽進(jìn)入水相。水相再用36％鹽酸酸化，調(diào)到pH2以下，二氯菊酸逐漸析出。將結(jié)晶產(chǎn)品過濾，結(jié)晶用蒸餾水淋洗三次，干燥(-100℃)，得二氯菊酸0.300g，對水解率35.37％應(yīng)得二氯菊酸(0.373g)計，收率80.43％。結(jié)晶二氯菊酸的四個異構(gòu)體含量用GC法測定(10％QF-1柱，5m，氫焰鑒測器)。取二氯菊酸樣品50mg，加等克分子的氯化亞砜、吡啶和(-)-孟醇的甲苯溶液，于100℃回流1小時衍生化后，進(jìn)行測定，得到R(+)-反-二氯菊酸71.79％,S(-)-反-二氯菊酸26.69％,R(+)-順-二氯菊酸1.12％,S(-)-順-二氯菊酸0.40％。
實施例2取豬肝酯酶(Sigma化學(xué)公司粗酶，20u/mg)100mg，右旋糖苷100mg，加入到10ml0.1MNaH2PO4～Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)中，搖勻，放入4℃冰箱中過夜后，加入消旋的二氯菊酸乙酯(順式/反式=40/60)1.20g(5.04mM)，升溫至40℃，振蕩(～200轉(zhuǎn)/分)反應(yīng)48小時。按實施例1所述方法，測定水解率30.34％，得二氯菊酸結(jié)晶0.200g，對水解率30.34％應(yīng)得之二氯菊酸(0.320g)計，收率68.75％；測定二氯菊酸結(jié)晶的四種異構(gòu)體的含量為R(+)-反-二氯菊80.39％,S(-)-反-二氯菊酸19.61％,R(+)-順-二氯菊酸0％,S(-)-順-二氯菊酸0％。
實施例3取豬肝酯酶(Sigma化學(xué)公司粗酶，20u/mg)10mg，乳糖50mg,Tween80 50mg，加入到10ml0.1MNa2HPO4緩沖溶液(pH8.0)中，搖勻后，加入消旋的二氯菊酸乙酯(順式/反式=40/60)1.20g(5.04mM)，于40℃，振蕩(～200轉(zhuǎn)/分)反應(yīng)24小時。按實施例1所述的方法，測定水解率為21.70％，得二氯菊酸結(jié)晶(0.216g，對此水解率下應(yīng)得二氯菊酸(0.229g)計，收率為94.32％；測定二氯菊酸結(jié)晶的四個異構(gòu)體的含量為R(+)-反-二氯菊酸89.33％,S(-)-反-二氯菊酸10.67％,R(+)-順-二氯菊酸～0％,S(-)-順-二氯菊酸0％。
比較例1取10ml,0.1MNaH2PO4～Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)置入一三角瓶中，加入消旋的二氯菊酸乙酯(順式/反式=40/60)1.20g(5.04mM)，搖勻，再加入豬肝酯酶(Sigma化學(xué)公司粗酶，活力20u/mg)100mg，于40℃下振蕩(～200轉(zhuǎn)/分)反應(yīng)48小時。按實施例1所述的方法，測定水解率為31.55％，得二氯菊酸結(jié)晶0.220g，對此水解率下應(yīng)得之二氯菊酸(0.241g)計，收率為91.29％；測定二氯菊酸結(jié)晶的四個異構(gòu)體的含量為R(+)-反-二氯菊酸67.43％,S(-)-反-二氯菊酸28.94％,R(+)-順-二氯菊酸2.25％,S(-)-順-二氯菊酸1.11％。
權(quán)利要求
1.一種制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，以消旋的(±)-二氯菊酸酯為原料；以酯酶為催化劑，催化(±)-二氯菊酸酯不對稱水解反應(yīng)，反應(yīng)在緩沖溶液中或水中常溫攪拌或振蕩下進(jìn)行，其特征在于水解反應(yīng)中加入特定的添加物改變酶反應(yīng)的微環(huán)境，特定添加物為寡糖、多糖、非離子型表面活性劑之一種，其在反應(yīng)體系中的重量濃度在0.001％-2％范圍內(nèi)。
2.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于所述多糖為蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉子糖、葡聚糖、瓊脂糖、糊精。
3.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于所述非離子表面活性劑為蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水山梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。
4.按權(quán)利要求1、2或3所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于添加物在反應(yīng)體系中的重量濃度為0.1～1％。
5.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于所述(+)-二氯菊酸中順式與反式異構(gòu)體比例在10～90/90～10范圍之間，在反應(yīng)溶液中重量濃度在1～40％范圍中。
6.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于二氯菊酸酯在反應(yīng)溶液中重量濃度為1～10％。
7.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于所述酯酶由新鮮豬肝、其他哺乳動物肝臟、細(xì)菌或酵母菌提取，活力不低于0.1u/mg，酯酶的用量為底物二氯菊酸酯的0.1～10％，最好0.5～5％。
8.按權(quán)利要求7所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于酯酶的用量為底物二氯菊酸酯的0.5-5％。
9.按權(quán)利要求1所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于水解反應(yīng)的介質(zhì)為磷酸鹽、碳酸鹽、硼酸鹽的無機(jī)鹽緩沖溶液、的有機(jī)鹽緩沖溶液、蒸餾水或脫離子水；控制反應(yīng)溶液pH在3～11范圍內(nèi)；水解反應(yīng)溫度在20～70℃范圍內(nèi)；水解反應(yīng)時間在6～96小時之間。
10.按權(quán)利要求9所述制造手性R(+)-反-二氯菊酸的方法，其特征在于控制反應(yīng)溶液pH在6～8；水解反應(yīng)溫度在30～50℃；水解反應(yīng)時間8～72小時。
全文摘要
一種制造手性R(+)－反－二氯菊酸的方法,以消旋的(±)－二氯菊酸酯為原料;以酯酶為催化劑,催化(±)－二氯菊酸酯不對稱水解反應(yīng),反應(yīng)在緩沖溶液中或水中常溫攪拌或振蕩下進(jìn)行,其特征在于:水解反應(yīng)中加入特定的添加物改變酶反應(yīng)的微環(huán)境,特定添加物為寡糖、多糖、非離子型表面活性劑之一種,其在反應(yīng)體系中的重量濃度在0.001%－2%范圍內(nèi)。本發(fā)明方法所用的特定的改變酶反應(yīng)微環(huán)境的添加物,可以明顯地加快酯酶催化水解二氯菊酸酯的水解速度,同時可以提高對映體及非對映體的空間選擇性。
文檔編號C07CGK1303844SQ00110029
公開日2001年7月18日 申請日期2000年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月12日
發(fā)明者邵昌平, 劉韌, 潘桂芝, 韓梅, 鄭卓 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所