專利名稱：通過酶去除游離硫醇來改善蛋白質(zhì)底物的酶處理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用第一種酶(如，巰基氧化酶)對蛋白質(zhì)底物的酶處理。所述第一種 酶除去了蛋白質(zhì)底物中存在的酶抑制劑，如游離硫醇。除去底物中的抑制化合物使得第二 種酶能有效地發(fā)揮酶作用，如通過酪氨酸酶對底物中存在的蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)交聯(lián)。
背景技術(shù)：
W002/14484和 W002/14595報道了從極毛桿菌科(Pseudomonadaceae)分離的酪氨 酸酶，及其用于蛋白質(zhì)交聯(lián)，特別是作為羊毛纖維的蛋白質(zhì)纖維的交聯(lián)的用途。W02006/084953報道了從木霉屬(Trichoderma)可獲得的酪氨酸酶，及其在使食 品蛋白質(zhì)交聯(lián)中的用途。根據(jù)一般反應2RSH+02 — RS_SR+H202，巰基氧化酶催化巰基氧化成二硫化物。多種巰基氧化酶是本領(lǐng)域已知的，例如源自酵母的巰基氧化酶可從例 如 X_Zyme(Ervlp 禾口 Ervlp—Xl)GmbH(Duesseldorf/ 德 國)(http://www.x-zyme. com/de/products. html)購 得；R. S. de la Motte 禾口 F.W.Wagner, Biochemistry 26 (1987) 7363-7371提供了一種來自黑曲霉(Aspergillus niger)的巰基氧化酶； US 4，087，328報道了從奶中制得的巰基氧化酶；US 4，632，905報道了獲自醬油曲霉 (Aspergillus sojae)的巰基氧化酶；US 4，894，340報道了來自黑曲霉的巰基氧化酶； Hoober 等，1996，Journal of Biological Chemistry 271，No. 48，pp30510_30516 提供了 雞蛋蛋白巰基氧化酶。巰基氧化酶在食品應用中的使用是已知的，例如，用于焙烤中EP0321811B公開 了巰基氧化酶可以用于強化面團，顯然與葡萄糖氧化酶結(jié)合。EP0705538B報道了牛和微生 物巰基氧化酶已經(jīng)用作酶添加劑，與半纖維素酶結(jié)合用于面團中。W02006/046146指出巰基 氧化酶可以用于硬質(zhì)小麥粉焙烤產(chǎn)品的制備中。W02007/093674報道了通過添加酪氨酸酶制備低配料肉制品的方法，并且涉及由 酪氨酸酶改性的低配料肉制品。將酪氨酸酶用于改變低配料肉制品的質(zhì)地或水結(jié)合特性， 該低配料肉制品具有低含量的至少鹽、磷酸鹽或肉。Lantto等，LffT 389(2006) 1117-1124報道了在豬肉中應用微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、 蘑菇酪氨酸酶以及含有多酚氧化酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的蘋果粉。它報道了所有酶制劑都能夠 改善未加熱肉勻漿的凝膠硬度。添加的半胱氨酸對蘋果粉處理的豬肉的硬度具有正面影 響，但對蘑菇酪氨酸酶和微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的肉具有負面影響。發(fā)明概述本發(fā)明是基于以下的發(fā)現(xiàn)天然存在于蛋白質(zhì)底物(如，蛋白質(zhì)食料)中的抑制劑 (如，游離硫醇)引起一些酶(如，酪氨酸酶)的抑制，以及可能能夠降低或消除這些抑制劑 的第一種酶(如，巰基氧化酶)的使用使得受到抑制劑抑制的酶(如，酪氨酸酶)能有效地 用于例如交聯(lián)蛋白質(zhì)底物中存在的蛋白質(zhì)，這可以改善蛋白質(zhì)底物的凝膠強度、保水性和/ 或改善其質(zhì)地。在一個方面中，本發(fā)明涉及在用活性受到游離硫醇抑制的第二種酶處理之前或同時，用第一種酶(如，巰基氧化酶)處理蛋白質(zhì)底物。第一種酶除去蛋白質(zhì)底物中存在的酶 抑制劑，如游離硫醇。去除底物中的抑制化合物使得第二種酶能更有效地作用，如通過酪氨 酸酶對底物中存在的蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)交聯(lián)。在另一個方面中，本發(fā)明提供了制備交聯(lián)蛋白質(zhì)底物的方法，所述方法包括步 驟a.用能夠除去游離硫醇的第一種酶處理包含游離硫醇的蛋白質(zhì)底物；b.用活性受到游離硫醇抑制的第二種酶處理蛋白質(zhì)底物；其中在步驟b)之前或同時進行步驟a)，并且其中步驟b)導致所述蛋白質(zhì)底物中 存在的蛋白質(zhì)的交聯(lián)。在另一個方面中，本發(fā)明提供了含有第一種酶和第二種酶的酶系統(tǒng)，其中第一種 酶是能夠從蛋白質(zhì)底物除去游離硫醇的酶，并且第二種酶是酪蛋白酶。本發(fā)明進一步提供了用于降低蛋白質(zhì)底物中游離硫醇濃度的第一種酶，如巰基氧 化酶的用途。在另一個方面中，本發(fā)明提供了改善其活性受到游離硫醇的存在抑制的第二種酶 對蛋白質(zhì)底物的酶活性的方法，所述方法包括用能夠除去游離硫醇的第一種酶處理蛋白質(zhì) 底物；其中在用第二種酶處理之前或同時進行第一種酶的處理，并且第一種酶和第二種酶 不是相同的酶。在進一步的方面中，本發(fā)明提供了制備交聯(lián)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的方法，所述方法包括步 驟a.用能夠降解或氧化游離硫醇的第一種酶處理蛋白質(zhì)底物；b.用第二種酶處理蛋白質(zhì)底物；其中在步驟b)之前或同時進行步驟a)，并且其中步驟b)導致所述蛋白質(zhì)底物中 存在的蛋白質(zhì)的交聯(lián)。以上的方法導致蛋白質(zhì)交聯(lián)的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的制備。蛋白質(zhì)底物可以是蛋白質(zhì)食料。蛋白質(zhì)產(chǎn)品可以是蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)交聯(lián)食料。本發(fā)明還提供了通過以上方法制得的交聯(lián)蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并且在蛋白質(zhì)底物是蛋白 質(zhì)食料的情況下，本發(fā)明還提供了食品，其包含蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)交聯(lián)食品。本發(fā)明還提供了包含肌球蛋白的蛋白質(zhì)食料或食品，其呈現(xiàn)出增強的保水性和/ 或提高的凝膠強度，并且其中蛋白質(zhì)食品中存在的部分肌球蛋白的至少一部分是交聯(lián)的。 可以將該產(chǎn)品的保水性和凝膠強度與沒有使用本發(fā)明方法制得的，或如在此另外限定的相 似產(chǎn)品相比較。附圖簡述

圖1 用TrTyr2和TG酶處理的肉提取物。泳道含有以下的提取物/處理1)火雞 /TG酶，2)火雞/TrTyr2，3)火雞/參照，4)鱈魚/TG酶，5)鱈魚/TrTyr2，6)鱈魚/參照， 7)牛肉/TG酶，8)牛肉/TrTyr2，9)牛肉/參照，10)豬肉/TG酶，11)豬肉/TrTyr2，12)豬 肉/參照，13)雞肉/TG酶，14)雞肉/TrTyr2，15)雞肉/參照，16)羊肉/TG酶，17)羊肉/ TrTyr2,18)羊肉/參照。圖2 對含有(泳道1-3)和不含(泳道4-6) STPP的緩沖液滲析的豬肉提取物。用TG酶(泳道1和4)、TrTyr2 (泳道2和5)處理的提取物，或是參照(泳道3和6)。圖3 在更多酶處理之前用巰基氧化酶處理的提取物的SDS-PAGE凝膠?！案逽0X” 表示用0. 33U/ml的處理。低SOX表示0. 033nkat/mlo a)豬肉提取物。泳道含有(第一種 酶處理/第二種酶處理)1)高巰基氧化酶/TG酶，2)高巰基氧化酶/TrTyr2，3)高巰基氧 化酶/無處理，4)低巰基氧化酶/TG酶，5)低巰基氧化酶/TrTyr2，6)低巰基氧化酶/無處 理，7)無處理/TG酶，8)無處理/TrTyr2，9)無處理/無處理。b)牛肉提取物。泳道含有 (第一種酶處理/第二種酶處理)1)高巰基氧化酶/TG酶，2)高巰基氧化酶/TrTyr2，3) 高巰基氧化酶/無處理，4)低巰基氧化酶/TG酶，5)低巰基氧化酶/TrTyr2，6)低巰基氧化 酶/無處理，7)無處理/TG酶，8)無處理/TrTyr2，9)無處理/無處理。圖4說明了從不同肉提取物制得的凝膠的凝膠強度和WHC與蛋白質(zhì)含量正相關(guān)。 注意到該圖只是描繪了參照樣品(無酶處理)。從鱈魚提取物制得的凝膠是不均一的，這使 得凝膠強度測量產(chǎn)生了很大的變化。然而，始終低于其他凝膠的。圖5 :a 從蛋白質(zhì)提取物產(chǎn)生的不同熱誘導的凝膠的凝膠強度，其用水(參照；η =3)，酪蛋白酶單獨(TrTyr2 ；η = 2)，酪蛋白酶和巰基氧化酶同時(TrTyr2+巰基氧化酶； η = 1)或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG酶；η = 2)進行了處理。b 與描繪WHC的相似。誤差棒表示標
準偏差。發(fā)明詳述在一個方面中，公開了制備交聯(lián)蛋白質(zhì)底物的方法，所述方法包括步驟a.用能夠除去游離硫醇的第一種酶處理含有游離硫醇的蛋白質(zhì)底物；b.用活性受到游離硫醇抑制的第二種酶處理蛋白質(zhì)底物；其中在步驟b)之前或同時進行步驟a)，并且其中步驟b)導致所述蛋白質(zhì)底物中 存在的蛋白質(zhì)的交聯(lián)，并且其中第一種酶和第二種酶不是相同的酶。在進一步的方面中，公開了改善第二種酶對含有游離硫醇的蛋白質(zhì)底物的酶活性 的方法，第二種酶的活性受到游離硫醇的存在的抑制，所述方法包括用能夠游離硫醇的第 一種酶處理蛋白質(zhì)底物；其中在用第二種酶處理之前或同時進行用第一種酶的處理，并且 其中第一種酶和第二種酶不是相同的酶。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)底物中酪氨酸酶的抑制可能是由于蛋白質(zhì)底物中存 在的游離硫醇的存在引起的。本發(fā)明是基于至少部分除去蛋白質(zhì)底物的游離硫醇含量，由 此至少部分地減輕第二種酶(如，酪氨酸酶)的抑制。本發(fā)明特別涉及肉加工工業(yè)，其中認為酪氨酸酶是用于提高保水性、改善凝膠強 度以及改善所加工肉制品的質(zhì)地和口感的合適加工助劑。酶處理本發(fā)明提供了制備交聯(lián)蛋白質(zhì)底物的方法，所述方法包括步驟a.用能夠除去游離硫醇的第一種酶處理含有游離硫醇的蛋白質(zhì)底物；b.用活性受到游離硫醇抑制的第二種酶處理蛋白質(zhì)底物；其中在步驟b)之前或同時進行步驟a)，并且其中步驟b)導致所述蛋白質(zhì)底物中 存在的蛋白質(zhì)的交聯(lián)，并且其中第一種酶和第二種酶不是相同的酶。本發(fā)明進一步提供了制備交聯(lián)蛋白質(zhì)產(chǎn)品(如，蛋白質(zhì)交聯(lián)的食料)的方法，所述 方法包括步驟
a.用能夠降解或氧化游離硫醇的第一種酶處理蛋白質(zhì)底物；b.用第二種酶處理蛋白質(zhì)底物；其中在步驟b)之前或同時進行步驟a)，并且其中步驟b)導致所述蛋白質(zhì)底物中 存在的蛋白質(zhì)的交聯(lián)，以產(chǎn)生交聯(lián)的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。本發(fā)明進一步提供了改善第二種酶對含有游離硫醇的蛋白質(zhì)底物的酶活性的方 法，第二種酶的活性受到游離硫醇的存在的抑制，所述方法包括用能夠除去游離硫醇的第 一種酶處理蛋白質(zhì)底物；其中在用第二種酶處理之前或同時進行第一種酶的處理，并且其 中第一種酶和第二種酶不是相同的酶。在一個實施方案中，如步驟a)中用第一種酶的處理導致蛋白質(zhì)底物的游離硫醇 濃度降低至少5%。在一個實施方案中，如步驟a)中用第一種酶的處理導致蛋白質(zhì)底物的游離硫醇 濃度降低至少ι μ M。在一個實施方案中，如步驟a)中用第一種酶的處理導致蛋白質(zhì)底物的游離硫醇 濃度降低，這種降低足以改善第二種酶交聯(lián)底物(如，蛋白質(zhì)食料)中存在的蛋白質(zhì)(其可 以是肌球蛋白)的能力?？梢酝ㄟ^i)蛋白質(zhì)底物中存在的蛋白質(zhì)與ii)通過本發(fā)明的方法獲得的本發(fā) 明的交聯(lián)蛋白質(zhì)產(chǎn)品相比較的SDS-PAGE分析來測定交聯(lián)蛋白質(zhì)產(chǎn)品中存在的蛋白質(zhì)交 聯(lián)。ii)與i)比較的SDS-PAGE中蛋白質(zhì)平均大小的改善是蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)品的表示。還原 SDS-PAGE適于通過酪蛋白酶活性形成的蛋白質(zhì)交聯(lián)沒有受到還原劑(二硫蘇糖醇或巰基 乙醇)的影響。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)食品包含肌球蛋白，并且在步驟a)和b)之后，處理過 的(即，交聯(lián)的)蛋白質(zhì)食品中存在的肌球蛋白的交聯(lián)程度是至少5%。以上的方法可以用于提高蛋白質(zhì)底物(例如，食料)的凝膠強度或保水性，或兩 者-使得在進行了步驟a)和b)之后，與蛋白質(zhì)底物相比，蛋白質(zhì)交聯(lián)的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中的這 些參數(shù)中的一個或多個得到了增強。第一種酶第一種酶通常選擇作為能夠減輕蛋白質(zhì)底物(如，肉提取物，例如，豬肉提取物) 內(nèi)第二種酶抑制的酶。實施例提供了怎樣進行這樣的肉提取的方案。如實施例中所公開 的，酪氨酸酶斑點試驗可以用于測量酪氨酸酶抑制，及其減輕，使用游離的半胱氨酸作為對 照抑制劑，或肉提取物，如根據(jù)實施例制備的豬肉提取物。從本發(fā)明的分析看，認為蛋白質(zhì)底物中存在的抑制劑底物之一或關(guān)鍵抑制劑底物 是游離硫醇，如游離半胱氨酸。因此，在這樣的實施方案中，將能夠從蛋白質(zhì)底物中除去游 離硫醇的酶在此稱為“第一種酶”。應當認識到術(shù)語“除去游離硫醇”指的是降低(即，減少)蛋白質(zhì)底物中存在的游 離硫醇濃度，這可以使用第一種酶(其可能是氧化酶)來合適地進行。因此，應當認為術(shù)語“除去游離硫醇”不必需涉及缺乏任何游離硫醇的蛋白質(zhì)底物 /產(chǎn)品的制備，只要游離硫醇的濃度降低了。在一個實施方案中，術(shù)語“除去游離硫醇”或“降低游離硫醇的濃度”指的是“游離 硫醇的氧化”。
因此，本發(fā)明提供了第一種酶的用途，用于降低蛋白質(zhì)底物(如，蛋白質(zhì)食料)中 游離硫醇的濃度?？梢允褂媚軌驈牡鞍踪|(zhì)底物中除去游離硫醇的酶來進行從蛋白質(zhì)底物中除去游 離硫醇?？梢允褂糜坞x硫醇耗盡試驗來鑒定這樣的酶。在一個實施方案中，游離硫醇耗盡 試驗使用了根據(jù)實施例制備的碎豬肉底物提取物。將一單位的酶活性定義為在pH7. 4和30°C下，在磷酸鹽緩沖液中ImM底物下，每分 鐘消耗Iymol游離硫醇基團(如，游離半胱氨酸或谷胱甘肽)的酶量。還可以以開特(用于催化活性的SI單位)來限定催化活性，其是在預定的底物濃 度、溫度和PH下，每秒鐘轉(zhuǎn)化Imol底物需要的酶量。因此，lnkat/g等于0. 06單位/g的比酶活性，或1單位/g等于16. 6nkat/g。從蛋白質(zhì)底物中除去游離硫醇的一種方法是氧化游離硫醇成分或其部分_因此， 在一個這樣的實施方案中，第一種酶優(yōu)選是氧化酶(氧化_還原酶)。在一個實施方案中，第一種酶是氧化酶，如呈現(xiàn)出以下一種或多種活性的酶巰基 氧化酶、漆酶(E. C. 1. 10. 3. 2)、谷胱甘肽氧化酶和二硫化物異構(gòu)酶。在一個實施方案中，第一種酶呈現(xiàn)出選自EC 1. 8. 3. 2和1. 8. 3. 3的酶活性。在一個實施方案中，第一種酶是巰基氧化酶，或呈現(xiàn)出巰基氧化酶活性，艮口， E. C. 1. 8. 3. 2。在一個實施方案中，第一種酶是產(chǎn)生過氧化氫的酶，如碳水化合物氧化酶，如葡萄 糖氧化酶或己糖氧化酶。在這樣的實施方案中，發(fā)明人考慮了所產(chǎn)生的過氧化氫氧化了存 在的游離硫醇，由此減輕了酪氨酸酶的抑制。術(shù)語巰基氧化酶(SOX)通過如國際生物化學和分子生物學聯(lián)盟(IUBMB)的命名委 員會所列出的酶分類E. C. 1. 8. 3. 2來限定，限定為根據(jù)等式2RSH+02 —RSSR+H202將硫醇化 合物轉(zhuǎn)化成相應的二硫化物的酶。各種巰基氧化酶是本領(lǐng)域已知的，并且可以用于本發(fā)明的目的中。在一個實施 方案中，巰基氧化酶可以分離自，或源自微生物來源，如真菌，如酵母或曲霉。EP0321881、 EP0338452和EP0705538報道了微生物巰基氧化酶在焙烤應用中的用途。優(yōu)選的巰基氧化酶可以源自黑曲霉，如de la Motte和Wagner Biochemistry 26(1987)7363-737中所述的巰基氧化酶。US4, 632，905提供了來自醬油曲霉的巰基氧化酶，在此引入作為參考。其他巰基氧化酶包括牛巰基氧化酶。曲霉SOX酶-NCBI登錄號-在此將以下記錄引入作為參考。1 :CAB58940. unnamed protein ρ··· [gi 6090366]2 :EAU34803. FAD-Iinked sulfhy— [gi 114193103]3 :XP_754731. FAD dependent sul... [gi :71000028]4 :XP_749041. FAD dependent sul... [gi 70987121]5 :XP_001213534. FAD-Iinked sulfhy— [gi 115395790]6 :EAL92693. FAD dependent sul... [gi 66852368]7 :EAL87003. FAD dependent sul... [gi 66846671]8 :XP_001273306. FAD dependent sul…[gi :121711381]
9 :XP_001270904. FAD dependent sul...[gi:121705282]10 :EAffll880. FAD dependent sul...[gi:119401457]11:EAff09478. FAD dependent sul... [gi :119399050]12 :CAK40401. sulphydryl oxidas- [gi :134078459]13 :XP_001401908. hypothetical prot- [gi :145257982]14 :CAK38806. unnamed protein p... [gi :134074512]15 :CAL00471. unnamed protein p... [gi :134083103]16 :CAK49098. unnamed protein p... [gi :134078570]17 :XP_001397560. hypothetical prot- [gi :145252094]18 :BAE55270. unnamed protein p... [gi :83765127]19 :XP_001402401. hypothetical prot- [gi :145256027]20 :XP_001208942. augmenter of live- [gi :115384790]21 :EAU38334. augmenter of live- [gi :114196634]22 :XP_661363. hypothetical prot- [gi :67526603]23 :XP_660631. hypothetical prot- [gi :67525139]24 :EAA63598. hypothetical prot- [gi :40744422]25 :EAA59967. hypothetical prot- [gi :40740777]酵母SOX-酶-NCBI登錄號-在此將以下記錄引入作為參考。1 :EDN61625sulfhydryl oxidas- [gi :151943312]2 :EDN61173sulfhydryl oxidas- [gi :151942827]3 :P27882Mitochondrial FAD- [gi :2506175]4 :Q12284FAD-linked sulfhy- [gi :2492823]5 :lJRA_DChain D, Crystah.. [gi :18158801]6 :lJRA_CChain C, Crystah.. [gi :18158800]7 :lJRA_BChain B, Crystah.. [gi :18158799]8 :lJRA_AChain A, Crystah.. [gi :18158798]9 :lJR8_BChain B, Crystal- [gi :18158797]10 :lJR8_AChain A, Crystal- [gi :18158796]11 :P55789FAD-linked sulfhy- [gi :2492821]12 CAA92143unknown [Saccharo--- [gi :1072405]13 :AAB48659regulatory protei- [gi :172378]14 :CAB16284sulfhydryl oxidas- [gi :2408079]15 :P36046Intermembrane spa." [gi :90110034]16 :CAB46757sulfhydryl oxidas- [gi :5441486]17 :NP_011543Ervlp[Saccharomy- [gi :6681846]18 :NP_015362Erv2p [Saccharomy- [gi :6325296]19 :CAA97017ERV1 [Saccharomyc- [gi :1945314]20 :CAA97016ERV1 [Saccharomyc- [gi :1945313]21 :CAA48192ERV1 [Saccharomyc- [gi :404218]
22 :CAA94987unknown [Saccharo...23 :CAA43129regulatory protei·24 :CAH56919unnamed protein p.25 :NP_005685C0X17 homolog, cy·26 :XP_570710thiol oxidase[Cr·27 :AAW43403thiol oxidase, pu-28 :CAL0047lunnamed protein p.29 :NP_005253ervl-like growth· .[gi =4305] .[gi 52747921] ‘· [gi 5031645] .[gi 58267108] [gi 57226944] .[gi 134083103] .[gi 54112432]30 :CAK38806unnamed protein p··· [gi : 134074512]31 :XP_001397560hypothetical prot— [gi 145252094]32 :AAA96390ERV1 [Homo sapien... [gi 6136037]33 :CAD25469PR0TEIN OF THE ER... [gi : 19069001]34 :XP_001644445hypothetical prot— [gi : 156842152]35 :XP_001642797hypothetical prot— [gi 156837548]36 :ED016587hypothetical prot— [gi 156115088]37 :ED014939hypothetical prot— [gi 156113366]38 :XP_001382524predicted protein— [gi : 150863891]39 :XP_001383309predicted protein— [gi : 126133569]40 :ABN64495predicted protein...[gi : 149385147]41 :ABN65280predicted protein— [gi 126095458]42 :XP_570522hypothetical prot— [gi 58266732]43 :AAW43215conserved hypothe...[gi 57226755]EP0565172提供了合適的巰基氧化酶，在此引入作為參考，如SEQ ID NOl中所示。SEQ ID NO 1 >gi 1134078459 | emb | CAK40401. 11 來自專利 EP565172-A1 的巰基氧化酶 Sox-黑曲霉MAPKSLFYSLFSTISVALASSIPQTDYDVIVVGGGPAGLSVLSSLGRMRRKTVMFDSGEYRNGVTREMHDVLGFDGTPPAQFRGLARQQISKYNSTSVIDIKIDSITPVEDAMNSSYFRAVDANGTQYTSRKVVLGTGLVDVIPDVPGLREAWGKGIWWCPffCDGYEHRDEPLGILGGLPDVVGSVMETHTLYSDIIAFTNGTYTPANEVALMKYPNWKQQLEAWNVGIDNRSIASIERLQDGDDHRDDTGRQYDIFRVHFTDGSSVVRNTFITNYPTAQRSTLPEELSLVMVDNKIDTTDYTGMRTSLSGVYAVGDCNSDGSTNVPHAMFSGKRAGVYVHVEMSREESNAAISKRDFDRRALEKQTERMVGNEMEDLffKRVLENHHRRS已經(jīng)報道了漆酶(EC 1. 10. 3. 2)直接氧化SH基團(參考Applied and Environmental Microbiology, 2000 年 2 月，p. 524-528，Vol. 66，No. 2)。因此，在一個實施
方案中，第一種酶是漆酶，或呈現(xiàn)出漆酶活性。術(shù)語“漆酶活性”通過如國際生物化學和分子生物學聯(lián)盟(IUBMB)的命名委員會 所列出的酶分類E. C. 1. 10. 3. 2 (漆酶)來限定；或酶分類EC 1. 10. 3. 1 (兒茶酚氧化酶)， 酶分類EC 1. 10. 3. 4 (ο-氨基酚氧化酶)，或酶分類EC 1. 3. 3. 5 (膽紅素氧化酶)。各種漆酶是本領(lǐng)域已知的，例如，W02007/054034A中公開的那些，其報道了來 自天藍色鏈霉菌的漆酶，特別是由W02007/054034A的SEQ IDNO :2的1至343表示的漆酶，在此引入作為參考。在本發(fā)明的一個實施方案中，氧化酶是漆酶，如多孔屬漆酶，如 W096/00290中所述的薄蓋單孔云芝漆酶(也稱為長絨毛栓菌漆酶)(來自Novo Nordisk Biotech.，Inc.)或毀絲霉屬(Myceliophthera)漆酶，尤其是W095/33836中所述的嗜熱毀 絲霄(Myceliophthera thermophila)漆醇(來自 Novo Nordisk Biotech. ,Inc.)。此夕卜， 漆酶可以是Scytalidium漆酶，如W095/33837中所述的S. thermophilium漆酶(來自Novo Nordisk Biotech. , Inc.)或 Pyricularia 漆酶，如 Pyricularia oryzae 漆酶,其可以依據(jù) 商品名SIGMA no. L5510購自SIGMA，或鬼傘屬漆酶，如毛革蓋菌(C. cinereus)漆酶，尤其 是毛革蓋菌IFO 30116漆酶，或絲核菌漆酶，如Rh. solani漆酶，尤其是W095/07988所述的 中性Rh. Solani漆酶(來自Novo Nordisk A/S)，其具有6. O至8. 5的最佳pH。漆酶也可 以源自真菌，如Collybia、Fomes、Lentinus、Pleurotus、曲霉、脈孢菌、普特斯阿屬、射脈菌 屬(Phlebia)，例如，輻射脈菌屬(P. radiata) (W092/01046)，革蓋菌屬(Coriolus)，例如， 毛革蓋菌(JP2-238885)，或Botrytis。W001/83770中描述了更多的漆酶。術(shù)語“谷胱甘肽氧化酶”(GOX)通過如國際生物化學和分子生物學聯(lián)盟(IUBMB)的 命名委員會所列出的酶分類E. C. 1. 8. 3. 3來限定，為催化2谷胱甘肽+0(2)=氧化的谷胱 甘肽+H(2)0(2)反應的酶，并且也可以催化半胱氨酸和幾種其他硫醇的氧化。在一個實施 方案中，可以通過測量在氧存在下緩沖液中谷胱甘肽消失來測定谷胱甘肽活性。在這樣的 實施方案中，一“G0X”單位是在30°C和pH7下，每分鐘氧化1 μ mol谷胱甘肽需要的酶含量。第一種酶的用量在一個實施方案中，第一種酶具有至少0. 01nkat/mg的比活性，如至少0. Inkat/ mg,如至少lnkat/mg,如至少10nkat/mg,如至少50nkat/mg,如至少100nkat/mg,如至少 200nkat/mg,如至少300nkat/mg。在一個實施方案中，第一種酶具有不高于500nkat/mg 的比活性，如不高于300nkat/mg，如不高于100nkat/mg，如不高于10nkat/mg，如不高于 5nkat/mg，如不高于 lnkat/mg。在一個實施方案中，將第一種酶以0.00001mg/g至100mg/g蛋白質(zhì)底物的量加入 到蛋白質(zhì)底物中，如0. 01mg/g至10mg/g，如0. 10mg/g至5mg/g。在一個實施方案中，每g 蛋白質(zhì)底物加入至少0. OOOOlmg的第一種酶，如至少0. 0001mg/g，如至少0. 001mg/g，如至 少0.01mg/g。在一個實施方案中，每g蛋白質(zhì)底物加入至多IOmg的第一種酶，如至多5mg/ g,如至多l(xiāng)mg/g，如至多0. 5mg/g，如至多0. 2mg/g。在一個實施方案中，加入的第一種酶的量為0.01至lnkat/g蛋白質(zhì)底物(或食 品)，如 0. 02 至 0. 5nkat/g。第二種酶除去蛋白質(zhì)底物中的抑制化合物使得第二種酶可以更有效地發(fā)揮作用，如通過酪 氨酸酶，使底物中存在的蛋白質(zhì)更有效地交聯(lián)。在一個實施方案中，第二種酶是催化作用受到游離硫醇的存在抑制的酶。在一個 實施方案中，蛋白質(zhì)底物中第二種酶(如，酪氨酸酶)的催化作用將導致蛋白質(zhì)的交聯(lián)。在一個實施方案中，術(shù)語“改善”限定為根據(jù)本發(fā)明處理的產(chǎn)品中第二種酶的催化 活性與沒用第一種酶處理的產(chǎn)品中第二種酶的催化活性相比較的增加。在一個實施方案中，術(shù)語“改善”限定為可測量參數(shù)(如，凝膠強度)的改變，這種 改變將由制造商或消費者感知為改善。
在一個實施方案中，術(shù)語“改善”限定為根據(jù)本發(fā)明處理的產(chǎn)品中的保水性與沒用 第一種酶處理的產(chǎn)品中的保水性相比較的改善。在另一個實施方案中，術(shù)語“改善”限定為根據(jù)本發(fā)明處理的產(chǎn)品中的交聯(lián)與沒用 第一種酶處理的產(chǎn)品中的交聯(lián)相比較的改善。在另一實施方案中，術(shù)語“改善”限定為根據(jù)本發(fā)明處理的產(chǎn)品中的質(zhì)地與沒用第 一種酶處理的產(chǎn)品的質(zhì)地相比較的改善。在一個實施方案中，酶活性導致蛋白質(zhì)底物(如，肉)中存在的蛋白質(zhì)的交聯(lián)。施 用于蛋白質(zhì)底物(如，肉)中的蛋白質(zhì)的交聯(lián)的第二種酶的實例是酪氨酸酶。在一個實施方案中，第一種酶和第二種酶不是相同的酶。在一個實施方案中，第二種酶選自酪氨酸酶、漆酶、脂肪氧合酶、半乳糖氧化酶、蛋 白質(zhì)溶素6-氧化酶(賴氨酰氧化酶)、半乳糖脂酶和溶血磷脂酶。在一個實施方案中，第二種酶選自酪氨酸酶、漆酶、脂肪氧合酶和蛋白質(zhì)溶素 6_氧化酶(賴氨酰氧化酶)、半乳糖脂酶和溶血磷脂酶。在進一步的實施方案中，第二種酶 選自脂肪氧合酶和蛋白質(zhì)溶素6-氧化酶(賴氨酰氧化酶)。在進一步的實施方案中，第二 種酶是漆酶。更優(yōu)選，酶是屬于EC編號1. 14. 18. 1所述組的酪氨酸酶。在一個方面中，第二種酶是酪氨酸酶，其是通過如國際生物化學和分子生物學聯(lián) 盟(IUBMB)的命名委員會所列出的酶分類E. C. 1. 14. 18. 1來限定(也稱為單苯基一氧化物 酶)。酪氨酸酶屬于酚氧化酶，其使用氧作為電子受體。傳統(tǒng)上，基于底物特異性和對抑 制劑的敏感性，可以將酪氨酸酶與其他酚氧化酶(即，漆酶)區(qū)分出來。然而，目前的差異 是基于結(jié)構(gòu)特征。酪氨酸酶和漆酶之間的主要結(jié)構(gòu)差異在于酪氨酸酶具有雙核銅位點，在 其活性位點具有兩個III型的銅，而漆酶在活性位點總共具有四個銅原子(I和M型銅，和 一對III型銅)。酪氨酸酶將各種酚化合物氧化成相應的醌。醌是高度反應性的，并且可以 進一步地進行非酶反應。酪氨酸酶的典型底物是酪氨酸(或蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基)，其首 先氧化成DOPA (二羥基苯丙氨酸或蛋白質(zhì)中的DOPA殘基)，然后通過酶進一步氧化成多巴 醌(或蛋白質(zhì)中的多巴醌)。多巴醌可以與多種化學結(jié)構(gòu)(如，其他多巴醌、硫醇和氨基) 進行非酶反應。因此，酪氨酸在一個相同的蛋白質(zhì)中具有兩種酶活性，即，單酚單加氧酶活 性(EC 1. 14. 18. 1)和兒茶酚氧化酶活性(EC 1. 10. 3. 1)，如下所示。
權(quán)利要求
1.交聯(lián)蛋白質(zhì)底物的制備方法，所述方法包括步驟a.用能夠除去游離硫醇的第一種酶處理包含游離硫醇的蛋白質(zhì)底物；b.用其活性受到游離硫醇抑制的第二種酶處理蛋白質(zhì)底物；其中在步驟b)之前或同時進行步驟a)，并且其中步驟b)導致所述蛋白質(zhì)底物中存在 的蛋白質(zhì)的交聯(lián)并且其中第一種酶和第二種酶不是相同的酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第二種酶選自酪氨酸酶、漆酶、脂肪氧合酶和蛋白質(zhì)溶 素6-氧化酶(賴氨酰氧化酶)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中第二種酶選自脂肪氧合酶和蛋白質(zhì)溶素6-氧化酶(賴 氨酰氧化酶)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中第二種酶是漆酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中第二種酶是酪氨酸酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中第一種酶和/或第二種酶是分離或純化形式的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中第一種酶是氧化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中第一種酶不是漆酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中第一種酶具有EC編碼1.8. 3. 2或1. 8. 3. 3。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中第一種酶是巰基氧化酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中第一種酶是谷胱甘肽氧化酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中第一種酶是二硫化物異構(gòu)酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中蛋白質(zhì)底物是蛋白質(zhì)食料，其優(yōu)選包含肌 球蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中蛋白質(zhì)食料含有或源自動物肉，如哺乳動物、鳥或魚肉。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中蛋白質(zhì)食料含有或源自選自豬肉、羊肉、雞肉、牛肉、 火雞、鱈魚、袋鼠、鴕鳥、鯊魚的肉。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中蛋白質(zhì)食料選自豬肉、羊肉和雞肉，最優(yōu)選豬肉。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中第一種和第二種酶存在于相同的酶組合物中。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17任一項的方法，其中在使用前，使第一種酶與第二種酶分離。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項的方法，其中第一種酶和第二種酶以試劑盒的形式作為 酶系統(tǒng)來提供，所述試劑盒包括含有第一種酶的第一個罐和含有第二種酶的第二個罐。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中第一種酶在使用前在0.001與300mg/g之間的濃度 下以酶系統(tǒng)的形式存在。
21.根據(jù)權(quán)利要求19-20任一項的方法，其中第二種酶在使用前在0.001與500mg/g的 濃度下以酶系統(tǒng)的形式存在。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21任一項的方法，其中酶系統(tǒng)是食品加工助劑的形式，用于蛋白 質(zhì)食品的酶處理。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中酶系統(tǒng)包含另外的成分，如一種或多種食品酶組合 物成分和/或載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23任一項的方法，其中步驟a)中游離硫醇的去除導致蛋白質(zhì)底物 的游離硫醇濃度降低至少5%。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項的方法，其中步驟a)中游離硫醇的去除導致蛋白質(zhì)底物 的游離硫醇濃度降低至少ι μ Μ。
26.在前任一項權(quán)利要求中限定的第一種酶的用途，用于降低蛋白質(zhì)底物中游離硫醇 的濃度。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的第一種酶的用途，其中蛋白質(zhì)底物是蛋白質(zhì)食料，其優(yōu)選包含 肌球蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的第一種酶的用途，其中蛋白質(zhì)食料含有或源自動物肉，如哺乳 動物、鳥或魚肉。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的第一種酶的用途，其中蛋白質(zhì)食料含有或源自選自豬肉、羊肉、 雞肉、牛肉、火雞、鱈魚、袋鼠、鴕鳥和鯊魚的肉。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的第一種酶的用途，其中蛋白質(zhì)食料選自豬肉、羊肉和雞肉，最優(yōu) 選豬肉。
31.根據(jù)權(quán)利要求26至30任一項的第一種酶的用途，其導致蛋白質(zhì)底物的游離硫醇濃 度降低至少5%。
32.根據(jù)權(quán)利要求26至31任一項的第一種酶的用途，其導致蛋白質(zhì)底物的游離硫醇濃 度降低至少ι μ Μ。
33.根據(jù)權(quán)利要求26至32任一項的第一種酶的用途，其中蛋白質(zhì)底物的游離硫醇濃度 的降低足以增強第二種酶交聯(lián)該底物中存在的蛋白質(zhì)如肌球蛋白的能力。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的第一種酶的用途，其中第二種酶是如權(quán)利要求1-25任一項中所 限定的。
35.改善其活性受到游離硫醇的存在抑制的第二種酶對含有游離硫醇的蛋白質(zhì)底物的 酶活性的方法，所述方法包括用能夠除去游離硫醇的第一種酶處理蛋白質(zhì)底物；其中在用 第二種酶處理之前或同時進行用第一種酶的處理并且其中第一種酶和第二種酶不是相同 的酶。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中酶活性導致所述蛋白質(zhì)底物中存在的蛋白質(zhì)的交聯(lián)。
37.根據(jù)權(quán)利要求35-36任一項的方法，其中第一種酶是如權(quán)利要求1-26任一項中所 限定的。
38.根據(jù)權(quán)利要求35-37任一項的方法，其中第二種酶選自酪氨酸酶、漆酶、脂肪氧合 酶、半乳糖氧化酶、蛋白質(zhì)溶素6-氧化酶(賴氨酰氧化酶)、半乳糖脂酶和溶血磷脂酶。
39.根據(jù)權(quán)利要求35-38任一項的方法，其中蛋白質(zhì)底物是如權(quán)利要求1-26中任一項 所限定的。
40.蛋白質(zhì)交聯(lián)食料的制備方法，所述方法包括步驟a.用能夠降解或氧化游離硫醇的第一種酶處理蛋白質(zhì)食料；b.用第二種酶處理蛋白質(zhì)食料；其中在步驟b)之前或同時進行步驟a)，并且其中步驟b)導致所述蛋白質(zhì)食品中存在 的蛋白質(zhì)的交聯(lián)。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中能夠降解或氧化游離硫醇的酶是如權(quán)利要求1-25任 一項中所限定的。
42.根據(jù)權(quán)利要求40或41的方法，其中步驟a)包括根據(jù)權(quán)利要求26-34任一項的第 一種酶的用途。
43.根據(jù)權(quán)利要求40-42任一項的方法，其中步驟a)導致蛋白質(zhì)食料的游離硫醇濃度 降低至少5%。
44.根據(jù)權(quán)利要求40-43任一項的方法，其中步驟a)導致蛋白質(zhì)食料的游離硫醇濃度 降低至少1 μ Μ。
45.根據(jù)權(quán)利要求40-44任一項的方法，其中步驟a)導致蛋白質(zhì)食料的游離硫醇濃度 的降低，這種降低足以增強第二種酶交聯(lián)該食品底物中存在的蛋白質(zhì)如肌球蛋白的能力。
46.根據(jù)權(quán)利要求40-45任一項的方法，其中第二種酶是如權(quán)利要求1-25任一項中所 限定的。
47.根據(jù)權(quán)利要求40-46任一項的方法，其中蛋白質(zhì)食品是權(quán)利要求27-30任一項中所 限定的。
48.根據(jù)權(quán)利要求40-47任一項的方法，其中蛋白質(zhì)食料包含肌球蛋白，并且繼步驟a) 和b)之后，處理過的蛋白質(zhì)食品中存在的肌球蛋白的交聯(lián)程度為至少5%。
49.根據(jù)權(quán)利要求40-48任一項的方法，其中在步驟a)和b)之后，與未處理的蛋白質(zhì) 食品相比，蛋白質(zhì)食料的凝膠強度或保水性，或兩者得到增強。
50.通過權(quán)利要求40-49任一項制備的食料。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的蛋白質(zhì)食料，其中所述食品中存在的游離硫醇的濃度不高于 15 μ Μ,或不高于10 μ Μ,或不高于5 μ Μ。
52.根據(jù)權(quán)利要求50至51的蛋白質(zhì)，其中凝膠強度增強了至少2g。
53.根據(jù)權(quán)利要求50至52任一項的蛋白質(zhì)食料，其中保水性增強了至少5%，如至少 10%。
54.根據(jù)權(quán)利要求50至53任一項的蛋白質(zhì)食料，其中總肌球蛋白的至少10%被交聯(lián)。
55.根據(jù)權(quán)利要求50至54任一項的蛋白質(zhì)食料，其中游離硫醇的濃度降低了至少 2 μ Mo
56.根據(jù)權(quán)利要求50至55任一項的蛋白質(zhì)食料，其中蛋白質(zhì)食料源自動物肉，如哺乳 動物、鳥或魚肉。
57.根據(jù)權(quán)利要求50至56任一項的蛋白質(zhì)食料，其中食品不含人造添加劑，特別是如 磷酸鹽的添加劑。
58.包含根據(jù)權(quán)利要求50至57任一項的蛋白質(zhì)食料的加工食品。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的加工食品，其中食品選自熟肉、干&半干咸肉產(chǎn)品、發(fā)酵制品、乳 化制品、魚&海鮮產(chǎn)品、新鮮肉肌肉、碎/重建鮮肉、重新形成的肉、家禽制品、蒸餾制品、高 壓滅菌肉制品、素食&人造肉產(chǎn)品。
60.根據(jù)權(quán)利要求1-25任一項的方法用于制備具有增強的保水性的蛋白質(zhì)食料的用途。
61.根據(jù)權(quán)利要求1-25任一項的方法用于制備具有增強的凝膠強度的蛋白質(zhì)食料的 用途。
62.根據(jù)權(quán)利要求1-25任一項的方法用于制備具有增強的質(zhì)地或口感的蛋白質(zhì)食料 的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用第一種酶(如，巰基氧化酶)處理蛋白質(zhì)底物。所述第一種酶除去蛋白質(zhì)底物中存在的酶抑制劑，如游離硫醇。除去底物中的抑制化合物使得第二種酶能有效地發(fā)揮酶作用，如通過酪氨酸酶對底物中存在的蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)交聯(lián)。
文檔編號C12N9/02GK102006783SQ200980113111
公開日2011年4月6日 申請日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日
發(fā)明者J·坎普, L·S·克里斯坦森, P·E·黛恩 申請人:丹尼斯科公司