專(zhuān)利名稱(chēng)：新的破骨細(xì)胞形成抑制因子、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的編碼人破骨細(xì)胞形成抑制因子-OPG-372的DNA序列，以及此DNA序列編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此DNA序列和多肽的用途和制備。具體地說(shuō)，本發(fā)明的多肽是一種新的與骨有關(guān)的破骨細(xì)胞形成抑制因子，它是一種OPG變體。
老年性骨質(zhì)疏松癥已成為一個(gè)全世界關(guān)注的重要疾病。老年人特別是老年婦女，因?yàn)榇萍に胤置诘闹饾u減少，加上骨微環(huán)境中其它因子的調(diào)節(jié)，致使成骨細(xì)胞活力下降比破骨細(xì)胞活力的下降要快得多。因此，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后就會(huì)表現(xiàn)出明顯骨質(zhì)疏松癥癥狀。老年性骨質(zhì)疏松癥不僅容易引起骨折，影響老年人的生活，而且難以治療。
破骨細(xì)胞形成抑制因子(osteoprotegerin或稱(chēng)osteoclastogenesis inhibitoryfactor以下簡(jiǎn)稱(chēng)OPG)首先是由Simonet等人發(fā)現(xiàn)，它是一種具有抑制破骨細(xì)胞形成的分泌型糖蛋白(W.S.Simonet et al.，Cell.Vol.89，309-319，1997)。隨后，日本學(xué)者Yasuda等人也報(bào)道了該蛋白質(zhì)(Yasuda H.et al.，Endocrinology，1998 vol.139.No.3 p 1329-1337)。經(jīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)OPG基因的鼠將出現(xiàn)骨硬化癥，而OPG基因knock out小鼠則出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥(Simonet，同上，1997)。在摘除卵巢的大鼠中，OPG蛋白可以治療由于缺少雌激素而形成的骨質(zhì)疏松癥，或可以防止由于缺少雌激素而導(dǎo)致的骨質(zhì)流失(Simonet，同上，1997)。另外，OPG在體內(nèi)還有明顯的降血鈣作用，能使正常的和摘除甲狀旁腺的大鼠血鈣濃度明顯下降(Simonet，同上，1997；Yamamoto M.et al.，Endocrinology vol.139 No.9，4012-4015，1998)。到目前為止，OPG調(diào)節(jié)骨密度的機(jī)理主要是一方面OPG抑制破骨細(xì)胞形成(Simonet，1997；Yasuda，1998)，另一方面OPG影響破骨細(xì)胞成活，引起破骨細(xì)胞凋亡(Akatsut.et al.，Biochemical and Biophysical Research Communication，250.229-234，1998)。因此，OPG具有很大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值，即OPG可以預(yù)防和治療老年婦女由于缺少雌激素而引起的骨質(zhì)疏松癥，也可以治療某些高血鈣癥。
然而，在本發(fā)明之前本領(lǐng)域還未報(bào)道破骨細(xì)胞形成抑制因子的其他變體。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)新的破骨細(xì)胞形成抑制因子。
本發(fā)明的目的是提供一種新的人破骨細(xì)胞形成抑制因子OPG-372蛋白以及其片段、類(lèi)似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的DNA序列。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的OPG-372多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的DNA序列，該DNA序列包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人OPG-372多肽的DNA序列；和(b)與DNA序列(a)互補(bǔ)的DNA序列。較佳地，該DNA序列編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該DNA序列的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1119位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中1-1163位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述DNA序列的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述DNA序列直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人OPG-372蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)人OPG-372蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人OPG-372蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人OPG-372多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測(cè)的核酸分子，它含有上述的DNA序列中連續(xù)的10-1163個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人OPG-372多肽活性的化合物，以及抑制人OPG-372多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人OPG-372多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測(cè)樣品中是否存在OPG-372蛋白的方法，它包括將樣品與OPG-372蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在OPG-372蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測(cè)與人OPG-372多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測(cè)編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人OPG-372多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制人OPG-372多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人OPG-372蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人OPG-372多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療骨質(zhì)疏松癥、高鈣血癥等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是OPG-372基因cDNA的凝膠電泳圖。
圖2顯示了含有OPG-372基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-OPG-372。
圖3顯示了含有OPG-372基因的甲醇酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC-OPG-372。
圖4是甲醇酵母表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖譜，其中泳道1為分子量標(biāo)記，泳道7，6，5分別為3、4、5天的樣品，泳道4-2為另二個(gè)單克隆菌株的樣品。
圖5A和5B顯示了含有OPG-372基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-OPG-372和pBacHT-OPG-372。
圖6是Tn-5B1-4細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖譜，其中泳道1為分子量標(biāo)記，泳道2和3為非還原表達(dá)樣品，指示物雙體形成；泳道5和5為還原樣品；泳道6為T(mén)n-5B1-4被未整合OPG基因的Bacmid感染后的表達(dá)樣品。
圖7顯示了對(duì)重組桿狀病毒BacHTOPG-372在Tn-5B1-4細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物用anti-His抗體進(jìn)行的Western印跡分析結(jié)果。
圖8顯示了OPG-372和His-OPG-372在小鼠體內(nèi)的降血鈣活性。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“OPG-372蛋白”、“OPG-372多肽”或“破骨細(xì)胞形成抑制因子OPG-372”可互換使用，都指具有人破骨細(xì)胞形成抑制因子OPG-372氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的破骨細(xì)胞形成抑制因子OPG-372。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的OPG-372蛋白或多肽”是指OPG-372多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化OPG-372蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。OPG-372多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人OPG-372蛋白的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人OPG-372蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類(lèi)似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人OPG-372多肽”指具有人OPG-372蛋白活性的SEQ IDNO.2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人OPG-372蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人OPG-372蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人OPG-372 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人OPG-372多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人OPG-372多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人OPG-372多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人OPG-372多肽序列的至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人OPG-372蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然人OPG-372多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人OPG-372蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
在一個(gè)實(shí)施例中，提供了N端帶His-Tag結(jié)構(gòu)的OPG-372融合蛋白，其在小鼠體內(nèi)的降血鈣作用有所下降。在另一實(shí)施例中，提供了C端5kD左右片段被降解的OPG-372活性片段，該5kD片段的降解對(duì)降血鈣活性幾乎沒(méi)有影響。
本發(fā)明的DNA序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的DNA序列包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的DNA序列”可以是包括編碼此多肽的DNA序列，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的DNA序列。
本發(fā)明還涉及上述DNA序列的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此DNA序列的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)DNA序列的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的DNA序列。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述DNA序列可雜交的DNA序列。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的DNA序列編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼OPG-372蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和DNA序列優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人OPG-372核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫(kù)中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的DNA序列的載體，以及用本發(fā)明的載體或OPG-372蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的OPG-372多肽。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人OPG-372多肽的DNA序列(或變異體)，或用含有該DNA序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
一種優(yōu)選的生產(chǎn)方法是，先通過(guò)將含OPG-372基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化例如大腸桿菌，抽提重組桿狀病毒DNA(重組Bacmid)，從而獲得含OPG-372基因的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒，再轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如粉紋夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4)，以產(chǎn)生本發(fā)明OPG-372蛋白。
本發(fā)明中，人OPG-372DNA序列序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人OPG-372編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門(mén)氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明的DNA序列在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人OPG-372蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療OPG-372蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)筄PG-372蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人OPG-372蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激人OPG-372蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人OPG-372 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人OPG-372基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人OPG-372基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人OPG-372蛋白的分子，也包括那些并不影響人OPG-372蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人OPG-372基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專(zhuān)利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人OPG-372基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人OPG-372蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類(lèi)單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人OPG-372蛋白功能的抗體以及不影響人OPG-372蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類(lèi)抗體可以利用人OPG-372基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人OPG-372基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
抗人OPG-372蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人OPG-372蛋白。此外，與人OPG-372蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人OPG-372蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人OPG-372蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計(jì)成針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人OPG-372蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過(guò)二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人OPG-372蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞(例如淋巴結(jié)細(xì)胞等)。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人OPG-372蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與OPG-372蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于骨質(zhì)疏松癥、高鈣血癥方面的治療。在使用本發(fā)明OPG-372蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療劑，如OPG、雌激素等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明OPG-372多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的OPG-372蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人OPG-372蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于OPG-372蛋白的無(wú)表達(dá)或異常/無(wú)活性的OPG-372蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)成表達(dá)變異的OPG-372蛋白，以抑制內(nèi)源性的OPG-372蛋白活性。來(lái)源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將OPG-372基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶OPG-372基因的重組病毒載體的方法可見(jiàn)于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人OPG-372基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制人OPG-372 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過(guò)編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過(guò)載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與人OPG-372蛋白結(jié)合的多肽分子可通過(guò)篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫(kù)而獲得。篩選時(shí)，必須對(duì)人OPG-372蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人OPG-372蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人OPG-372蛋白水平，可以用作解釋人OPG-372蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷OPG-372蛋白起作用的疾病。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在OPG-372蛋白的方法是利用OPG-372蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與OPG-372蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在OPG-372蛋白。
OPG-372蛋白的多聚核苷酸可用于OPG-372蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，OPG-372蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)OPG-372蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下OPG-372蛋白的異常表達(dá)。如OPG-372 DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷OPG-372蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開(kāi)的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的DNA序列的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱(chēng)為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用OPG-372蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)OPG-372蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)OPG-372基因的突變也可用于診斷OPG-372蛋白相關(guān)的疾病。OPG-372蛋白突變的形式包括與正常野生型OPG-372 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)本發(fā)明OPG-372蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見(jiàn)于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通過(guò)與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過(guò)連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的DNA序列，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的DNA序列是從人正常肝細(xì)胞的中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的DNA序列序列全長(zhǎng)為1163個(gè)堿基，其開(kāi)放讀框位于1-1119位，編碼全長(zhǎng)為373個(gè)氨基酸的人OPG-372蛋白(SEQ ID NO2)。去除了起始甲硫氨酸后的長(zhǎng)度為372個(gè)氨基酸，故稱(chēng)為OPG-372蛋白。
隨后，從中國(guó)人胎盤(pán)總RNA中也克隆了OPG-372基因，證明OPG-372基因并非是由于組織間差異產(chǎn)生。對(duì)兩個(gè)正常中國(guó)人外周血淋巴細(xì)胞和加拿大人胎腎細(xì)胞株OPG基因的3’基因組序列分析表明，OPG-372的產(chǎn)生也并非是由于人種間差異和RNA水平加工所致。這表明，OPG-372是一種廣泛存在的、正常的人破骨細(xì)胞形成抑制因子的變體。OPG-372為治療骨質(zhì)疏松癥、高鈣血癥等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1OPG-372基因的克隆和大腸桿菌克隆質(zhì)粒pSK-OPG-372的構(gòu)建為了得到OPG成熟肽編碼序列，根據(jù)國(guó)外報(bào)道的OPG基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物OPGPRI1和OPGPRI2，其核苷酸序列分別為OPGPRI15’-GGATCCATGAAACGTTTCCTCCAAAGTACC-3’(SEQ ID NO3)OPGPRI25’-ACCTCGAGGCCATTTCCAGTTATAAGCAGC-3’(SEQ ID NO4)其中，OPFPRI1為OPG成熟蛋白N端的編碼序列；OPGPRI2為OPG C端編碼序列以及終止密碼子后面的非編碼區(qū)的互補(bǔ)序列。
以O(shè)PGPRI1和OPGPRI2為引物，以從中國(guó)人肝細(xì)胞株L02和中國(guó)人胎盤(pán)中抽提的總RNA為模板合成的第一鏈cDNA為模板，PCR擴(kuò)增OPG基因序列，在其5’端和3’端分別引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)。PCR條件為94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 2min，共35個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)94℃變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。在約1200bk處有一擴(kuò)增條帶。
PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖純化后，克隆到pSK(+)的EcoRV位點(diǎn)中，構(gòu)建質(zhì)粒pSK-OPG-372。經(jīng)測(cè)序獲得了SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，編碼一個(gè)新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2所示)。
分析表明，該新蛋白的基因與國(guó)外報(bào)道的OPG基因相比有一個(gè)堿基差別，但這一堿基變化產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子，使這一變體蛋白質(zhì)比國(guó)外報(bào)道的蛋白質(zhì)C端少8個(gè)氨基酸，因此我們將此變體基因稱(chēng)為OPG-372基因。
進(jìn)一步試驗(yàn)表明，從中國(guó)人肝細(xì)胞株L02和胎盤(pán)中所克隆的序列相一致。對(duì)從兩個(gè)中國(guó)人的外周血淋巴細(xì)胞和一個(gè)加拿大胎腎細(xì)胞株中克隆的OPG基因3’端的基因組序列進(jìn)行的分析結(jié)果表明，三者所得的序列與cDNA序列一致。因此，認(rèn)為OPG-372變體基因不是由于組織間差異，也不是由于RNA水平加工，也并非人種間差異致，而是一個(gè)具有普遍性基因。
實(shí)施例2含有OPG-372基因的大腸桿菌表達(dá)pET-OPG-372的構(gòu)建將pSK-OPG-372質(zhì)粒用BamHI和XhoI雙酶切，分離出質(zhì)粒上的OPG-372基因，并與事先經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的pET-28a(+)質(zhì)粒相連接，構(gòu)建形成含OPG-372基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-OPG-372(圖2)。
實(shí)施例3含OPG-372基因的甲醇酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC-OPG-372的構(gòu)建將含OPG-372基因的大腸桿菌克隆質(zhì)粒pSK-OPG-372用BamHI和EcoRI酶切(EcoRI為pSK載體上的酶切位點(diǎn))，用低熔點(diǎn)瓊脂糖分離OPG-372基因片段，并與事先經(jīng)BamHI和EcoRI酶切的pPIC3.5K相連接，構(gòu)建含OPG-372基因的甲醇酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC-OPG-372(圖3)。
實(shí)施例4OPG-372基因在甲醇酵母中的表達(dá)將pPIC-OPG-372質(zhì)粒用SalI酶切線性化，用電轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化甲醇酵母GS115，在MD平板上篩選His陽(yáng)性菌落，再將其點(diǎn)在含2mg/mlG418的YEPD平板上篩選OPG-372基因多拷貝菌株。將這些菌落在YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，后抽提其基因組DNA，用OPGPRI1和OPGPRI2引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明大多數(shù)菌落均為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，然后取其菌，用BMMY稀釋至A600＝1，繼續(xù)培養(yǎng)，每天補(bǔ)加甲醇至0.5％，三天后，每天取其細(xì)胞用0.5mm玻璃珠破壁進(jìn)行SDS-PAGE分析。
結(jié)果表明，OPG-372基因在甲醇酵母中表達(dá)產(chǎn)生兩種形式的蛋白，一種是未糖基化的43kD蛋白質(zhì)，其分子量與理論推算值相近，另一種是70kD的糖基化蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖4)。
實(shí)施例5含OPG-372基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒供體質(zhì)粒pBac-OPG-372和pBacHT-OPG-372的構(gòu)建將pSK-OPG-372用BamHI和XhoI雙酶切，用低熔點(diǎn)瓊脂糖回收OPG-372基因片段，并與事先經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的pFastBacl和pFastBacHTb相連接，構(gòu)建含OPG-372基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒供體質(zhì)粒pBac-OPG-372和pBacHT-OPG-372(圖5)。
實(shí)施例6含OPG-372基因的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒的獲得取1μl含OPG-372基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒供體質(zhì)粒pBac-OPG-372和pBacHT-OPG-372，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac，用氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素四種抗生素和藍(lán)白斑篩選經(jīng)轉(zhuǎn)座后含重組桿狀病毒DNA(Bacmid)的菌落。再經(jīng)同樣的平板進(jìn)行復(fù)檢，然后抽提重組桿狀病毒DNA(Bacmid)，取5μl重組桿狀病毒DNA(Bacmid)加入100μl無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基混均。取6μl Lipofectin加入100μl無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基混均。將兩者混均，室溫放置15分鐘，加入800μl無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基混均。將事先培養(yǎng)在35mm Dish中的粉紋夜蛾Tn-5B1-4細(xì)胞用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基洗滌兩次，并逐滴加入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和Lipofectin混合物，27℃培養(yǎng)3天，收取上清進(jìn)行病毒擴(kuò)增。即可得到大量的含OPG-372基因的重組桿狀病毒BacOPG-372和BacHTOPG-372。
重組桿狀病毒BacHTOPG-372被命名為重組的銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus)BacHTOPG-372，并于2000年11月6日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)，北京)，保藏號(hào)為CGMCC No.0505。
實(shí)施例7OPG-372基因在粉紋夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4中的表達(dá)取擴(kuò)增的含OPG-372基因的重組桿狀病毒BacOPG-372和BacHTOPG-372感染粉紋夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4，3天后收集細(xì)胞，加入適量TE緩沖液后加入等體積的2×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，取20μl進(jìn)行SDS-PAGE分析，用考馬斯亮蘭R250染色。
結(jié)果表明，重組桿狀病毒BacOPG-372和BacHTOPG-372感染粉紋夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4均可表達(dá)出39kD左右的蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖6)，其分子量比理論理論小5kD左右，原因可能是在細(xì)胞內(nèi)被降解。用anti-His抗體對(duì)BacHTOPG-372病毒表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western印跡分析，結(jié)果表明被降解的5kD片段是在C端(見(jiàn)圖7)。
實(shí)施例8Tn-5B1-4表達(dá)的OPG-372蛋白的降血鈣活性分析在該實(shí)施例中，還對(duì)粉紋夜蛾Tn-5B1-4細(xì)胞表達(dá)的OPG-372蛋白和His-OPG-372進(jìn)行了活性分析。
經(jīng)Tn-5B1-4細(xì)胞擴(kuò)增的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒BacOPG-372和BacHTOPG-372感染Tn-5B1-4細(xì)胞，3天后收集細(xì)胞，懸于PBS(pH7.4)中。經(jīng)反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎，高速離心后收集上清液，用0.22μm微孔膜過(guò)濾除菌。以非重組Bacmid感染Tn-5B1-4細(xì)胞經(jīng)同樣的處理作為陰性對(duì)照。4℃保存?zhèn)溆?。取少量重組桿狀病毒表達(dá)的全細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE分析，測(cè)定OPG-372和His-OPG-372蛋白占細(xì)胞可溶性蛋白的百分比，并對(duì)全細(xì)胞解液進(jìn)行總蛋白質(zhì)的測(cè)定。按6mg/kg的OPG劑量注射經(jīng)24h饑餓的Balb/C小鼠，注射相同總蛋白質(zhì)量的非重組Bacmid表達(dá)全細(xì)胞裂解液為陰性對(duì)照。以40ng/只劑量的sCT注射小鼠作為陽(yáng)性對(duì)照。2h和4h后放取小鼠血液(正常小鼠和陽(yáng)性對(duì)照均在2h時(shí)取血)，收集其血清進(jìn)行鈣離子濃度測(cè)定。取OCPC試液(稱(chēng)取OCPC 32.5mg，8-HQ 1.1g，加水250ml，加濃鹽酸7.5ml，充分?jǐn)嚢枞芙夂笥盟a(bǔ)足至500ml)、二乙胺試液(21ml二乙胺加水至500ml)、甲醇按1.5∶1.5∶1.0的比例配成鈣顯色試劑。取50μl血清加入3ml鈣顯色試劑，測(cè)定570nm光吸收值。以2.5、5、7.5、10、12.5、15.0mg/100ml的碳酸鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液制作鈣離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算血清中的鈣離子濃度。
結(jié)果表明如圖8所示，OPG-372在正常小鼠體內(nèi)具有明顯的降血鈣作用，而N端帶His-Taq結(jié)構(gòu)的His-OPG-372則幾乎沒(méi)有降血鈣作用。這表明，OPG的N端結(jié)構(gòu)的正確折疊對(duì)其活性具有十分重要的作用，而其C端被降解5kD左右的片段則幾乎不影響其活性。
實(shí)施例9抗OPG-372蛋白抗體的產(chǎn)生將實(shí)施例7中獲得的重組人OPG-372蛋白用來(lái)免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100mg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100mg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人OPG-372蛋白基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。
產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性O(shè)PG-372是一個(gè)新OPG變體(OPG-372)基因，此基因與國(guó)外報(bào)道相比，在核苷酸序列上僅僅相差一個(gè)堿基，但是由于這一堿基突變形成一個(gè)終止密碼子，使這一蛋白質(zhì)在C端缺失8個(gè)氨基酸。本發(fā)明人將OPG-372基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)，比國(guó)外在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中表達(dá)具有更高的表達(dá)量，而且操作相對(duì)簡(jiǎn)單。OPG是一個(gè)可以經(jīng)過(guò)基因工程方法生產(chǎn)的內(nèi)源蛋白質(zhì)，與化學(xué)合成的降鈣素(CT)相比，具有安全、副作用小、以及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且OPG在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥方面比CT更佳。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱(chēng)新的破骨細(xì)胞形成抑制因子、其編碼序列及用途(iii)序列數(shù)目4(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1163bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGAAACGT TTCCTCCAAA GTACCTTCAT TATGACGAAG AAACCTCTCA TCAGCTGTTG 60TGTGACAAAT GTCCTCCTGG TACCTACCTA AAACAACACT GTACAGCAAA GTGGAAGACC 120GTGTGCGCCC CTTGCCCTGA CCACTACTAC ACAGACAGCT GGCACACCAG TGACGAGTGT 180CTATACTGCA GCCCCGTGTG CAAGGAGCTG CAGTACTCAA GCAGGGAGTG CAATCGCACC 240CACAACCGCG TGTGCGAATG CAAGGAAGGG CGCTACCTTG AGATAGAGTT CTGCTTGAAA 300CATAGGAGCT GCCCTCCTGG ATTTGGAGTG GTGCAAGCTG GAACCCCAGA GCGAAATACA 360GTTTGCAAAA GATGTCCAGA TGGGTTCTTC TCAAATGAGA CGTCATCTAA AGCACCCTGT 420AGAAAACACA CAAATTGCAG TGTCTTTGGT CTCCTGCTAA CTCAGAAAGG AAATGCAACA 480CACGACAACA TATGTTCCGG AAACAGTGAA TCAACTCAAA AATGTGGAAT AGATGTTACC 540CTGTGTGAGG AGGCATTCTT CAGGTTTGCT GTTCCTACAA AGTTTACGCC TAACTGGCTT 600AGTGTCTTGG TAGACAATTT GCCTGGCACC AAAGTAAACG CAGAGAGTGT AGAGAGGATA 660AAACGGCAAC ACAGCTCACA AGAACAGACT TTCCAGCTGC TGAAGTTATG GAAACATCAA 720AACAAAGACC AAGATATAGT CAAGAAGATC ATCCAAGATA TTGACCTCTG TGAAAACAGC 780GTGCAGCGGC ACATTGGACA TGCTAACCTC ACCTTCGAGC AGCTTCGTAG CTTGATGGAA 840AGCTTACCGG GAAAGAAAGT GGGAGCAGAA GACATTGAAA AAACAATAAA GGCATGCAAA 900CCCAGTGACC AGATCCTGAA GCTGCTCAGT TTGTGGCGAA TAAAAAATGG CGACCAAGAC 960ACCTTGAAGG GCCTAATGCA CGCACTAAAG CACTCAAAGA CGTACCACTT TCCCAAAACT 1020GTCACTCAGA GTCTAAAGAA GACCATCAGG TTCCTTCACA GCTTCACAAT GTACAAATTG 1080TATCAGAAGT TATTTTTAGA AATGATAGGT AACCAGGTCT AATCAGTAAA AATAAGCTGC 1140TTATAACTGG AAATGGCCTC GAG 1163(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度373個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2METFPPKYLH YDEETSHQLL CDKCPPGTYL KQHCTAKWKT VCAPCPDHYY 50TDSWHTSDEC LYCSPVCKEL QYVKQECNRT HNRVCECKEG RYLEIEFCLK 100HRSCPPGFGV VQAGTPERNT VCKRCPDGFF SNETSSKAPC RKHTNCSVFG 150LLLTQKGNAT HDNICSGNSE STQKCGIDVT LCEEAFFRFA VPTKFTPNWL 200SVLVDNLPGT KVNAESVERI KWQHSSQEQT FQLLKLWKHQ NKDQDIVKKI 250IQDIDLCENS VQWHIGHANL TFEQLRSLME SLPGKKVGAE DIEKTIKACK 300PSDQILKLLS LWRIKNGDQD TLKGLMHALK HSKTYHFPKT VTQSLKKTIR 350FLHSFTMYKL YQKLFLEMIG NQV 373(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3GGATCCATGA AACGTTTCCT CCAAAGTACC 30(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4ACCTCGAGGC CATTTCCAGT TATAAGCAGC 30
權(quán)利要求
1.一種分離的人OPG-372多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的DNA序列，其特征在于，它包含(a)編碼如權(quán)利要求1或2所述多肽的DNA序列；(b)與DNA序列(a)互補(bǔ)的DNA序列。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA序列，其特征在于，該DNA序列編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的DNA序列。
6.如權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，它包括重組的銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus)BacHTOPG-372 CGMCCNo.0505。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種產(chǎn)生OPG-372多肽的方法，其特征在于，在適合表達(dá)所述多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，或者培養(yǎng)含權(quán)利要求7所述宿主細(xì)胞的動(dòng)物，從而表達(dá)出所述的多肽；和分離所述的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的人OPG-372多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1所述的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的破骨細(xì)胞形成抑制因子－OPG－372蛋白,編碼OPG－372蛋白的DNA序列和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種OPG－372蛋白的方法。OPG－372蛋白是OPG的變體。本發(fā)明還公開(kāi)了這種OPG－372蛋白的用途。本發(fā)明還公開(kāi)了此OPG－372蛋白可用于治療多種疾病,如用于骨質(zhì)疏松癥、高血鈣癥等疾病。本發(fā)明還提供了含OPG－372蛋白的藥物組合物。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1375501SQ0110570
公開(kāi)日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2001年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月21日
發(fā)明者吳祥甫, 楊冠珍, 何志勇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所