用于藥物組合物的巨噬細胞活化因子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含巨噬細胞活化因子（MAF）的藥物組合物和產(chǎn)生所述藥物組合物的方法，特別涉及基本不含糖苷酶的MAF組合物。本發(fā)明的組合物和包含所述組合物的藥物組合物特別適用于靜脈內給藥。這樣，根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供了一種包含Gc蛋白來源的巨噬細胞活化因子（GcMAF）的組合物，其中所述組合物基本上不含糖苷酶。
【專利說明】用于藥物組合物的巨噬細胞活化因子
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及包含Ge蛋白來源的巨噬細胞活化因子(GcMAF)的藥物組合物和產(chǎn)生所述藥物組合物的方法，特別涉及基本不含糖苷酶的GcMAF組合物。
[0002]發(fā)明背景
[0003]發(fā)炎導致巨噬細胞活化，引起免疫反應過程的進展。發(fā)炎引起的巨噬細胞活化需要B和T淋巴細胞和血清維生素D結合蛋白(DBP)的參與。
[0004]人維生素D結合蛋白，也稱為“組-特異性成分”或“Ge蛋白”，是一種顯示遺傳多態(tài)性的進化上保守的糖蛋白。它是一種血漿蛋白，具有大約52，000的相對分子量，通常構成人血漿蛋白的大約0.5%。凝膠電泳分析可表明Ge蛋白的多態(tài)性，顯示兩個主要表型:Gcl和Gc2 (Hirschfeld等人，1960.Naturel85:931)。已經(jīng)報告了 Gcl和Gc2基因的整個核苷酸編碼序列，和所預測的氨基酸序列(Cooke等人，1985.J.Clin.1nvest.76:2420 ；Yang等人，1985.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:7994)。Gcl 又分成 Gclf 和 Gcls 亞型，因為存在一個氨基酸殘基的變異，兩個亞型在電泳上作為兩條帶遷移(“快”和“慢”)。
[0005]Gcl蛋白是人Ge蛋白的主要亞型。它攜帶一個分支的三糖，該三糖由連接于核心蛋白的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)構成，具有半乳糖和唾液酸(在Gclf中)的末端，或者半乳糖和甘露糖(在Gcls中)的末端。Gc2具有簡單的糖基化模式，有一個核心GalNAc連接到末端半乳糖部分。Gclf寡糖被炎癥引起的B細胞的膜β-半乳糖苷酶水解，產(chǎn)生巨噬細胞促活化因子，該因子接著被T細胞的唾液酸酶(也稱為神經(jīng)氨酸苷酶)水解，產(chǎn)生巨噬細胞活化因子(MAF) (Yamamoto 等人，1991.Proc.Nail.Acad.Sc1.USA88:8539-8543 ；Yamamoto和 Kumashirol993.1mmunol, 151:2794—2902 ；Naraparaju 和 Yamamoto 1994.1mmunol.Lets43:143-148)。小鼠DBP攜帶一個二糖，該二糖由N-乙酰半乳糖胺和半乳糖末端構成。該二糖被單獨的B細胞β-半乳糖苷酶水解，產(chǎn)生活性MAF。這樣，小鼠DBP和人Ge蛋白是MAF的前體。
[0006]本發(fā)明的發(fā)明人的美國專利號5，177,002公開了通過用糖苷酶處理糖基化的維生素D結合蛋白來體外產(chǎn)生活性巨噬細胞活化因子的方法。Ge蛋白的表型Gcl和Gc2以及Gcl亞型Gclf和Gcls,尤其表現(xiàn)為連接于Ge分子的多肽部分的寡糖的差異。通過與β -半乳糖苷酶和唾液酸酶(也稱作神經(jīng)氨酸苷酶)的組合溫育，或與半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶的組合溫育，從Gclf或Gcls蛋白有效地產(chǎn)生了巨噬細胞活化因子。如果Gcls至少部分包含Gcls變體Gcls*，后者含有唾液酸(N-乙酰基-D-神經(jīng)氨酸或“NeuNAc”)代替α -甘露糖，用來處理Gcls/Gcls*混合物的酶混合物還包括唾液酸酶。單獨用β -半乳糖苷酶處理Gc2蛋白有效地產(chǎn)生了巨噬細胞活化因子。這樣，5，177，002專利公開了在沒有完整B和T細胞的情況下，Ge蛋白向巨噬細胞活化因子的有效體外轉變，從而產(chǎn)生命名為GcMAF的高度活性的因子。
[0007]對傳統(tǒng)治療形式有抗性的轉移瘤的無控制生長是來自癌癥的死亡的主要原因。轉移來自預先存在于原發(fā)性腫瘤 中的特化惡性細胞的非隨機傳播。這些轉移在來源上可以是無性系的，不同的轉移可以來源于不同的祖細胞。另外，與良性非轉移細胞相比，轉移細胞可以展現(xiàn)增高的自發(fā)突變率，這解釋了多個轉移瘤對于同樣的治療形式可以展現(xiàn)不同敏感性的臨床觀察結果。這樣對于擴散轉移的成功治療應規(guī)避腫瘤異質性和抗性發(fā)展的問題。
[0008]適當活化的巨噬細胞能滿足這些苛刻的標準。通過與包含免疫調節(jié)劑的磷脂囊(脂質體)的相互作用，巨噬細胞可被活化而變成殺腫瘤的。殺腫瘤的巨噬細胞能在體外和體內識別和破壞腫瘤細胞，而不傷害非腫瘤細胞。雖然巨噬細胞區(qū)分腫瘤發(fā)生細胞和正常細胞的準確機制是未知的，該機制是獨立于腫瘤細胞特征的，例如免疫原性、轉移潛力和對細胞毒性藥物的敏感性。而且，巨噬細胞對于腫瘤細胞的破壞明顯與腫瘤細胞抗性的發(fā)展不相關。另外，活化的巨噬細胞對于形成相對于細菌和病毒入侵的免疫應答是必要的。因為在三種應答(殺腫瘤、殺菌、殺病毒)中，活化機制是相同的，巨噬細胞活化在宿主免疫應答中具有應用，對抗腫瘤、細菌和病毒的挑戰(zhàn)。
[0009]研究已經(jīng)表明，GcMAF在小鼠模型中對于一種埃利希(Ehrlich)腹水腫瘤的治療具有殺腫瘤作用(Yamamoto等人，1997.Cancer Res.57:2187 - 2192 ;Koga等人，1999.ProcSoc Exp Biol Med.220:20 - 26)。在鱗狀細胞癌的小鼠模型中，將GcMAF作為光動力治療的輔助免疫治療施用，顯示了對于小鼠中腫瘤治愈的協(xié)同效應(Korbelik等人.1997.Br JCancer75:202 - 207)。在兩種腫瘤模型中，假設GcMAF通過活化巨噬細胞發(fā)揮其作用，然后后者直接攻擊腫瘤細胞。又有證據(jù)表明，GcMAF部分通過抗血管生成的機制而具有抗腫瘤發(fā)生性(Kisker等人，2003.Neoplasia5 (I): 32 - 40)。在所有模型中，均觀察到GcMAF作為抗腫瘤發(fā)生性治療的高效力。 [0010]美國專利申請公布號2011/0123591公開了通過使用體外系統(tǒng)通過巨噬細胞活化在哺乳動物中誘導殺腫瘤、殺細菌或殺病毒應答的方法。該系統(tǒng)包含將哺乳動物血液的白細胞組分與GcMAF或從Ge蛋白前體中產(chǎn)生內源性GcMAF的一種或更多酶相接觸的方法。或者，該系統(tǒng)包含固定在惰性介質上的ct -N-乙酰氨基半乳糖苷酶(Nagalase)-結合配體,該惰性介質與哺乳動物的血漿接觸，這樣降低Nagalase的水平。
[0011]MAF的前體，即糖基化Ge蛋白，可自血液來源純化?；蛘?，Ge蛋白或者其負責巨噬細胞活化的小結構域可以運用重組方法進行生產(chǎn)，例如，如本發(fā)明的發(fā)明人的美國專利號6，410，269所公開的。不依賴于Ge蛋白來源，為了獲得上文所描述的巨噬細胞活化因子，Ge蛋白應被部分去糖基化。5，177，002專利公開了固定酶的使用，將反應混合物通過適當?shù)慕刂篂V器，以避免糖苷酶污染最后制備物。未提供選擇固定方式的任何特別指導原則，活化的瓊脂糖珠為優(yōu)選實施方案。
[0012]截至今天，GcMAF的使用被限制于離體治療，或者限制于肌肉內給藥以避免不良副作用，副作用的產(chǎn)生明顯是因為組合物中存在根據(jù)前面公開的程序產(chǎn)生的污染蛋白。
[0013]因為已經(jīng)確定了 GcMAF作為免疫缺陷疾病(例如AIDS)、不同類型的癌癥、病毒感染和骨硬化病的有效療法的潛力，使GcMAF組合物免于蛋白污染并適于靜脈內注射將非常有利。
[0014]發(fā)明概述
[0015]本發(fā)明涉及治療性的Ge蛋白來源的巨噬細胞活化因子(GcMAF)組合物和產(chǎn)生所述組合物的方法。
[0016]本發(fā)明的教導克服了迄今公開的GcMAF組合物的缺點，后者被發(fā)現(xiàn)含有用來將Ge蛋白轉化為巨噬細胞活化因子的糖苷酶的殘留物，這樣，當藥物性施用特別是靜脈內給藥時，可能會引起不良反應 。
[0017]本發(fā)明部分基于未預期的發(fā)現(xiàn)，即，從將Ge蛋白源與固定在聚半乳糖基樹脂(例如，瓊脂糖珠)的β -半乳糖苷酶接觸所獲得的GcMAF制備物含有有害量的β -半乳糖苷酶。無意于被任何特定理論或作用機制所束縛，GcMAF組合物中發(fā)現(xiàn)的糖苷酶殘留物的存在可能是由于固體支持物被附著于其的糖苷酶消化的現(xiàn)象。
[0018]這樣，根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供了含有Ge蛋白來源的巨噬細胞活化因子(GcMAF)的組合物，其中所述組合物基本上不含糖苷酶。
[0019]在此使用的術語“基本上不含糖苷酶”指的是含有少于組合物總蛋白含量的3%的糖苷酶、典型地少于2%或1%、更典型地少于所述組合物的總蛋白含量的0.5%或0.2%的組合物。
[0020]根據(jù)一些實施方案，GcMAF包含維生素D結合蛋白(Ge蛋白)、或者具有連接到氨基酸殘基的N-乙酰半乳糖胺基團的其活性片段。
[0021]術語“維生素D結合蛋白”和“Ge蛋白”在此互換使用，指的是該糖蛋白和其遺傳變體的所有多態(tài)形式，包括Gc2、Gcl、和亞型Gclf、Gcls和Gels*。此處使用的術語“其活性片段”指的是Ge蛋白的具有連接到氨基酸殘基的末端N-乙酰半乳糖胺基團，能夠活化巨噬細胞的任何部分。
[0022]根據(jù)一些實施方案，Ge蛋白片段包含對應于所有成熟Ge蛋白多態(tài)形式的氨基酸400-435的氨基酸序列。根據(jù)其他的實施方案，Ge片段是對應于成熟蛋白的氨基酸375-458的Ge蛋白結構域III。
[0023]根據(jù)一些實施方案，Ge蛋白包含選擇自由SEQ ID NO: 1-3 (分別為Gclf、Gcls和Gc2)組成的組的氨基酸序列。根據(jù)這些實施方案，N-乙酰半乳糖胺基團連接到成熟Ge蛋白的位置418的氨基酸蘇氨酸或位置420的氨基酸蘇氨酸。
[0024]根據(jù)其他實施方案，對應于成熟Ge蛋白的氨基酸375-458的Ge片段結構域III，由SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:5中所列出的氨基酸序列組成。根據(jù)該實施方案，N-乙酰半乳糖胺連接到位置44的氨基酸蘇氨酸或位置46的氨基酸蘇氨酸。
[0025]根據(jù)一些實施方案，分離的維生素D結合蛋白或其任何部分純化自人血清。根據(jù)其他實施方案，分離的維生素D結合蛋白或其負責巨噬細胞活化的小結構域可運用重組系統(tǒng)由克隆的多核苷酸產(chǎn)生。
[0026]從混合介質(composition medium)中去除將Ge蛋白轉化為巨卩遼細胞活化因子的糖苷酶可由本領域技術人員所知的任何方法來進行，所述方法包括但不限于，親和層析、離子交換層析和凝膠過濾。根據(jù)一些典型實施方案，這些酶被固定在固相上，特別是沒有酶底物的固相。
[0027]將這些酶固定在固體支持物上有數(shù)個優(yōu)點，包括將酶從想得到的蛋白質中簡單分離開。本發(fā)明現(xiàn)在公開，使用沒有酶底物的固相防止可溶性酶釋放入反應介質中，有利于將不期望的酶從最終組合物中移除。
[0028]這樣，根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生基本上不含糖苷酶的GcMAF組合物的方法，該方法包括(a)將Ge蛋白或者其活性片段在體外與糖苷酶β -半乳糖苷酶或者與β-半乳糖苷酶和至少一種另外的糖苷酶的組合相接觸，其中每種糖苷酶都固定在不含所述酶底物的固相上，以獲得Ge巨噬細胞活化因子(GcMAF);和(b)將所固定的酶從GcMAF組合物中移除，從而獲得基本上不含糖苷酶的GcMAF組合物。
[0029]根據(jù)一些實施方案，另外的糖苷酶選自由甘露糖苷酶和唾液酸酶組成的組。
[0030]根據(jù)一些實施方案，Ge蛋白是Gclf，且與半乳糖苷酶和唾液酸酶(神經(jīng)氨酸苷酶)接觸。
[0031]根據(jù)一些實施方案，該方法還包括將含有GcMAF的組合物進行離子交換層析。根據(jù)典型的實施方案，層析為陰離子交換層析，使用，例如Q-瓊脂糖柱。根據(jù)可選的實施方案，該方法還包括將GcMAF組合物進行疏水作用層析，例如苯基瓊脂糖柱。根據(jù)其他的實施方案，該方法還包括離子交換層析與疏水作用層析的組合。 [0032]根據(jù)一些實施方案，β_半乳糖苷酶固定在包含丙烯酸珠的固相上。根據(jù)特別的實施方案，固相為親水性丙烯酸珠。
[0033]根據(jù)一些實施方案,表型Gd、亞型Gclf的Ge蛋白，與固定的β_半乳糖苷酶和固定的唾液酸酶接觸，以提供巨噬細胞活化因子。根據(jù)其他的實施方案，表型Gd、亞型Gcls的Ge蛋白，如所需地與固定的β_半乳糖苷酶和至少一種固定的另外的糖苷酶接觸。根據(jù)一些典型實施方案，表型Gd、亞型Gcls的Ge蛋白，與β -半乳糖苷酶和甘露糖苷酶和唾液酸酶的組合相接觸，每種酶都固定在不含酶底物的固相上，以確保含有唾液酸代替α -甘露糖的Gcls變體(h Gcls*)的轉換。根據(jù)另外的實施方案，表型Gc2的Ge蛋白與所固定的單獨半乳糖苷酶接觸，以形成巨噬細胞活化因子。
[0034]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供根據(jù)以上描述的方法制備的巨噬細胞活化因子。根據(jù)一些實施方案，所述巨噬細胞活化因子基本上不含糖苷酶。
[0035]根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，包含治療有效量的本發(fā)明的巨噬細胞活化因子，并還包含藥學上可接受的稀釋劑或載體。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，藥物組合物被配制用來靜脈內給藥。
[0036]根據(jù)又另外一個方面，本發(fā)明提供了在有此需要的個體中誘導巨噬細胞活化的方法，包含向所述個體施用本發(fā)明的含巨噬細胞活化因子的藥物組合物。
[0037]根據(jù)又另外一個方面，本發(fā)明提供了治療癌癥或HIV感染患者的方法，包含向有此需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的含GcMAF的藥物組合物。
[0038]根據(jù)一些實施方案，以100_500ng/注射的劑量給予GcMAF。
[0039]根據(jù)一些實施方案,癌癥與α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(alpha-N-acetylgalactosaminidase) (Nagalase)水平升高相關。根據(jù)其他的實施方案,癌癥選自由以下組成的組:乳腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、頭/頸癌、腦癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌、纖維肉瘤、間皮瘤、白血病和黑色素瘤。
[0040]本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將從下文的詳述和附圖中變得明顯。
[0041]發(fā)明詳述
[0042]本發(fā)明提供了包含Ge蛋白來源的巨噬細胞活化因子的治療組合物。本發(fā)明的組合物比迄今已知的組合物具有優(yōu)勢，不含污染性的酶并適于靜脈內給藥。
[0043]Ge蛋白，也稱為維生素D結合蛋白，是一種包含附著有特定寡糖的多肽的血清因子。用特異性的糖苷酶逐步移除一定的寡糖，導致將Ge蛋白轉化為高度有效的巨噬細胞活化因子(MAF)，如本發(fā)明的發(fā)明人的美國專利號5，177，002所公開，通過引用全文并入本文。[0044]人Ge蛋白可用本領域技術人員所知的任何方法從血清中純化。根據(jù)一些實施方案，用于本發(fā)明方法的高純度Ge蛋白根據(jù)Link等人(1986.Anal.Biochem.157:262)的程序使用25-羥基維生素D3-瓊脂糖親和層析分離自血清。Ge蛋白也可根據(jù)Haddad等人(1984.Biochem.J.218:805)的程序通過肌動蛋白-瓊脂糖親和層析進行純化，后者利用Ge蛋白對肌動蛋白的結合特異性。[0045]可選地，Ge蛋白可從編碼人Ge蛋白或Ge蛋白小結構域(結構域III)的克隆cDNA獲得。Ge蛋白和Ge結構域III的克隆和表達描述于本發(fā)明的發(fā)明人的美國專利號6，410，269，通過引用全文并入本文。其中描述的方法采用噬菌體λ gtll中的人肝cDNA文庫(Clontech，Palo Alto，CA)，以分離編碼人Ge蛋白的全長cDNA，并使用昆蟲細胞中的桿狀病毒表達系統(tǒng)進行蛋白質表達。然而，應明確理解本領域所知的任何方法/系統(tǒng)能被用于表達編碼Ge蛋白或其活性部分的cDNA，包括細菌、昆蟲和哺乳動物細胞系統(tǒng)。根據(jù)一些實施方案，在真核細胞中進行表達，使得Ge蛋白或其活性結構域被正確糖基化?？梢允褂帽绢I域所知的任何這樣的細胞系統(tǒng)，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、BHK細胞、人胚腎HEK293細胞和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。因此,可以使用任何真核表達載體，包括但不限于，pC1-NE0、pWE3、pcDNA3.1和pCM182。將載體插入選擇的細胞系統(tǒng)可以如下進行，例如，通過電穿孔，脂類例如TransFectin或本領域技術人員所知的化學方法，伴隨或不伴隨擴增。轉染可以導致瞬時或穩(wěn)定的表達，兩種方式均足以獲得所要的Ge蛋白或其部分。根據(jù)本發(fā)明的教導，所表達的蛋白是活性MAF的前體，可以通過本領域所知的任何方法從細胞中提取或從生長培養(yǎng)基中采集。
[0046]這里所用的術語“Ge蛋白”或“維生素D結合蛋白”指的是所有基因型，包括Gc2、Gd、以及亞型Gclf、Gcls和Gcls*和其活性變體和片段。這里所用的“活性” Ge蛋白或其片段指的是能夠激活巨噬細胞的Ge蛋白，尤其是具有連接至氨基酸殘基的N-乙酰半乳糖胺基團的Ge蛋白或其片段。
[0047]根據(jù)一些實施方案，Ge蛋白包含選自由SEQ ID NO: 1-3 (分別為Gclf、Gcls和Gc2)組成的組的氨基酸序列。根據(jù)這些實施方案，N-乙酰半乳糖胺基團連接至成熟Ge蛋白位置418的氨基酸蘇氨酸或位置420的氨基酸蘇氨酸。
[0048]根據(jù)一些實施方案，Ge蛋白片段包含對應于所有成熟Ge蛋白多態(tài)形式的氨基酸400-435的氨基酸序列。根據(jù)其他的實施方案，Ge片段是對應于成熟蛋白的氨基酸375-458的Ge蛋白結構域III。
[0049]根據(jù)其它的實施方案，對應于成熟Ge蛋白的氨基酸375-458的Ge片段結構域111由SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:5中所列出的氨基酸序列組成。根據(jù)該實施方案，N-乙酰半乳糖胺連接到位置44的氨基酸蘇氨酸或位置46的氨基酸蘇氨酸。
[0050]當巨噬細胞被激活時，它具有清除癌癥細胞和HIV-感染細胞的潛力。GcMAF被酶α-Ν-乙酰氨基半乳糖苷酶(Nagalase)的去糖基化阻止它激活巨噬細胞并因此抑制細胞免疫應答。已提出在HIV感染的患者中，有缺陷的抗原呈遞是免疫缺陷中的一個因素。HIV患者血漿中升高的Nagalase的存在表明在這些患者中巨噬細胞激活可能被抑制。另外，Nagalase已被顯示是感染起始促進融合的包膜蛋白的內在成分。全身性紅斑狼瘡患者中的Nagalase的血漿濃度也被發(fā)現(xiàn)升高。在狼瘡中，自身抗體形成病理性免疫復合體并沉積在組織中。如果巨噬細胞激活被阻斷，會抑制這些復合體被巨噬細胞的清除。已顯示癌細胞產(chǎn)生Nagalase，血清中升高的濃度已被記錄于許多患黑色素瘤、前列腺癌、結腸直腸癌、轉移性乳腺癌的癌癥患者中。給予這樣的患者外源性GcMAF可以因此克服由于Nagalase的升高濃度而引起的活性巨噬細胞的不足。事實上，GcMAF已被顯示直接作用并激活癌癥患者、HIV感染患者和骨硬化病(osteoperotic)患者的巨噬細胞或破骨細胞，初步臨床試驗顯示GcMAF對于數(shù)種人類癌癥的治愈效應(例如，Pacini S.等人,2012.AnticancerRes.; 32 ⑴:45-52 !Gregory KJ 等人 2010.PLoS One.20105 (10): el3428)。
[0051]為了適于藥用，特別當配制為用于靜脈內注射時，GcMAF組合物應滿足無毒并且被人高度耐受的精細要求。
[0052]因此，要求用來將Ge蛋白或其結構域III轉化為活化MAF的糖苷酶以及其它潛在污染物應被從MAF組合物中移除。
[0053]根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供包含Ge蛋白來源的巨噬細胞活化因子(GcMAF)的組合物，其中所述組合物基本上不含糖苷酶。
[0054]根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生基本上不含糖苷酶的GcMAF組合物的方法，該方法包括(a)將Ge蛋白或其活性片段在體外與糖苷酶β-半乳糖苷酶或與β-半乳糖苷酶和至少一種另外的糖苷酶的組合接觸，其中每種糖苷酶固定在不含所述酶底物的固相上，以獲得Ge巨噬細胞活化因子(GcMA F );和(b )將所固定的酶從GcMAF組合物中移除，從而獲得基本上不含糖苷酶的GcMAF組合物。
[0055]移除糖苷酶可由本領域已知的任何方法來進行。根據(jù)本發(fā)明的一些典型實施方案，Ge蛋白或其部分與酶接觸，其中酶固定在固相上，其中固相不含酶底物。特別重要的是將β_半乳糖苷酶固定在不含半乳糖的固相上。本發(fā)明現(xiàn)在公開，β_半乳糖苷酶在將Ge蛋白活化為MAF所要求的溫育時間期間被從瓊脂糖固相中釋放出來。這樣，當在迄今公開的方法中將固定的半乳糖苷酶從組合物中移除時，可溶性酶或其殘留物仍然能污染組合物。
[0056]根據(jù)一些實施方案，包含GcMAF的本發(fā)明的組合物包含少于所述組合物的總蛋白含量3%的糖苷酶。根據(jù)其它的實施方案，組合物含有少于組合物的總蛋白含量的2%、典型地少于1%、更典型地少于0.5%或0.2%。每一種可能性代表本發(fā)明的一個單獨的實施方案。如此處所使用，術語“總蛋白含量的總蛋白的百分比(％)”指的是總蛋白含量中的糖苷酶的
重量/重量百分比。
[0057]根據(jù)一些實施方案，根據(jù)本發(fā)明的教導，β_半乳糖苷酶的固定固相不含糖苷酶底物，由能夠結合酶的丙烯酸珠組成。數(shù)種市場上能買到的樹脂可被用于糖苷酶的固定，所述樹脂包括但不限于Profinity環(huán)氧化物(Biorad) ;FractOgel?環(huán)氧基樹脂(Merck);和Eupergit? (BioChemika, Sigma)。
[0058]除了半乳糖苷酶，至少一種另外的糖苷酶可被使用，取決于Ge蛋白基因型。為了激活Gclf蛋白，β-半乳糖苷酶和唾液酸酶被用于將Gclf轉化為GcMAF。為了激活Gcls蛋白，半乳糖苷酶和甘露糖苷酶被用于將Gcls轉化為GcMAF。除了 β-半乳糖苷酶以外，每種另外使用的酶可 以固定在固相上。根據(jù)本發(fā)明的教導，為了避免在最終組合物中存在甘露糖苷酶和/或唾液酸酶，甘露糖苷酶和唾液酸酶中每一種酶均固定在不含酶底物的基質上。
[0059]根據(jù)一些實施方案，甘露糖苷酶或唾液酸酶固定在基于瓊脂糖的珠上。[0060]可選地以及另外，可溶或者固定的糖苷酶通過將酶從期望GcMAF蛋白質中分離的幾種層析技術和/或過濾和/或沉淀和/或離心，從所述GcMAF組合物中被移除。
[0061]典型的層析技術包括通過大小(尺寸排阻，也稱作凝膠過濾)；通過電荷(離子交換層析)，通過疏水性(疏水作用層析和反相層析)和通過生物識別(親和層析)分離。
[0062]根據(jù)一些實施方案，該方法還包括將含有GcMAF的組合物通過離子交換層析。根據(jù)典型的實施方案，層析是陰離子交換層析。可使用不同類型的陰離子交換樹脂，包括 DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex> DEAE-Sephacel> DEAE-纖維素、DEAE-Sepharose>Q-sepharose 等等。
[0063]本發(fā)明現(xiàn)在公開，將GcMAF組合物通過陰離子交換層析還導致活性GcMAF從非活性形式中分離。這樣，本發(fā)明提供了實現(xiàn)活性GcMAF從不同來源中高產(chǎn)量分離和純化的方法。
[0064]根據(jù)一些實施方案，陰離子交換樹脂為Q-Sepharose。不同的條件可被用于該特定步驟中。根據(jù)一些實施方案，陰離子交換樹脂首先用PH在4.5-9.5、傳導率低于12.0mS/cm的緩沖溶液平衡。樹脂被平衡后，含有GcMAF的級分通過稀釋被調整至離子強度低于12mS/cm,并被加載在陰離子交換樹脂上。pH和傳導率的這些條件允許GcMAF保留在柱上，同時洗滌陰離子交換介質。洗滌緩沖液(pH范圍在4.5-9.5之間)的傳導率在洗滌過程中增加。這種增加提供適合的條件，使得沒有GcMAF在流通液(flow through)中被丟棄,從而得到最大GcMAF產(chǎn)量。
[0065]然后GcMAF從柱上被洗脫。根據(jù)一些實施方案，使用pH在4.5-9.5，傳導率高于3mS/cm的緩沖溶液進行洗脫。
[0066]根據(jù)其它的實施方案，該方法還包括將GcMAF組合物通過疏水作用層析，例如苯基瓊脂糖柱。
[0067]根據(jù)一些實施方案，疏水作用樹脂是苯基瓊脂糖。不同的條件可被用于該特定步驟。根據(jù)一些實施方案，疏水作用樹脂首先用PH在4.5-9.5、傳導率高于15.0mS/cm的緩沖溶液平衡。樹脂被平衡后，含有GcMAF的級分通過稀釋被調整至離子強度高于15.0mS/cm,并被加載在疏水作用樹脂上。PH和傳導率的這些條件允許GcMAF保留在柱上，同時洗滌疏水作用介質。洗滌緩沖液(pH范圍在4.5-9.5之間)的傳導率在洗滌過程中降低。這種降低提供適合的條件，使得沒有GcMAF在流通液中被丟棄，從而得到最大GcMAF產(chǎn)量。
[0068]然后GcMAF從柱上被洗脫。根據(jù)一些實施方案，使用pH在4.5-9.5、傳導率低于25mS/cm的緩沖溶液進行洗脫。
[0069]本發(fā)明的組合物的無菌性是主要關注事項，因為產(chǎn)物將要因治療目的被施用于人，特別是通過靜脈內給藥。雖然對血清來源材料通常檢查了污染病毒的存在，并盡很大努力去排除污染的供體級分，有需要進一步確保該方法的最終產(chǎn)物是無病毒的。
[0070]因此，本發(fā)明的方法可還包括病毒移除和/或病毒失活步驟。可通過幾種方法完成病毒減少，包括納米過濾；溶劑/清潔劑處理；碘失活，例如，用碘化的離子交換基質材料例如碘化的SEPHADEX?進行處理(如PCT申請W097/48422和W097/48482所公開)；用病原體失活化合物進行處理；熱失活，Y照射；或任何其他適合的殺病毒方法。
[0071]脂質包被病毒被非離子生物相容性溶劑和清潔劑有效失活。描述了通過溶劑-清潔劑應用進行病毒失活的方法，例如，在EP0131740中。然而，非-脂質包被的病毒不能通過溶劑-清潔劑處理被失活，這樣，不得不使用其它失活方法來進行其失活，包括通過物理方式排除，例如，將組合物通過非常小孔徑的濾器進行過濾，以通過尺寸排阻移除病毒(納米過濾)。
[0072]在將糖苷酶從活性GcMAF中分離和病毒移除以后，可通過傳統(tǒng)的方法，例如透析過濾、超濾、凍干法等，或它們的組合，來處理溶液以降低其水含量并改變離子組成。
[0073]根據(jù)一些實施方案，包含純化GcMAF的組合物以PBS緩沖液通過超濾進行透析，MWCO在5-50kDa之間。然后用PBS將GcMAF蛋白稀釋至其終濃度，通過0.1或0.2 μ m的膜進行過濾，以獲得無菌的GcMAF組合物。
[0074]根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供包含治療有效量的本發(fā)明的巨噬細胞活化因子，并包含藥學上可接受的稀釋劑或載體的藥物組合物。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，藥物組合物配制為用于靜脈內給藥。
[0075]如這里所使用，術語“治療有效量”指的是蛋白或蛋白制劑或組合物在其給藥的活生物體內經(jīng)一段時間有效治療病癥的量。
[0076]本發(fā)明的藥物組合物可通過本領域熟知的方法進行生產(chǎn)，例如，通過傳統(tǒng)混合、溶解、制粒、研磨、粉碎、糖衣制作、磨細、乳化、封裝、捕獲或凍干過程進行生產(chǎn)。藥物組合物的目的是有利于將化合物向生物體的施用。
[0077]這樣，根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可以使用一種或多種包括輔料和助劑的可接受的稀釋劑或載體以傳統(tǒng)方式配制，這些輔料和助劑有利于將活性化合物加工為可被藥用的組合物。適當?shù)闹苿┮蕾囉谒x擇的給藥途徑。根據(jù)典型的實施方案，本發(fā)明的藥物組合物配制為用于靜脈內給藥。
[0078]為了靜脈內注射，本發(fā)明的化合物可用水溶液配制，優(yōu)選使用生理性相容的緩沖液，例如Hank溶液、Ringer溶液、或生理鹽水緩沖液。含水注射混懸劑可以包含增加混懸液粘度的物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖酐。任選地，混懸液也可以含有合適的穩(wěn)定劑或試劑來增加化合物的穩(wěn)定性和可溶性，并允許高度濃縮溶液的組合物。
[0079]可選地，活性成分可以是粉末形式，以使用適合的媒介物例如無菌無熱原水在使用前重構。
[0080]在本發(fā)明的情形下適合使用的藥物組合物包括其中包含可達到預期目的的有效量的活性成分的組合物。更具體地說，治療有效量意味著可有效預防、減輕或改善被治療的受試者的疾病癥狀的化合物的量。
[0081]確定治療有效量是本領域技術人員能力范圍內的。根據(jù)一些實施方案，以100-500ng/注射的劑量給予GcMAF。技術人員可根據(jù)與待被治療的特定疾病和階段以及受治療個體的特征(年齡、大小、性別，等)相關的參數(shù)來確定給藥方案。
[0082]這里描述的化合物的毒性和治療有效性可由細胞培養(yǎng)或實驗動物中的標準藥學程序來確定，例如，通過確定根據(jù)本發(fā)明的GcMAF化合物的IC50(提供50%巨噬細胞活化的濃度)和LD50 (在50%受試動物中引起死亡的致死劑量)。從這些細胞培養(yǎng)試驗和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可被用于配制一系列的人用劑量。劑量可以依賴于使用的劑型和利用的給藥途徑而變化?？捎蓚€體醫(yī)生根據(jù)患者的情況選擇確切的劑型、給藥途徑和劑量(見例如，F(xiàn)ingl 等人，1975,于 〃The Pharmacological Basis of Therapeutics' Ch.1p.1 中)。
[0083]依賴于待治療病癥的嚴重性和響應性，可確定給藥方案。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的包含GcMAF的藥物組合物通過靜脈內注射給藥，每周一次，共幾周。給藥也可以是慢釋組合物的單獨給藥，治療過程持續(xù)幾天到幾周，或者直到實現(xiàn)治愈或達到減小疾病狀態(tài)。
[0084]當然，將給藥的組合物的量依賴于被治療的受試者、病痛的嚴重性、給藥方式、開處方醫(yī)師的判斷、等等。
[0085]提供下列實施例以更充分地闡明發(fā)明的一些實施方案。然而，它不應以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的寬范圍。本領域技術人員能容易地設計此處公開的原則的許多變化和修改，而不偏離本發(fā)明的范圍。
實施例
[0086]實施例1:GcMAF產(chǎn)牛
[0087]第I步:富集-用硫酸銨沉淀 [0088]從健康供血者處獲得血液。每一血樣的Ge蛋白類型在PCR反應中使用特異性引物來確定，并進一步通過質譜分析法進行確定。由BioGlobe GmbH Hamburg, Germany基于Abbas 等人 2008 年(Cancer Epidemiol Biomarkers Prevl7:1339-1343)描述的方法進行分型。將Gclf等位基因純合的供血者樣品取出進行進一步處理。在2009年篩查的50例樣品中的I例，以及2010年篩查的105例樣品中的7例被鑒定為Gclf純合子。
[0089]從血液樣品中分離出血清級分,Ge蛋白通過70%硫酸銨(AS )從血清中被沉淀。在離心后，將沉淀蛋白溶于PBS中，并在pH約7.0-7.6的相同緩沖液中透析。
[0090]第2步:捕獲-維生素D-瓊脂糖親和柱
[0091]將蛋白加載在以TEST緩沖液(Tris、EDTA、鹽水、Triton，pH7.4)預平衡的25-0H-維生素D親和柱上。在用TEST緩沖液洗滌后，蛋白用6M GuHCl洗脫。匯集峰吸收值在280nm的級分,并用pH7.0的磷酸鹽緩沖液透析。
[0092]第3步:鈍化-羥某磷灰石梓
[0093]將蛋白加載在用pH7.0的磷酸鹽緩沖液預平衡的羥基磷灰石柱上。在用相同緩沖液洗滌后，蛋白通過10-200mM的線性梯度的磷酸鹽洗脫。匯集含有蛋白的級分。
[0094]第4步:Ge活化(GcMAF的制各)
[0095]將僅含Gclf型的匯集蛋白級分用與丙烯酸珠(Profinity Epoxide, BioRad)結合的β -半乳糖苷酶在ΡΗ7.4的PBS中在37°C處理I小時，伴隨輕輕混合。結合至丙烯酸珠的酶以離心方式移除，并收集蛋白級分。接著，蛋白級分在0.1M NaAc2mM CaCl2pH5.0中在37°C下用結合至瓊脂糖的神經(jīng)氨酸苷酶處理I小時，伴隨輕輕混合，結合的酶通過離心被移除?，F(xiàn)在收集含有GcMAF的蛋白級分，通過0.22μπι的濾器進行過濾，并貯存在4°C。蛋白類型通過ELISA進行確認,并通過Bradford試驗進行定量。
[0096]第5步:最終鈍化
[0097]GcMAF在離子交換(IEX)柱(例如Q瓊脂糖)和疏水作用層析(HIC)柱(例如苯基瓊脂糖凝膠)上處理，以移除殘留的污染的酶和未活化的Ge蛋白。然后通過測量糖苷酶活性和/或使用特異性抗體測量糖苷酶的存在，檢查組合物為基本上不含糖苷酶。
[0098]第6步:配制
[0099]純化的蛋白通過超濾在PBS中進行透析，MWCO在IOkDa到50kDa之間。然后蛋白用PBS稀釋至其終濃度并為了滅菌通過0.2 μ m Millipore濾器進行過濾。[0100]前述具體實施方案的描述充分揭示了本發(fā)明的一般特性，以致他人在沒有過多實驗和不偏離一般概念的情況下，可通過應用現(xiàn)有的知識將容易修改和/或調整此具體的實施方案用于多種應用，且，因此，此類調整和修改應該并預期被包含在公開的實施方案的等同物的含義和范圍內。將理解的是本文所采用的用語或術語是用于描述并不是限制的目的。用于實施多種公開的功能的手段、材料和步驟可采取多種可選的形式而不偏離本發(fā)明。
【權利要求】
1.一種組合物，其含有Ge蛋白來源的巨噬細胞活化因子(GcMAF)，其中所述組合物基本上不含糖苷酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，所述組合物含有少于所述組合物的總蛋白含量中的3%的糖苷酶。
3.根據(jù)權利要求2所述的組合物，所述組合物含有少于所述組合物的總蛋白含量中的1%的糖苷酶。
4.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述GcMAF包含具有連接到氨基酸殘基的N-乙酰半乳糖胺基團的維生素D結合蛋白(Ge蛋白)或其片段。
5.根據(jù)權利要求4所述的組合物，其中所述GcMAF包含SEQIDNO: 1-3中的任何一個所列出的氨基酸序列。
6.根據(jù)權利要求5所述的組合物，其中所述N-乙酰半乳糖胺基團連接至在選自由位置418和位置420組成的組的位置的氨基酸蘇氨酸。
7.根據(jù)權利要求4所述的組合物，其中所述Ge蛋白片段包含對應于所述Ge蛋白的氨基酸400-435的氨基酸序列。
8.根據(jù)權利要求5所述的組合物，其中所述Ge片段由SEQID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所列出的氨基酸序列組成。
9.根據(jù)權利要求8所述的組合物，其中所述N-乙酰半乳糖胺基團連接至在選自由位置44和位置46組成的組的位置的氨基酸蘇氨酸。
10.根據(jù)權利要求1-9中任一項所述的組合物，其中所述Ge蛋白或其片段是自血清中純化。
11.根據(jù)權利要求1-9中任一項所述的組合物，其中所述Ge蛋白或其片段是產(chǎn)生自克隆的多核苷酸。
12.—種用于產(chǎn)生基本上不含糖苷酶的GcMAF組合物的方法，所述方法包含(a)將Ge蛋白或者其活性片段在體外與糖苷酶β_半乳糖苷酶或者與β_半乳糖苷酶和至少一種另外的糖苷酶的組合相接觸，其中每種所述糖苷酶都固定在不含所述酶底物的固相上，以獲得Ge巨噬細胞活化因子(GcMAF);和(b)將所固定的酶從GcMAF中移除，從而獲得基本上不含糖苷酶的GcMAF組合物。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述另外的糖苷酶選自由甘露糖苷酶和唾液酸酶組成的組。
14.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述GcMAF包含具有連接到氨基酸殘基的N-乙酰半乳糖胺基團的Ge蛋白或其片段。
15.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述Ge蛋白包含SEQID N0:l_3中的任何一個所列出的氨基酸序列或其片段。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述N-乙酰半乳糖胺基團連接至在選自由位置418和位置420組成的組的位置的氨基酸蘇氨酸。
17.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述Ge蛋白片段包含對應于所述Ge蛋白的氨基酸400-435的氨基酸序列。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述Ge蛋白片段由SEQID N0:4或SEQ ID NO: 5中所列出的氨基酸序列組成。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中所述N-乙酰半乳糖胺基團連接至在選自由位置44和位置46組成的組的位置的氨基酸蘇氨酸。
20.根據(jù)權利要求12-19中任一項所述的方法，其中所述Ge蛋白或其片段是自血清中純化。
21.根據(jù)權利要求12-19中任一項所述的方法，其中所述Ge蛋白或其片段是產(chǎn)生自克隆的多核苷酸。
22.根據(jù)權利要求12所述的方法，還包括將所述含有GcMAF的組合物通過離子交換層析。
23.根據(jù)權利要求22所述的方法，包括將所述含有GcMAF的組合物通過陰離子交換層析。
24.根據(jù)權利要求12所述的方法，還包括將所述含有GcMAF的組合物通過疏水作用層析。
25.根據(jù)權利要求12所述的方法，還包括將所述含有GcMAF的組合物通過離子交換層析和疏水作用層析的組合。
26.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶固定在包含丙烯酸珠的固相上。
27.一種組合物，其包含根據(jù)權利要求12-26的任一項所述的方法產(chǎn)生的GcMAF，其中所述組合物基本上不含糖苷酶。
28.根據(jù)權利要求27所述的組合物，所述組合物含有少于所述組合物的組合物總蛋白含量中的3%的糖苷酶。
29.根據(jù)權利要求27所述的組合物，所述組合物含有少于所述組合物的總蛋白含量中的1%的糖苷酶。
30.一種藥物組合物，包含治療有效量的根據(jù)權利要求1所述的包含巨噬細胞活化因子的組合物，還包含治療上可接受的稀釋劑或載體。
31.一種藥物組合物，包含治療有效量的根據(jù)權利要求27所述的包含巨噬細胞活化因子的組合物，還包含治療上可接受的稀釋劑或載體。
32.根據(jù)權利要求30或31所述的藥物組合物，配制為用于靜脈內給藥。
33.一種在有此需要的個體中誘導巨噬細胞活化的方法，包括向所述個體施用權利要求32所述的藥物組合物。
34.一種用于治療癌癥的方法，包括向有此需要的受試者施用治療有效量的權利要求32所述的藥物組合物。
35.一種治療HIV感染患者的方法，包括向有此需要的受試者施用治療有效量的權利要求32所述的藥物組合物。
36.根據(jù)權利要求34或35所述的方法，其中所述癌癥或HIV與α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(Nagalase)的升高的水平相關。
37.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中所述癌癥選自由以下組成的組:乳腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、頭/頸癌、腦癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌、纖維肉瘤、間皮瘤、白血病和黑色素瘤。
【文檔編號】A61K38/14GK103547280SQ201280024137
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年4月5日 優(yōu)先權日:2011年4月7日
【發(fā)明者】山本信人 申請人:艾弗蘭納特有限公司