專利名稱：牛y染色體特異性引物序列及在牛胚胎性別鑒定中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用巢式PCR來鑒定牛早期胚胎性別的牛Y-染色體特異性引物序列。
牛早期胚胎的性別鑒定已有十幾年的發(fā)展歷史，從早期的免疫學(xué)方法到胚胎細(xì)胞的染色體核型分析和現(xiàn)在的分子生物學(xué)方法，該項(xiàng)技術(shù)取得了巨大的進(jìn)展，但真正進(jìn)入可以實(shí)際應(yīng)用階段是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在牛早期胚胎性別鑒定中的應(yīng)用。Herr CM等首先成功應(yīng)用了PCR技術(shù)鑒定牛羊胚胎性別(Herr CM，Theriogenology，1991，35(1)45-54)。在國(guó)內(nèi)，曾溢滔等在1991年通過對(duì)牛Y-染色體性別決定區(qū)(SRY)基因核心序列的直接測(cè)序，并通過測(cè)定SRY基因核心序列的存在與否鑒定了奶牛胚胎的性別(中國(guó)科學(xué)(B)，1993，23(4)371-375)。目前人們常用來鑒定牛胚胎性別的序列有Y-染色體重復(fù)序列、SRY基因核心序列等，但Y-染色體重復(fù)序列常常會(huì)因?yàn)樵谄渌旧w上可能存在其同源序列而影響胚胎性別鑒定的準(zhǔn)確率，曾溢滔等所應(yīng)用的SRY核心序列也有其不足之處，因?yàn)镾RY基因的核心序列在哺乳動(dòng)物間有很高的同源性(達(dá)80％以上)，如和人的SRY基因的核心序列的同源性高達(dá)84％，這樣在進(jìn)行牛胚胎性別鑒定時(shí)男性操作者和其他動(dòng)物的DNA容易對(duì)鑒定過程產(chǎn)生污染，特別是在野外進(jìn)行PCR操作時(shí)，因?yàn)榄h(huán)境條件不夠嚴(yán)格，容易產(chǎn)生假陽性，從而影響胚胎性別鑒定的準(zhǔn)確率。并且Herr CM等所用的常規(guī)PCR一次擴(kuò)增的靈敏度有限，因?yàn)榕咛バ詣e鑒定時(shí)所能從胚胎切割取樣的細(xì)胞數(shù)很少，所以有時(shí)會(huì)造成由于擴(kuò)增產(chǎn)物的量太少而影響鑒定結(jié)果的判斷。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是牛Y-染色體特異性引物序列在牛早期胚胎性別鑒定中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明是先提取牛耳組織基因組DNA，進(jìn)行引物特異性檢驗(yàn)，然后分割胚胎的細(xì)胞樣品，提取胚胎細(xì)胞樣品DNA后，使用巢式PCR進(jìn)行胚胎性別鑒定的方法來進(jìn)行牛的性別控制，用外引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)公牛樣品可以擴(kuò)增出255bp的片段，使用Y染色體特異片段的內(nèi)、外引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)時(shí)公牛樣品則可以擴(kuò)增出205bp的擴(kuò)增片段，而母牛樣品使用這些引物則沒有任何擴(kuò)增產(chǎn)物，從而可以鑒定牛胚胎性別。
從相關(guān)報(bào)道中知道SRY基因核心序列以外的區(qū)域在目前所檢測(cè)的哺乳動(dòng)物中同源性低于54％，利用這一特點(diǎn)，本發(fā)明根據(jù)美國(guó)基因庫(Genbank)所提供的Y-染色體特異性DNA序列中的SRY基因5′調(diào)控區(qū)序列，設(shè)計(jì)合成了A、B、C3條嵌套式引物(見表1)，并利用巢式PCR靈敏度和特異性高的特點(diǎn)，使用巢式PCR鑒定牛胚胎的性別。
表1公牛特異的Y-染色體片段引物序列引序 列物A 5′-AGCATTCTGAAAGTCGTTAGCAC-3′B 5′-ATGAAGGTGCAGCAGACATACTA-3′C 5′-AGCTACTGGAATACGTACATAGA-3′在實(shí)際應(yīng)用中如果只使用Y-染色體特異性引物序列，在牛胚胎性別鑒定過程中容易產(chǎn)生假陰性，因此本發(fā)明根據(jù)牛酪蛋白基因序列設(shè)計(jì)合成了一對(duì)牛酪蛋白基因引物作為內(nèi)標(biāo)基因引物。這樣使用Y-染色體特異性序列引物和牛酪蛋白基因引物對(duì)牛DNA或牛胚胎進(jìn)行性別鑒定時(shí)，母牛就只能擴(kuò)增出403bp的內(nèi)標(biāo)基因——牛酪蛋白基因片段，而公牛則同時(shí)能擴(kuò)增出205bp的Y-染色體特異性片段和403bp的牛酪蛋白基因片段(見附

圖1)，如果胚胎細(xì)胞丟失則沒有任何擴(kuò)增產(chǎn)物。
綜上所述，本發(fā)明提供了Y-染色體特異性序列引物，并且該引物特異性強(qiáng)和其他哺乳動(dòng)物的同源性低，避免了其他動(dòng)物DNA給牛胚胎性別鑒定帶來污染的問題。同時(shí)本發(fā)明提供的是嵌套式引物，使用的巢式PCR技術(shù)提高了性別鑒定的靈敏度和特異性，而且內(nèi)標(biāo)基因引物的使用排除了性別鑒定中假陰性錯(cuò)誤，保證了鑒定結(jié)果的可靠性。本發(fā)明完全適合在野外操作，便于在生產(chǎn)中使用。
M100bp梯度的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、4、6、7為母牛，3、5、8為公牛；9為空白對(duì)照，10為陰性對(duì)照，11為陽性對(duì)照；205bp為公牛Y-染色體特異性片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶；403bp為公、母牛共有基因(內(nèi)標(biāo)基因)——酷蛋白基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶。
圖2為引物進(jìn)行牛胚胎性別鑒定的結(jié)果。
1、4、6泳道同時(shí)擁有205bp的Y-染色體特異性片段和403bp的酪蛋白基因擴(kuò)增片段的電泳帶，所以性別鑒定為雄性胚胎，而2、3、5、7、8泳道只有酪蛋白基因擴(kuò)增片段的電泳帶，所以性別鑒定為雌性胚胎。
實(shí)施例1通過?；蚪MDNA進(jìn)行性別鑒定，檢測(cè)引物的特異性。
先提取公牛和母牛的耳組織DNA，再將提取后的牛耳組織DNA溶于400μl滅菌超純水中，然后取0.5μl用于巢式PCR。
本發(fā)明根據(jù)Genbank所提供的Y-染色體特異性DNA序列中的SRY基因5′調(diào)控區(qū)序列，設(shè)計(jì)合成的引物序列如下所示引物 序列A 5′-AGCATTCTGAAAGTCGTTAGCAC-3′B 5′-ATGAAGGTGCAGCAGACATACTA-3′C 5′-AGCTACTGGAATACGTACATAGA-3′使用本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行性別鑒定的具體實(shí)驗(yàn)過程如下巢式PCR的反應(yīng)體系為第一次PCR反應(yīng)體系體積為10μl，其中含引物A、B和酪蛋白基因引物各0.1μmol/l，Taq酶2.0U，共20個(gè)循環(huán)。取第一次PCR反應(yīng)物2～4μl作為第二次PCR反應(yīng)模板，同時(shí)加入引物C、B和酪蛋白基因引物各0.25μmol/l，Taq酶2.0U共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性94℃，5min；變性94℃，30s；退火63℃，30s；延伸72℃，1min，最后在72℃，5min。PCR反應(yīng)在PTC-100(MJ Research)上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀觀察結(jié)果。
結(jié)果表明只使用引物A、B進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)公?？梢詳U(kuò)增出255bp的片段，使用引物A、B、C和酪蛋白基因引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增時(shí)公?？梢詳U(kuò)增出205bp的Y-染色體特異性片段和403bp的酪蛋白基因片段，而母牛DNA樣品則只能擴(kuò)增出403bp的酪蛋白基因片段(如附圖1)。共檢測(cè)了19頭公牛和27頭母牛的DNA樣品，性別檢測(cè)的結(jié)果和實(shí)際完全相符，說明本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的Y-染色體特異性序列引物公牛特異。
實(shí)施例2牛胚胎性別鑒定微量牛胚胎細(xì)胞DNA的提取使用簡(jiǎn)易胚胎分割儀，從桑椹胚或囊胚切取4-6個(gè)細(xì)胞，然后把胚胎細(xì)胞樣品放入200μl離心管后，加入7μl滅菌超純水；在離心機(jī)上短暫離心，使胚胎細(xì)胞樣品存在于離心管底，用封口膜封好離心管；在100℃煮沸10-15min后立即置于冰上；冷卻后14000r/min離心10min，取上清用PCR。其巢式PCR的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)與實(shí)施例1相同。胚胎的性別鑒定結(jié)果如附圖2所示。雄性胚胎可以擴(kuò)增出205bp的Y-染色體特異性片段和403bp的酪蛋白基因片段，而雌性胚胎則只能擴(kuò)增出403bp的酪蛋白基因片段。共檢測(cè)了12個(gè)胚胎的性別，性別鑒定胚胎移植后產(chǎn)犢牛的性別和檢測(cè)結(jié)果完全相一致。
實(shí)施例3使用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對(duì)人、羊和豬的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物是否牛特異。
采集人、羊和豬的血液，提取DNA后，用于巢式PCR擴(kuò)增，其具體的實(shí)驗(yàn)過程與實(shí)施例1相同。結(jié)果所有的人、羊和豬的基因組DNA都沒有任何擴(kuò)增產(chǎn)物，說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物嚴(yán)格牛特異，男性操作者和其他動(dòng)物的DNA不會(huì)對(duì)牛胚胎性別鑒定結(jié)果產(chǎn)生污染。
權(quán)利要求
1.一種牛Y-染色體特異性引物序列，其特征在于這些引物序列如下所示5′-AGCATTCTGAAAGTCGTTAGCAC-3′5′-ATGAAGGTGCAGCAGACATACTA-3′5′-AGCTACTGGAATACGTACATAGA-3′
2.牛Y-染色體特異性引物序列在使用巢式PCR進(jìn)行牛早期胚胎性別鑒定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛Y－染色體特異性引物序列及其在牛胚胎性別鑒定中的應(yīng)用,它是先提取牛耳組織DNA,進(jìn)行引物特異性鑒定后,再提取胚胎細(xì)胞樣品DNA,然后使用巢式PCR進(jìn)行牛胚胎性別的鑒定,用外引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)公牛樣品可以擴(kuò)增出255bp的片段,使用內(nèi)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)公牛樣品則可以擴(kuò)增出205bp的擴(kuò)增片段,而母牛樣品使用這些引物則沒有任何擴(kuò)增產(chǎn)物,說明引物公牛特異,從而表明使用該引物可以鑒定牛胚胎性別。本發(fā)明具有既能減少污染、提高準(zhǔn)確率又能提高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),而且本發(fā)明完全適合在野外操作,便于在生產(chǎn)中使用。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1384209SQ02111848
公開日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2002年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月23日
發(fā)明者黃路生, 陳從英, 陳靜波, 任軍, 陳克飛, 丁能水, 高軍, 艾華水 申請(qǐng)人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)