專利名稱:一種雞cLATS1基因、核苷酸和蛋白的編碼序列,及其制備與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種新的多聚核苷酸,由該多聚核苷酸編碼的多肽,這些多聚核苷酸和多肽的用途,以及所述多聚核苷酸的生產(chǎn)方法。更具體的說,本發(fā)明涉及l(fā)ats腫瘤抑制基因家族的一個(gè)新成員。
lats基因是第一條被發(fā)現(xiàn)同時(shí)在脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物體中起腫瘤抑制功能的基因。我們克隆到的人和小鼠的同源基因hLATS1和mLATS1,在序列和功能上與果蠅lats基因都非常保守。人同源基因hLATS1可被用來拯救果蠅lats突變?cè)斐傻闹滤佬?yīng),抑制腫瘤發(fā)生(NatureGenet(1999)21177-181)。研究發(fā)現(xiàn),hLATS1與細(xì)胞周期蛋白cyclinA和cylinB競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞周期依賴性激酶CDC2(Oncogene(2001)206516-6523),同時(shí)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinA和cyclinB的表達(dá)量(Oncogene(2002)211233-1241),來抑制其H1激酶活性。這與果蠅體中誘導(dǎo)cyclinA或CDC2的突變可抑制lats基因突變表型的結(jié)論相符。推測(cè)lats基因通過調(diào)控細(xì)胞周期來行使其腫瘤抑制的功能。
病理分析表明,mLATS1基因剔除的小鼠具有乳腺發(fā)育缺陷、不育、垂體增生、血清激素水平降低等缺陷(Nature Genet(1999)21182-186)。這與人體中的兩類疾病由黃體促性腺激素分泌不足引起的性腺機(jī)能減退、黃體機(jī)能不全非常相似。同時(shí)發(fā)現(xiàn),所有mLATS1缺失的雌鼠都會(huì)長(zhǎng)出良性的卵巢基質(zhì)細(xì)胞瘤。而且,mLATS1缺失后小鼠對(duì)于致癌刺激特別敏感,易生長(zhǎng)惡性的軟組織肉瘤。雖然軟組織肉瘤在人體中比較少見,但是研究發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生率在兩個(gè)著名的腫瘤抑制基因p53和p16的基因缺失小鼠中也非常高(Nature(1992)356215-221;Cell(1996)8527-37)。由于p53和p16的基因變異與大多數(shù)的人體腫瘤相關(guān),可以推斷hLATS1在抑制人體腫瘤發(fā)生過程中也相當(dāng)重要。
用腺病毒載體將人hLATS1基因轉(zhuǎn)入6種不同的腫瘤細(xì)胞株中并誘導(dǎo)其表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)hLATS1蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。異源表達(dá)的hLATS1蛋白通過誘導(dǎo)細(xì)胞分裂G2/M轉(zhuǎn)變期的停滯或細(xì)胞凋亡的途徑來抑制腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂上的貼壁不依賴性生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),將hLATS1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞移植入裸鼠體內(nèi)也無法形成腫瘤組織。奇妙的是只有在P53未發(fā)生變異的腫瘤細(xì)胞株中,hLATS1的高表達(dá)才可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,否則只能誘導(dǎo)G2/M轉(zhuǎn)換期的停滯。人hLATS1基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤的這一特性,與其它腫瘤抑制基因非常相似,闡明了它在人體中抑制腫瘤發(fā)生的重要性。
lats基因突變果蠅的幼蟲或器官原肌與野生型相比,增大可達(dá)10倍以上,表明lats參與個(gè)體和器官大小的調(diào)控。個(gè)體和器官大小的差異是多細(xì)胞生物進(jìn)化過程中變化最顯著的性狀之一。雖然不同物種單個(gè)細(xì)胞的大小差別并不大,但在器官和個(gè)體水平上,這個(gè)差異可達(dá)幾個(gè)數(shù)量級(jí)之多。而且外在環(huán)境對(duì)多細(xì)胞生物個(gè)體和器官大小的影響同內(nèi)在基因的決定作用相比是微不足道的。近來發(fā)現(xiàn),胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能參與生物器官和個(gè)體大小。但遺憾的是,對(duì)高等生物特別是脊椎動(dòng)物中調(diào)控大小的分子機(jī)制了解甚少。
人hLATS1基因可抑制果蠅lats基因突變?cè)斐傻钠鞴俸蛡€(gè)體增大等表型缺陷,表明LATS信號(hào)傳導(dǎo)途徑從果蠅到人是高度保守的。近一步暗示我們LATS1在高等生物中也參與器官和個(gè)體大小的調(diào)控。研究LATS1基因在脊椎動(dòng)物器官和個(gè)體大小的調(diào)控機(jī)制,需要遺傳背景相同而個(gè)體大小相差懸殊的品系作為研究對(duì)象。家禽和家禽的品系特點(diǎn)使其中的一些生物與該準(zhǔn)則相匹配。本發(fā)明就是選取雞作為研究對(duì)象。
本發(fā)明的另一個(gè)目的提供一種新的lats基因家族成員的基因產(chǎn)物,該蛋白被命名為cLATS1。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的雞cLATS1蛋白的方法。
本發(fā)明還涉及這種雞cLATS1蛋白的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面,提供了一種分離出的DNA分子,它包括編碼具有cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列,所述的核苷酸序列與SEQ ID NO1中從393-3803位的核苷酸序列有至少80%的同源性;或者所述的核苷酸序列能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1中從核苷酸393-3803位的核苷酸序列雜交。
在本發(fā)明中,“分離”和“純化”的DNA是指,該DNA或片斷已經(jīng)從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來,也指該DNA或片斷與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開,而且已經(jīng)在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明的另一方面,提供了一種分離的cLATS1蛋白多肽,它包括具有SEQ ID NO2氨基酸序列或其活性片斷、其活性衍生物。
在本發(fā)明中,術(shù)語“cLATS1蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列,入SEQ ID NO1的簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指,位于SEQ ID NO1序列的編碼框393-3803位的核苷酸中,有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下于SEQ ID NO1中從核苷酸393-3803位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外,該術(shù)語還包括與SEQ ID NO1中從核苷酸393-3803位的核苷酸序列的同源性至少70%,較佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與cLATS1相同功能的蛋白的、SEQ ID NO1序列的變異形式。這些變異包括(但不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè),較佳地1-60個(gè),更佳地1-20個(gè),最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和(或)取代,以及在5’和(或)3’端添加數(shù)個(gè)(通常60個(gè)以內(nèi),較佳地30個(gè)以內(nèi),更佳地10個(gè)以內(nèi),最佳地5個(gè)以內(nèi))核苷酸。該多肽地變異形式包括同源序列、等位變異體、天然變異體、誘導(dǎo)變異體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與cLATS1核苷酸序列雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用cLATS1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明的另一方面,提供了一種載體,它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面,提供了一種所述載體能轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面,提供了一種能產(chǎn)生具有cLATS1蛋白活性的多肽的方法,該方法包括(1)將編碼具有cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連與表達(dá)調(diào)控序列,形成cLATS1蛋白表達(dá)載體,所述的核苷酸序列與SEQ ID NO1中從393-3803位的核苷酸序列有至少70%的同源性;(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,形成cLATS1蛋白的重組細(xì)胞;(3)在適當(dāng)表達(dá)cLATS1蛋白多肽的條件下,培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞;(4)分離出具有cLATS1蛋白活性的多肽。
本發(fā)明還提供cLATS1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然cLATS1蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異,也可以是不影響序列的修飾形式上的差異,或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到,如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)突變,還可通過定點(diǎn)誘變法或其它已知分子生物學(xué)技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解,本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?;螋然?。修飾還包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾后產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸,磷酸絲氨酸,磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括cLATS1多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)cLATS1蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針分子,該分子通常具有cLATS1多肽編碼序列的8-100個(gè),較佳地15-50個(gè)連續(xù)的氨基酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼cLATS1的核酸序列。
本發(fā)明還包括檢測(cè)cLATS1核苷酸序列的方法,它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交,然后檢測(cè)探針是否與之發(fā)生了結(jié)合。較佳地,該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物,其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于cLATS1多肽的編碼序列,可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
在本分明中,可選用本領(lǐng)域已知的各種載體,如市售的載體。
在本分明中,術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子如大腸桿菌和枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地,該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞,如COS細(xì)胞,CHO細(xì)胞等。
另一方面,本發(fā)明還包括對(duì)cLATS1DNA或其片斷編碼的多肽具有特異性的抗體,尤其是單克隆抗體。這里,“特異性”是指抗體那結(jié)合于cLATS1基因產(chǎn)物或片斷。較佳地,指那些能與cLATS1基因產(chǎn)物或片斷結(jié)合但不識(shí)別或結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本分明中,抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制cLATS1蛋白的分子,也包括那些并不影響cLATS1蛋白功能的抗體。本分明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾的cLATS1基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體,還包括具有免疫活性的抗體片斷,如Fab′或(Fab)2片斷;抗體重鏈;抗體輕鏈;遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人,美國(guó)專利No.4,946,778);或嵌和抗體,如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如,純化的cLATS1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片斷,可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的,表達(dá)cLATS1或其具有抗原性的片斷的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來產(chǎn)生抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷cLATS1功能的抗體以及不影響cLATS1功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用cLATS1基因產(chǎn)物的片斷或功能區(qū),通過免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與cLATS1基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生;與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽), 可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的cLATS1核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通??梢杂梅肿与s交方法從雞的cDNA文庫篩選、PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于cDNA文庫篩選法,可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列,尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)探針,從市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫中雜交篩選而克隆到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí),常常需要將多個(gè)片斷按正確次序拼接在一起。也可通過本發(fā)明中的公開序列來設(shè)計(jì)引物,通過一次或多次的PCR擴(kuò)增并拼接來獲得序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列,就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通過是將其克隆入載體,再轉(zhuǎn)入細(xì)胞,然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。除了用重組法產(chǎn)生之外,本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù),通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人,(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,San Francisco;Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如,可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City,CA)來自動(dòng)合成肽??梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片斷,然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
得到了全長(zhǎng)的cDNA分子后就可以與特定載體連接,制成探針或作為微矩陣的底物以獲得一系列相關(guān)核苷酸序列;得到了蛋白后,可制成抗體、受體、拮抗劑、藥物或試劑盒診斷、治療相關(guān)疾??;針對(duì)cDNA序列,設(shè)計(jì)一種方法來操縱雞體內(nèi)該蛋白活性并來改良雞、這一重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的多聚核苷酸全長(zhǎng)為3411個(gè)核苷酸,其詳細(xì)序列見SEQ ID NO1,其開放閱讀框位于393-3803位核苷酸。該多聚核苷酸是如此獲得的利用人hLATS1(gi|4324433)基因cDNA的1-1755位核苷酸為探針,以低嚴(yán)謹(jǐn)度分子雜交方法,從雞胚Uni-ZAP XR cDNA文庫(購自Stratagene)中獲取lats同源基因克隆。經(jīng)序列分析后,通過酶切連接的方法將片斷進(jìn)行拼接,得到含有SEQ ID NO1的393-3803位核苷酸的克隆。
用cLATS1的全長(zhǎng)cDNA序列以其編碼蛋白在GenBank+EMBL+PDB+DDBJ數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白結(jié)構(gòu)及功能域同源檢索,發(fā)現(xiàn)它與lats家族成員具有較高的同源性,如它與人hLATS1(gi|4324433)基因在蛋白水平上具有94%的同源性(見附表),與小鼠mLATS1(gi|4324435)基因在蛋白水平上具有90%的同源性,與果蠅lats(gi|903941)基因在蛋白水平上具有42%的同源性。cLATS1編碼序列與這三個(gè)基因編碼蛋白在激酶催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)同源性更高,如cLATS1蛋白與小鼠和人的LATS1蛋白享有98%的同源性,與果蠅LATS蛋白享有75%。因而認(rèn)為本發(fā)明的cLATS1蛋白是該家族的新成員,具有該家族蛋白相似的功能,也可用來診斷和治療腫瘤、侏儒癥、巨人癥等疾病,調(diào)控家禽(雞等)的器官和個(gè)體大小以改良該經(jīng)濟(jì)物種。本發(fā)明的cLATS1蛋白可以與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用,這類藥物組合物具有治療有效的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑;本發(fā)明的cLATS1蛋白還可被制備成針劑、片劑和其它治療劑一起使用的試劑盒。本發(fā)明的cLATS1蛋白還可作為靶蛋白,篩選對(duì)診斷和治療腫瘤、侏儒癥、巨人癥等疾病,控制雞器官和個(gè)體大小有效的小分子藥物。通過構(gòu)建本發(fā)明中cLATS1基因的轉(zhuǎn)基因家禽(如雞),制備改良經(jīng)濟(jì)物種。
附表為本發(fā)明的cLATS1與果蠅LATS、小鼠mLATS1和人hLATS1的蛋白序列比較。其中相同的氨基酸已用黑色背景標(biāo)出。
實(shí)施例1cLATS1的cDNA序列的克隆和測(cè)定由于lats基因家族成員的C端含有與其它絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶非常保守的激酶催化域,所以選取人hLATS1(gi|4324433)基因cDNA的5’端1-1755位核苷酸作為探針。用以低嚴(yán)謹(jǐn)度分子雜交方法,從雞胚Uni-ZAP XR cDNA文庫(購自Stratagene)中獲取lats同源基因克隆。具體步驟如下將1×106個(gè)噬菌體克隆轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Amersham),再用80℃烘烤或紫外交聯(lián)法將DNA固定。同時(shí)運(yùn)用隨機(jī)引物延伸法,將探針用[α-32P]dCTP標(biāo)記。然后將膜在含有6xSSC、5xDenharts’、0.5%SDS、100微克/毫升鮭魚精DNA和2納克/毫升cDNA探針的雜交體系中55℃雜交過夜。最后在含有1xSSC和0.1%SDS的洗脫體系中60℃洗脫30分鐘。挑選陽性噬菌體克隆,再用ECL試劑盒(Amersham)進(jìn)行兩輪復(fù)篩以選取單克隆(雜交方法見ECL試劑盒說明書)。然后,利用Uni-ZAP XR文庫的特性,將各單克隆片斷從原來的Uni-ZAP XR噬菌體載體中亞克隆入噬菌粒載體pBluescript SK中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌SOLRTM。最終送交測(cè)序公司進(jìn)行片斷序列測(cè)序分析。
經(jīng)測(cè)序分析后,分析序列檢驗(yàn)片段是否含有全長(zhǎng)的cDNA序列。然后選取所需克隆片斷,通過酶切連接的方法將片斷進(jìn)行拼接,得到含有SEQ ID NO1的393-3803位核苷酸的克隆。根據(jù)得到的全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出cLATS1的氨基酸序列,共1123個(gè)氨基酸殘基,其氨基酸序列見SEQ ID NO2。
實(shí)施例2同源比較用cLATS1的全長(zhǎng)cDNA序列以其編碼蛋白在GenBank+EMBL+PDB+DDBJ數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白結(jié)構(gòu)及功能域同源檢索,發(fā)現(xiàn)它與lats家族成員具有較高的同源性,如它與人hLATS1(gi|4324433)基因在蛋白水平上具有94%的同源性(見附表),與小鼠mLATS1(gi|4324435)基因在蛋白水平上具有91%的同源性,與果蠅lats(gi|903941)基因在蛋白水平上具有42%的同源性。cLATS1編碼序列與這三個(gè)基因編碼蛋白在激酶催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)同源性更高,如cLATS1蛋白與小鼠和人的LATS1蛋白享有98%的同源性,與果蠅LATS蛋白享有75%。
lats基因家族成員被認(rèn)為與腫瘤抑制和器官個(gè)體大小的調(diào)控有關(guān)。通過EMBL的InterProScan工具分析,本發(fā)明的cLATS1蛋白亦包含lats基因家族蛋白激酶的各種功能域。如UBA結(jié)構(gòu)域,它與特異性降解蛋白的泛素途徑相關(guān),在高等生物的LATS1同源蛋白中都有發(fā)現(xiàn),而在果蠅LATS蛋白中不存在;絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域,它在一系列與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的蛋白激酶中高度保守;SH3域結(jié)合位點(diǎn),在所有的lats家族成員中都存在。研究發(fā)現(xiàn),lats參與的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在進(jìn)化上高度保守(1)cLATS1蛋白與lats家族的其它成員在序列和功能域上非常相似;(2)mLATS1基因剔除小鼠易生長(zhǎng)軟組織肉瘤和卵巢基質(zhì)細(xì)胞瘤,而且對(duì)致癌刺激特別敏感;(3)高表達(dá)hLATS1蛋白可通過誘導(dǎo)細(xì)胞分裂G2/M轉(zhuǎn)變期的停滯或細(xì)胞凋亡的途徑來抑制各種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng);(4)人hLATS1基因可抑制果蠅lats基因突變引起的腫瘤發(fā)生和器官、個(gè)體的增大(可參與調(diào)控果蠅的器官和個(gè)體大小)。有力地證明了,若將cLATS1蛋白的抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等制成藥物,可用于腫瘤、侏儒癥、巨人癥等疾病的診斷和治療。通過轉(zhuǎn)基因等手段,操縱cLATS1蛋白的活性或運(yùn)用拮抗劑、抑制劑來調(diào)節(jié)cLATS1的表達(dá)水平,以改良雞這一經(jīng)濟(jì)物種。
實(shí)施例3cLATS1在大腸桿菌中的表達(dá)測(cè)序結(jié)果顯示編碼cLATS1的cDNA序列插入在載體pBluescript SK的EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)中,其插入方向與該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄方向相符。利用該片段起始密碼子上游的NotI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和終止密碼子下游的KpnI限制酶酶切位點(diǎn)(該cDNA片段內(nèi)部都沒有相同的位點(diǎn)),將該cDNA片段亞克隆入細(xì)菌表達(dá)載體pET32a(+)(Novagen)。
NotI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和XhoI限制酶酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于該表達(dá)載體pET32a(+)上的多克隆位點(diǎn)。該質(zhì)粒表達(dá)載體含有編碼氨芐抗性的基因(Ampr)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)(f1ori)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)操縱子(lac o)、兩個(gè)His標(biāo)記物(His-Tag)、一個(gè)S標(biāo)記物(S-Tag)、一個(gè)Trx標(biāo)記物(Trx-Tag)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)T7轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、一個(gè)T7轉(zhuǎn)錄終止子及一個(gè)限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)。
先用KpnI內(nèi)切酶消化帶有cLATS1片段的載體pBluescript SK,并將KpnI酶失活。再用利用T4 DNA多聚酶的3’到5’外切酶活性,切除KpnI酶切后引入的3’端突出片段,并失活T4 DNA多聚酶。同時(shí)用XhoI內(nèi)切酶消化載體pET32a(+),并失活XhoI酶。再利用Klenow酶的5’到3’的聚合酶活性,將XhoI酶切后引入的5’端突出補(bǔ)平,并失活Klenow酶。然后用NotI內(nèi)切酶分別消化兩片段,分別回收pET32a(+)和cLATS1的核酸片段。隨后將cLATS1片斷連接到pET32a(+)載體中并保持開放閱讀框在細(xì)菌RBS起始。再把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。DE3基因編碼由lac啟動(dòng)子啟動(dòng)的T7RNA聚合酶。在該菌株的基因組中還含有編碼lacI阻遏物的基因。加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)誘導(dǎo)后,IPTG與lacI阻遏物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合lac啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子的lac o位點(diǎn),去除了lacI阻遏物對(duì)T7RNA聚合酶和本發(fā)明的cLATS1的轉(zhuǎn)錄抑制。產(chǎn)生的T7RNA聚合酶結(jié)合于T7啟動(dòng)子,大幅度地啟動(dòng)本發(fā)明的CLATS1的轉(zhuǎn)錄。在含有Amp的LB培養(yǎng)基上挑選轉(zhuǎn)化子,在補(bǔ)加Amp(100微克/毫升)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化子。抽提質(zhì)粒,NotI和XhoI酶切鑒定插入片斷的大小,測(cè)序結(jié)果表明cLATS1的cDNA插入片斷己正確插入載體。
過夜培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋,然后接種到大體積培養(yǎng)基中,培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至OD600為1.0時(shí),加入IPTG至終濃度為1mM。。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí),隨后離心(600xg,20分鐘)。超聲裂解培養(yǎng)物,收集細(xì)胞裂解液并將其稀釋于6M的鹽酸胍中。澄清后,通過在能使含His標(biāo)記物質(zhì)蛋白緊密結(jié)合的條件下,用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的cLATS1用6M鹽酸胍(Ph5.0)從柱中洗脫SEZ-6??捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先,使用透析步驟出去鹽酸胍,或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以合到第二柱中,該柱中具有遞減的線形鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性,隨后用鹽酸胍(Ph5.0)洗脫。最后,將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析,然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10%(w/v)甘油的貯存液中。
用12%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳,鑒定表達(dá)蛋白性質(zhì)。此外,用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO2的序列一致。
實(shí)施例4cLATS1在真核細(xì)胞(IPLB-Sf21細(xì)胞)中的表達(dá)桿狀病毒(baculovirus)表達(dá)系統(tǒng)可表達(dá)分子量比較大的蛋白,與原核表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)更具優(yōu)勢(shì)。由于通過桿狀病毒介導(dǎo)在昆蟲宿主細(xì)胞中表達(dá)的蛋白經(jīng)過了翻譯后修飾,因此具有與天然蛋白相似的結(jié)構(gòu)和功能,而且其表達(dá)量可達(dá)整個(gè)細(xì)胞蛋白重量的30%左右。本實(shí)施例使用BakPAKTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Clontech)來表達(dá)本發(fā)明的cLATS1蛋白。該系統(tǒng)由線性的BacPAK6病毒DNA和環(huán)形的轉(zhuǎn)移載體BacPAK8、BacPAK9兩部分所組成。BackPAK6病毒DNA缺失了桿狀病毒(AcMNPV,苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒)復(fù)制所必須的基因,因此無法在昆蟲體內(nèi)繁殖。一旦與攜帶該缺失基因的轉(zhuǎn)移載體BacPAK8或BacPAK9在細(xì)胞內(nèi)重組后就可生成具有侵染能力的病毒。由于多角體蛋白(polyhedrin)缺失的病毒仍可侵染昆蟲細(xì)胞,所以在BacPAK8和BacPAK9所攜帶的多角體蛋白的編碼片段被一段限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)所替代。外源基因插入后,可利用多角體蛋白的調(diào)控元件來高效表達(dá)。
BacPAK8轉(zhuǎn)移載體含有編碼氨芐抗性的基因(Ampr)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)(M13ori)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)及一段改造過的病毒序列。該序列包括AcMNPV復(fù)制所必須的基因和一個(gè)多角體蛋白啟動(dòng)子(polyhedrin promoter)、一個(gè)加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA序列及一個(gè)限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)。
利用實(shí)施例3中所述的帶有cLATS1片段的pBluescript SK載體上的XbaI和KpnI酶切位點(diǎn),將本發(fā)明的cLATS1的cDNA序列亞克隆入BacPAK8。BamHI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和XhoI限制酶酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于該表達(dá)載體BacPAK8轉(zhuǎn)移載體上的多克隆位點(diǎn)。用NotI和KpnI內(nèi)切酶消化載體BacPAK8轉(zhuǎn)移載體,隨后將插入片斷連接到BacPAK8載體中,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109。在含有Amp的LB平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子,并在補(bǔ)加Amp(100微克/毫升)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子克隆。抽提質(zhì)粒,NotI和KpnI酶切鑒定插入片斷的大小,測(cè)序結(jié)果表明cLATS1的cDNA插入片斷已正確插入載體BacPAK8。
采用脂質(zhì)體Bacfectin(Clontech)將BacPAK6和攜帶cLATS1 cDNA片斷的BacPAK8共轉(zhuǎn)染IPLB-Sf21草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞株(按照Clontech公司提供的步驟)。27℃培養(yǎng)5小時(shí)后,加入BacPAK完全培養(yǎng)液(Clontech)再培養(yǎng)72小時(shí)。然后,收集共轉(zhuǎn)染上清培養(yǎng)基,并用BacPAK桿狀病毒效價(jià)試劑盒(Clontech)測(cè)定病毒的效價(jià)。選取20為病毒感染復(fù)數(shù)(M.O.I.),侵染單層Sf21貼壁細(xì)胞,1小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基,27℃繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2小時(shí)收集細(xì)胞,按50μl裂解緩沖液/每106個(gè)Sf21細(xì)胞的比例加入裂解液,同時(shí)加入蛋白酶抑制劑,用12%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳,鑒定表達(dá)蛋白性質(zhì)。此外,用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO2的序列一致。如要大量生產(chǎn)cLATS1蛋白,可用Sf21細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/毫升的100-500毫升培養(yǎng)基,以20為M.O.I.混入重組病毒直至Sf21細(xì)胞終濃度為1×106個(gè)/毫升。24-60小時(shí)后,收集細(xì)胞并超聲破解。提取裂解液,分離cLATS1蛋白(可用針對(duì)cLATS1的特異性抗體沉淀該蛋白)。
實(shí)施例5cLATS1在真核細(xì)胞(COS細(xì)胞)中的表達(dá)用實(shí)施例3中所述的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)NotI和KpnI,將本發(fā)明的cLATS1cDNA序列亞克隆入真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen)。NotI和XhoI酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于該表達(dá)載體的多克隆酶切位點(diǎn)中。將本發(fā)明的cLATS1cDNA片斷連接入載體后,其轉(zhuǎn)錄方向與該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄方向相同。pcDNA3質(zhì)粒表達(dá)載體含有編碼抗生素抗性的基因(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)(f1 ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ColE1)、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P CMV)、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA序列,一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA序列及一個(gè)限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)。
先用KpnI內(nèi)切酶消化帶有cLATS1片段的載體pBluescript SK,并將KpnI酶失活。再用利用T4 DNA多聚酶的3’到5’外切酶活性,切除KpnI酶切后引入的3’端突出片段,并失活T4 DNA多聚酶。同時(shí)用XhoI內(nèi)切酶消化載體pcDNA3,并失活XhoI酶。再利用Klenow酶的5’到3’的聚合酶活性,將XhoI酶切后引入的5’端突出補(bǔ)平,并失活Klenow酶。然后用NotI內(nèi)切酶分別消化兩片段,分別回收pcDNA3和cLATS1的核酸片段。隨后將cLATS1片斷連接到pcDNA3載體中,并把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109。在含有Amp的LB平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子,并在補(bǔ)加Amp(100微克/毫升)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子克隆。抽提質(zhì)粒,NotI和XhoI酶切鑒定插入片斷的大小,測(cè)序結(jié)果表明cLATS1的cDNA插入片斷已正確插入載體。
采用脂質(zhì)體Lipofectamine(GIBCOL)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞株(按照GIBCOL公司提供的步驟)。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后,經(jīng)15-20天的持續(xù)G418的加壓篩選,收集單克隆細(xì)胞上清并測(cè)定cLATS1蛋白表達(dá)量和活性。然后去除G418,連續(xù)傳代培養(yǎng);將單克隆細(xì)胞混合并極限稀釋,挑選具有較高蛋白活性的細(xì)胞單克隆。按照常規(guī)方法培養(yǎng)陽性單克隆。48-72小時(shí)后,收集細(xì)胞及上清,用超聲破解細(xì)胞。以含有0.05%Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液和洗脫液,用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集cLATS1蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱,以含有不同濃度NaCl(0-1M)和50mM Tris·HCl(pH8.0)的一系列洗脫液進(jìn)行梯度洗脫,收集cLATS1蛋白活性峰。最后用PBS(pH7.4)透析cLATS1蛋白溶液,并凍干保存。
用12%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳,鑒定表達(dá)蛋白性質(zhì)。此外,用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO2的序列一致。
實(shí)施例6cLATS1的果蠅在體活性測(cè)定1.高表達(dá)實(shí)驗(yàn)在果蠅UAS/GAL4表達(dá)系統(tǒng)中,通過組織特異性的GAL4蛋白與UAS序列的結(jié)合,誘導(dǎo)UAS下游外源基因的組織特異性表達(dá)。
在該實(shí)施例中,利用實(shí)施例3中所述的帶有cLATS1片段的pBluescript SK載體上的NotI和KpnI酶切位點(diǎn),將本發(fā)明的cLATS1的cDNA序列亞克隆入表達(dá)載體pUAST。NotI和KpnI酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于該表達(dá)載體的多克隆酶切位點(diǎn)中。將本發(fā)明的cLATS1的cDNA片斷連接入載體后,其轉(zhuǎn)錄方向與該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄方向相同。pUAST質(zhì)粒表達(dá)載體由含有編碼抗生素抗性的基因(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)含有5個(gè)GAL4蛋白結(jié)合位點(diǎn)的上游激活序列(UAS)、一個(gè)P轉(zhuǎn)座因子的左端序列,一個(gè)P轉(zhuǎn)座因子的右端序列、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA序列,一個(gè)mini-w+基因,及一個(gè)限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)。
用NotI和KpnI內(nèi)切酶消化載體pUAST載體,隨后將插入片斷連接到pUAST載體中,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109。在含有Amp的LB平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子,并在補(bǔ)加Amp(100微克/毫升)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子克隆。抽提質(zhì)粒,NotI和KpnI酶切鑒定插入片斷的大小,測(cè)序結(jié)果表明cLATS1的cDNA插入片斷已正確插入載體pUAST。
用一個(gè)僅編碼轉(zhuǎn)座酶的缺陷型P因子質(zhì)粒(Δ2-3),與攜帶cLATS1 cDNA的pUAST載體一起顯微注射到w1118品系果蠅的卵生殖細(xì)胞內(nèi)。通過P轉(zhuǎn)座酶識(shí)別pUAST載體上的P因子末端的反向重復(fù)序列,將cLATS1 cDNA和mini-w+基因整合入果蠅基因組內(nèi)。同時(shí)在子二代,由于mini-w+表達(dá)使果蠅的眼睛變?yōu)闇\紅或桔紅色,所以挑選紅眼果蠅建立UAS-cLATS1果蠅品系,并用果蠅平衡系平衡。然后與已構(gòu)建好的不同GAL4果蠅品系交配,再下一代檢測(cè)表型。
結(jié)果顯示,cLATS1 cDNA的表達(dá)可調(diào)控果蠅的器官和個(gè)體大小(附
圖1)。在pGMR-GAL4果蠅品系中,pGMR啟動(dòng)子誘導(dǎo)GAL4在眼原肌的分化細(xì)胞內(nèi)特異性地表達(dá)。UAS-cLATS1品系與該品系交配的得到子一代中,果蠅眼睛粗糙,變小。Ey啟動(dòng)子誘導(dǎo)GAL4在眼原肌的增殖細(xì)胞內(nèi)特異性地表達(dá)。UAS-cLATS1品系與Ey-GAL4品系交配的子一代中,果蠅眼睛變小。Actin啟動(dòng)子可誘導(dǎo)GAL4的組成型表達(dá),UAS-cLATS1品系與該Actin-GAL4品系交配的得到子一代個(gè)體變小,大約為野生型果蠅個(gè)體體積的2/3左右。
2.拯救實(shí)驗(yàn)該實(shí)施例中,將本發(fā)明中的誘導(dǎo)cLATS1 cDNA在lats突變果蠅體內(nèi),檢測(cè)cLATS1是否能抑制lats突變引起的發(fā)育早期致死。
將上述構(gòu)建的pUAST-cLATS1載體上的NotI和XbaI酶切位點(diǎn),將本發(fā)明的cLATS1的cDNA序列亞克隆入表達(dá)載體pCaspeR-hs。NotI和XbaI酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于該表達(dá)載體的多克隆酶切位點(diǎn)中。將本發(fā)明的cLATS1的cDNA片斷連接入載體后,其轉(zhuǎn)錄方向與該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄方向相同。pCaspeR-hs質(zhì)粒表達(dá)載體由含有編碼抗生素抗性的基因(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)熱激可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(hsp70)、一個(gè)P轉(zhuǎn)座因子的左端序列,一個(gè)P轉(zhuǎn)座因子的右端序列、一個(gè)mini-w+基因,及一個(gè)限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)。
用NotI和XbaI內(nèi)切酶消化載體pCaspeR-hs載體,隨后將插入片斷連接到pCaspeR-hs載體中,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109。在含有Amp的LB平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子,并在補(bǔ)加Amp(100微克/毫升)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子克隆。抽提質(zhì)粒,NotI和XbaI酶切鑒定插入片斷的大小,測(cè)序結(jié)果表明cLATS1的cDNA插入片斷已正確插入載體pCaspeR-hs。按照上述構(gòu)建UAS-cLATS1品系相同的方法,構(gòu)建hs-cLATS1品系。挑選hs-cLATS1整合在果蠅II號(hào)染色體上的品系,與latse26-1突變果蠅系交配以獲得基因型為hs-cLATS1/+;lase26-1/TM6B的果蠅品系(TM6B為果蠅III號(hào)平衡染色體)。然后收集該品系的卵,每天37℃誘導(dǎo)1小時(shí)直至果蠅羽化,檢測(cè)是否有l(wèi)atse26-1純合果蠅成蟲存在。
結(jié)果表明,熱激誘導(dǎo)cLATS1的表達(dá)可部分拯救latse26-1純合突變引起的表型缺陷(附圖2)。latse26-1純合突變引起果蠅在發(fā)育的蛹期致死。被cLATS1拯救活的果蠅與野生型果蠅相比,個(gè)體偏大、翅膀變寬、交叉翅脈有部分或全部缺失,而且不育。
實(shí)施例7DNA芯片的底物DNA芯片,又稱微距陣(Microarray)。DNA芯片可通過使用噴墨技術(shù)及一系列化學(xué)方法如射線、化學(xué)、熱力學(xué)、機(jī)械方法等把樣品固定在底物上得到,形成的元件有點(diǎn)狀、條形等等。一塊典型的芯片通常含有一定數(shù)量的元件,可通過手工或用適當(dāng)?shù)膬x器設(shè)備制備。雜交反應(yīng)后,洗脫未結(jié)合的探針,然后用掃描儀來檢測(cè)發(fā)生雜交反應(yīng)的元件及反應(yīng)程度。探針與每一芯片元件的互補(bǔ)性和結(jié)合量都可通過對(duì)掃描出的圖象的分析來判斷。
全長(zhǎng)cDNA、EST、或基因片段都可以作為固定于底物上的樣品。適合于雜交的片段可以用一些著名的生物軟件,如DNASTAR來選擇。這些全長(zhǎng)cDNA、EST、與本發(fā)明的核酸序列相關(guān)的片段、或與這項(xiàng)發(fā)明有關(guān)的cDNA庫中隨機(jī)選出的片段被有序的排列于玻璃等載體上。cDNA固著于玻片的方法是紫外線交聯(lián)、熱學(xué)、化學(xué)處理、干燥(Science(1995)270467-470;Genome Res.(1996)6639-645)等。將探針用熒光標(biāo)記后,在與固著地反應(yīng)元件雜交。雜交結(jié)果可用于推斷基因功能,理解疾病產(chǎn)生的基因基礎(chǔ),診斷疾病,并可改進(jìn)及監(jiān)測(cè)藥劑的活性。
本發(fā)明cLATS1核苷酸序列或其全長(zhǎng)片段可用作微距陣的對(duì)象,監(jiān)測(cè)出基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象,從而對(duì)腫瘤、侏儒癥、巨人癥等疾病的診斷及治療起輔助作用。
實(shí)施例8多克隆抗體制備將按實(shí)施例3和實(shí)施例4的獲得的蛋白免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體。具體步驟如下,可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離,將電泳條帶從凝膠中切下,再用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。再將200毫升乳化過的cLATS1蛋白(50-100微克)注射入小鼠腹腔內(nèi)。14天后,用非完全Freund′s佐劑乳化的相同劑量蛋白進(jìn)行腹腔內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天后,再用相同劑量蛋白免疫,至少3次以上。收集到的血清多克隆抗體的活性,可通過其在體外沉淀cLATS1蛋白的能力來判斷。該多克隆抗體可用來親和純化相關(guān)蛋白或篩選該家族的其它蛋白成員。
實(shí)施例9試劑盒的制備試劑盒1該試劑盒含有進(jìn)行PCR擴(kuò)增的特異性引物和使用說明。該試劑盒同時(shí)也可含有可將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的試劑和使用說明。特異性引物序列衍生自SEQ ID NO1的序列,并可對(duì)含有cLATSlcDNA序列的核酸片斷進(jìn)行特異性擴(kuò)增,以檢測(cè)樣品中是否含有cLATS1核酸序列。該試劑盒還可具備進(jìn)行PCR擴(kuò)增的其它試劑如Taq酶、PCR緩沖液、MgCl溶液等。此外,較佳地,該特異性引物對(duì)跨越兩個(gè)外顯子,對(duì)含有cLATS1序列的基因組片斷不進(jìn)行特異性的擴(kuò)增。
試劑盒2該試劑盒中含有可與天然cLATS1基因和mRNA結(jié)合的特異性探針分子(如生物素或同位素標(biāo)記探針)。該試劑盒還可具有雜交尼龍膜、雜交緩沖液等附屬制品??捎迷撛噭┖兄刑结樂肿优ccLATS1編碼片段的特異性反應(yīng)來檢測(cè)樣本中是否存在cLATS1的核酸分子。也可用來檢測(cè)基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象,并找出一系列與cLATS1相關(guān)的基因,從而對(duì)疾病的治療和診斷起輔助作用。
試劑盒3試劑盒含有針對(duì)cLATS1的特異性抗體和使用說明(如按實(shí)施例6制備的多克隆抗體或運(yùn)用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體)。該試劑盒可直接檢測(cè)樣品中是否含有cLATS1蛋白??上韧ㄟ^形成特異性的免疫復(fù)合物,然后直接檢測(cè)免疫復(fù)合物的成分。
實(shí)施例10制成藥物本發(fā)明的蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等都可作為藥物,用于診斷和治療腫瘤或侏儒癥、巨人癥等疾病,是對(duì)于調(diào)控經(jīng)濟(jì)動(dòng)物或人體個(gè)體、器官大小的有重要價(jià)值的小分子藥物。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等,當(dāng)在治療上進(jìn)行使用時(shí),可提供不同的效果。通常,可將這些物質(zhì)配置于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中,其中pH通常為約5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配置物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配置好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥,其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
此外,本發(fā)明核酸(編碼序列或反義序列)可以直接引入細(xì)胞,以提高人的表達(dá)水平或者抑制的過度表達(dá)。本發(fā)明的蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人,以治療或減輕因缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外,還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
當(dāng)本發(fā)明的蛋白多肽被用作藥物時(shí),治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重,而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重,較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然,具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑等因素,這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
實(shí)施例11轉(zhuǎn)基因雞的制備由于lats家族成員參與器官和個(gè)體大小的調(diào)控,cLATS1也應(yīng)該具備該相似的功能。對(duì)該本發(fā)明的cLATS1編碼片段進(jìn)行修飾后,可調(diào)節(jié)其蛋白活性。我們可根據(jù)實(shí)際需要,構(gòu)建不同的cLATS1轉(zhuǎn)基因雞品系,以改良雞這一重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。
自八十年代初Palmiter首次獲得轉(zhuǎn)基因超級(jí)小鼠(Nature(1982)300(16)611-615)以來,已有許多有關(guān)哺乳類乳腺特異表達(dá)成功的實(shí)例。然而在目前大部分轉(zhuǎn)基因研究中,外源基因的導(dǎo)入仍以顯微注射法為主。顯微注射技術(shù)不僅成本高、難度大,而且效率較低。1989年,Lavitrano等首次利用小鼠附睪內(nèi)的精子攜帶外源DNA轉(zhuǎn)基因成功,并以30%的高整合率獲得轉(zhuǎn)基因小鼠(Cell(1989)57717-723)。盡管有人對(duì)其轉(zhuǎn)基因的可靠性提出質(zhì)疑,但由于該技術(shù)簡(jiǎn)便易行且陽性率較高,所以一直為人們所關(guān)注。本實(shí)施例中即以他們的工作為基礎(chǔ),通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,應(yīng)用雞精子作為轉(zhuǎn)基因載體,攜帶含有外源融化基因(雞cLATS1衍生物的組織特異性和組成型表達(dá)載體)進(jìn)行雞的體外受精和胚胎移植。具體步驟如下取出供精公雞的附睪,剪開附睪管,用一根無菌玻璃針挑取一滴精液,放入預(yù)先平衡的CO2培養(yǎng)箱中的、石蠟油覆蓋的0.5ml培養(yǎng)液TYH中,待精子自行擴(kuò)散后取出玻璃針。將液滴放入37℃、5%CO2、濕度99%條件下的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)。此間吸取少量懸液,用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)確定精子的濃度。培養(yǎng)1小時(shí)后,直接將精子加入0.2ml石蠟油覆蓋的受精微滴(TYH)中,受精精子濃度為1-2×106/ml。取DOSPER脂質(zhì)體(Boehringer Mannheim)與外源基因溶液輕輕混合,37℃靜置20分鐘,按一定比例加入受精微滴中,繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)半小時(shí)。以性成熟的母雞分別作為供、受體進(jìn)行超排卵處理。取出供卵母雞輸卵管,將成熟卵子取出并與受精微滴混合,在37℃、5%CO2中進(jìn)行受精培養(yǎng)。胚胎發(fā)育到2-4細(xì)胞時(shí)進(jìn)行輸卵管移植;或發(fā)育至桑椹胚以后進(jìn)行子宮移植。用PCR檢測(cè)外源基因的整合。提取小雞組織基因組DNA,于50μl反應(yīng)體系中,按照93℃1分鐘、60℃30秒、72℃延伸2分鐘條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。同時(shí)將基因組DNA用BamHI酶切后,進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)外源基因整合。
序列表<110>復(fù)旦大學(xué)<120>雞cLATS1基因,核苷酸和蛋白序列及其應(yīng)用方法<130>32<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4244<212>核苷酸<213>雞<220><221>編碼序列<222>(393)..(3803)<223><400>1gctggagcta atcccaccgc ggtggcggcc gctctagaac tagtggatcc cccgggctgc 60aggcgcggcg gagacaccga caaaatggcg gcgccgaact gaaagggccc tggcggcggc120ggcgggccgt ggcggaggga gcgagcggcc gcggcgggca gcgcggaagg ccgcggcggt180cgtcgctgcg cgggcggggc cggggcgctg ccgccgccgc cctctcgcct caggatatct240gctttgcatt gtggcacacg tcagcactac aagaatcaca gtctagcagt gaagagtcac300tgccttcacg tgttctgaaa ctaccagtca gccttcctgg agttttgcat tagcgcgagt360ccttggtgga ggttgcatat atacatgttt tc atg aag aga agt gag aag cca 413Met Lys Arg Ser Glu Lys Pro1 5gaa ggt tat aga caa atg agg cct aag act ttt cct gcc agt aac tat 461Glu Gly Tyr Arg Gln Met Arg Pro Lys Thr Phe Pro Ala Ser Asn Tyr10 15 20act ggc agc agc cag cag atg tta cag gaa ata cga gag agc ctc agg 509Thr Gly Ser Ser Gln Gln Met Leu Gln Glu Ile Arg Glu Ser Leu Arg25 30 35aat tta cca aaa ccc tca gat gct gct aaa gct gat ctc 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附表同源序列比較
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子,其特征在于,它包括編碼具有雞cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列,該核苷酸序列與SEQ ID NO1中從核苷酸393-3803位的核苷酸序列有至少85%的同源性;或者所示的核苷酸序列能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1中從核苷酸393-3803位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子,其特征在于,所述的序列編碼-多肽,該多肽具有SEQID NO2所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子,其特征在于,該序列具有SEQ ID NO1中從核苷酸393-3803位的核苷酸序列。
4.一種分離的cLATS1蛋白多肽,其特征在于,該多肽具有SEQ ID NO2序列的多肽。
5.一種載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
6.一種用權(quán)利要求5所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞,其特征在于,該細(xì)胞是大腸桿菌。
8.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞,其特征在于,該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
9.一種產(chǎn)生具有cLATS1蛋白活性的多肽的方法,其特征在于,該方法包括(1)將編碼具有cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列,形成cLATS1蛋白表達(dá)載體,所述的核苷酸序列與SEQ ID NO1中從核苷酸393-3803位的核苷酸序列有至少70%的同源性;(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,形成cLATS1蛋白的重組細(xì)胞;(3)在合適表達(dá)cLATS1蛋白多肽的條件下,培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞;(4)分離出具有cLATS1蛋白活性的多肽。
10.如權(quán)利要求10所述的方法,其方法在于,該方法可產(chǎn)生如序列SEQ ID NO1中從393-3803位的核苷酸。
11.一種能與權(quán)利要求4所述的cLATS1蛋白多肽特征性結(jié)合的抗體。
12.一種核苷酸分子,其特征在于,它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
13.一種探針分子,其特征在于,它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明是一種雞cLATS1基因,核苷酸和蛋白序列及其制備和用途?,F(xiàn)有技術(shù)中尚無該類研究的報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明提供了該蛋白的cDNA編碼序列、該序列編碼的多肽,以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的雞cLATS1蛋白的方法。該蛋白可用于診斷和治療腫瘤疾病、改良經(jīng)濟(jì)物種等。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1396259SQ0211181
公開日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2002年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月23日
發(fā)明者許田, 陳偉麗, 盧剛 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)