專利名稱：含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。
背景技術(shù)：
磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族一直被報(bào)道為細(xì)胞表面上存在的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的新家族。迄今，5種磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5)已被報(bào)道成磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成員。這些家族成員具有大小一致的核心蛋白(約60kDa)，享有特異和完全保守的半胱氨酸序列，并且通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨結(jié)合到細(xì)胞膜上。
通過(guò)對(duì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有異常細(xì)胞分裂模式的果蠅(Drosophila melanogaster)變體的基因進(jìn)行篩選已鑒定了Dally(分裂異常延遲的)基因。已知Dally的cDNA代表一可讀框(ORF)，所述ORF編碼其序列顯示與含有所有磷脂酰肌醇蛋白聚糖特征的脊椎動(dòng)物的跨膜蛋白聚糖(GRIP)同源(24-26％的同源性)的產(chǎn)物。并且還已提示dally基因在調(diào)節(jié)dpp(decapentaplegia)受體機(jī)制中發(fā)揮作用。這暗示哺乳動(dòng)物的磷脂酰肌醇蛋白聚糖可調(diào)節(jié)TGF和BMP之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。具體而言，已提示磷脂酰肌醇蛋白聚糖可起到一些肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(例如EGF、PDGF、BMP2和FGF)的共同受體的作用。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3已被分離為大鼠腸中發(fā)育調(diào)節(jié)下的轉(zhuǎn)錄物(Filmus，J.，Church，J.G.和Buick，R.n.(1988)Mol.Cell Biol.8，4243-4249)，然后鑒定成一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的GPI-連接的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖OCT-5，其核心蛋白的分子量為69kDa(Filmus，J.，Shi，W.，Wong，Z.-M.和Wong，M.J.(1995)Biochem.J.311，561-565)。同樣在人中，編碼磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因已從人胃癌細(xì)胞系中被分離為MXR-7(Hermann Lage等，Gene 188(1997)151-156)。已有報(bào)道，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3與胰島素樣生長(zhǎng)因子-2形成蛋白-蛋白復(fù)合體，以便調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子的作用(Pilia，G.等，(1996)Nat.Genet.12，241-247)。此報(bào)道提出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3不總是與含有硫酸乙酰肝素鏈的生長(zhǎng)因子相互作用。
已有報(bào)道建議磷脂酰肌醇蛋白聚糖3可用作肝癌標(biāo)記(Hey-ChiHsu等，CANCER RESERCH 57，5179-5184(1997))。然而，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)說(shuō)明磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和癌細(xì)胞增殖之間的明確關(guān)系。
此外，也有提示磷脂酰肌醇蛋白聚糖可起到內(nèi)皮抑素(endostatin)受體的作用，所述內(nèi)皮抑素可用作血管形成抑制劑(Molecular Cell(2001)，7，811-822)。但是，這種功能與細(xì)胞增殖之間的關(guān)系仍然未加以闡述。
如上所述，已說(shuō)明了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3參與細(xì)胞增殖。然而，細(xì)胞增殖機(jī)制等是未知的，以及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)的應(yīng)用從未嘗試過(guò)。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。
深入研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體通過(guò)ADCC(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)活性和CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性)活性而施加細(xì)胞增殖抑制活性，由此完成了本發(fā)明。此外，還預(yù)測(cè)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體也通過(guò)抑制生長(zhǎng)因子的作用而施加細(xì)胞增殖抑制活性。而且，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體也通過(guò)與諸如放射性同位素、化療劑或細(xì)菌衍生的毒素等的細(xì)胞毒性物質(zhì)結(jié)合而施加細(xì)胞增殖抑制活性。
本發(fā)明的主題如下(1)一種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分；(2)(1)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體具有細(xì)胞毒性活性；(3)(2)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中細(xì)胞毒性活性為抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)活性；(4)(1)-(3)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中細(xì)胞為癌細(xì)胞；(5)(4)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中細(xì)胞選自肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞；(6)(5)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中細(xì)胞為肝癌細(xì)胞；(7)(1)-(6)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中抗體為單克隆抗體；(8)(1)-(6)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中抗體為人源化抗體或嵌合抗體；(9)一種抗體，其磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合；(10)(9)所述的抗體，其具有細(xì)胞毒性活性；(11)(10)所述的抗體，其具有針對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性；以及(12)(11)所述的抗體，其具有針對(duì)HuH-7肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性活性。
下文將詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明為一種含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體作為活性成分的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。此外，本發(fā)明為一種含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體作為活性成分的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其可用于針對(duì)基于異常細(xì)胞增殖的疾病的治療，特別是針對(duì)癌癥的治療。
本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的例子包括已知抗體，例如人源化抗體、人抗體(WO96/33735)、嵌合抗體(日本專利公布(Kokai)號(hào)4-228089A(1992))或小鼠抗體以及本發(fā)明中公開(kāi)的抗體。另外，抗體可以為多克隆抗體，并且優(yōu)選單克隆抗體。
本發(fā)明中所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可來(lái)自任何起源，可屬于任何類型(單克隆或多克隆抗體)以及可以是任何形式，只要其能夠抑制細(xì)胞增殖。
1.抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體本發(fā)明中所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可通過(guò)已知途徑以多克隆抗體或單克隆抗體的形式獲得。本發(fā)明中所用的特別優(yōu)選的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體為源自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。源自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體的例子包括由雜交瘤產(chǎn)生的抗體以及通過(guò)基因工程技術(shù)利用含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主所產(chǎn)生的抗體。該抗體結(jié)合到磷脂酰肌醇蛋白聚糖3上以便抑制細(xì)胞增殖。
這樣一種抗體的例子為由本發(fā)明的雜交瘤克隆所產(chǎn)生的單克隆抗體。
2.產(chǎn)抗體的雜交瘤產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤可基本上利用如下已知的技術(shù)進(jìn)行制備。即，雜交瘤的制備方法如下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫方法，利用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為免疫原進(jìn)行免疫接種，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞融合方法將上述獲得的免疫細(xì)胞與已知的親本細(xì)胞融合，然后采用標(biāo)準(zhǔn)篩選方法對(duì)產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞進(jìn)行篩選。
具體而言，單克隆抗體可如下制備。
如Lage，H.等所公開(kāi)(Gene 188(1997)，151-156)，通過(guò)表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(MXR7)基因(氨基酸序列)，首先獲得準(zhǔn)備用作免疫原誘導(dǎo)抗體的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3。具體而言，將編碼磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因序列插入在一已知的表達(dá)載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，然后通過(guò)已知方法從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物上清液中純化出靶人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白。
接著，該純化的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白用作免疫原?；蛘撸字＜〈嫉鞍拙厶?的部分肽可用作致敏抗原。這時(shí)，部分肽可以從人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸序列中通過(guò)化學(xué)合成獲得。
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體與ADCC作用、CDC作用和生長(zhǎng)因子的活性一起抑制細(xì)胞增殖活性。此外，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體還可通過(guò)與諸如放射性同位素、化療劑或源自細(xì)菌的毒素的細(xì)胞毒性物質(zhì)結(jié)合而抑制細(xì)胞增殖。因此，在本發(fā)明中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的表位被抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體所識(shí)別，其不限于特定的表位?？沽字＜〈嫉鞍拙厶?抗體可識(shí)別任何表位，只要所述表位存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上。因而，任何片段可用作抗原來(lái)制備本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，只要其在磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上含有所述表位。
用免疫原進(jìn)行免疫接種的哺乳動(dòng)物不是特別受限，考慮到與準(zhǔn)備用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性而優(yōu)選加以選擇。例如，通常使用諸如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠或兔子或猴子的嚙齒類動(dòng)物。
根據(jù)已知方法，用免疫原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種。例如，將免疫原腹膜內(nèi)或皮下注射哺乳動(dòng)物，采用這種常規(guī)方法進(jìn)行免疫接種。具體而言，將免疫原用適當(dāng)體積的PBS(磷酸鹽緩沖液)、生理鹽水等稀釋或懸浮于其中；如果需要，把適當(dāng)體積的諸如弗氏完全佐劑的標(biāo)準(zhǔn)佐劑與產(chǎn)物混合；乳化；然后每4-21天，將溶液施用給哺乳動(dòng)物若干次。此外，適當(dāng)?shù)妮d體也可在免疫接種時(shí)與免疫原一起使用。
如上所述對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，然后確認(rèn)血清中所需抗體的效價(jià)增加。隨后，從哺乳動(dòng)物中收集免疫細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞融合。優(yōu)選的免疫細(xì)胞尤其為脾細(xì)胞。
作為準(zhǔn)備與上述免疫細(xì)胞相融合的配偶體細(xì)胞，使用哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞。此處優(yōu)選使用的骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞系的例子包括各種已知的細(xì)胞系，例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immuol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S 194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)和R210(Galfre，G.等，Nature(1979)277，131-133)。
上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合可基本上按照已知方法，例如Kohler和Milstein等(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)的方法進(jìn)行。
更具體而言，上述細(xì)胞融合在含有例如細(xì)胞融合加速劑的標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中進(jìn)行。作為細(xì)胞融合加速劑，例如，可使用聚乙二醇(PEG)、日本血細(xì)胞凝集病毒(HVJ)等。如果需要，可加入佐劑，例如二甲亞砜，以進(jìn)一步增強(qiáng)融合效率。
對(duì)此處所用的免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的任何比例可加以設(shè)定。例如，免疫細(xì)胞數(shù)優(yōu)選高出骨髓瘤細(xì)胞數(shù)1-10倍。作為準(zhǔn)備用于上述細(xì)胞融合的培養(yǎng)液，例如，可使用對(duì)上述骨髓瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)合適的RPMI1640培養(yǎng)液或MEM培養(yǎng)液，或者使用用于這種細(xì)胞培養(yǎng)的其他標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液。此外，諸如胎牛血清(FCS)的血清流體可以組合形式使用。
細(xì)胞融合的方法如下在上述培養(yǎng)液中混合足夠數(shù)量的上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，加入在約37℃預(yù)先加熱的PEG(例如，平均分子量約為1000-6000)溶液(濃度一般為30-60％(w/v))，然后混合上述溶液，以便形成靶融合細(xì)胞(雜交瘤)。隨后，相繼加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，并且重復(fù)通過(guò)離心除去上清液的步驟，從而去除對(duì)雜交瘤生長(zhǎng)不利的細(xì)胞融合的試劑等。
通過(guò)在諸如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷的培養(yǎng)液)的標(biāo)準(zhǔn)選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)雜交瘤而對(duì)上述獲得的雜交瘤加以選擇。在上述HAT培養(yǎng)液中持續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，足夠讓細(xì)胞(未融合細(xì)胞)而非靶雜交瘤死亡(通常數(shù)天至數(shù)周)。隨后，采用標(biāo)準(zhǔn)限制稀釋方法，從而對(duì)產(chǎn)生靶抗體的雜交瘤進(jìn)行篩選和單克隆。
除了用抗原對(duì)非人動(dòng)物進(jìn)行接種免疫來(lái)獲得上述雜交瘤的方法以外，通過(guò)用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3體外致敏人淋巴細(xì)胞，并使致敏淋巴細(xì)胞與具有永久分裂潛力的人衍生的骨髓瘤細(xì)胞融合的方法也可獲得與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3具有結(jié)合活性的所需的人抗體(參見(jiàn)日本專利公布(Kokoku)號(hào)1-59878B(1989))。此外，將磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為抗原施用給具有全部人抗體基因庫(kù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以獲得產(chǎn)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的細(xì)胞，然后磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人抗體可從無(wú)限增殖化的產(chǎn)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的細(xì)胞中獲得(參見(jiàn)國(guó)際專利公布號(hào)WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918和WO94/02602)。
這樣制得的產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤可在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，或者可長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存在液氮中。
用于從雜交瘤中獲得單克隆抗體的方法的一個(gè)例子包括根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)雜交瘤以及在培養(yǎng)物上清液中獲得單克隆抗體。另一方法包括將雜交瘤施用給與雜交瘤相容的哺乳動(dòng)物以使它們?cè)鲋?，并在腹水中獲得單克隆抗體。前一方法適用于獲得高純度的抗體。而后一方法適用于大量生產(chǎn)抗體。
3.重組抗體可用于本發(fā)明的單克隆抗體為重組單克隆抗體，其制備方法如下采用基因工程技術(shù)從雜交瘤中克隆抗體基因，把基因整合到合適的載體中，將載體導(dǎo)入宿主，然后使宿主產(chǎn)生重組單克隆抗體(例如，參見(jiàn)Vandamme，A.M.等，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。具體而言，將編碼抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的可變(V)區(qū)的mRNA從產(chǎn)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的雜交瘤中分離出來(lái)。mRNA的分離方法是已知的，例如胍超速離心法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry(1979)18，5294-5299)或AGPC法(Chomczynski，P等，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)，由此制備總RNA。然后采用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等制備靶mRNA。除此之外，mRNA也可利用QuickPrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接制備。
利用反轉(zhuǎn)錄酶從上述制得的mRNA中合成抗體V區(qū)的cDNA。cDNA的合成采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶第一條鏈cDNA合成試劑盒(SEIKAGAKU CORPORATION)等。此外，為了合成和擴(kuò)增cDNA，例如，可采用5’-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech)和5’-RACE法(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)通過(guò)PCR進(jìn)行。
從這樣獲得的PCR產(chǎn)物中純化靶DNA片段，然后連接到一載體DNA上。而且，重組載體從產(chǎn)物中制備，并繼續(xù)將載體導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichia coli)等中，挑選克隆，由此制備所需的重組載體。靶DNA的核苷酸序列通過(guò)已知方法，例如雙脫氧核苷酸鏈終止法而確認(rèn)。
在編碼靶抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的V區(qū)的DNA獲得之后，將該DNA整合到一表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體含有編碼所需抗體的恒定區(qū)(C區(qū))的DNA。
為了產(chǎn)生本發(fā)明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，將抗體基因整合到表達(dá)載體中，以便基因在包括例如增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的基因表達(dá)控制區(qū)的調(diào)節(jié)下得以表達(dá)。下一步，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使宿主表達(dá)抗體。
抗體基因的表達(dá)可將編碼抗體重鏈(H鏈)的DNA或編碼抗體輕鏈(L鏈)的DNA分別整合到表達(dá)載體中，然后同時(shí)把這兩個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；或者將編碼H鏈和L鏈的DNA整合到單一表達(dá)載體中，然后把此載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參見(jiàn)WO 94/11523)。
除了上述宿主細(xì)胞以外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可用來(lái)產(chǎn)生重組抗體。例如，將抗體基因插入編碼奶中獨(dú)特產(chǎn)生的蛋白(例如，山羊β酪蛋白)的基因，從而制備融合基因。將其中已插入抗體基因的含有融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎中，然后將此胚胎導(dǎo)入雌性山羊。從由轉(zhuǎn)基因山羊或已接受了胚胎的山羊生出的后代所產(chǎn)生的奶中獲得期望的抗體。此外，為了增加含有由轉(zhuǎn)基因山羊所產(chǎn)生的期望抗體的奶量，可對(duì)轉(zhuǎn)基因山羊施用激素(Ebert，K.M.等，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
4.變?cè)炜贵w(altered antibody)在本發(fā)明中，除了上述抗體外，諸如嵌合抗體或人源化抗體的人工變?cè)斓幕蛑亟M抗體可用于例如降低針對(duì)人的異種抗原性。這些變?cè)炜贵w可采用已知的方法產(chǎn)生。
嵌合抗體的制備方法如下將編碼上述抗體V區(qū)的DNA連接到編碼人抗體C區(qū)的DNA上，把此產(chǎn)物整合到表達(dá)載體上，然后使載體導(dǎo)入宿主以使宿主產(chǎn)生抗體。利用這種已知方法，可獲得本發(fā)明中有用的嵌合抗體。
人源化抗體也稱重構(gòu)人抗體，其制備方法是將除人以外的哺乳動(dòng)物例如小鼠的抗體CDR(互補(bǔ)決定區(qū))嫁接到人抗體的CDR。其總的基因重組技術(shù)也是已知的(參見(jiàn)歐洲專利申請(qǐng)公布號(hào)EP 125023和WO96/02576)。
具體而言，DNA序列的合成是通過(guò)PCR方法利用若干寡核苷酸作為引物進(jìn)行的，所述寡核苷酸已事先制備，具有使小鼠抗體CDR的終止區(qū)和人抗體的框架區(qū)(FR)重疊的部分(參見(jiàn)WO 98/13388中所述的方法)。
對(duì)與具有良好抗原結(jié)合部位的CDR連接的框架區(qū)加以選擇。如果需要，可替換抗體可變區(qū)中的框架區(qū)的氨基酸，以便重構(gòu)人抗體的CDR形成合適的抗原結(jié)合部位(Sato，K.等，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
對(duì)于嵌合抗體和人源化抗體的C區(qū)使用人抗體區(qū)。例如，對(duì)于H鏈，可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4，而對(duì)于L鏈，可使用Cκ或Cλ。此外，為了提高抗體或其生產(chǎn)的穩(wěn)定性，人抗體C區(qū)可加以修飾。
嵌合抗體由源自除人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的可變區(qū)和衍生自人抗體的恒定區(qū)組成。同時(shí)，人源化抗體由源自除人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的CDR和衍生自人抗體的框架區(qū)和C區(qū)組成。由于人源化抗體的抗原性預(yù)定在人體中是低的，因此，其可用作本發(fā)明治療劑的活性成分。
5.修飾抗體用于本發(fā)明的抗體不限于整個(gè)分子，只要其能與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合以及抑制細(xì)胞增殖即可，并且可以是抗體片段或其修飾產(chǎn)物。二價(jià)抗體和單價(jià)抗體均包括在內(nèi)。抗體片段的例子包括Fab、F(ab’)2、Fv、含有一個(gè)Fab和完整Fc的Fab/c以及單鏈Fv(scFv)，其中H鏈或L鏈的Fv與適當(dāng)?shù)慕宇^相連接。具體而言，通過(guò)采用諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶處理抗體而合成抗體片段，或者構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將這些基因?qū)氡磉_(dá)載體，然后通過(guò)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá)基因(參見(jiàn)例如，Co.，M.S.等，J.Immunol.(1994)152，2968-2976，Better，M.& Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Plueckthun，A.& Skerra，A.Methodsin Enzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.等，Methodsin Enzymology(1989)121，663-669，以及Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
將抗體的H鏈V區(qū)與L鏈V區(qū)連接獲得scFv。在scFv中，H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)通過(guò)接頭或優(yōu)選通過(guò)肽接頭連接(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可源自如本說(shuō)明書(shū)中所述抗體的任一種。作為連接V區(qū)的肽接頭，例如，使用任一含有12-19個(gè)氨基酸殘基的單鏈肽。
編碼scFv的DNA可如下獲得。通過(guò)PCR方法利用編碼所需氨基酸序列的整個(gè)或部分DNA(編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的DNA以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA)作為模板以及規(guī)定兩端的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增。然后通過(guò)組合使用編碼肽接頭部分的DNA和規(guī)定使兩端各自與H鏈和L鏈連接的引物對(duì)，進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增。
此外，一旦制備了編碼scFv的DNA，含有DNA的表達(dá)載體以及轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體的宿主可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。另外，通過(guò)使用宿主，scFv可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。
利用宿主通過(guò)以與上述方法相似的方式獲得其基因并且使基因表達(dá)，可產(chǎn)生這些抗體片段。本發(fā)明中的“抗體”也包括這些抗體片段。
作為修飾抗體，可采用與聚乙二醇(PEG)或諸如細(xì)胞毒性物質(zhì)的各種各樣的分子之一結(jié)合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體。本發(fā)明中的“抗體”也包括這些修飾的抗體。這種修飾抗體可通過(guò)化學(xué)修飾得到的抗體而獲得。此外，抗體修飾方法在本技術(shù)領(lǐng)域中也已建立。
而且，用于本發(fā)明中的抗體可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體可具有識(shí)別磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上不同表位的抗原結(jié)合部位?；蛘?，一個(gè)抗原結(jié)合部位可識(shí)別磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，而另一抗原結(jié)合部位可識(shí)別諸如化療劑、源自細(xì)胞的毒素、放射性物質(zhì)等的細(xì)胞毒性物質(zhì)。在這種情況下，細(xì)胞毒性物質(zhì)允許直接作用于表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的細(xì)胞上以特異性破壞腫瘤細(xì)胞，從而腫瘤細(xì)胞的增殖可以得到抑制。雙特異性抗體可通過(guò)結(jié)合兩種抗體的H-L對(duì)而制備，它也可通過(guò)融合產(chǎn)不同單克隆抗體的雜交瘤以制備產(chǎn)雙特異性抗體的融合細(xì)胞來(lái)獲得。此外，雙特異性抗體也可通過(guò)基因工程技術(shù)制備。
6.重組抗體或修飾抗體的表達(dá)和生產(chǎn)如上所述構(gòu)建的抗體基因可通過(guò)已知方法表達(dá)和獲得。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的情況下，基因可通過(guò)可操作連接常用的有用啟動(dòng)子和待表達(dá)的抗體基因以及通過(guò)連接位于其3’端下游的polyA信號(hào)而得以表達(dá)。例如，啟動(dòng)子/增強(qiáng)子是人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
此外，另一可在本發(fā)明中用于抗體表達(dá)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的例子包括病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，如反轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒或猿猴病毒40(SV40)，或者源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，如人延伸因子1a(HEF1a)。
當(dāng)采用SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，通過(guò)Mulligan等(Nature(1979)277，108)的方法可容易地進(jìn)行基因表達(dá)，而當(dāng)采用HEF1a啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，通過(guò)Mizushima等(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)的方法可容易地進(jìn)行基因表達(dá)。
在大腸桿菌的情形下，將常用的有用啟動(dòng)子、用于抗體分泌的信號(hào)序列以及待表達(dá)的抗體基因可操作連接，以便基因可得以表達(dá)。啟動(dòng)子的例子包括lacz啟動(dòng)子和araB啟動(dòng)子。當(dāng)采用lacz啟動(dòng)子時(shí)，通過(guò)Ward等(Nature(1098)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)的方法可表達(dá)抗體基因，而當(dāng)采用araB啟動(dòng)子時(shí)，通過(guò)Better等(Science(1988)240，1041-1043)的方法可表達(dá)抗體基因。
作為抗體分泌的信號(hào)序列，當(dāng)抗體在大腸桿菌的周質(zhì)中產(chǎn)生時(shí)，可采用pelB信號(hào)序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。在周質(zhì)中產(chǎn)生的抗體被分離后，將抗體的結(jié)構(gòu)適當(dāng)?shù)丶右哉郫B和使用。
可用的復(fù)制起點(diǎn)源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等。此外，為了在宿主細(xì)胞系統(tǒng)中擴(kuò)增基因拷貝數(shù)，表達(dá)載體可含有氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標(biāo)記。
為了生產(chǎn)用于本發(fā)明的抗體，可采用任何表達(dá)系統(tǒng)，例如真核細(xì)胞系統(tǒng)或原核細(xì)胞系統(tǒng)。真核細(xì)胞的例子包括動(dòng)物細(xì)胞，如建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)或昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，以及絲狀真菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞。原核細(xì)胞的例子包括諸如大腸桿菌細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明中的抗體在諸如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero或Hela細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
接著，將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞體外或體內(nèi)培養(yǎng)，以便使宿主細(xì)胞產(chǎn)生靶抗體。根據(jù)已知方法，培養(yǎng)宿主細(xì)胞。例如，作為培養(yǎng)液，可采用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等。諸如胎牛血清(FCS)的血清流體可以組合形式使用。
7.抗體的分離和純化如上所述表達(dá)和生產(chǎn)的抗體可從細(xì)胞或宿主動(dòng)物中分離，并純化成一致的水平。準(zhǔn)備用于本發(fā)明中的抗體的分離和純化可利用親和柱進(jìn)行。利用蛋白A柱的例子為Hyper D、POROS、SepharoseF.F.(Pharmacia)。其他用于蛋白的標(biāo)準(zhǔn)分離和純化方法也可使用，對(duì)其應(yīng)用沒(méi)有限制。例如，除了上述親和柱以外的層析柱、滲濾、超濾、鹽析方法、透析等可適當(dāng)加以選擇并組合使用，以便分離和純化抗體(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)。
8.抗體活性的確認(rèn)已知方法可用來(lái)分析本發(fā)明中所用的抗體的抗原結(jié)合活性(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)以及抑制配體受體結(jié)合的活性(Harada，A.等，International Immunology(1993)5，681-690)。
作為測(cè)定本發(fā)明中所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原結(jié)合活性的方法，可采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、EIA(酶免疫測(cè)定)、RIA(放射免疫測(cè)定)或熒光抗體技術(shù)。例如，當(dāng)采用酶免疫測(cè)定時(shí)，將含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的樣品，如產(chǎn)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液，或者純化的抗體加入到涂覆有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的平板上。加入標(biāo)記有諸如堿性磷酸酶的酶的第二抗體。然后將平板溫育，洗滌，加入酶底物，如對(duì)硝基苯基磷酸，接著測(cè)定吸光度，以便對(duì)抗原結(jié)合活性加以評(píng)價(jià)。
為了證實(shí)用于本發(fā)明的抗體的活性，對(duì)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的中和活性進(jìn)行測(cè)定。
9.細(xì)胞毒性活性用于本發(fā)明中的抗體具有ADCC活性或CDC活性作為細(xì)胞毒性活性。
通過(guò)混合效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，然后檢測(cè)ADCC的水平，可對(duì)ADCC活性進(jìn)行測(cè)定。作為效應(yīng)細(xì)胞，例如，可采用小鼠脾細(xì)胞、人外周血或分離白骨髓的單細(xì)胞。作為靶細(xì)胞，例如，可采用人建立的細(xì)胞系，如HuH-7人肝癌細(xì)胞系。靶細(xì)胞事先用51Cr標(biāo)記，將抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體加入到細(xì)胞中，然后進(jìn)行溫育。接著，以效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞適當(dāng)?shù)谋壤尤胄?yīng)細(xì)胞，然后進(jìn)行溫育。溫育后，收集上清液，對(duì)上清液中的放射性進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而可測(cè)定ADCC活性。
CDC活性的測(cè)定方法如下混合上述標(biāo)記的靶細(xì)胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，加入補(bǔ)體，溫育，培養(yǎng)，然后對(duì)上清液中的放射性進(jìn)行計(jì)數(shù)。
抗體需要Fc部分施加細(xì)胞毒性活性。當(dāng)本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑利用抗體的細(xì)胞毒性活性時(shí)，用于本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體需要含有Fc部分。
10.抑制血管形成本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可用于抑制血管形成。
11.給藥方法以及藥物制劑本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑用于治療或改善由基于異常細(xì)胞增殖的疾病，特別是癌癥引起的狀況。
本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的靶癌細(xì)胞的優(yōu)選例子包括，但不特異性限于，肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞。肝癌細(xì)胞是特別優(yōu)選的。
有效劑量選自每次給藥每kg體重為0.001mg至1000mg的范圍內(nèi)?；蛘撸蛇x擇的劑量范圍為每個(gè)患者0.01-100000mg。然而，含有本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的治療劑不限于這些劑量。
另外，作為本發(fā)明的治療劑的服藥時(shí)間，藥劑可在疾病臨床癥狀發(fā)作之前或之后施用。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Remington’s Pharmaceutical Science，最新版，MarkPublishing Company，Easton，U.S.A.)，含有本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的治療劑可加以配制，并且可一起含有可藥用的載體和添加劑。
這種載體和藥物添加劑的例子包括水、可藥用有機(jī)溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖以及可接受的表面活性劑作為藥物添加劑。
上述添加劑的一種或適當(dāng)組合在實(shí)踐中根據(jù)本發(fā)明治療劑的劑型加以選擇，但不限于此。例如，可用作注射用藥物制劑的藥劑的制備方法是將純化的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體溶解在諸如生理鹽水、緩沖液或葡萄糖溶液的溶劑中，然后向溶液中加入諸如Tween80、Tween20、明膠或人血清白蛋白的吸附抑制劑?；蛘?，凍干劑可用來(lái)制備劑型，其在用前復(fù)溶而溶解。作為凍干的賦形劑，例如，可采用諸如甘露醇或葡萄糖的糖醇或糖類。
附圖簡(jiǎn)述

圖1示出抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)對(duì)HuH-7細(xì)胞的ADCC活性。
圖2示出抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6511)對(duì)HuH-7細(xì)胞的CDC活性。
圖3示出磷脂酰肌醇蛋白聚糖在HuH-7細(xì)胞上的表達(dá)。
圖4A示出FACS分析由人肺癌細(xì)胞系表達(dá)GPC3的結(jié)果。它們是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結(jié)果。
圖4B示出FACS分析由人白血病細(xì)胞系表達(dá)GPC3的結(jié)果。它們是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結(jié)果。
圖4C示出FACS分析由人淋巴瘤細(xì)胞系表達(dá)GPC3的結(jié)果。它們是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結(jié)果。
圖4D示出FACS分析由人結(jié)腸癌細(xì)胞系表達(dá)GPC3的結(jié)果。它們是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結(jié)果。
圖4E示出FACS分析由人乳腺癌細(xì)胞系表達(dá)GPC3的結(jié)果。它們是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結(jié)果。
圖4F示出FACS分析由人前列腺癌細(xì)胞系表達(dá)GPC3的結(jié)果。它們是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結(jié)果。
圖4G示出FACS分析由人胰腺癌細(xì)胞系和人肝癌細(xì)胞系表達(dá)GPC3的結(jié)果。它們是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)分析的結(jié)果。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將參考下列實(shí)施例進(jìn)一步描述。然而，本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例等的限制。
實(shí)施例1針對(duì)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3合成肽的單克隆抗體的制備合成具有人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白的氨基酸序列(第355位到第371位的氨基酸)(RQYRSAYYPEDLFIDKK)的肽。利用馬來(lái)酰亞胺苯甲酰氧基琥珀酰亞胺(MBS)型交聯(lián)劑將合成肽結(jié)合到匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)上，由此制備免疫原。將小鼠(BALB/c，雌性，6周齡)用免疫原以每只小鼠100μg的劑量免疫接種3次。分析血清中的抗體效價(jià)?？贵w效價(jià)測(cè)定方法包括使稀釋血清與固定在平板上的肽(0.5μg)反應(yīng)，與HRP標(biāo)記的抗小鼠抗體進(jìn)行反應(yīng)，加入底物，然后在顯色的450nm處測(cè)定吸光度(肽固相ELISA方法)。在確認(rèn)抗體效價(jià)后，收集脾細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞(P3/X63-Ag8)融合(Khler，G，Milstein，CNature，256495(1975))，由此制備雜交瘤。接著對(duì)5種雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體進(jìn)行純化。利用肽固相ELISA方法，測(cè)定對(duì)肽的結(jié)合活性，然后選擇具有高結(jié)合活性的IgG1抗體(下文稱K6534)和IgG3抗體(下文稱K6511)。
實(shí)施例2利用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體抑制細(xì)胞增殖根據(jù)Current Protocols in Immunology，第7章，Immunologic studiesin humans，John E，Cologan等編，John Wiley & Sons，Inc.，1993中所述的方法，對(duì)ADCC(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)活性和CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性)活性進(jìn)行測(cè)定。
1.制備效應(yīng)細(xì)胞從CBA/N小鼠(8周齡，雄性)摘出脾臟，然后將脾細(xì)胞分離在RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)中。把細(xì)胞洗滌在含有10％肽牛血清(FBS，HyClone)的同樣培養(yǎng)基中，使制得的細(xì)胞濃度為5×106/mL，由此制備效應(yīng)細(xì)胞。
2.制備補(bǔ)體溶液將幼兔補(bǔ)體(CEDARLANE)在10％含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)中稀釋10倍，由此制備補(bǔ)體溶液。
3.制備靶細(xì)胞將HuH-7人肝癌細(xì)胞系(Japanese Collection of ResearchBioresources(JCRB)No.JCRB0403，Human Science Research SupportBank(Human Science Kenkyu Shien Bank))用0.2mCi的51Cr-鉻酸鈉(Amersham Pharmacia Biotech)在10％含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)1小時(shí)，由此進(jìn)行放射性標(biāo)記。在放射性標(biāo)記后，將細(xì)胞在10％含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基中洗滌3次，制得的細(xì)胞濃度為2×105/mL，由此制備靶細(xì)胞。
4.測(cè)定ADCC活性各50μl的靶細(xì)胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534)加入到96孔的U型底平板(Beckton Dickinson)中，在冰上反應(yīng)15分鐘。然后加入100μl的效應(yīng)細(xì)胞，并在二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。抗體的終濃度制成0或10μg/mL。培養(yǎng)后，收集100μL的上清液，并利用γ計(jì)數(shù)器(COBRA II AUTO-GAMMA，MODEL D5005，PackardInstrument Company)測(cè)定放射性。細(xì)胞毒性活性(％)利用公式(A-C)/(B-C)×100求出。其中，“A”代表各樣品中的放射性(cpm)，“B”代表補(bǔ)充有1％NP-40(nacalai tesque)的樣品中的放射性(cpm)，以及“C”代表僅含有靶細(xì)胞的樣品中的放射性(cpm)。試驗(yàn)重復(fù)兩次，并計(jì)算出平均值。
5.測(cè)定CDC活性各50μl的靶細(xì)胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6511)加入到96孔的平底平板(Beckton Dickinson)中，在冰上反應(yīng)15分鐘。然后加入100μl的補(bǔ)體溶液，接著在二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)?？贵w的終濃度為0或3μg/mL。培養(yǎng)后，收集100μL的上清液，并利用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性。以在“4.測(cè)定ADCC活性”中所用的同樣方式求出細(xì)胞毒性活性(％)。試驗(yàn)重復(fù)兩次，并計(jì)算出平均值。
圖1示出ADCC活性，而圖2示出CDC活性。這些結(jié)果揭示出抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體對(duì)HuH-7人肝癌細(xì)胞系施加了ADCC活性和CDC活性，從而抑制了細(xì)胞增殖。
實(shí)施例3測(cè)定磷脂酰肌醇蛋白聚糖在HuH-7細(xì)胞上的表達(dá)水平將大約5×105個(gè)HuH-7細(xì)胞懸浮在100μl的FACS/PBS(通過(guò)將1g牛血清白蛋白(SIGMA)溶解在1L的CellWASH(Beckton Dickinson)中來(lái)制備)。然后，把抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6511)或小鼠IgG2a(Biogenesis)作為對(duì)照抗體以25μg/mL的濃度加入，并讓溶液在冰上放置30分鐘。在用FACS/PBS洗滌后，產(chǎn)物懸浮在100μl的FACS/PBS中。加入4μl的山羊抗小鼠Ig FITC(Becton Dickinson)，并讓溶液在冰上放置30分鐘。
在用FACS/PBS洗滌兩次之后，將產(chǎn)物懸浮于1ml的FACS/PBS中。利用流式細(xì)胞儀(EPICS XL，BECKMAN COULTER)測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
圖3示出流式細(xì)胞儀測(cè)定的結(jié)果。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在HuH-7細(xì)胞上表達(dá)，這提示抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體結(jié)合于在細(xì)胞上表達(dá)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，從而抑制細(xì)胞增殖(圖3)。
實(shí)施例4利用FCM分析GPC3在癌細(xì)胞組上的表達(dá)利用FCM對(duì)人癌癥細(xì)胞系(肺、結(jié)腸、直腸、乳腺、前列腺、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、胰腺和肝臟)表達(dá)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)進(jìn)行分析。
將細(xì)胞培養(yǎng)2天，然后進(jìn)行分析。利用已經(jīng)細(xì)胞解離緩沖液(目錄號(hào)13150-016，批號(hào)1098554，GIBCO)稀釋10倍的胰蛋白酶-EDTA(目錄號(hào)25300-054，批號(hào)14210，GIBCO)收集附著的細(xì)胞。讓收集的細(xì)胞在冰上與抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體(K6534，600μg/ml)或mIgG2a抗體作為陰性對(duì)照(Biogenesis，M-IgG2a-i，批號(hào)EA990719A，1mg/ml)(抗體終濃度為10μg/ml)反應(yīng)。洗滌后，讓細(xì)胞與FITC標(biāo)記的抗小鼠Ig抗體(目錄號(hào)349031，BD PharMingen)在冰上反應(yīng)(2μl/測(cè)試)。細(xì)胞洗滌后，利用流式細(xì)胞儀(EPICS XL，BECKMAN COULTER)測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果，GPC3的表達(dá)在下列細(xì)胞系中得到證實(shí)肺癌細(xì)胞系(A549，NCI-H460，NCI-H23，NCI-H226，DMS114，EKVX，HOP-62和NCI-H322M；白血病細(xì)胞系P30/OHK，BALL-1，THP-1和P39/TSU)、淋巴瘤細(xì)胞系(MLMA，Ramos和U937)-，、結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480，COLO205，Lo Vo和SW837)、乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231，SK-BR-3和MDA-MB-468)、前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP和22Rv1)、胰腺癌細(xì)胞系(MIAPaCa-2)和肝癌細(xì)胞系(HepG2)。根據(jù)這些結(jié)果，可得出結(jié)論本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑在治療肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌等中是有用的。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，提供了含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。而且，根據(jù)本發(fā)明，提供了含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑?？沽字＜〈嫉鞍拙厶?抗體與在人肝癌細(xì)胞系的HuH-7細(xì)胞上表達(dá)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合，從而抑制細(xì)胞增殖。由此，含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的藥劑作為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑是有用的，特別是作為癌細(xì)胞抑制劑。
所有在此引用的出版物、專利和專利申請(qǐng)以其全文在此引作參考。所以，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員容易理解，在不背離如所附權(quán)利要求中所述的本發(fā)明的技術(shù)概念和范圍的情況下，有可能對(duì)本發(fā)明作出眾多修改和變化。本發(fā)明旨在包括這樣的修改和變化。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分。
2.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體具有細(xì)胞毒性活性。
3.權(quán)利要求2所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中細(xì)胞毒性活性為抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)活性。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中細(xì)胞為癌細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中細(xì)胞選自肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中抗體為單克隆抗體。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其中抗體為人源化抗體或嵌合抗體。
9.一種抗體，其與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合。
10.權(quán)利要求9所述的抗體，其具有細(xì)胞毒性活性。
11.權(quán)利要求10所述的抗體，其具有針對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
12.權(quán)利要求11所述的抗體，其具有針對(duì)HuH-7肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性活性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其可用于治療基于異常細(xì)胞增殖的疾病，尤其是癌癥。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分。
文檔編號(hào)C07K16/30GK1688692SQ02812570
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2002年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者中村徹雄, 土屋政幸, 油谷浩幸 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社, 油谷浩幸