專利名稱：一種磷脂酰肌醇的化學制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種磷脂酰肌醇的化學溶液分離制備方法。
背景技術：
單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)為革蘭氏陽性無芽孢桿菌李斯特屬，是一種重要的人畜共患食源性病原菌，可以引起人和多種動物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，病死率高達30% 70%。由于其具有耐熱(60°C)、耐低溫(4°C)、耐鹽、耐干燥等特性，因此潛在危害很大，是食品安全風險評估所關注的重要食源性致病菌之一。1986年，WHO和FDA將其列為20世紀90年代食品四大致病菌之一 ；2000年，LM被WHO列為重點檢測的食源性致病菌之一；國際食品法典委員于2009年開始使用食品中LM的限量標準。第51屆世界衛(wèi)生大會之后，我國開始逐步研究通過實施微生物學危險性評價(MRA) 和危害性分析關鍵控制點(HACCP)等原理來加強對微生物性有害因素的有效管理。2009年JEMRA及美國FDA/FSIS分別對即食食品中LM進行定量評估并發(fā)布了評估報告。近年來LM作為食品衛(wèi)生及流行病學的研究熱點，其分離和鑒定方法取得了很大的進步。LM的檢測時間、特異性、靈敏度以及準確性等各方面都得到很大的改進。目前主要應用的方法有如下三類傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法、免疫學方法以及分子生物學檢測方法。針對LM的快速檢測的需要，許多國家致力于LM顯色培養(yǎng)基的研究，針對LM特有的肌醇磷酸磷脂酶(PI-PLC)和P-D-葡萄糖苷酶(卩-D-glueosidase)設計顯色底物對LM進行快速檢測。商品化的顯色培養(yǎng)基主要有以下幾種以七葉靈為底物的PALCAM、0XF0RD、LPM、MOX培養(yǎng)基；以5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃糖苷和肌醇磷酸X-IP為底物的BCMI11listeria顯色培養(yǎng)基；以X-IP為底物的Rapid’LMONO agar培養(yǎng)基；以5_溴_4_氯_3_吲哚吡喃糖苷和磷脂?；紴榈孜锏腃HROMagar Listeria顯色培養(yǎng)基、ALOA培養(yǎng)基以及OCLA培養(yǎng)基。其中部分顯色培養(yǎng)基已經(jīng)得到大規(guī)模的商品化。而國內(nèi)關于LM顯色培養(yǎng)基的研究一直處于滯后狀態(tài)，主要是由于底物價格昂貴，難以大規(guī)模開發(fā)應用。因此LM顯色底物的制備研究成為制約LM顯色培養(yǎng)基應用的關鍵技術，是目前研究的難點。國內(nèi)外相關研究表明磷脂酰肌醇(I-a-phosphatidylinositol)能夠作用于LM中的特異性磷脂酶PI-PLC，可以作為特異性檢測底物應用于LM顯色培養(yǎng)基。磷脂酰肌醇的主要分離制備方法有溶劑法、柱層析法、薄層色譜法、酶法和化學反應法等。其中溶劑法操作簡便，便于工業(yè)化，但是具有消耗溶劑量大，生產(chǎn)成本高的缺點；柱層析法分離效率高，但負載量小，可重復性差；薄層色譜制備量小，分離能力有限，主要用于檢測；化學反應方法合成容易使得肌醇磷脂中不飽和鍵著色且副產(chǎn)物難以有效分離；另外還有利用高效液相色譜制備少量磷脂酰肌醇純品，但是由于成本高操作復雜且產(chǎn)量很少，只停留在實驗室少量分析研究的階段。目前國內(nèi)的磷脂酰肌醇制備產(chǎn)率提高困難，難以商品化應用；國外引進又價格昂貴，從而限制了磷脂酰肌醇在微生物檢測等方面的應用，亟需尋找一種高產(chǎn)率且商品化可行的制備工藝。在國內(nèi)大豆磷脂酰肌醇的研究比較少，迄今為止主要有齊齊哈爾大學以及武漢工程學院做過相關方面的研究。齊齊哈爾大學在2003年到2006年做了用溶劑法分離制備大豆肌醇磷脂相關方面的研究，其中2005年陳志強等報道了可以采用乙醇-正己烷體系分離了肌醇磷脂，2006年吳平等進一步考察了溶劑法分離磷脂酰肌醇的優(yōu)化條件，并稱可以將產(chǎn)率提高到73. 89% ；2008年后武漢工業(yè)學院做了采用柱層析法分離制備大豆磷脂的研究，2008年以及2009年姜波等報道了用柱色譜法分離制備大豆磷脂，實驗表明硅膠為吸附介質(zhì)分離大豆磷脂是可行的，但是由于柱層析法負載量較小，且分離周期長，所得產(chǎn)量較低而一直沒有得到實際應用。目前亟待開發(fā)一種簡便有效的分離方法，得到便于工業(yè)化的優(yōu)化工藝條件，使磷脂酰肌醇的制備工業(yè)化，為其在顯色培養(yǎng)基中的應用創(chuàng)造條件。而國外相關研究集中在上世紀九十年代，目前已經(jīng)發(fā)展到工業(yè)化應用領域。目前國外采用的獲得大豆肌醇磷脂的方法主要為酶法及分子改性等化學手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種磷脂酰肌醇的化學制備方法，該方法簡單易行，大大降·低了生產(chǎn)成本，便于工業(yè)化生產(chǎn)。利用該方法制備得到的磷脂酰肌醇產(chǎn)品的純度高，經(jīng)實驗證實可以作為進口原料的替代品作為底物應用到LM顯色培養(yǎng)基中，效果很好。本發(fā)明的磷脂酰肌醇的化學制備方法，其特征在于，包括以下步驟將粗品用硅膠柱層析，以體積比為2. 5 : I的氯仿/甲醇作為洗脫劑進行洗脫，收集組份，再經(jīng)真空干燥，得到磷脂酰肌醇；所述的粗品通過以下方法制備(I):取大豆磷脂，按質(zhì)量體積比I : 3 10g/ml加入堿性乙醇中浸提若干次，固液分離得到粗分離混合物，將粗分離混合物溶于正己烷中，然后再加入含有硝酸鉀的體積分數(shù)為55%的乙醇水溶液進行液-液萃取，分離出乙醇水相，再按0. 03 0. 05g/100ml加入鈣鹽，充分溶解，靜置待沉淀析出后分離沉淀，真空干燥得到粗品；或者(2)a)取大豆磷脂，將其溶于冷氯仿中，攪拌并加入冷甲醇，至大豆磷脂充分溶解后再繼續(xù)攪拌2 4h，靜置并在低溫、5000 8000r/min下離心10 20min，棄去上層液體，b)取沉淀用冷氯仿溶解，攪拌并加入冷甲醇，溶解后再攪拌2 4小時，靜置并在低溫、5000 8000r/min下離心10 20min,棄去上層液體,取沉淀,重復b)步驟若干次,最后將沉淀濃縮干燥得粗品。含有硝酸鉀的體積分數(shù)為55%的乙醇水溶液其硝酸鉀含量優(yōu)選為0.388g/100ml。所述的堿性乙醇的pH優(yōu)選為8 11，在乙醇中添加的調(diào)節(jié)pH值的堿性物質(zhì)為強堿或氨水。優(yōu)選，所述的a)取大豆磷脂，將其溶于冷氯仿中，攪拌并加入等體積的冷甲醇；所述的b)取沉淀用冷氯仿溶解，攪拌并加入冷氯仿I 3倍體積的冷甲醇。所述的冷氯仿、冷甲醇和在低溫下離心，其中的冷和低溫，本領域技術人員均知，其指的是在4°C以下。利用本發(fā)明的磷脂酰肌醇的化學制備方法制備得到的磷脂酰肌醇產(chǎn)品，其純度較高，以此產(chǎn)品作為LM顯色培養(yǎng)基的底物，顯色效果很好，因此可以作為進口原料的替代品應用到LM顯色培養(yǎng)基，降低LM顯色培養(yǎng)基中底物的價格。并且本發(fā)明的方法簡便易行，大大降低了生產(chǎn)成本，有利于磷脂酰肌醇的應用。


圖I是磷脂酰肌醇產(chǎn)品的紅外光譜(IR)譜圖；圖2是磷脂酰肌醇產(chǎn)品與標準品的紅外光譜(IR)對照圖； 圖3是磷脂酰肌醇產(chǎn)品的NMR-P31譜圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。一、磷脂酰肌醇的制備
實施例I :稱取粉末大豆磷脂50g，加入300ml的堿性乙醇(pH值為10，加入的調(diào)節(jié)pH的是NaOH)，攪拌浸提3小時，離心分離固體，重復上述過程3次。經(jīng)固液分離，收集固體得到粗分離混合物，經(jīng)過高效液相色譜分析，其中含磷脂酰肌醇28. 5% ;粗分離產(chǎn)物用200ml正己烷溶解，在IOOml體積分數(shù)為55%的乙醇水溶液中加入0. 388g的硝酸鉀，將此乙醇溶液加入正己烷中，室溫下充分攪拌，在4°C冰柜中靜置過夜，進行液-液萃取。分離乙醇水相，加入50mg的無水CaCl2固體，室溫下攪拌1_2小時至充分溶解，靜置24-48小時，離心分離沉淀，真空干燥得到粗品。粗品用高效液相色譜HPLC分析，其中含磷脂酰肌醇為76.7%。用硅膠100-200目，在120°C下活化40min，用流動相浸泡過夜后填濕法裝柱。膠柱IOOcmX26mm，采用氯仿甲醇=2.5 1(體積比)為洗脫劑，負載量為0.25g/150g硅膠，稱取粗品用洗脫劑溶解后上樣，用洗脫劑洗脫，采用自動采樣器收集產(chǎn)品組分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空條件下除去溶劑并干燥得到磷脂酰肌醇產(chǎn)品，經(jīng)紅外光譜(IR)分析以及與標準譜圖的對比，可以證明所制備的化合物磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu)正確，經(jīng)HPLC分析，產(chǎn)物純度為94. 7%。實施例2 本實施例與實施例I基本相同，只是有兩個地方與實施例I不同(I):取50g大豆磷脂，加入150ml的堿性乙醇(pH值為8，加入的是氨水調(diào)pH值)；(2)分離出乙醇水相后，加入30mg的無水CaCl2固體，其它步驟與實施例I相同，得到磷脂酰肌醇產(chǎn)品，經(jīng)紅外光譜(IR)分析以及與標準譜圖的對比，可以證明所制備的化合物磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu)正確，經(jīng)HPLC分析，產(chǎn)物純度為90.3%。實施例3 本實施例與實施例I基本相同，只是取50g大豆磷脂，加入500ml的堿性乙醇(pH值為11，加入的是NaOH調(diào)pH值)，其它與實施例I相同，得到磷脂酰肌醇產(chǎn)品，經(jīng)紅外光譜(IR)分析以及與標準譜圖的對比，可以證明所制備的化合物磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu)正確，經(jīng)HPLC分析，產(chǎn)物純度為95. I %。實施例4稱取5g粉末大豆磷脂，用60ml冷三氯甲烷(4°C )溶解，攪拌并加入60ml冷甲醇(40C )，至大豆磷脂充分溶解后再繼續(xù)攪拌2h，靜置并在2°C、5000r/min下離心lOmin。棄去上層液體，沉淀用30ml冷氯仿(4 °C)溶解，并在攪拌下加入60ml冷甲醇(4°C)，攪拌2h后，靜置并在2°C、5000r/min下離心lOmin。重復上述過程二次，取沉淀減壓蒸餾并干燥得到粗品。所得粗品按照實施例I的硅膠柱層析的方法進行層析分離，收集產(chǎn)品，經(jīng)紅外光譜(IR)分析以及與標準譜圖的對比，可以證明所制備的化合物磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu)正確。所得產(chǎn)品經(jīng)HPLC分析，產(chǎn)物純度為97. 5%。實施例5 稱取5g粉末大豆磷脂，用60ml冷三氯甲烷(3°C )溶解，攪拌并加入60ml冷甲醇(3°C )，至大豆磷脂充分溶解后再繼續(xù)攪拌4h，靜置并在2°C、8000r/min下離心20min。棄去上層液體，沉淀用30ml冷氯仿(4 °C)溶解，并在攪拌下加入30ml冷甲醇(4°C)，攪拌4h后，靜置并在2°C、8000r/min下離心20min。重復上述過程二次，取沉淀減壓蒸餾并干燥得到粗品。所得粗品按照實施例I的硅膠柱層析的方法進行層析分離，收集產(chǎn)品，經(jīng)紅外光譜(IR)分析以及與標準譜圖的對比，可以證明所制備的化合物磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu)正確。所得產(chǎn)品經(jīng)HPLC分析，產(chǎn)物純度為92. I %。實施例6 稱取5g粉末大豆磷脂，用60ml冷三氯甲烷(3°C )溶解，攪拌并加入60ml冷甲醇·(3°C ),至大豆磷脂充分溶解后再繼續(xù)攪拌3h,靜置并在4°C、6000r/min下離心15min。棄去上層液體，沉淀用30ml冷氯仿(4 °C)溶解，并在攪拌下加入90ml冷甲醇(4°C)，攪拌3h后，靜置并在4°C、6000r/min下離心15min。重復上述過程二次，取沉淀減壓蒸餾并干燥得到粗品。所得粗品按照實施例I的硅膠柱層析的方法進行層析分離，收集產(chǎn)品。該產(chǎn)品，經(jīng)正己烷-異丙醇-I %乙酸(8 8 I)溶解后，上高效液相色譜HPLC分析，收集特征峰處產(chǎn)物，真空干燥。再經(jīng)高效液相色譜分析，并與標準品對照(標準品采購自美國SIGMA公司)，純度可以達到99. 81%。產(chǎn)物經(jīng)NMR-P31以及紅外光譜分析，NMR-P31的圖譜見圖3，由圖3可以看出，NMR-P31只檢測出單一磷脂峰，表明所得產(chǎn)物純度較高，紅外光譜解析如圖I所示3400為醇羥基O-H的伸縮振動峰；2924，2853為甲基亞甲基的C-H伸縮振動峰；1741是-C0-0-中C = 0的伸縮振動峰;1235和1040分別為P = 0和P-O-C的伸縮振動峰；1066為酯基-C-O-C-的伸縮振動峰；1466和721分別為CH2的剪式變角振動峰和面內(nèi)搖擺振動峰。經(jīng)過譜圖解析以及與標準譜圖的對比(圖2)，可以證明所制備的化合物磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu)正確。二、磷脂酰肌醇作為LM顯色培養(yǎng)基的底物顯色效果測試稱取實施例I中的磷脂酰肌醇產(chǎn)品2g，蛋白胨23g、酵母浸出物23g、NaCl 5g，e-D-gluO. 05g，瓊脂15g，將這些物質(zhì)加入水中溶解，調(diào)節(jié)pH值為7. 0±0. 2，再定容至1L，制成LM顯色培養(yǎng)基?；蛘叻Q取幼牛腦200g、牛心250g、葡萄糖2g、氯化鈉5g、碳酸氫二鈉2. 5g、瓊脂15g、月示胨10g、實施例I中的磷脂酰肌醇產(chǎn)品2g、5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷(^ -D-glu) 0. 05g,將這些物質(zhì)加入水中溶解，調(diào)節(jié)pH值為7. 0±0. 2，再定容至1L，制成LM
顯色培養(yǎng)基。將LM顯色培養(yǎng)基在0，IMpa下高溫滅菌，再將滅菌好的培養(yǎng)基倒平板，放入烘箱中干燥，待平板充分凝固且無水蒸氣液滴殘留時取出，劃線接種LM標準菌株CMCC 54002，于38°C培養(yǎng)48h，觀察菌落特征。以ALOA和CHRO Magar Listeria培養(yǎng)基作為對照，劃線接種LM標準菌株CMCC 54002,于38°C培養(yǎng)48h，觀察菌落特征。在三種顯色培養(yǎng)基平板上，LM皆呈現(xiàn)藍綠色菌落，周圍環(huán)繞不透明暈環(huán)現(xiàn)象，其中ALOA培養(yǎng)基上菌落顏色較鮮艷，三種培養(yǎng)基均出現(xiàn)明顯的白色暈環(huán)現(xiàn)象。
由此可見，按照本發(fā)明的方法制備得到的磷脂酰肌醇其純度高，可以作為LM顯色 培養(yǎng)基的底物使用。
權(quán)利要求
1.一種磷脂酰肌醇的化學制備方法，其特征在于，包括以下步驟 將粗品用硅膠柱層析，以體積比為2. 5 : I的氯仿/甲醇作為洗脫劑進行洗脫，收集組份，再經(jīng)真空干燥，得到磷脂酰肌醇； 所述的粗品通過以下方法制備 (I):取大豆磷脂，按質(zhì)量體積比I : 3 10g/ml加入堿性乙醇中浸提若干次，固液分離得到粗分離混合物，將粗分離混合物溶于正己烷中，然后再加入含有硝酸鉀的體積分數(shù)為55%的乙醇水溶液進行液-液萃取，分離出乙醇水相，再按0. 03 0. 05g/100ml加入鈣鹽，充分溶解，靜置待沉淀析出后分離沉淀，真空干燥得到粗品； 或者(2)a)取大豆磷脂，將其溶于冷氯仿中，攪拌并加入冷甲醇，至大豆磷脂充分溶解后再繼續(xù)攪拌2 4h，靜置并在低溫、5000 8000r/min下離心10 20min，棄去上層液體，b)取沉淀用冷氯仿溶解，攪拌并加入冷甲醇，溶解后再攪拌2 4小時，靜置并在低溫、5000 8000r/min下離心10 20min,棄去上層液體,取沉淀,重復b)步驟若干次,最后將沉淀濃縮干燥得粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的磷脂酰肌醇的化學制備方法，其特征在于，所述的含有硝酸鉀的體積分數(shù)為55%的乙醇水溶液其硝酸鉀含量為0. 388g/100ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的磷脂酰肌醇的化學制備方法，其特征在于，所述的堿性乙醇的pH為8 11，在乙醇中添加的調(diào)節(jié)pH值的堿性物質(zhì)為強堿或氨水。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的磷脂酰肌醇的化學制備方法，其特征在于，所述的a)取大豆磷脂，將其溶于冷氯仿中，攪拌并加入等體積的冷甲醇；所述的b)取沉淀用冷氯仿溶解，攪拌并加入冷氯仿I 3倍體積的冷甲醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磷脂酰肌醇的化學制備方法。本發(fā)明以大豆磷脂作為原料，利用溶劑萃取和硅膠柱層析分離的方法，得到磷脂酰肌醇產(chǎn)品。利用本發(fā)明的磷脂酰肌醇的化學制備方法制備得到的磷脂酰肌醇產(chǎn)品，其純度高達90％以上，以此產(chǎn)品作為單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)顯色培養(yǎng)基的底物，顯色效果很好，與同類顯色培養(yǎng)基相比無明顯差異。因此可以作為進口原料的替代品應用到LM顯色培養(yǎng)基，降低LM顯色培養(yǎng)基中底物的價格。并且本發(fā)明的方法簡便易行，大大降低了生產(chǎn)成本，有利于磷脂酰肌醇的應用。
文檔編號C07F9/117GK102964380SQ20121000674
公開日2013年3月13日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者吳清平, 李琳, 張菊梅, 蔡芷荷, 郭偉鵬 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司