專利名稱：一種利用水稻bt－雄性不育細胞質(zhì)的育性恢復(fù)基因來賦予或控制育性的方法及鑒定育性 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用水稻BT型細胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)基因來獲得或抑制水稻育性及其鑒定水稻恢復(fù)基因的方法。
本申請要求以2001年9月19日提交的日本專利申請No.2001-285247，2001年10月4日提出的日本專利申請No.2001-309135以及2002年6月26日提出的日本專利申請No.2002-185709的優(yōu)先權(quán)。這三個專利申請的完全公開內(nèi)容在此并入本文背景技術(shù)水稻是自花授粉植物，在水稻品種之間進行雜交時，首先必須在水稻開花前將穎花內(nèi)的全部雄蕊去除以避免自花受粉，然后用來自親本品種的花粉使欲進行雜交的品種獲得育性。然而，這種人工雜交的方法完全不適合商業(yè)目的來生產(chǎn)大量的雜交種子。
因此，通常利用細胞質(zhì)雄性不育的三系法來生產(chǎn)雜交水稻。所述三系法利用了三個品系即細胞質(zhì)雄性不育的不育系、具有Rf-1基因的恢復(fù)系以及與不育系具同樣核基因而不具有細胞質(zhì)雄性不育的保持系。利用這三個品系，(i)用恢復(fù)系的花粉對不育系進行授粉而獲得雜交種子；而(ii)用保持系的花粉對不育系進行授粉而使不育系得以保存下去。
利用BT型細胞質(zhì)雄性不育的三系法中，繁殖恢復(fù)系水稻是非常重要的，為此，必需在育種的各個階段中確保水稻中保持有Rf-1基因，并且確保在最后培育階段中Rf-1基因是純合的。在三系法中需要核實以確保用于恢復(fù)系的品種具有Rf-1基因，或者核實Rf-1基因的存在以確保所得到的雜交種子已恢復(fù)了育性。
為了確定植物體中的Rf-1基因基因座的基因型，首先需要將要確定其基因型的植物與標準系雜交產(chǎn)生雜交種子，以獲得F1代植株，然后進行自花授粉，繼而調(diào)查能超過一定水平(如70-80％或更高)的頻率產(chǎn)生種子的植株個體的出現(xiàn)機率。所述標準系是指保持系、不育系或這兩個品系形成的一套品系，并且應(yīng)根據(jù)待測個體的細胞質(zhì)是否屬于BT型、正常型還是未知的來作出合適的選擇。如果標準系為不育系，則雜交時以待測個體作為母本，如果標準系是保持系，則作為父本與待測個體雜交。
但是，實施這些技術(shù)需要花費大量的勞動力和時間。進一步的問題是，為生產(chǎn)種子而進行的授粉易受環(huán)境因素的影響，當在惡劣的環(huán)境下，如低溫或日照不足，造成的不育可能與基因型構(gòu)成無關(guān)，導(dǎo)致不能準確地確定Rf-1基因基因座的基因型。
為了解決這些問題，最近有人提出用分子生物學(xué)的方法來判斷Rf-1基因是否存在。該方法基于檢測與Rf-1基因連鎖的堿基序列(這些序列以下稱作DNA標記)來確定Rf-1基因存在或缺失。值得指出的是目前還沒弄清Rf-1基因的DNA序列，所以不可能直接檢測Rf-1基因。
例如，已有報道，水稻Rf-1基因位點位于第10號染色體上，并且存在于限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的DNA標記(RFLP標記)G291位點和G127位點之間(Fukuta et al.1992，Jpn.Breed.42(supl.1)164-165)。通過研究與Rf-1基因連鎖的DNA標記G291位點和G127位點的基因型可推知Rf-1基因位點的基因型，這是一種已知的方法。
但是，以往的常規(guī)分子生物學(xué)方法存在著以下若干問題。首先，利用RFLP標記需要通過Southern印跡分析來進行檢測。為了進行Southern雜交，還必需從待測個體中制備純化微克級重量的DNA，而且還要進行限制性內(nèi)切酶處理、電泳、印跡、與探針之間進行雜交以及信號的檢測等一系列操作過程；除了需要相當量的勞動外，還需花費約1周的時間才能獲得檢測結(jié)果。
第二個問題是，由于RFLP標記G291位點和G127位點之間的基因圖距長約30cM(在水稻DNA中相當于約9000kbp)，考慮在該區(qū)域中出現(xiàn)雙重重組的機率達到百分之幾，因而不能完全保證通過這些標記來正確的確定Rf-1基因位點的基因型。
第三個問題是，如果通過檢測RFLP標記G291位點和G127位點來推測Rf-1基因是否存在，則不僅Rf-1基因而且還有這些基因座之間的基因區(qū)域被引入到篩選出的育性恢復(fù)系中。結(jié)果是從RF-1基因供體親本中引入的DNA序列將含有至少30cM或更長的染色體區(qū)，即存在著引入了在該區(qū)域的潛在有害基因的風險。
為了解決上述問題，現(xiàn)已研究出與Rf-1基因位點連鎖的顯性DNA標記(日本專利公開No.222588/1995)和共顯性DNA標記(日本專利公開No.313187/1997)。這些標記與Rf-1基因位點連鎖，遺傳距離分別為1.6±0.7cM(相當于水稻DNA約480kbp)以及3.7±1.1cM(相當于水稻DNA約1110kbp)，這些基因位點存在于Rf-1基因位點兩側(cè)。因此，通過檢測顯性PCR標記位點和共顯性PCR標記位點的存在來估計Rf-1基因的存在。通過檢測共顯性PCR標記也可以估計出Rf-1基因位點是純合還是雜合的。
但是，即使使用這些PCR標記，仍然存在著幾個問題。所述共顯性標記與Rf-1基因位點具有3.7±1.1cM的遺傳距離，所以還沒有真正解決與Rf-1基因位點之間重組頻率很高的問題。其結(jié)果是，就共顯性標記本身來說，雖能夠準確地檢測出是純合型還是雜合型。但如果共顯性標記位點和Rf-1基因位點之間發(fā)生了重組，則不能準確地確定Rf-1基因位點的基因型，尤其不能確定其是純合型還是雜合型。另一方面，當用顯性標記確定Rf-1基因位點的基因型時，則不管個體是Rf-1基因純合體(Rf-1/Rf-1)還是雜合體(Rf-1/rf-1)都能檢測到顯性標記。因此，即使利用共顯性標記和顯性標記的結(jié)合來確定Rf-1基因位點的基因型，也不能正確地鑒別植株個體是Rf-1基因純合型還是雜合型。還有，用顯性標記進行PCR反應(yīng)而沒有得到PCR產(chǎn)物，也不能排除可能是由于實驗程序問題導(dǎo)致的。進一步的，由于這些共顯性標記和顯性標記之間的遺傳距離長達約5.3cM(約1590kbp)，由Rf-1基因供體親本引入的染色體區(qū)域的長度不能限定在足夠小的數(shù)值，還不能排除該區(qū)域中可能含有的有害基因被引入。
另外，在日本專利公開No.139465/2000描述了一種共顯性標記，其根據(jù)位于水稻第10號染色體上Rf-1基因附近的RFLP標記的堿基序列而建立的。然而，這些PCR標記大多數(shù)與Rf-1基因之間的遺傳距離都大于約1cM。
發(fā)明概述本發(fā)明目的之一是提供一種恢復(fù)水稻育性的方法。本發(fā)明的方法包括將核酸導(dǎo)入到水稻中，所述核酸具有恢復(fù)育性的功能，并具有SEQ ID NO.27的堿基序列或與SEQ ID NO.27的堿基序列有至少70％同一性。本發(fā)明的另一方法包括將核酸導(dǎo)入到水稻中，所述核酸具有恢復(fù)育性的功能，并具有SEQ ID NO.27的第38538至54123位的堿基序列或與SEQ ID NO.27的第38538至54123位的堿基序列有至少70％同一性。本發(fā)明的再一方法包括將核酸導(dǎo)入到水稻中，所述核酸具有恢復(fù)育性的功能，并具有SEQ ID NO.27的第42357-53743位的堿基序列，更優(yōu)選的具有第42132-48883位堿基序列，或與SEQ ID NO.27的第42357-53743位的堿基序列，優(yōu)選的第42132-48883位堿基序列有至少70％的同一性。本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方式是，具有與SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.27的第38538至54123位堿基序列有至少70％同一性的堿基序列至少滿足下面兩個要求1)與SEQ ID NO.27的第45461位堿基相應(yīng)的堿基是A；和2)與SEQ ID NO.27的第49609位堿基相應(yīng)的堿基是A。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定被測個體或其種子是否具有Rf-1基因的方法。本發(fā)明的鑒定方法利用了可以確定水稻恢復(fù)基因(Rf-1基因)功能存在的序列，其位于在水稻第10號染色體上的多態(tài)性檢測標記P4497MboI和B56691 XabI之間。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，檢測水稻個體或其種子是否具有Rf-1基因所用堿基序列具有與SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.27的第38538至54123位堿基序列有至少70％同一性，并且至少滿足下面兩個要求1)與SEQ ID NO.27的第45461位堿基相應(yīng)的堿基是A；和2)與SEQ ID NO.27的第49609位堿基相應(yīng)的堿基是A。
本發(fā)明另一個目的是提供一種抑制Rf-1基因的功能以恢復(fù)育性的方法。本發(fā)明抑制方法的一個實施方式包括導(dǎo)入如下的反義序列，即其具有序列互補于有恢復(fù)育性功能的SEQ ID NO.27或互補于與SEQ ID NO.27的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列，其長度至少為100個連續(xù)堿基。另一個實施方式，本發(fā)明的抑制方法包括導(dǎo)入的反義序列具有互補于有恢復(fù)育性功能的SEQ ID NO.27第38538-54123位或互補于與SEQ ID NO.27第38538-54123位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列，其長度至少100個連續(xù)堿基。
本發(fā)明另一目的是提供具有恢復(fù)育性功能的具有SEQ ID NO.27或與SEQ ID NO.27的堿基序列有至少70％同一性的核酸。本發(fā)明也提供一種核酸，其具有恢復(fù)育性功能并具有SEQ ID NO.27的第38538-54123位或與SEQID NO.27的第38538-54123位堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。本發(fā)明也提供一種核酸，具有恢復(fù)育性功能并具有SEQ ID NO.27第42357-53743位，更優(yōu)選SEQ ID NO.27第42132-48883位的堿基序列或者具有與SEQ IDNO.27第42357-53743位，更優(yōu)選SEQ ID NO.27第42132-48883位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。


圖1表示從RFLP標記位點S12564開始的染色體步行實驗結(jié)果。
圖2表示與BAC克隆AC068923相關(guān)的lambda克隆重疊區(qū)的排列。
圖3表示重組體花粉(全部有育性)的Rf-1位點附近的染色體組織結(jié)構(gòu)，是基于在由該在粉產(chǎn)生的10個體(RS1，RS2，RC1-8)標記位點的基因型之最靠近Rf-1位點進行作圖的結(jié)果?？瞻讞l代表粳稻(japonica)區(qū)，黑條代表秈稻(indica)區(qū)。
圖4是基因圖譜，用相關(guān)的各種標記對水稻第10號染色體上的Rf-1基因位點進行定位；圖距值是以1042個F1代個體的分離數(shù)據(jù)計算出來的。
圖5顯示用于互補分析檢測Rf-1區(qū)域的10個基因組克隆的片段。通過染色體步行(細線)獲得的Lambda克隆被用于對以粗線表示的染色體區(qū)域進行互補分析。XSF18被發(fā)現(xiàn)存在缺失，其缺失區(qū)用點線表示。
圖6表示用XSG16的15.7kb片段(例10)和XSF18的16.2kb片段(例8)進行互補分析的結(jié)果。抽穗(ear bowing)結(jié)果表明用XSG16的15.7kb片段轉(zhuǎn)化的植株恢復(fù)了育性。
本發(fā)明的最佳實施方式我們首先將Rf-1基因位點定位在水稻第10號染色體上極小的區(qū)域內(nèi)。以此為基礎(chǔ)，我們建立了位于Rf-1基因位點附近的PCR標記，并找到一種利用與Rf-1基因位點連鎖的PCR標記來檢測Rf-1基因的方法。具體地說，通過確定與Rf-1位點接近的新PCR標記位點的基因型來檢測Rf-1基因的存在和選擇Rf-1基因純合的個體，其中新標記是基于Rf-1位點被定位于水稻第10號染色體上的PCR標記位點S12564 Tsp509I和C1361 MwoI之間而建立的。我們先前于2000年8月17日提出的日本專利申請No.2000-247204描述了一種檢測Rf-1基因的方法。該專利申請的全部公開內(nèi)容在此引入本申請作為參考。
I.日本專利申請No.2000-247204描述的鑒定Rf-1位點的基因型的方法日本專利申請No.2000-247204描述的方法是基于Rf-1位點被定位于水稻第10號染色體上的PCR標記位點S12564 Tsp509I和C1361 MwoI之間，進而確定待測水稻個體或其種子是否具有Rf-1基因。
標記針對Rf-1基因位點附近的特定區(qū)域設(shè)計用于PCR反應(yīng)的引物對，其擴增產(chǎn)物用特定的限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng)電泳，在有些秈稻(indica)系中，呈現(xiàn)可觀察條帶的大小與粳稻系的不同。在秈稻系中呈現(xiàn)的特有條帶在此稱為Rf-1連鎖帶。目前本發(fā)明的發(fā)明人已證實了Rf-1基因位點位于水稻第10號染色體上的PCR標記位點S12564 Tsp509I和C1361 MwoI之間，因此本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以建立和利用Rf-1基因位點附近的PCR標記。
例如，根據(jù)本發(fā)明，測定待測水稻個體基因組中是否含有下述PCR標記中的至少一個，進而確定被測個體是否具有與這些PCR標記連鎖的Rf-1基因(1)標記1即PCR標記R1877 EcoRI用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示序列的DNA作為引物進行水稻基因組PCR反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在限制酶EcoRI識別位點，來檢測粳稻品系和秈稻品系個體之間的多態(tài)性；(2)標記2即PCR標記G4003 HindIII(SEQ ID NO19)用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示序列的DNA作為引物對進行水稻基因組PCR反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在限制酶HindIII識別位點，來檢測粳稻品系和秈稻品系個體之間的多態(tài)性；(3)標記3即PCR標記C1361 MwoI(SEQ ID NO20)用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示序列的DNA作為引物對進行水稻基因組PCR反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在限制酶MwoI識別位點，來檢測粳稻品系和秈稻品系個體之間的多態(tài)性；(4)標記4即PCR標記G2155 MwoI(SEQ ID NO21)用SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示序列的DNA作為引物對進行水稻基因組PCR反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在限制酶MwoI識別位點，來檢測粳稻品系和秈稻品系個體之間的多態(tài)性；(5)標記5即PCR標記G291 MspI(SEQ ID NO22)用SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示序列的DNA作為引物對進行水稻基因組PCR反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在限制酶MspI識別位點，來檢測粳稻和秈稻品系個體之間的多態(tài)性；(6)標記6即PCR標記R2303 BslI(SEQ ID NO23)用SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示序列的DNA作為引物對進行水稻基因組PCR反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在限制酶BslI識別位點，來檢測粳稻品系和秈稻品系個體之間的多態(tài)性；(7)標記7即PCR標記S10019 BstUI(SEQ ID NO24)用SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示序列的DNA作為引物對進行水稻基因組PCR反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在限制酶BstUI識別位點，來檢測粳稻品系和秈稻品系個體之間的多態(tài)性；(8)標記8即PCR標記S10602 KpnI(SEQ ID NO25)用SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示序列的DNA作為引物對進行水稻基因組PCR反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在限制酶KpnI識別位點，來檢測粳稻品系和秈稻品系個體之間的多態(tài)性；和(9)標記9即PCR標記S12564 Tsp509I(SEQ ID NO26)用SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示序列的DNA作為引物對進行水稻基因組PCR反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在限制酶Tsp509I識別位點，來檢測粳稻品系和秈稻品系個體之間的多態(tài)性。
Rf-1基因位點最大可能位于水稻第10號染色體上的RFLP標記區(qū)R1877、G291、R2303、S12564、C1361、S10019、G4003、S10602以及G2155的附近(請參照Fukuta et al.1992，Jpn.Breed.42(supl.1)164-165的RFLP連鎖分析結(jié)果以及Harushima et al.1998，Genetics 148 479-494的水稻RFLP連鎖圖)，如下文描述的參考實施例1，本發(fā)明人將這些RFLP標記轉(zhuǎn)變?yōu)楣诧@性PCR標記如CAPS標記或dCAPS標記(Michaels and Amasino 1998，The PlantJournal 14(3)381-385；Neff et al.1998，The Plant Journal 14(3)387-392)。通過這種轉(zhuǎn)變得到了上述PCR標記。
在這些PCR標記中，由PCR標記R1877 EcoRI、G291 MspI(SEQ IDNO22)、R2303 BslI(SEQ ID NO23)以及S12564 Tsp509I(SEQ ID NO26)形成一組，由C1361 MwoI(SEQ ID NO20)、S10019 BstUI(SEQ ID NO24)、G4003 HindIII(SEQ ID NO19)、S10602 KpnI(SEQ ID NO25)以及G2155MwoI(SEQ ID NO21)形成另一組，這兩組分別位于第10號染色體上Rf-1基因位點的兩側(cè)位置。
因此，作為本發(fā)明最佳的實施方式之一，(a)在PCR標記R1877 EcoRI、G291 MspI、R2303 BslI以及S12564 Tsp509I中至少選出一個PCR標記，和(b)在C1361 MwoI、S10019 BstUI、G4003 HindIII、S10602 KpnI以及G2155MwoI中至少選出一個PCR標記以檢測出Rf-1連鎖帶，進而確定Rf-1基因是否存在。在該種情況下，在(a)組中至少優(yōu)選使用PCR標記S12564 Tsp509I，以及在(b)組中至少優(yōu)選使用C1361 MwoI作為最接近Rf-1基因的標記。在被測水稻的基因組中，如果用(a)和(b)中的PCR標記檢測出Rf-1連鎖帶，則可以認為該水稻很可能具有Rf-1基因。
在另一個實施方式中，可以通過(a)組中至少2個PCR標記和(b)組中至少2個PCR標記而檢測Rf-1連鎖帶。例如，在(a)和(b)兩組標記中，如圖1所示的基因圖譜，用距離Rf-1基因很近的標記可檢測到Rf-1連鎖帶，而用距離Rf-1基因遠一些的標記則不能檢測到Rf-1連鎖帶，通過篩選這樣的水稻個體可以選出含有不需要基因區(qū)最小的具有Rf-1基因的水稻個體。同樣，優(yōu)選的，(a)組中的至少一個PCR標記是S12564 Tsp509I和(b)組中的至少一個PCR標記是C1361 MwoI。因而，S12564 Tsp509I和C1361 MwoI兩個PCR標記位點之間的遺傳距離為0.3cM。利用這種特性，可以從Rf-1基因供體親本引入的染色體區(qū)限定至1cM左右區(qū)域。這有助于將供體親本Rf-1基因附近可能存在的有害基因被引入至恢復(fù)系中的可能性降至最小。
Rf-1基因的檢測為了檢測水稻基因組中的Rf-1基因，利用上述SEQ ID NO1-18作為引物進行PCR反應(yīng)可以自水稻基因組擴增出上述任何一個PCR標記，然后用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)方法(PCR-RFLP)進行檢測。PCR-RFLP是一種適用于下述情形，即PCR擴增DNA片段中的限制性酶的識別位點在不同品種之間存在多態(tài)性，并且能從那些限制性的切割模式而方便的鑒定出特異的多態(tài)性(D.E.Harry et al.，Theor.Appl.Genet.(1998)，97327-336)。
根據(jù)所用引物而在凝膠上觀察到的條帶所反映出的限制性內(nèi)切酶切割模式，列于下述表1中。
表1檢測條帶的大致大小(bp)由引物對1檢測標記1(R1877 EcoRI)當待測水稻基因組中純合的含有Rf-1基因時 1500及1700當待測水稻基因組中雜合的含有Rf-1基因時 1500、1700及3200當待測水稻基因組不含有Rf-1基因的情況下 3200由引物對2檢測標記2(G4003 HindIII)當待測水稻基因組中純合的含有Rf-1基因時 362當待測水稻基因組中雜合的含有Rf-1基因時 95、267及362當待測水稻基因組不含有Rf-1基因的情況下 95及267由引物對3測標記3(C1361 MwoI)當待測水稻基因組中純合的含有Rf-1基因時 50及107當待測水稻基因組中雜合的含有Rf-1基因時 25、50、79及107當待測水稻基因組不含有Rf-1基因的情況下 25、50及79由引物對4檢測標記4(G2155 MwoI)當待測水稻基因組中純合的含有Rf-1基因時 25、27及78當待測水稻基因組中雜合的含有Rf-1基因時 25、27、78及105當待測水稻基因組不含有Rf-1基因的情況下 25及105由引物對5檢測標記5(G291 MspI)當待測水稻基因組中純合的含有Rf-1基因時 25、49及55當待測水稻基因組中雜合的含有Rf-1基因時 25、49、55及104當待測水稻基因組不含有Rf-1基因的情況下 25和104由引物對6檢測標記6(R2303 BslI)當待測水稻基因組中純合的含有Rf-1基因時 238、655及679當待測水稻基因組中雜合的含有Rf-1基因時 238、655、679及1334當待測水稻基因組不含有Rf-1基因的情況下 238及1334
由引物對檢測標記7(S10019 BstUI)當待測水稻基因組中純合的含有Rf-1基因時 130、218及244當待測水稻基因組中雜合的含有Rf-1基因時 130、218、244及462當待測水稻基因組不含有Rf-1基因的情況下 130及462由引物對8檢測標記8(S10602 KpnI)當待測水稻基因組中純合的含有Rf-1基因時 724當待測水稻基因組中雜合的含有Rf-1基因時 117、607及724當待測水稻基因組不含有Rf-1基因的情況下 117及607由引物對9檢測標記9(S12564 Tsp509I)當待測水稻基因組中純合的含有Rf-1基因時 41及117當待測水稻基因組中雜合的含有Rf-1基因時 26、41、91及117當待測水稻基因組不含有Rf-1基因的情況下 26、41及91II.Rf-1位點的鑒定如上所述，日本專利申請No.2000-247204所公開RFLP-PCR標記，是基于我們發(fā)現(xiàn)Rf-1位點定位于DNA標記位點S12564 Tsp509I和C1361 MwoI之間。通過回交將Rf-1基因引入不含有Rf-1基因的粳稻品系中建立育性恢復(fù)品系。如果在這個過程中使用日本專利申請No.2000-247204描述的鑒定Rf-1位點的方法，不僅可以有效的建立恢復(fù)系(2-3年內(nèi))，而且插入的片段長度也能得到控制。
然而，通過雜交不可避免的將Rf-1附近的區(qū)域也同時引入受體親本中。日本專利申請No.2000-247204表明Rf-1位點定位于DNA標記位點S12564Tsp509I和C1361 MwoI之間，但這兩個位點的圖距約為0.3cM，即約90kbp。如果在Rf-1附近存在有害基因，將不可否認該有害基因也可能與Rf-1基因一起被插入。
因此，基于Rf-1位點和DNA標記位點S12564 Tsp509I有密切的連鎖，我們通過染色體步行和遺傳分析尋找在DNA標記位點S12564 Tsp509I和C1361 MwoI之間的與Rf-1基因連鎖的區(qū)域。結(jié)果，我們成功的鑒定出了包含Rf-1基因的約76kb的區(qū)域，并測定了所述區(qū)域的全部堿基序列。根據(jù)本發(fā)明，通過遺傳工程的方法而有可能將育性恢復(fù)基因的功能導(dǎo)入到BT型雄性不育細胞質(zhì)。
具體地說，在日本專利申請No.2000-247204中，用FR Koshihikari(在Rf-1位點是雜合的)對MS Koshihikari進行授粉而獲得1042個個體群，進行連鎖分析發(fā)現(xiàn)1個在Rf-1和S12564 Tsp509I位點之間發(fā)生重組的重組體和2個在Rf-1和C1361 MwoI位點之間發(fā)生重組的重組體(本申請中為參考實施例1-2)。在本發(fā)明中，增加了4103個個體而使群體中分析共有5145個個體。結(jié)果，新發(fā)現(xiàn)1個在Rf-1和S12564 Tsp509I位點之間發(fā)生重組的重組體和6個在Rf-1和C1361 MwoI位點之間發(fā)生重組的重組體，總數(shù)分別為2和8個重組體。通過本發(fā)明的高精度分離分析對這10個個體進行檢測以獲得在Rf-1位點最近處發(fā)生重組的重組體(實施例1)。
在Rf-1和C1361 MwoI位點之間的8個重組體和在Rf-1和S12564Tsp509I位點之間的2個重組體，從其頻率比較上看可知S12564 Tsp509I位點比C1361 MwoI位點與Rf-1位點的遺傳距離要近。遺傳距離(用重組頻率表示cM)和物理距離(用堿基對數(shù)量來表示bp)并不總是成比例的，但通?？烧J為遺傳距離的減少，其物理距離也隨著減少。
因此，我們試圖從S12564 Tsp509I位點開始進行染色體步行來分離Rf-1位點(實施例2)。利用秈稻品種IR24和粳稻品種Asominori的基因組DNA以λDASH II為載體制備基因組文庫以用于染色體步行。IR24是攜帶Rf-1的品種，而Asominori未攜帶Rf-1。染色體步行結(jié)果，從IR24基因克隆中獲得覆蓋了約76kp染色體區(qū)域的重疊區(qū)(在染色體上的重疊克隆按序設(shè)定(ordered sets))，進而測定了整個序列(76363bp)。
然后，基于獲得的堿基序列信息等而新發(fā)現(xiàn)了12個標記，并對上述提到的與Rf-1位點最接近的10個重組體進行高精度分離分析(實施例3)。結(jié)果，包含于上述約76kb中的65kb序列被發(fā)現(xiàn)包含了可以用于確定Rf-1基因功能存在的序列。這個區(qū)域由8個基因組克隆組成的重疊區(qū)所覆蓋。每一個克隆長約12-22kb并且至少有4.7kb的重疊區(qū)域。水稻中不同基因的長度差別跨越非常大(從短到長)，但大部分基因的長度為數(shù)kb或更短。因此，在這8個基因組克隆中至少有一個被預(yù)期包含了全長Rf-1基因。
我們進一步在上述約76kb的染色體區(qū)域中的Rf-1基因區(qū)域進行定位，以用于進行互補分析以直接闡明是否存在育性恢復(fù)能力。
具體而言，通過遺傳工程技術(shù)將上述76kb區(qū)域中的10個部分片段(每一個長10-21kb)分別導(dǎo)入雄性不育系MS Koshihikari的未成熟種子中(圖5)。在所利用的10個部分片段中，有8個片段來自于先前通過染色體步行而得到的(圖1中的XSE1、XSE7、XSF4、XSF20、XSG22、XSG16、XSG8和XSH18，并描述在實施例3中)。此外，從XSF18和XSX1兩個克隆中獲得片段也進行了互補分析。XSF18在5′和3′端分別與XSF20的相同(分別是SEQID NO27中的第20328位和41921位堿基)，但缺乏中間的第33947至38591位堿基。這是因為在克隆XSF18最初被分離時就發(fā)現(xiàn)在克隆分離后的擴增中包含上述缺失，因此重新進行擴增步驟而得到了完整克隆，稱為XSF20(實施例8)。XSX1是從克隆XSG8和XSH18通過限制性內(nèi)切酶處理并連接以包含足夠的重疊區(qū)而重新獲得的克隆，因為兩克隆的重疊區(qū)相對比較小(約7kb)(實施例13)。
由于Rf-1是顯性基因，如果插入片段完全包含Rf-1基因，則轉(zhuǎn)化個體在當代即顯示出恢復(fù)育性。在互補分析中，評價了用每一個片段轉(zhuǎn)化的植株種子育性以找到那些用15.6kb片段轉(zhuǎn)化的其種子育性已恢復(fù)的植株，其中15.6kb片段包括SEQ ID NO27的第38538-54123位堿基，它來源于λ噬菌體克隆XSG16(實施例10)。用其它片段轉(zhuǎn)化的植株全都是不育的。這些結(jié)果表明上述15.6kb片段完全包含了Rf-1基因。況且，本發(fā)明提供了通過遺傳工程技術(shù)導(dǎo)入Rf-1基因的方法，且證明是有效的。
為了進一步弄清λ噬菌體克隆XSG16中的確含有Rf-1基因的區(qū)域，我們通過互補分析，評價了比15.6kb片段(包含SEQ ID NO27的第38538-54123位堿基)更短片段的種子育性。結(jié)果表明，來自XSG16的11.4kb片段(包含SEQ ID NO27的第42357-53743位堿基)具有恢復(fù)種子育性的功能(實施例10(2))。用進一步短的6.8kb片段(包含SEQ ID NO27的第42132-48883位堿基)進行轉(zhuǎn)化得到的植株也具有恢復(fù)的種子育性(實施例10(3))。這些結(jié)果表明上述6.8kb片段包含Rf-1基因。
III.包含Rf-1位點的核酸本發(fā)明提供包含育性恢復(fù)基因位點(Rf-1)的核酸。本發(fā)明所述包含育性恢復(fù)基因位點(Rf-1)的核酸包括有恢復(fù)育性功能的具有SEQ ID NO.27或與SEQ ID NO.27的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。
如實施例10中所描述的，證實了Rf-1基因尤其完全包含于SEQ IDNO.27的第38538至54123位的堿基序列中。相應(yīng)的，本發(fā)明尤其提供有恢復(fù)育性的功能并具有SEQ ID NO.27的第38538至54123位或與SEQ IDNO.27的第38538至54123位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。在這里，術(shù)語“SEQ ID NO.27的堿基序列”是指SEQ ID NO.27的全部堿基序列或其對育性恢復(fù)功能起作用的部分序列，特別是第38538至54123位堿基。更優(yōu)選的，它指第42357至53743位堿基，還優(yōu)選第42132至48883位堿基。
在下面的實施例中，從攜帶Rf-1基因的秈稻水稻IR24基因組文庫中分離了包含育性恢復(fù)基因(Rf-1)的核酸，并且被確定具有SEQ ID NO27的堿基序列。然而，本發(fā)明的包含育性恢復(fù)基因(Rf-1)的核酸可以從任何攜帶RF-1基因的秈稻品種中衍生而來。攜帶Rf-1基因的秈稻品種包括，但不局限于，例如IR24、IR8、IR36、IR64、Chinsurah和BoroII。已知的不攜帶Rf-1基因的粳稻品種包括，但不局限于，例如Asominori、Koshihikari、Kirara 397、Akihikari、Akitakomachi、Sasanishiki、Kinuhikari、Nipponbare、Hatsuboshi、Koganebare、Hinohikari、Mineasahi、Aichinokaori、Hatsushimo、Akebono、Fujihikari、Minenoyukimochi、Kokonoemochi、Fukuhibiki、Dontokoi、Gohyakumangoku、Hanaechizen、Todorokiwase、Haenuki、Domannaka、Yamakikari等等?！岸i稻”和“粳稻”品種對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言非常熟知的，并且本發(fā)明所包括的水稻品種對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是容易確定的。
本發(fā)明的核酸可以是單鏈和雙鏈形式的DNA，及其相應(yīng)的互補RNA。DNA包括舉例來說如基因組DNA(包括相應(yīng)的cDNA)、化學(xué)合成的DNA、PCR擴增得到的DNA和它們的組合。
本發(fā)明的包含Rf-1基因的核酸優(yōu)選具有SEQ ID NO27的堿基序列。同一個氨基酸可由不只一個密碼子編碼，這稱為遺傳密碼的簡并性。因此，與SEQ ID NO27的堿基序列不完全相同的DNA序列可能與SEQ ID NO27所示堿基序列編碼了完全相同的氨基酸序列的蛋白。這種變體DNA序列可能由于沉默突變導(dǎo)致的(例如在PCR擴增過程中產(chǎn)生)，或也可能由于天然序列的變異(deliberate mutagenesis)所導(dǎo)致。
本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟知，甚至來自不同品種的具有不同氨基酸序列的蛋白質(zhì)，仍然具有同樣的功能。本發(fā)明的Rf-1基因包括SEQ ID NO27所示堿基序列的同系物和變體，只要它們具有恢復(fù)育性功能。術(shù)語“具有恢復(fù)育性功能”意指當這樣的DNA片段導(dǎo)入后可使水稻植株個體或其種子獲得育性。育性恢復(fù)可能由于通過Rf-1基因的蛋白表達或可賦予育性的Rf-1基因核酸(DNA或RNA)本身的功能所導(dǎo)致。
Rf-1基因同系物或變體是否具有育性恢復(fù)功能可通過下面列舉的方法來檢測，但并不局限于這些方法。待測核酸片段根據(jù)Hiei等(PlantJournal(1994)，6(2)，p272-282)的方法導(dǎo)入到用MS-FR Koshihikari對MSKoshihikari(不育系)進行授粉而獲得的未成熟種子中。所獲得的轉(zhuǎn)化體在正常條件下進行培養(yǎng)，只有被測核酸片段具有育性恢復(fù)功能時才能獲得成熟的種子。
衍生自不攜帶Rf-1基因的粳稻Asominori相應(yīng)區(qū)的核酸具有如SEQ IDNO28所示的堿基序列。SEQ ID NO28和SEQ ID NO27的相應(yīng)部分大體上有約98％的同一性。因此，本發(fā)明中包含育性恢復(fù)基因(Rf-1)位點的核酸與SEQ ID NO27有至少70％，優(yōu)選約80％或更高，更優(yōu)選約90％或更高，還更優(yōu)選95％或更高，最優(yōu)選98％或更高的同一性。
同一性的百分率可通過目測和數(shù)學(xué)計算來確定。任選地，兩個核酸之間的同一性可通過利用GAP計算機程序，version 6.0的序列比較信息來確定。所述程序描述于Devereux等，Nucl.Acids Res.，12387(1984)，并可從theUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)獲得。GAP程序優(yōu)選的默認參數(shù)包括(1)堿基的一元比較矩陣(包含值為1時表示相同，為0時表示不相同)，和Gribskov和Burgess，Nucl.Acids Res.，146745(1986)的加權(quán)比較矩陣，描述于Schwartz和Dayhoff編的Atlas of Protein Sequence andStructure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358；(2)每一個缺口(gap)罰分值3.0，對每一個缺口中的每一個堿基(symbol)額外罰分值0.10；和(3)末端缺口不罰分。也可以采用其它本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的序列比較程序。
本發(fā)明的核酸也包括在中等嚴謹條件下能與SEQ ID NO27序列進行雜交并具有育性恢復(fù)功能的核酸，以及高度嚴謹條件下能與SEQ ID NO27序列進行雜交并具有育性恢復(fù)功能的核酸。
在此處，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)如DNA的長度來確定所述中等嚴謹條件。基本條件描述于Sambrook等Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd，Vo.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)，包括用對硝化纖維膜進行預(yù)洗的預(yù)洗液即5×SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)，雜交是在約1×SSC至6×SSC于約40到60℃下進行(或其它類似雜交液，如Stark’s溶液，即約50％甲酰胺于約42℃)，以及洗滌在約60℃，0.5×SSC，0.1％SDS下進行。在雜交液包含約50％甲酰胺時雜交溫度可低約15-20℃。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可根據(jù)如DNA的長度來確定高度嚴謹條件。通常，高度嚴謹條件包括相對于上述中等嚴謹條件而言，其雜交和/或洗滌在更高溫度和/或更低鹽濃度條件下進行。例如，這些條件包括雜交條件是0.1×SSC到0.2×SSC，在約60-65℃和/或洗滌條件是0.2×SSC，0.1％SDS在約65-68℃。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉可根據(jù)各種因素如探針長度來對溫度和洗液鹽濃度進行必要的調(diào)整。
本發(fā)明的DNA也包括由于缺失、插入或取代一或多個堿基而不同于SEQ ID NO.27所示的序列，但仍然具有育性恢復(fù)功能的核酸。只要保持了育性恢復(fù)功能，缺失、插入或取代堿基的數(shù)目沒有特別的限制，但優(yōu)選為1至數(shù)千個，更優(yōu)選1-1000，更優(yōu)選1-500，更優(yōu)選1-200，最優(yōu)選1-100個堿基。
基于本申請的描述，一旦Rf-1基因得到進一步弄清，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在去除例如Rf-1基因之外的區(qū)域或其內(nèi)含子區(qū)后而利用Rf-1基因。特定氨基酸的取代可通過例如具有類似理化特性的殘基進行取代。這種保守性取代的例子包括用另一個脂肪族氨基酸取代脂肪族氨基酸，例如Ile、Val、Leu或Ala中的一個取代其中的另一個；用極性殘基取代極性殘基，例如在Lys和Arg、Glu和Asp、或Gln和Asn之間進行改變；或者用芳香族殘基之間的取代，例如用Phe、Trp或Tyr中的一個取代其中的另一個。其它熟知的保守性取代包括，例如在具有類似疏水特性的整個區(qū)域之間的變化。為了引入合適的缺失、插入或取代時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用熟知的遺傳工程技術(shù)例如位點特異性突變，其描述于Sambrook等Molecular CloningALaboratoryManual，2nd，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)。
我們對攜帶Rf-1基因(SEQ ID NO27)的秈稻品種IR24與沒有攜帶的粳稻品種如Asominori(SEQ ID NO28)和Nipponbare BAC克隆(GanBankAccession No.AC068923)之間進行了比較。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)攜帶Rf-1基因的秈稻品種中Rf-1區(qū)域至少具有下述單堿基多態(tài)性(SNP)。
1)與SEQ ID NO27的第1239位堿基對應(yīng)的堿基是A；2)與SEQ ID NO27的第6227位堿基對應(yīng)的堿基是A；3)與SEQ ID NO27的第20680位堿基對應(yīng)的堿基是G；4)與SEQ ID NO27的第45461位堿基對應(yīng)的堿基是A；
5)與SEQ ID NO27的第49609位堿基對應(yīng)的堿基是A；6)與SEQ ID NO27的第56368位堿基對應(yīng)的堿基是T；7)與SEQ ID NO27的第57629位堿基對應(yīng)的堿基是C；和8)與SEQ ID NO27的第66267位堿基對應(yīng)的堿基是G。
因此，本發(fā)明包含Rf-1區(qū)域的核酸優(yōu)選地滿足上述1)-8)中一個到全部的要求。
在下面的實施例3，對Rf-1區(qū)域中與Rf-1基因距離最靠近的重組體(RS1-RS2，Rc1-RC8)的染色體組織結(jié)構(gòu)進行了研究。結(jié)果顯示可以確定Rf-1基因功能存在的序列包含于SEQ ID NO27的第1239-66267位堿基，即以最大可能性來估計應(yīng)包含于位點P4497 MboI和B56691 XbaI位點之間(約65kb)(圖3)。然而，存在這樣一種可能，即對于Rf-1基因遺傳功能的表達非常重要的是，Rf-1基因只是秈稻基因型的一部分，而不管其余區(qū)域是粳稻還是秈稻基因型，其遺傳功能可能沒有明顯變化?？赡苓€存在一個極端的例子，在粳稻與秈稻基因型之間，編碼區(qū)相互之間完全相同而只有啟動子區(qū)之間存在區(qū)別；啟動子區(qū)和編碼區(qū)只部分的包含于位點P4497 MboI和B56691 XbaI位點之間(約65kb)區(qū)域內(nèi)。因此，還不能得出結(jié)論認為上述的共同秈稻區(qū)域(SEQ ID NO27的第1239-66267位堿基之間)完全包含了完整的Rf-1基因。然而，基于以下考慮，可以確定至少SEQ ID NO27完全包含了完整的Rf-1基因1)基因通常的大小為數(shù)kb而很小超過10kb；2)本發(fā)明鑒定出的IR24基因組堿基序列(SEQ ID NO27)完全包含上述共同秈稻區(qū)域；3)SEQ ID NO27的5′端位于上述共同秈稻區(qū)域的上游1238bp處，且構(gòu)成另一個基因的一部分(S12564)；和4)SEQ ID NO27的3′末端位于上述共同秈稻區(qū)域3′末端的下游10096bp處。
如此，我們第一次成功的將Rf-1基因的區(qū)域限定到76kb范圍內(nèi)。因此，相對于現(xiàn)有技術(shù)例如日本專利公開No.2000-139465中描述的與Rf-1基因相距約1cM(約300kb)遺傳距離的共顯性標記所選擇出來的那些核酸，本發(fā)明包含Rf-1基因區(qū)域的核酸含有與Rf-1基因接近的其它基因的可能性大大減少。而且，相對于我們要求的優(yōu)先權(quán)即日本專利申請No.2000-247204中描述的用DNA標記位點S12564 Tsp509I和C1361 MwoI(之間的遺傳距離為0.3cM)所選擇出來的核酸，本發(fā)明上述核酸含有與Rf-1基因接近的其它基因的可能性也減少。
我們進而對Rf-1基因是否完全包含于尤其SEQ ID NO27的第38538-54123位堿基序列中作了互補分析。因而，在本發(fā)明的一個實施方案中，與SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.27第38538至54123位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列至少滿足下面兩個要求1)與SEQ ID NO.27的第45461位堿基相應(yīng)的堿基是A；2)與SEQ ID NO.27的第49609位堿基相應(yīng)的堿基是A。
IV.恢復(fù)水稻育性的方法本發(fā)明提供一種恢復(fù)水稻育性的方法，包括將核酸導(dǎo)入到水稻中，所述核酸具有恢復(fù)育性的功能，其堿基序列如SEQ ID NO.27所示或與SEQ IDNO.27的堿基序列有至少70％同一性。本發(fā)明的方法可能包括將核酸導(dǎo)入到水稻中，所述核酸具有恢復(fù)育性的功能，并具有SEQ ID NO.27的部分序列，尤其是第38538至54123位，優(yōu)選第42357至53743位堿基序列，更優(yōu)選42132-48883位堿基序列，或具有與SEQ ID NO.27的第38538至54123位，優(yōu)選第42357至53743位，更優(yōu)選42132-48883位的堿基序列有至少70％同一性。
在本發(fā)明中，導(dǎo)入到水稻中的包含育性恢復(fù)基因(Rf-1)位點的核酸，可以是上述描述于“III.包含Rf-1位點的核酸”中的任何一個核酸?？梢杂靡阎姆椒▉韺⒑怂釋?dǎo)入到水稻中，而沒有特別的限制。本發(fā)明的核酸可通過已知的遺傳工程技術(shù)或雜交而導(dǎo)入到水稻中。由于可以防止包含其它鄰近基因的導(dǎo)入，并能縮短了建立品系的周期，因而遺傳工程技術(shù)優(yōu)先選用。
可以使用遺傳工程技術(shù)中的任何適合于轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達系統(tǒng)。重組表達載體包括含有本發(fā)明的育性恢復(fù)基因(Rf-1)的核酸，其可被導(dǎo)入水稻，可操作連接于合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列，其中的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列可源自例如哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因。
調(diào)節(jié)序列的例子包括轉(zhuǎn)錄啟動子、操縱子或增強子、mRNA核糖體結(jié)合位點和可以控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的合適序列。在調(diào)節(jié)序列功能性地與DNA序列聯(lián)系時堿基序列可操作地連接于調(diào)控序列。因此，啟動子堿基序列可操作連接于DNA序列，是指啟動子堿基序列能夠控制該DNA的轉(zhuǎn)錄。復(fù)制起始位點使DNA在水稻中能夠復(fù)制，和用于鑒定轉(zhuǎn)化體的選擇基因通常也整合在表達載體中?？捎脗鹘y(tǒng)方法的可選擇標記基因的例子，如對抗生素如四環(huán)素、氨芐青霉素、卡那霉素、新霉素、潮霉素或壯觀霉素的抗性基因。
此外，編碼合適的信號肽(水稻本身的或異源的)也可以整合到表達載體中。信號肽的DNA序列(分泌肽)以與本發(fā)明核酸序列的閱讀框適合的方式進行融合，以便DNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄起始和mRNA翻譯而得到含有信號肽的融合蛋白。
本發(fā)明也提供包含本發(fā)明基因的重組載體。將本發(fā)明基因的DNA片段整合到載體如質(zhì)粒中，可用方法描述于Sambrook等Molecular CloningALaboratory Manual，2nd，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)。商業(yè)化的連接試劑盒(例如從TAKARA獲得)使用非常方便。進而將獲得的重組載體(如重組質(zhì)粒)導(dǎo)入到宿主水稻細胞中。
通過標準方法在現(xiàn)有載體(如質(zhì)粒DNA)中插入目的基因而方便的制備到重組載體。植物轉(zhuǎn)化載體尤其適合于利用本發(fā)明的核酸片段來使水稻具備育性。對植物轉(zhuǎn)化載體沒有特別的限制，只要它們在植物中能夠表達預(yù)期基因而產(chǎn)生蛋白質(zhì)即可，但優(yōu)選地包括pBI221、pBI121(Clontech)、和它們衍生的載體。尤其是，用于轉(zhuǎn)化屬于單子葉植物水稻的載體包括pIG121Hm和pTOK233(Hiei et al.，Plant J.，6，271-282(1994))，和pSB424(Komari et al.，PlantJ.，10，165-174(1996))。
用本發(fā)明的核酸片段取代上述載體中β-葡糖苷酸酶(GUS)基因而構(gòu)建成植物轉(zhuǎn)化載體，對植物進行轉(zhuǎn)染而獲得轉(zhuǎn)基因植物。植物轉(zhuǎn)化載體優(yōu)選包括至少啟動子、起始密碼子、目的基因(本發(fā)明的核酸序列或其一部分)、終止密碼子和終止子。根據(jù)需要也可以包含編碼信號肽的DNA、增強子序列、目的基因的5′和3′非翻譯區(qū)、選擇標記區(qū)等。只要能在植物中發(fā)揮作用，對啟動子和終止子的選擇也沒有特別的限制，其中包括組成型表達啟動子如最初已存在于上述載體中的35S啟動子、激動蛋白和泛素(ubiquitin)基因的啟動子。
將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細胞的合適方法包括利用磷酸鈣或氧化鈣/氯化銣、電激(electroporation)、電注射、用PEG或類似物的化學(xué)處理、以及使用基因槍等，這些方法可見于Sambrook等Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)。對植物細胞的轉(zhuǎn)化可用如葉盤法[Science，227，129(1985)]或電激法[Nature，319，791(1986)]。
將基因?qū)氲街参镏械姆椒òɡ棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)(Horsch et al.，Science，227，129(1985)；Hiei et al.，Plant J.，6，271-282(1994))、電激法(Fromm et al.，Nature，319，791(1986))、PEG(Pazkowski et al.，EMBO J.，3，2717(1984))、微注射(Crossway et al.，Mol.Gen.Genet.，202，179(1986))、粒子轟擊(McCabe et al.，Bio/Technology，6，923(1988))。對這些方法沒有特別的限制，只要它們適合于將核酸導(dǎo)入到靶植物中即可。
通過雜交發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)可按如下例子進行。首先，Rf-1供體親本與粳稻品種雜交獲得F1，然后與粳稻品種進行回交。從得到的植株個體中選出在位點S12564 Tsp509I是純合體、在位點P4497 MboI和B53627 BstZ17I是雜合體的個體，進一步用于回交。再從得到的植株個體中選出在位點P4497 MboI和B56691 XbaI是雜合體、而對于粳稻(japonica)在位點B53627 BstZ17I是雜合體的個體，進一步用于回交。如此，對每一次回交后代個體中篩選在位點P4497 MboI和B56691 XbaI屬于雜合體的個體以用于進一步的回交，重復(fù)進行約10個循環(huán)。最終，在位點P4497 MboI和B56691 XbaI為雜合體的個體進行自交，在獲得的后代中篩選出在這兩個位點都是純合的個體，這樣就獲得了含有從Rf-1供體親本導(dǎo)入的在位點P4497 MboI和B56691 XbaI之間的有限染色體區(qū)域的恢復(fù)系。
根據(jù)本發(fā)明，分離了包含育性恢復(fù)基因(Rf-1)的核酸，進而Rf-1基因可通過遺傳工程方法而被導(dǎo)入到水稻品種中以建立恢復(fù)系。本發(fā)明成功地將Rf-1區(qū)域定位在76kb或更窄的區(qū)域內(nèi)。因此本發(fā)明的包含Rf-1位點的核酸，相對現(xiàn)有技術(shù)而言，極大的減少了含有與Rf-1基因鄰近的其它基因的可能性。而且，在本發(fā)明中對包含Rf-1基因區(qū)域的整個堿基序列進行了測定。根據(jù)本申請的說明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對Rf-1基因本身作進一步的研究。因而，可以只導(dǎo)入Rf-1基因，而沒有同時導(dǎo)入其它任何鄰近基因。這對于鄰近基因有害時是非常重要的。進一步的，建立恢復(fù)系可以在更短的時間內(nèi)完成，如比通過雜交方式縮短了1-2年。
在實施例4-13中描述的互補分析中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法用圖5中描述的10個克隆片段轉(zhuǎn)化了MS Koshihikari(具有BT型細胞質(zhì)且其中的一個核心基因(core gene)在基本上與Koshihikari的相同)。結(jié)果表明，用包含SEQ IDNO27的第38538-54123位，優(yōu)選第42357-53743位，更優(yōu)選第42132-48883位堿基序列的核酸轉(zhuǎn)化而能建立育性恢復(fù)系。
用于建立水稻恢復(fù)系的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法如Hiei et al.，Plant J.，6，271-282(1994)、Komari et al.，Plant J.，10，p.165-174(1996)、Ditta et al.，PNAS77pp.7347-7351(1980)等描述的方法，但并不局限于這些。
首先，制備要插入目的核酸片段的質(zhì)粒載體。合適的質(zhì)粒載體包括如pSB11、pSB22等具有如Komari et al.，Plant J.，10，p.165-174(1996)(同上)所描述質(zhì)粒圖的載體。或者，本領(lǐng)域技術(shù)人員自己也可根據(jù)諸如上述pSB11、pSB22來構(gòu)建出適合的載體。在下面的例子中，利用了中間載體pSB200，它是以pSB11為基礎(chǔ)而制備的含有潮霉素抗性基因的載體。具體地說，胭脂堿合成酶終止子(Tnos)首先與泛素啟動子和泛素內(nèi)含子進行融合(Pubi-ubiI)。再將潮霉素抗性基因插入到所得Pubi-ubiI-Tnos復(fù)合體上的ubiI和Tnos之間得到Pubi-ubiI-HYG(R)-Tnos組裝。再將其與pSB11(Komari et al.，如上)的HindIII/EcoRI片段整合得到pKY205。用來添加限制性內(nèi)切酶位點如NotI、NspV、EcoRV、KpnI、SacI、EcoRI的接頭序列插入到該pKY205中Pubi的上游HindIII位點，獲得含有潮霉素抗性基因表達盒的pSB200。
然后，用包含了插入核酸的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞(如DH5α、JM109、MV1184，均可由商業(yè)購買得到如從TAKARA獲得)。
進而，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞與農(nóng)桿菌菌株，優(yōu)選同時與輔助(helper)大腸桿菌(攜帶幫助質(zhì)粒)進行三親雜配，可根據(jù)例如Ditta等(1980)的方法進行。合適的農(nóng)桿菌菌株包括根癌農(nóng)桿菌菌株如LBA4404/pSB1、LBA4404/pNB1、LBA4404/pSB3等。它們均具有Komari et al.，Plant J.，10，p.165-174(1996)(同上)中描述的質(zhì)粒圖譜，且本領(lǐng)域技術(shù)人員也可利用它們來構(gòu)建載體。合適的輔助大腸桿菌菌株包括但不限于如HB101/pRK2013(可從Clontech獲得)。有報道顯示攜帶pRK2073的大腸桿菌有pRK2073也可用作輔助大腸桿菌，雖然它們并不常用(Lemas et al.，Plasmid 1992，27，pp.161-163)。
然后，根據(jù)Hiei等(1994)的方法用期望交配的農(nóng)桿菌細胞對雄性不育水稻進行轉(zhuǎn)化。通過用粳稻品種花粉對雄性不育水稻進行授粉來獲得所需用于轉(zhuǎn)化的未成熟種子。
評估轉(zhuǎn)化植物中育性恢復(fù)，例如可通過評估直立(standing)植株抽穗(heading)后約1個月的種子育性來進行。對直立植株的評估意指對生長在田間的植株等進行觀察?？蛇x方法是對穗的成熟(ripening)種子百分率進行實驗室研究來進行。
V.鑒定Rf-1基因存在的方法根據(jù)本發(fā)明，表明可以確定Rf-1基因功能存在的序列位于水稻第10號染色體上的多態(tài)性檢測標記P4497 MboI和B56691 XabI之間。而且，互補分析確證Rf-1基因完全包含于尤其是SEQ ID NO.27的第38538至54123位堿基序列之中。
對攜帶Rf-1基因(SEQ ID NO27)的秈稻品種IR24與沒有攜帶所述基因的(Asominori(SEQ ID NO28)和Nipponbare BAC克隆AC068923)粳稻品種之間進行比較，發(fā)現(xiàn)兩品種之間存在多態(tài)性。那么，基于在Rf-1基因附近區(qū)域中堿基序列的多態(tài)性，我們可以方便、快速和準確地鑒定待測水稻植株或其種子是否攜帶Rf-1基因。
因此，本發(fā)明也提供一種鑒定被測水稻個體或其種子是否具有水稻Rf-1基因的方法，其中利用了可以確定水稻Rf-1基因功能存在的序列，該序列位于在水稻第10號染色體上的多態(tài)性檢測標記P4497 MboI和B56691 XabI之間。
可用任何已知的方法來檢測多態(tài)性。例如，已知方法包括限制性片段長度多態(tài)(RFLP)、通過測序直接確定、用識別8個堿基序列的限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行切割后進行末端放射性標記，進而用識別4或6個堿基序列的限制性內(nèi)切酶作進一步切割，繼而對消化產(chǎn)物進行雙向電泳(RLGS，Restriction Landmark Genome Scanning)等。AFLP分析(擴增片段長度多態(tài)，P.Vos et al.，Nucleic Acids Res.Vol.23，pp.4407-4414(1995))也已經(jīng)被開發(fā)，其中通過PCR來擴增/檢測RFLP。
例如，涉及通過PCR擴增來檢測RFLP(將RFLP標記轉(zhuǎn)化成PCR標記)或通過PCR擴增來檢測微衛(wèi)星中的多態(tài)性(微衛(wèi)星標記)的常規(guī)方法將在下面闡述。
將RFLP標記轉(zhuǎn)化成PCR標記A.基于與RFLP探針相應(yīng)的基因組區(qū)域中多態(tài)性的PCR標記(D.E.Harry，B.Temesgen，D.B.Neale；Codominant PCR-based markers for Pinus taedadeveloped from mapped cDNA clones，Theor.Appl.Genet.(1998)97pp.327-336)?！癛FLP”是一種用DNA片段作為探針經(jīng)Southern分析而觀察到的多態(tài)性。用作探針的DNA片段的堿基序列稱為“RFLP標記探針序列”。根據(jù)RFLP標記探針序列設(shè)計PCR引物，進行基因組PCR反應(yīng)后，可通過如下兩種方式獲得PCR標記。第一種方式涉及用一系列的限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)物以找到能引起片段長度多態(tài)的限制酶，第二種方式涉及找出通過比較品種之間產(chǎn)物的堿基序列得到的多態(tài)性，基于該多態(tài)性制備PCR標記。
B.基于引起RFLP位點的PCR標記。通過鑒定在PCR探針內(nèi)或附近(通常在數(shù)kb范圍內(nèi))的引起RFLP位點來獲得PCR標記(只在兩個比較品種中的一個品種攜帶該內(nèi)切酶識別位點)。
微衛(wèi)星標記微衛(wèi)星是在基因組中大量存在的以約2-4個堿基如(CA)n的重復(fù)序列。如果品種間多態(tài)性是由于重復(fù)數(shù)(repetition)引起的，則可根據(jù)鄰近區(qū)域中設(shè)計引物進行PCR擴增，觀察其擴增產(chǎn)物的長度來確定多態(tài)性，因而可以檢測到這種DNA多態(tài)性。利用微衛(wèi)星檢測多態(tài)性的標記被稱微衛(wèi)星標記(O.Parnaud，X.Chen，S.R.McCouch，Mol.Gen.Genet.(1996)252pp.597-607)。
在本發(fā)明中使用的檢測多態(tài)性的方法也沒有特別限制。從效率和方便角度考慮，優(yōu)選PCR-RFLP，它是將PCR和RFLP結(jié)合來鑒定限制性內(nèi)切酶切割模式所造成的多態(tài)性，在不同品種間的PCR擴增DNA片段序列中，由于內(nèi)切酶識別位點的差異形成PCR-RFLP。PCR-RFLP也稱為CAPS(切割擴增多態(tài)性序列)。如不存在任何適合的限制性內(nèi)切酶識別位點以體現(xiàn)多態(tài)性的區(qū)域時，也可利用改進的CAPS稱為dCAPS(衍生的切割擴增多態(tài)性序列)，其中限制性內(nèi)切酶識別位點通過PCR引入(Michaels，S.D.and Amasino，R.M.(1998)，The Plant Journal 14(3)381-385；A.Konieczny et al.，(1993)，Plant J.4(2)pp.403-410；Neff，M.M.，Neff，J.D.，Chory，J.and Pepper，A.E.(1998)，ThePlant Journal 14(3)387-392)。這些方法在下面還要詳細介紹。
CAPS，dCAPS本發(fā)明的鑒定方法包括，但不局限于i)制備引物對其根據(jù)在秈稻和粳稻品種之間的在Rf-1位點和其鄰近區(qū)域的堿基序列中體現(xiàn)多態(tài)性位點的堿基序列來設(shè)計的，用于擴增所述堿基序列；ii)進行核酸擴增反應(yīng)，用被測水稻個體或其種子的基因組DNA作為模板；和iii)基于在核酸擴增產(chǎn)物中的多態(tài)性以鑒定被測水稻(rice)個體或其種子是否具有Rf-1基因。
制備第i)中引物對優(yōu)選包括下述任何一種方式a)在核酸擴增產(chǎn)物的多態(tài)性中存在缺失區(qū)的變化時，則根據(jù)缺失區(qū)的側(cè)翼序列來設(shè)計核酸擴增的引物對，以形成可檢測多態(tài)性的標記；b)在核酸擴增產(chǎn)物的多態(tài)性中存在引起限制性內(nèi)切酶識別差異的堿基變化時，則根據(jù)堿基改變位點的側(cè)翼序列來設(shè)計核酸擴增的引物對，以形成可檢測多態(tài)性的標記；或c)在核酸擴增產(chǎn)物的多態(tài)性中存在不引起限制性內(nèi)切酶識別差異的堿基變化時，制備引物對以引入錯配堿基，其中引物對中包含堿基改變位點并且將包含堿基改變位點的區(qū)域改變成可導(dǎo)致在核酸擴增產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶識別差異的堿基序列，以形成可檢測多態(tài)性的標記。
在本發(fā)明中，可合理的選擇出鑒定Rf-1基因存在的合適多態(tài)性位點，以便多態(tài)性檢測標記可按下面的描述來制備。即基于攜帶Rf-1基因秈稻品種(IR24)的堿基序列(SEQ ID NO27)與不攜帶Rf-1基因粳稻品種的相應(yīng)序列(Asominori(SEQ ID NO28)和Nipponbare BAC克隆AC068923)之間的比較，但可不局限于這兩個品種之間的比較。
如果發(fā)現(xiàn)多態(tài)性導(dǎo)致了限制性內(nèi)切酶識別的差異，舉例而言，制備核酸擴增用的引物對以側(cè)接多態(tài)性位點并用于檢測該多態(tài)性。優(yōu)選的，引物不針對特異于高度重復(fù)序列來設(shè)計，以避免產(chǎn)生非預(yù)期產(chǎn)物。如果發(fā)現(xiàn)多態(tài)性沒有引起限制性內(nèi)切酶識別的差異，標記的制備則適用于上面描述的dCAPS方法。針對dCAPS標記的引物優(yōu)選不針對特異于重復(fù)序列來設(shè)計，并使產(chǎn)物優(yōu)選在50-300個堿基，更優(yōu)選約100個堿基的長度以使多態(tài)性檢測容易。
如果發(fā)現(xiàn)多態(tài)性涉及微衛(wèi)星，核酸擴增引物可按微衛(wèi)星的側(cè)翼序列來設(shè)計以側(cè)接該微衛(wèi)星，并用于檢測該多態(tài)性。同樣，也不要將引物設(shè)計成特異于重復(fù)序列。
1)核酸擴增在本發(fā)明中，根據(jù)在被測水稻個體或種子中測定的Rf-1位點的堿基序列來制備引物對，優(yōu)選被設(shè)計成可擴增包含多態(tài)性的鄰近區(qū)域。引物對用于核酸擴增反應(yīng)，以被測水稻個體或種子的基因組DNA為模板。核酸擴增反應(yīng)優(yōu)選為聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)(Saiki et al.，1985，Science 230，pp.1350-1354)。
用于核酸擴增反應(yīng)的引物對，其是根據(jù)多態(tài)性位點和其鄰近區(qū)域的堿基序列來設(shè)計的，可按任何已知的方法制備。具體地說，制備根據(jù)多態(tài)性位點和其鄰近區(qū)域的堿基序列來設(shè)計的引物對時，通過下面的方式，其包括產(chǎn)生與多態(tài)性位點和其鄰近區(qū)域的堿基序列具有相同序列的單鏈DNA或與該區(qū)域互補的堿基序列，如果需要，制備成包含修飾但不影響對多態(tài)性位點和其鄰近區(qū)域堿基序列特異結(jié)合的單鏈DNA，但滿足以下條件1)每條引物的長度為15-30個堿基；2)每條引物的堿基中G+C比率在30-70％；3)每條引物的堿基序列中的A、T、G和C不存在局部的嚴重不平衡分布。
4)通過引物對而擴增出的核酸長度約為50-3000個堿基，優(yōu)選為50-300個堿基；和5)在每條引物或引物堿基序列之間不存在任何互補序列片段。
在這里，多態(tài)性位點的“鄰近區(qū)域”意指包含多態(tài)性位點及其鄰近的在核酸擴增，尤其對于PCR，合適范圍內(nèi)的區(qū)域。被擴增的鄰近區(qū)域優(yōu)選但不局限于具有約50-3000個堿基，更優(yōu)選約50-約2000個堿基。為了便于鑒定多態(tài)性，產(chǎn)物長度優(yōu)選在50-300個堿基，更優(yōu)選為約100個堿基。鄰近區(qū)域在多態(tài)性位點的5′和3′側(cè)優(yōu)選，但不局限于具有約0至約3000個堿基，更優(yōu)選約0至約2000個堿基，還優(yōu)選為約0至約1000個堿基。
核酸擴增反應(yīng)的程序和條件沒有特別的限制，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是非常熟練的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)各種因素如多態(tài)性位點及其鄰近區(qū)域的堿基序列、引物對的堿基序列和長度等來確定合適的條件。通常，當引物越長或G+C含量越高或者A、T、G和C的分布更均勻，則核酸擴增反應(yīng)可在更嚴謹?shù)臈l件下進行(退火和核酸延長反應(yīng)在更高的溫度下進行，并采用較少的循環(huán)次數(shù))。采用越嚴謹?shù)臈l件可使擴增反應(yīng)具有更高的特異性。
擴增反應(yīng)可按照如下條件進行，但不局限于它們94℃2分鐘1個循環(huán)，于94℃1分鐘、58℃1分鐘和72℃2分鐘進行30個循環(huán)，最后是1個循環(huán)72℃2分鐘，用50ng基因組DNA作模板，每種dNTP 200μm和ExTaqTM(TAKARA)5U。反應(yīng)也可用如下條件94℃2分鐘1個循環(huán)，于94℃1分鐘、58℃1分鐘和72℃1分鐘進行30個循環(huán)，最后是72℃2分鐘1個循環(huán)。另一個具體例子，反應(yīng)在如下條件進行94℃2分鐘1個循環(huán)，于94℃30秒、58℃30秒和72℃30秒進行35個循環(huán)，最后是72℃2分鐘1個循環(huán)。
作為PCR模板的被測水稻(檢測水稻)基因組DNA可以用Edwards等(Nucleic Acids Res.8(6)1349，1991)的方法而容易的從植株個體或種子中提取出來。更優(yōu)選的，可用標準方法對DNA進行純化。一個尤其優(yōu)選的提取方法是CATB法(Murray，M.G.et al.，Nucleic Acids Res.8(19)4321-4325，1980)。用作PCR模板的DNA量優(yōu)選為最終濃度0.5ng/μL。
2)制備檢測多態(tài)性的標記通過用引物對進行核酸擴增反應(yīng)而獲得擴增產(chǎn)物，檢測其中是否存在多態(tài)性。之后，可以基于發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性來建立檢測該多態(tài)性的標記。下面提供可檢測擴增產(chǎn)物中的多態(tài)性的例子，但并不局限于這些例子。
a)在核酸擴增反應(yīng)產(chǎn)物的多態(tài)性中存在包含缺失區(qū)的改變(change)。
在這種情況下，制備用于核酸擴增的引物對側(cè)接缺失區(qū)以形成檢測多態(tài)性的標記。如果缺失區(qū)達到足夠的大小，多態(tài)性可通過如瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳時擴增產(chǎn)物的泳動的差異來檢測。舉例來說，當堿基對數(shù)差別在約5％或更大的情況下，可用瓊脂糖凝膠電泳檢測多態(tài)性，或當長度差別約為1個堿基或更多時，可用測序用的丙烯酰胺凝膠電泳檢測多態(tài)性。任選地，也可通過用寡核苷酸或DNA片段作為分析探針與核酸擴增產(chǎn)物進行雜交來檢測多態(tài)性，其中所用的寡核苷酸或DNA片段具有與不包括缺失區(qū)的堿基序列互補的序列不包括缺失區(qū)。任選地，如果需要，可測定擴增產(chǎn)物的堿基序列來進一步確證多態(tài)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用合適的關(guān)于核酸電泳、雜交、測序及相關(guān)的已知實驗技術(shù)。在這種情況下，擴增產(chǎn)物的長度差別直接反應(yīng)多態(tài)性，以此為基礎(chǔ)的用于檢測多態(tài)性的標記被稱為ALP(擴增子(amplicon)長度多態(tài))標記。
b)在核酸擴增產(chǎn)物的多態(tài)性中存在引起限制性內(nèi)切酶識別差異的堿基改變。
在這種情況下，根據(jù)堿基改變位點的側(cè)翼序列來設(shè)計核酸擴增的引物對以形成可檢測多態(tài)性的標記。此時，在核酸擴增產(chǎn)物的多態(tài)性中存在引起限制性內(nèi)切酶識別差異的堿基改變，即造成一個或多個特定的限制性內(nèi)切酶可以切割或不能切割核酸擴增產(chǎn)物。因此，擴增產(chǎn)物可用限制性內(nèi)切酶和在例如瓊脂糖凝膠上進行電泳時的泳動的差異來檢測多態(tài)性。如果需要，測定擴增產(chǎn)物的堿基序列來進一步確證多態(tài)性。
在這種情況下，通過PCR等方法的擴增產(chǎn)物的限制性片段的長度差異可反應(yīng)出多態(tài)性，基于此而用于檢測多態(tài)性的標記被稱為CAPS標記或PCR-RFLP標記(A.Konieczny等，如上)。
這種標記的例子如下面實施例1中的引物對P4497 MboI、P23945 MboI、P41030 TaqI、P45177 BstUI、B59066 BsaJI、B56691 XbaI。甚至如果多態(tài)性可通過如上面a)描述的通過擴增產(chǎn)物的核酸長度來進行檢測，也可通過與限制性內(nèi)切酶處理相結(jié)合而更容易的進行檢測。
c)在核酸擴增產(chǎn)物的多態(tài)性中存在不引起限制性內(nèi)切酶識別差異的堿基改變此時，制備用于引入錯配堿基的引物對，其包含堿基改變位點并且將包含堿基改變位點的區(qū)域改變成可導(dǎo)致擴增產(chǎn)物中的限制性內(nèi)切酶識別差異的堿基序列，以形成可檢測多態(tài)性的標記。
具體的說，基于天然靠近Rf-1基因區(qū)域的序列來設(shè)計引物對，可在核酸擴增產(chǎn)物中產(chǎn)生多態(tài)性但沒有導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶識別的差異。因此，在一條或兩條引物中引入錯配堿基以將包含堿基改變位點(多態(tài)性)的區(qū)域改變成可導(dǎo)致在擴增產(chǎn)物中的限制性內(nèi)切酶識別有差異的堿基序列。例如，在Mikaelian等Nucl.Acids.Res.20376.1992中描述的方法可以作為通過PCR介導(dǎo)的位點特異性突變來對特定堿基進行取代、缺失或增加的標準方法。用錯配引入引物得到的擴增產(chǎn)物作為檢測多態(tài)性的標記可能被一個或多個特定限制性內(nèi)切酶切割或不被切割，因為在錯配引入位點存在限制性內(nèi)切酶識別差異。因此，擴增產(chǎn)物用這些限制性內(nèi)切酶處理并在例如瓊脂糖凝膠上電泳，通過如上述b)描述的觀察泳動差別來檢測出多態(tài)性。
引入錯配堿基既不能影響引物與靶標植物基因組的結(jié)合，也不能影響多態(tài)性堿基的改變。多態(tài)性堿基的改變用于在其附近引入錯配，以通過堿基的改變和錯配相結(jié)合產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶識別的差異。引入這種錯配的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如可詳見于Michaels，S.D.andAmasino，R.M.(1998)，Neff，M.M.，Neff，J.D.，Chory，J.and Pepper，A.E.(1998)。
這種情況下的標記是對上述b)描述的CAPS標記的改進，并稱為dCAPS(衍生CAPS)標記。這種標記的例子如下面實施例3中的P9493 BslI。
在上述第b)或c)種情況下，如果存在額外的與品種多態(tài)性無關(guān)的限制性酶切位點，則很難鑒定基于限制性內(nèi)切酶識別差異的多態(tài)性。在這種情況下，可以引入合適的錯配堿基到引物中以消除不必要的限制性酶切位點。例如，在實施例3中引入了合適的錯配堿基到R-引物來消除在B60304 MspI中的與多態(tài)性無關(guān)的MspI位點。
雖然本發(fā)明并不局限于任何特定方法，CAPS或dCAPS方法相對于其它RFLP方法具有幾個優(yōu)點。具體的說，例如進行分析時比RFLP需要更小量的樣品。另一個優(yōu)點是大大減小了分析所需要的人力和時間。用PCR標記檢測的多態(tài)性可通過凝膠電泳來觀察，這比用微衛(wèi)星標記的丙烯酰胺凝膠電泳要容易操作一些。
本發(fā)明的鑒定方法的優(yōu)選實施方式鑒定被測水稻是否具有Rf-1基因的方法之優(yōu)選方式通過下面的示例描述來闡明。在此處的例子中，發(fā)現(xiàn)秈稻品種IR24所攜帶的Rf-1基因(SEQ IDNO27)的堿基序列與粳稻品種的相應(yīng)區(qū)域相比至少具有下述1)-8)的多態(tài)性1)與SEQ ID NO27的第1239位堿基對應(yīng)的堿基是A；2)與SEQ ID NO27的第6227位堿基對應(yīng)的堿基是A；3)與SEQ ID NO27的第20680位堿基對應(yīng)的堿基是G；4)與SEQ ID NO27的第45461位堿基對應(yīng)的堿基是A；5)與SEQ ID NO27的第49609位堿基對應(yīng)的堿基是A；6)與SEQ ID NO27的第56368位堿基對應(yīng)的堿基是T；7)與SEQ ID NO27的第57629位堿基對應(yīng)的堿基是C；和8)與SEQ ID NO27的第66267位堿基對應(yīng)的堿基是G。
因此在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，當被測水稻個體或種子滿足一個到全部上述1)-8)的條件時可以判斷攜帶有Rf-1基因。
我們進一步核實了Rf-1基因的功能表達所必需的區(qū)域包含于尤其是SEQ ID NO27的第38538-54123位，優(yōu)選第42357-53743位，更優(yōu)選第42132-48883位堿基中。因此在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，當具有與SEQID NO27或SEQ ID NO27的第38538-54123位堿基序列有至少70％的同一性，并至少滿足下述1)和2)中的一個條件，則被測水稻個體或種子可被鑒定為具有Rf-1基因1)與SEQ ID NO.27的第45461位堿基相應(yīng)的堿基是A；2)與SEQ ID NO.27的第49609位堿基相應(yīng)的堿基是A。
利用已知多態(tài)性檢測方法可以確定是否滿足了上述條件。也可以直接測定包含所述序列的鄰近區(qū)域的堿基序列。然而，上面描述的CAPS或dCAPS方法由于具有快速和方便的特性而優(yōu)選使用。CAPS或dCAPS方法例如可以通過包括下面步驟來進行i)基于包括下述任何一個堿基的鄰近區(qū)域堿基序列制備引物對；1)相應(yīng)于SEQ ID NO27的第1239位堿基的堿基；2)相應(yīng)于SEQ ID NO27的第6227位堿基的堿基；3)相應(yīng)于SEQ ID NO27的第20680位堿基的堿基；4)相應(yīng)于SEQ ID NO27的第45461位堿基的堿基；5)相應(yīng)于SEQ ID NO27的第49609位堿基的堿基；6)相應(yīng)于SEQ ID NO27的第56368位堿基的堿基；7)相應(yīng)于SEQ ID NO27的第57629位堿基的堿基；和8)相應(yīng)于SEQ ID NO27的第66267位堿基是G。
以擴增出上述堿基及其鄰近區(qū)域。
ii)利用被測水稻個體或其種子的基因組作為模板進行核酸擴增反應(yīng)。
iii)根據(jù)所得到的核酸擴增產(chǎn)物的多態(tài)性來鑒定被測水稻個體或其種子中是否存在Rf-1。
在檢測核酸擴增產(chǎn)物的多態(tài)性中發(fā)現(xiàn)滿足，但不局限于，下面一個到全部1)-8)的要求時，可確定被測水稻個體或其種子中存在Rf-11)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第1239位堿基的區(qū)域但不具有任何MboI識別序列；2)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第6227位堿基的區(qū)域但不具有任何BslI識別序列；3)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第20680位堿基的區(qū)域但不具有任何MboI識別序列；4)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第45461位堿基的區(qū)域但不具有任何TaqI識別序列；5)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第49609位堿基的區(qū)域但不具有任何BstUI識別序列；6)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第56368位堿基的區(qū)域但不具有任何MspI識別序列；7)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第57629位堿基的區(qū)域但不具有任何BsaJI識別序列；和8)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第66267位堿基的區(qū)域但不具有任何XbaI識別序列。
然而，只要能夠檢測出上述1)-8)的特異區(qū)域，則本發(fā)明不局限于上述限制性內(nèi)切酶。
優(yōu)選地，本發(fā)明的鑒定方法包括i)以包含下述任何一堿基的鄰近區(qū)域堿基序列為基礎(chǔ)，制備引物對；1)與第45461位堿基相應(yīng)的堿基；或2)與第49609位堿基相應(yīng)的堿基；ii)利用被檢水稻個體或其種子的基因作為模板進行核酸擴增反應(yīng)。
iii)根據(jù)所述核酸擴增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性來鑒定被測水稻個體或其種子中Rf-1的存在。在步聚iii)中，當發(fā)現(xiàn)滿足下述，雖然不局限于，條件1)和2)中的至少一個時，可以確定被測水稻個體或其種子中具有Rf-1基因1)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第45461位堿基但不具有任何TaqI識別序列的區(qū)域；2)包括了相應(yīng)于SEQ ID NO27的第49609位堿基但不具有任何BstUI識別序列的區(qū)域。
以SEQ ID NO27的堿基序列為基礎(chǔ)，并優(yōu)選滿足上述條件的情況下選擇出合適的用于核酸擴增反應(yīng)的引物對。優(yōu)選地，使用具有選自SEQ IDNO39和40、SEQ ID NO41和42、SEQ ID NO43和44、SEQ ID NO45和46、SEQ ID NO47和48、SEQ ID NO49和50、SEQ ID NO51和52、SEQID NO53和54組成的引物對。更優(yōu)選地，選擇SEQ ID NO45和46、SEQ IDNO47和48組成的引物對。如果需要，上述引物對的序列中可包含取代、缺失或插入突變，但仍保持對多態(tài)性位點及其鄰近區(qū)域的堿基序列的特異性結(jié)合，其也可以用作引物。
為了檢驗可產(chǎn)生限制性片段長度多態(tài)性的PCR產(chǎn)物，可用與PCR標記中識別位點相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行切割。根據(jù)所使用限制性內(nèi)切酶，可在合適的反應(yīng)溫度下溫育數(shù)小時到1天來進行切割反應(yīng)。用限制酶切割后的PCR擴增樣品通過在約0.7％-2％瓊脂糖凝膠或約3％MetaPhorTM瓊脂糖凝膠上電泳來進行分析。進而例如通過溴化乙錠染色后于紫外光下進行觀察。
本發(fā)明最優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)所使用的引物對，在表2中列出了凝膠上帶型所反映的限制性內(nèi)切酶切割模式。
表2被檢測出的條帶大致大小(bp)用P4497 MobI擴增(SEQ ID NO39和40)限制性酶MboI被測水稻基因組具有Rf-1基因(純合) 730沒有 385，345用P9493 BslI擴增(SEQ ID NO41和42)限制性酶BslI被測水稻基因組具有Rf-1基因(純合) 126沒有 100，26用P23945 MobI擴增(SEQ ID NO43和44)限制性酶MboI被測水稻基因組具有Rf-1基因(純合) 160，100沒有 260用P41030 TaqI擴增(SEQ ID NO45和46)限制性酶TaqI被測水稻基因組具有Rf-1基因(純合) 280沒有 90，190用P45177 BstUI擴增(SEQ ID NO47和48)限制性酶BstUI被測水稻基因組具有Rf-1基因(純合) 20，65，730沒有 20，65，175，555
用B60304 MspI擴增(SEQ ID NO49和50)限制性酶MspI被測水稻基因組具有Rf-1基因(純合) 330沒有 220，110用B59066 BsaJI擴增(SEQ ID NO51和52)限制性酶BsaJI被測水稻基因組具有Rf-1基因(純合) 420沒有 65，355用B56691 XbaI擴增(SEQ ID NO53和54)限制性酶XbaI被測水稻基因組具有Rf-1基因(純合) 670沒有 140，530在下面的實施例3中，對于具有花粉育性的存在于Rf-1基因附近的重組體(RS1-RS2，RC1-RC8)，利用14個多態(tài)性標記(包括上面描述的8對引物)檢測了它們的Rf-1區(qū)域的染色體組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果，證實這些植株中均攜帶了來自秈稻品種的P9493 BslI和59066 BsaJI之間的Rf-1基因。這種結(jié)果表明具有如圖3所示的染色體組織結(jié)構(gòu)的重組體花粉具備育性，即Rf-1基因在這些花粉中發(fā)揮了功能作用。這表明在秈稻區(qū)域中的可確定Rf-1基因功能存在的序列包括在秈稻區(qū)域中，該區(qū)域在這些重組體花粉中是共同，即根據(jù)最大可能性來估計，包括在位點P4497 MboI和B56691 XbaI之間的區(qū)域(約65kb)中。
在本發(fā)明中，染色體步行是基于假設(shè)位點S12564 Tsp509I應(yīng)當與Rf-1位點非常靠近，這可通過雜交產(chǎn)生的個體表現(xiàn)型頻率來判斷。事實上，根據(jù)本發(fā)明的高精度分離分析結(jié)果表明這兩個位點的遺傳距離約為0.04cM。在日本專利公開No.2000-139465中描述了被認為與Rf-1位點最緊密連鎖的標記之一，離Rf-1位點約1cM。考慮到在水稻中，1cM平均相當于約300kb，如果從日本專利公開No.2000-139465中描述的標記開始進行染色體步行還需要相當長的時間來進一步定位Rf-1基因區(qū)域。
VI.通過抑制Rf-1基因的功能以恢復(fù)育性的方法根據(jù)本發(fā)明，分離了具有育性恢復(fù)功能的包括了含有育性恢復(fù)基因(Rf-1)位點的核酸。測定了該核酸的全部堿基序列，因而可以通過遺傳工程方法來控制Rf-1基因的育性恢復(fù)功能。因此，本發(fā)明進一步提供一種抑制Rf-1基因的功能以恢復(fù)育性的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，抑制Rf-1基因的功能以恢復(fù)育性的方法包括通過導(dǎo)入長度至少100個連續(xù)堿基的反義序列，其序列互補于具有恢復(fù)育性功能的SEQ ID NO.27或與SEQ ID NO.27的堿基序列有至少70％同一性。
在一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的抑制Rf-1基因的功能以恢復(fù)育性的方法包括通過導(dǎo)入長度至少100個連續(xù)堿基的反義序列，且其序列選自互補于具有恢復(fù)育性功能的SEQ ID NO.27第38538-54123位，優(yōu)選第42357-53743位，更優(yōu)選第42132-48883位的堿基序列，或互補于與SEQ IDNO.27第38538-54123位，優(yōu)選第42357-53743位，更優(yōu)選第42132-48883位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。
反義序列具有至少100個堿基或更長，更優(yōu)選為500個堿基或更長，最優(yōu)選為1000個堿基或更長。從導(dǎo)入方法的技術(shù)方便性來考慮，優(yōu)選具有10000個堿基或更短，更優(yōu)選為5000個堿基或更短?？捎靡阎椒▉砗铣煞戳x序列?？衫靡阎姆椒▽⒎戳x序列導(dǎo)入到水稻中，如Terada等(Plant CellPhysical.2000 Jul，41(7)，pp.881-888)所描述的方法。
也可以預(yù)期，Rf-1斷裂(disrupt)系可從包含轉(zhuǎn)座元件(例如，但不局限于，Tos17(Hirochika H.et al.1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，pp.7783-7788))的不同變體系中篩選出在SEQ ID NO27中具有轉(zhuǎn)座元件的品系來獲得。在植物中，對以同源重組來進行基因斷裂已有研究。利用具有恢復(fù)育性功能的SEQ ID NO.27或與SEQ ID NO.27的堿基序列有至少70％同一性的核酸，可建立用Rf-1基因變體取代了Rf-1基因的品系，這樣也可能以達到抑制育性恢復(fù)功能的目的。
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實施例下面通過實施例來進一步闡明本發(fā)明，但并不意欲限定本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地根據(jù)說明書的描述來對本發(fā)明進行改變或變化，但仍然包含在本發(fā)明技術(shù)范圍內(nèi)。
參考實施例下面的參考實施例是根據(jù)我們先前的申請(日本專利申請No.2000-247204)中描述的方法而進行的。
參考實施例1 將Rf-1基因位點附近的RFLP標記轉(zhuǎn)換為PCR標記在這些參考例中，將Rf-1基因位點附近9個RFLP標記(R1877、G291、R2303、S12564、C1361、S10019、G4003、S10602、G1255)轉(zhuǎn)換成了PCR標記。
(1)材料和方法Rf-1基因位點附近9個RFLP標記即R1877、G291、R2303、S12564、C1361、S10019、G4003、S10602、G1255，購自于日本農(nóng)林漁水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物資源研究所(the National Institute of Agrobiological Sciences，the Ministry ofAgriculture，F(xiàn)orestry and Fisheries of Japan)。確定載體中的插入堿基序列之后，按照以下步驟進行實驗。此處所述的水稻品種，其中Asominori為粳稻品種，而IR24為秈稻品種。
(2)Asominori基因組文庫的制備按照CTAB法從Asominori的綠色葉子中提取總DNA。用MboI部分消化后，用NaCl密度梯度離心(6-20％線性梯度、20℃、37000rpm、4小時、總體積為12ml)對DNA進行分級。用每個級分部分(約0.5ml)進行電泳，收集和純化含有15-20kb DNA的級分。以Lambda DASH II(Stratagene)為載體，按照產(chǎn)品所附方案來制備基因組文庫。包裝采用Giga Pack IIIGold(Stratagene)。包裝后，添加500μl的SM緩沖液和20μl氯仿。離心并在上清液里加入20μl氯仿，作為文庫溶液。
用已稀釋50倍的文庫溶液5μl，感染XL-1 Blue MRA(P2)，結(jié)果得到83個噬菌斑。這相當于每個文庫達到4.15×105pfu，假定平均插入片段的長度為20kb來計算，則這些噬菌斑共覆蓋了8.3×109bp。因此可以認為這個文庫相對于水稻基因組(4×108bp)而言包含了足夠大小的片段。
(3)含有R1877-、C1361-和G4003-標記區(qū)的基因組克隆的分離就C1361及G4003而言，分離含有RFLP標記探針的質(zhì)粒，進行限制酶處理和電泳，以分離RFLP標記探針的部分；用DNA回收過濾器(TakaraSUPERC-01)回收所述目的DNA。對于R1877，需要設(shè)計特異于標記探針兩末端的引物，用Asominori總DNA為模板進行PCR反應(yīng)，電泳并用上述方法回收擴增產(chǎn)物。然后用Rediprime DNA標記系統(tǒng)(Amersham Pharmacia)標記回收的DNA，制備成用于文庫篩選的探針。PCR反應(yīng)可按常規(guī)方法進行(這也適合于下面的描述)。
將噬菌斑印跡到Hybond-N+(Amersham Pharmacia)上，再按照常規(guī)方法進行文庫篩選。初步篩選后，分別挑取各個陽性噬菌斑區(qū)，并懸浮于SM緩沖液中，用于第二輪篩選。第二輪篩選后，挑取陽性噬菌斑區(qū)，進行第三輪篩選，分離單個噬菌斑。
將分離得到的目標噬菌斑懸浮于SM緩沖液后，噬菌體的初級增殖按照平板裂解法。通過震蕩培養(yǎng)法對該噬菌體增殖液進行次級增殖，然后用Lambda starter試劑盒(QIAGEN)純化噬菌體DNA。
對于每個標記，初篩時用8個平板進行，每個平板使用10μl文庫溶液等分。經(jīng)過初篩、第二次和第三次篩選，分離出與R1877、C1361及G4003相關(guān)的基因組克隆，分別得到4、3和3個克隆。
(4)將R1877轉(zhuǎn)化成PCR標記對分離到的基因組克隆進行分析，以鑒定出引起RFLP的位點，或EcoRI位點，其存在于IR24(秈稻)中而不存在Asominori(粳稻)中。將其轉(zhuǎn)化成PCR標記。
具體來說，對分離到的4個克隆進行如下分析。首先，用T3和T7引物驗證每個克隆中的插入片段兩末端的堿基序列。接著，設(shè)計在標記探針的兩末端向外延伸的引物。并與T3和T7引物組合而形成總共為4個引物的組合，以每個克隆為模板進行PCR反應(yīng)。
作為一個獨立的步驟，用NotI和EcoRI消化每個克隆，電泳后判斷插入片段的大小和每個克隆中的EcoRI片段長度。
通過這些分析可以揭示每個克隆的相對位置。在RFLP分析中，已報道標記探針R1877在Nipponbare(粳稻)中可檢測出20kb的EcoRI片段，在Kasalath(秈稻)中可檢測出6.4kb的EcoRI片段(ftp//ftp.staff.or.jp/pub/geneticmap98/parentsouthen/chr10/R1877.JPG)。將該報道與上述分析結(jié)果總和起來分析，可以推定EcoRI位點存在于IR24中而不存在于Asominori中。因此，設(shè)計一種用以擴增鄰近區(qū)域的引物組合(SEQ IDNO1×SEQ ID NO2)，以進行基因組PCR，其參數(shù)是94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃2分鐘為1個循環(huán)，共30個循環(huán)以上。將所得PCR產(chǎn)物用EcoRI處理，并以0.7％瓊脂糖凝膠進行電泳。
結(jié)果，在Asominori和IR24之間觀察到了預(yù)期的多態(tài)性。對于IR24品種，用EcoRI處理PCR產(chǎn)物(約3200bp)，得到1500bp和1700bp片段，但對于Asominori品種卻不存在這種切割模式。利用Asominori-IR24的RIL(重組體近交系(Recombinant inbreed line))進行PCR標記作圖，結(jié)果表明PCR標記與RFLP標記位點R1877處于相同的區(qū)域，因而確認了RFLP標記R1877已被轉(zhuǎn)換成PCR標記，在本發(fā)明中稱為R1877 EcoRI。
(5)將G4003轉(zhuǎn)化成PCR標記對分離到的基因組克隆進行分析，以鑒定出引起RFLP的位點，或HindIII位點，其存在于Asominori中而不存在IR24中。以將G4003轉(zhuǎn)化成PCR標記。
與對R1877的分析方法相似，揭示分離到的3個克隆的相對位置。在RFLP分析中，已報道標記探針G4003在Nipponbare(粳稻)中可檢測出3kb的HindIII片段，在Kasalath(秈稻水稻)中檢測出的片段為10kb(ftp//ftp.staff.or.jp/pub/geneticmap98/parentsouthen/chr10/R1877.JPG)。將該報道與上述分析結(jié)果總和起來分析，可以暫時推測，Asominori中存在而IR24中不存在的HindIII位點應(yīng)位于2個候選位置中的一個。設(shè)計一種可擴增鄰近區(qū)域的引物組合(SEQ ID NO3×SEQ ID NO4)，以進行基因組PCR，其參數(shù)是94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒為1個循環(huán)，共35個循環(huán)以上。將所得PCR產(chǎn)物用HindIII處理，并以2％瓊脂糖凝膠進行電泳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在標記探針內(nèi)部的HindIII位點顯示出多態(tài)性。對于Asominori而言，用HindIII消化PCR產(chǎn)物(362bp)可得到95bp和267bp片段，但對于IR24而言沒有這種切割模式。作圖結(jié)果表明，RFLP標記G4003被轉(zhuǎn)換成了PCR標記，本發(fā)明將其命名為G4003 HindIII(SEQ ID NO19)。
(6)將C1361轉(zhuǎn)化成PCR標記依據(jù)分離到的基因組克隆的堿基序列信息來設(shè)計引物。并以Asominori和IR24的總DNA為模板進行PCR反應(yīng)，電泳后，用已知的方法回收PCR產(chǎn)物。以回收的DNA作模板，用ABI Model 310分析了各個水稻品種的堿基序列，以找出可引起多態(tài)性的變異。
與分析R1877一樣，建立了分離到的3個克隆大致的相對位置。但發(fā)現(xiàn)，很難在C1361標記附近區(qū)域進行PCR擴增或確定其堿基序列，因而很難鑒定出引起RFLP的位點。因此，發(fā)明人注意到能夠產(chǎn)生相對較長的PCR產(chǎn)物(2.7kb)的區(qū)域，并嘗試創(chuàng)建dCAPS標記。
具體來說，采用Asominori和Koshihikari(都是粳稻水稻)以及Kasalath和IR24(均為秈稻水稻)，比較了所述區(qū)域的基因組PCR產(chǎn)物的堿基序列，在粳稻品種和秈稻品種之間發(fā)現(xiàn)了6個位點顯示有多態(tài)性。其中的一個位點用于創(chuàng)建dCAPS標記。為此，用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6作引物進行PCR，即以94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒為1個循環(huán)，共35個循環(huán)以上為參數(shù)。將所得PCR產(chǎn)物用MwoI處理，再用3％MetaPhorTM瓊脂糖凝膠電泳進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于Asominori而言，在2位點處被切割，得到約25bp、50bp、79bp的三個電泳條帶，但對于IR24，只在1位點處進行了切割，得到約50bp、107bp的兩個電泳條帶。作圖分析表明，RFLP標記C1361被轉(zhuǎn)換成了PCR標記，在本發(fā)明中命名為C1361 MwoI(SEQ ID NO20)。
(7)將G2155轉(zhuǎn)化為PCR標記根據(jù)標記探針的兩末端設(shè)計特異引物，并以Asominori、Koshihikari、IR24或IL216(該品系是通過回交而將Rf-1基因引入到Koshihikari中而建立的；其基因型為Rf-1/Rf-1)的總DNA為模板進行PCR。根據(jù)上面已經(jīng)描述的方法，純化所得到的PCR產(chǎn)物并找出對于限制性片段長度多態(tài)性有用的突變。
具體來說，比較被測品種之間相應(yīng)區(qū)域的堿基序列，在具有Rf-1基因的品種/品系(IR24及IL216)和沒有Rf-1基因的品種(Asominori及Koshihikari)之間發(fā)現(xiàn)3位點突變。其中的1處突變被用于創(chuàng)建dCAPS標記。為此，用SEQ ID NO7和SEQ ID NO8作引物，以94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒為1循環(huán)，共35個循環(huán)以上為參數(shù)進行PCR反應(yīng)。將所得PCR產(chǎn)物用MwoI處理，再用3％MetaPhorTM瓊脂糖凝膠電泳進行分析。對于Asominori，有1個切割位點，得到約25bp、105bp的兩個觀察到電泳條帶；對于IR24，有2個切割位點，得到約25bp、27bp、78bp的三個可觀察電泳條帶。圖譜分析表明，RFLP標記G2155被轉(zhuǎn)換成了PCR標記，在本發(fā)明中命名為G2155MwoI(SEQ ID NO21)。
(8)將G291轉(zhuǎn)換成PCR標記設(shè)計特異于標記探針內(nèi)部序列的引物，并將各種引物組合起來進行PCR反應(yīng)，以找到一種引物組合而能夠產(chǎn)生預(yù)期大小的擴增產(chǎn)物。利用該選擇出的引物組合，以Asominori、Koshihikari、IR24及IL216的總DNA為模板進行PCR反應(yīng)。按前面已描述的方法純化所得到的PCR產(chǎn)物并找出對于限制性片段長度多態(tài)性有用的變異。
具體而言，用特異于標記探針序列的引物，本發(fā)明人對被測的每一個品種進行了基因組PCR反應(yīng)，并比較擴增產(chǎn)物的堿基序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有Rf-1基因的品種/品系(IR24及IL216)和沒有Rf-1基因的品種(Asominori及Koshihikari)之間發(fā)現(xiàn)4處位點的突變。其中的1處突變被用于創(chuàng)建dCAPS標記。為此，用SEQ ID NO9和SEQ ID NO10作引物，以94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒為1循環(huán)，共35個循環(huán)以上為參數(shù)進行PCR反應(yīng)。將所得PCR產(chǎn)物用MspI處理，再以3％MetaPhorTM瓊脂糖凝膠電泳進行分析。對于具有Rf-1基因的品種/品系，有2個切割位點，得到約25bp、49bp、55bp的三個可觀察的電泳條帶；但對于不具有Rf-1基因的品種，只有1個切割位點，得到約25bp、104bp的兩個可觀察的電泳條帶。圖譜分析表明，RFLP標記G2155被轉(zhuǎn)換成了PCR標記，在本發(fā)明中命名為G291 MspI(SEQ IDNO22)。
(9)將R2303轉(zhuǎn)化成PCR標記設(shè)計特異于標記探針內(nèi)部序列的引物，以Asominori(粳稻)、IR24及Kasalath(秈稻)的總DNA為模板進行PCR反應(yīng)。按前面已描述的方法純化所得到的PCR產(chǎn)物并找出對于限制性片段長度多態(tài)性有用的突變。
比較被測品種之間相應(yīng)區(qū)域的堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在粳稻品種和秈稻品種之間存在突變。由于該突變出現(xiàn)在BslI識別位點，因而直接用作產(chǎn)生CAPS標記。為此，用SEQ ID NO11和SEQ ID NO12作引物，以94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃2分鐘為1循環(huán)，共30個循環(huán)以上為參數(shù)進行PCR反應(yīng)。將所得PCR產(chǎn)物用BslI處理，以2％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。在粳稻品種中有1個切割位點，可觀察到約238bp、1334bp的兩個電泳條帶，而在秈稻品種中有2個切割位點，可觀察到約238bp、655bp、679bp的三個電泳條帶。圖譜分析證明，RFLP標記G2303已被轉(zhuǎn)換成PCR標記，在本發(fā)明中命名為G2303 BslI(SEQ ID NO23)。
(10)將S10019轉(zhuǎn)化成PCR標記按照第(9)中的將R2302轉(zhuǎn)換成PCR標記的方法來將S10019轉(zhuǎn)化成PCR標記。
比較被測品種之間相應(yīng)區(qū)域的堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在粳稻品種和秈稻品種之間存在突變。由于該突變出現(xiàn)在BstUI識別位點，因而直接用作產(chǎn)生CAPS標記。為此，用SEQ ID NO13和SEQ ID NO14作引物，以94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘為1循環(huán)，共30個循環(huán)以上為參數(shù)進行PCR反應(yīng)。將所得PCR產(chǎn)物用BstUI處理，以2％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。在粳稻品種中有1個切割位點，可觀察到約130bp、462bp的兩個電泳條帶，而在秈稻品種中有2個切割位點，可觀察到約130bp、218bp、244bp的三個電泳條帶。圖譜分析證明，RFLP標記S10019已被轉(zhuǎn)換成PCR標記，在本發(fā)明中命名為S10019 BstUI(SEQ ID NO24)。
(11)將S10602轉(zhuǎn)化成為PCR標記按照第(9)中的將R2302轉(zhuǎn)換成PCR標記的方法來將S10602轉(zhuǎn)換成PCR標記。
比較被測品種之間相應(yīng)區(qū)域的堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在粳稻品種和秈稻品種之間存在突變。該突變用作創(chuàng)建CAPS標記。為此，用SEQ ID NO15和SEQ ID NO16作引物，以94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘為1循環(huán)，共33個循環(huán)以上為參數(shù)進行PCR反應(yīng)。將所得PCR產(chǎn)物用KpnI處理，以2％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。在粳稻品種中有1個切割位點，可觀察到約117bp、607bp的兩個電泳條帶，而在秈稻品種中沒有切割位點，只可觀察到724bp的電泳條帶。圖譜分析證明，RFLP標記S10602已被轉(zhuǎn)換成PCR標記，在本發(fā)明中命名為S10602 KpnI(SEQ ID NO25)。
(12)將S12564轉(zhuǎn)化成PCR標記按照第(9)中的將R2302轉(zhuǎn)換成PCR標記的方法來將S12564轉(zhuǎn)換成PCR標記。
具體地，比較被測品種之間相應(yīng)區(qū)域的堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在粳稻品種和秈稻品種之間存在突變。由于該突變出現(xiàn)在BstUI識別位點，因而直接用作創(chuàng)建dCAPS標記。為此，用SEQ ID NO17和SEQ ID NO18作引物，以94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒為1循環(huán)，共35個循環(huán)以上為參數(shù)進行PCR反應(yīng)。將所得PCR產(chǎn)物用Tsp509I處理，以3％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。在粳稻品種中有2個切割位點，可觀察到約26bp、41bp、91bp的三個電泳條帶，而在秈稻品種中有1個切割位點，可觀察到約41bp、117bp的兩個電泳條帶。圖譜分析證明，RFLP標記S12564已被轉(zhuǎn)換成PCR標記，在本發(fā)明中命名為S12564 Tsp509I(SEQ ID NO26)。
參考實施例2 Rf-1基因位點的基因圖譜用BT型雄性不育細胞質(zhì)取代Koshihikari的細胞質(zhì)而制備得到MSKoshihikari(BC10F1代)。MS-FR Koshihikari是由此而創(chuàng)建的品系，將源于IR8(由National Institute of Agrobiological Sciences提供)的Rf-1基因?qū)氲組S Koshihikari(Rf-1基因位點是雜合的)。用MS-FR Koshihikari的花粉對MS Koshihikari授粉產(chǎn)生的F1代群體，從F1代的1042株幼苗中提取DNA，以供試驗分析之用。
首先，分析每一個體中被認為位于參考實施例1中所述2個標記位點即R1877 EcoRI和G2155 MwoI(其推測位于Rf-1基因座的相對側(cè))之間的Rf-1基因的基因型。在R1877 EcoRI位點或G2155 MwoI位點上，粳稻為純合體則被認為在這兩個標記位點之間是重組體。接著，對每個重組體，研究其在G291 MspI、R2303 BslI、S12564 Tsp509I、C1361 MwoI、S10019 BstUI、G4003HindIII、S10602 KpnI位點的基因型，并鑒定發(fā)生重組的位置。
對R1877 EcoRI和G2155 MwoI位點的基因型的研究結(jié)果表明，46個個體在Rf-1基因位點附近發(fā)生重組。分析在Rf-1基因位點附近的標記基因位點的基因型，結(jié)果如表3所示。
表3 Rf-1基因位點附近的重組體個體中的標記位點基因型基因座 12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23R1877 EcoRI JJJJJJJJHHHHHHHHHHHHHHHG291 MspI HJJJJJJJHHHHHHHHHHHHHHHR2303 BslI HHJJJJJJHHHHHHHHHHHHHHHS12564 Tsp509I HHHHHHHJHHHHHHHHHHHHHHHC1361 MwoI HHHHHHHHJJHHHHHHHHHHHHHS10019 BstUIHHHHHHHHJJJJJJJJHHHHHHHG4003 HindIII HHHHHHHHJJJJJJJJJJJJJJJS10602 KpnI HHHHHHHHJJJJJJJJJJJJJJJG2155 MwoI HHHHHHHHJJJJJJJJJJJJJJJ2425 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHJJJJJJJJJHHHHHHHHHHHHHHJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJHHJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ純合Koshihikari型H雜合Koshihikari型/MS-FR Koshihikari型如表3中所示，獲得的重組體8在S12564 Tsp509I標記位點、重組體9和10在C1361 MwoI標記位點對于粳稻是純合。所有這些重組體均恢復(fù)了育性，前者可認為重組位于Rf-1和S12564 Tsp509I位點之間而后者則認為重組是在Rf-1和C1361 MwoI位點之間，這表明Rf-1基因位于S12564Tsp509I和C1361 MwoI之間。有報告指出，在上述雜交中的具有BT型胞質(zhì)雄性不育的個體中，只有攜帶了Rf-1基因的花粉是可育的(C.Shinjyo，JAPAN.J.GENETICS Vol.44，No.3149-156(1969))，根據(jù)該報道Rf-1基因位點可在更詳細的連鎖圖譜上進行定位(圖4)。
實施例1獲得靠近Rf-1位點的重組體(材料和方法)用MS-FR Koshihikari(BC9F1代，在Rf-1基因位點是雜合的)的花粉對MS Koshihikari(BC10F1代)進行授粉產(chǎn)生了由4103個個體組成的BC10F1群體，在S12564 Tsp509I和C1361 MwoI位點的基因型與參考實施例2中描述的相同。其中，在S12564 Tsp509I位點純合的Koshihikari個體，被認為是由于在Rf-1和S12564 Tsp509I之間發(fā)生重組所致，而在C1361 MwoI位點基因純合的Koshihikari個體，被認為是由于在Rf-1和C1361 MwoI之間發(fā)生重組所致。從這4103個個體的每一個體中提取DNA。
(結(jié)果和討論)在這4103個個體中，發(fā)現(xiàn)了1個在Rf-1和S12564 Tsp509I之間發(fā)生重組的重組體和6個在Rf-1和C1361 MwoI之間發(fā)生重組的重組體。在上述參考實施例2中，如表3所示，已從1042個個體中獲得了1個在Rf-1和S12564Tsp509I之間發(fā)生重組的重組體和2個在Rf-1和C1361 MwoI之間發(fā)生重組的重組個體。
因此從總數(shù)為5145個個體中總共獲得了2個在Rf-1和S12564 Tsp509I之間發(fā)生重組的重組體和8個在Rf-1和C1361 MwoI之間發(fā)生重組的重組體。在下面的實施例中對這10個個體進行高精度分離分析。
實施例2染色體步行(1)第一次染色體步行(材料和方法)按照參考實施例1所述方法，用Lambda DASH II載體構(gòu)建了Asominori粳稻(不攜帶Rf-1)的基因組DNA的基因組文庫，并用染色體步行進行檢測。
按常規(guī)方法，利用Asominori的總DNA為模板，及下述引物對進行PCR反應(yīng)5′-atcaggagccttcaaattgggaac-3′(SEQ ID NO29)和5′-ctcgcaaattgcttaattttgacc-3′(SEQ ID NO30)其中這兩條引物是按照RFLP探針S12564的部分堿基序列(AccessionNo.D47284)設(shè)計的。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增產(chǎn)物約1200bp，用QIAEXII(QIAGEN)進行純化。用Rediprime DNA標記系統(tǒng)(Amersham Pharmacia)對純化DNA進行標記，而形成了文庫篩選探針(探針A，圖1)。
在噬菌斑印跡到Hybond-M+(Amersham Pharmacia)上之后對文庫進行常規(guī)篩選。通過平板裂解法用Lambda Midi試劑盒(QIAGEN)純化噬菌體DNA，分離單個的噬菌斑。
(結(jié)果和討論)末端堿基序列分析和限制酶片斷長度分析結(jié)果表明篩選得到的4個克隆中的兩個克隆(WSA1和WSA3)具有如圖1所示的相對位置關(guān)系。通過引物步行(DNA Sequencer377，ABI)測定與WSA1和WSA3相應(yīng)的Asominori基因組堿基序列。
(2)第二次染色體步行除了上述的Asominori基因組文庫外，還類似地自秈稻品種IR24(攜帶Rf-1)基因組DNA構(gòu)建了IR24基因組文庫，用染色體步行進行分析。
按常規(guī)方法，利用WSA3的DNA為模板，及下述引物對進行PCR反應(yīng)5′-tgaaggagttatgggtgcgtgacg-3′(SEQ ID NO31)和5′-ttgccgagcacacttgccatgtgc-3′(SEQ ID NO32)其中這兩條引物是按照(1)中確定的Asominori基因組堿基序列來設(shè)計的。將所得524bp擴增產(chǎn)物進行純化，并用上面描述的方法對其進行標記，而形成了文庫篩選探針(探針E，圖1)。
文庫篩選和噬菌體DNA的純化按上面描述的方法進行。
(結(jié)果和討論)末端堿基序列分析和限制酶片斷長度分析結(jié)果表明通過篩選Asominori基因組文庫而得到的15個克隆中的1個克隆(WSE8)具有如圖1所示的相對位置關(guān)系。與WSE8相應(yīng)的Asominori基因組堿基序列通過引物步行進行測定。
末端堿基序列分析和限制酶片斷長度分析結(jié)果表明通過篩選IR24基因組文庫而得到的7個克隆中的2個克隆(XSE1和XSE7)具有如圖1所示的相對位置關(guān)系。與XSE1和XSE7相應(yīng)的IR24基因組堿基序列通過引物步行進行測定。
(3)第三次染色體步行(材料和方法)上述的Asominori基因組文庫和IR24基因組文庫用染色體步行進行分析。
按常規(guī)方法，利用WSE8的DNA為模板，及下述引物對進行PCR反應(yīng)5′-gcgacgcaatggacatagtgctcc-3′(SEQ ID NO33)和5′-ttacctgccaagcaatatccatcg-3′(SEQ ID NO34)其中這兩條引物是按照(2)中確定的Asominori基因組堿基序列來設(shè)計的。純化獲得的擴增產(chǎn)物約1159bp，并用上面描述的方法對其進行標記，而形成了文庫篩選探針(探針F，圖1)。
文庫篩選和噬菌體DNA的純化按上面描述的方法進行。
(結(jié)果和討論)末端堿基序列分析和RFLP分析結(jié)果表明篩選Asominori基因組文庫而得到的8個克隆中的2個克隆(WSF5和WSF7)具有如圖1所示的相對位置關(guān)系。與WSF5和WSF7相應(yīng)的Asominori基因組堿基序列通過引物步行進行測定。
末端堿基序列分析和RFLP分析結(jié)果表明通過篩選IR24基因組文庫而得到的13個克隆中的2個克隆(XSF4和XSF20)具有如圖1所示的相對位置關(guān)系。與XSF4和XSF20相應(yīng)的IR24基因組堿基序列通過引物步行進行測定。
(4)第四次染色體步行上述的Asominori基因組文庫和IR24基因組文庫用染色體步行進行分析。
按常規(guī)方法，利用WSF7的DNA為模板，及下述引物對進行PCR反應(yīng)5′-aaggcatactcagtggagggcaag-3′(SEQ ID NO35)和5′-ttaacctgaccgcaagcacctgtc-3′(SEQ ID NO36)其中這兩條引物是按照(3)中確定的Asominori基因組堿基序列來設(shè)計的。純化獲得的擴增產(chǎn)物約456bp，并用上面描述的方法對其進行標記，而形成了文庫篩選探針(探針G，圖1)。
文庫篩選和噬菌體DNA的純化按上面描述的方法進行。
(結(jié)果和討論)末端堿基序列分析和RFLP分析結(jié)果表明通過篩選Asominori基因組文庫而得到的6個克隆中的2個克隆(WSG2和WSG6)具有如圖1所示的相對位置關(guān)系。與WSG2和WSG6相應(yīng)的Asominori基因組堿基序列通過引物步行進行測定。
末端堿基序列分析和RFLP分析結(jié)果表明通過篩選IR24基因組文庫而得到的14個克隆中的3個克隆(XSG8、XSG16和XSG22)具有如圖1所示的相對位置關(guān)系。與XSG8、XSG16和XSG22相應(yīng)的IR24基因組堿基序列通過引物步行進行測定。
(5)第五次染色體步行上述的IR24基因組文庫用染色體步行進行分析。
我們詳細瀏覽了TIGR(The Institute for Genomic Research)公共網(wǎng)址，發(fā)現(xiàn)在GenBank中已經(jīng)登記保藏包含RFLP標記S12564的BAC克隆(細菌人工染色體)(Accession NO.AC068923)。該BAC克隆包含Nipponbare粳稻的基因組DNA，經(jīng)序列比較顯示完全包括了在(1)-(4)中制備得到的Asominori和IR24的重疊區(qū)域(contig regions)。
因此，按常規(guī)方法，利用IR24的總DNA為模板，及下述引物對進行PCR反應(yīng)5′-tggatggactatgtggggtcagtc-3′(SEQ ID NO37)和5′-agtggaagtggagagagtagggag-3′(SEQ ID NO38)其中這兩條引物被設(shè)計用于擴增該BAC克隆的部分序列。純化獲得的擴增產(chǎn)物約600bp，并用上面描述的方法對其進行標記，而形成了文庫篩選探針(探針H，圖1)。
文庫篩選和噬菌體DNA的純化按上面描述的方法進行。
(結(jié)果和討論)末端堿基序列分析和RFLP分析結(jié)果表明在篩選Asominori基因組文庫而得到的15個克隆中的1個(XSH18)具有如圖1所示的相對位置關(guān)系。與XSH18相應(yīng)的IR24基因組堿基序列通過引物步行進行測定。
實施例3高精度分離分析(1)PCR標記P4497 MboI的確立將實施例2中所確定的IR24重疊區(qū)(SEQ ID NO27)相應(yīng)的基因組堿基序列與Asominori重疊區(qū)(SEQ ID NO28)相應(yīng)的基因組堿基序列進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO27的第1239位堿基是A，而相應(yīng)該位置的SEQ ID NO28的第12631位堿基是G。
為了檢測該堿基的變化，首先利用下述引物通過PCR反應(yīng)擴增所述堿基位置的附近區(qū)域，得到片段約730bpP4497 MboI F5′-ccctccaacacataaatggttgag-3′(SEQ ID NO39)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第853-876位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第12247-12270位堿基)P4497 MboI R
5′-tttctgccaggaaactgttagatg-3′(SEQ ID NO40)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第1583-1560位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第12975-12952位堿基)用MboI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從Asominori DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有MboI識別位點(GATC)而能被MboI所切割，而從IR24 DNA擴增到的產(chǎn)物不具有MboI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用MboI消化后的DNA片段長度存在差異。
(2)PCR標記P9493 BslI的確立將實施例2中所確定的IR24重疊區(qū)(SEQ ID NO27)相應(yīng)的基因組堿基序列與Asominori重疊區(qū)(SEQ ID NO28)相應(yīng)的基因組堿基序列進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO27的第6227位堿基是A，而相應(yīng)位置的SEQ ID NO28的第17627位堿基是C。
為了檢測該堿基的變化，首先利用下述引物通過PCR反應(yīng)擴增所述堿基位置的附近區(qū)域，得到片段約126bpP9493 BslI F5′-gcgatcttatacgcatactatgcg-3′(SEQ ID NO41)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第6129-6152位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第17529-17552位堿基)P9493 BslI R5′-aaagtctttgttccttcaccaagg-3′(SEQ ID NO42)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第6254-6231位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第17654-17631位堿基)用BslI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從Asominori DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有BslI識別位點(CCNNNNNNNGG)而能被BslI所切割，而從IR24 DNA擴增到的產(chǎn)物不具有BslI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用BslI消化后的DNA片段長度存在差異。
該標記的建立適用于dCAPS方法(Michaels and Amasino 1998，Neff etal.，1998)。具體地說，通過利用上述P9493 BslI R引物而在SEQ ID NO27的第6236位和SEQ ID NO28的第17636位堿基處，用g取代a。因此，Asominori DNA中的片段在SEQ ID NO28的第17626-17636位堿基序列變成CCtttccttGG，而可以被BslI所切割。
(3)PCR標記P23945 MboI的建立將實施例2中所確定的IR24重疊區(qū)(SEQ ID NO27)相應(yīng)的基因組堿基序列與Asominori重疊區(qū)(SEQ ID NO28)相應(yīng)的基因組堿基序列進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO27的第20680位堿基是G，而相應(yīng)位置的SEQ ID NO28的第32079位堿基是A。
為了檢測該堿基的變化，首先利用下述引物通過PCR反應(yīng)擴增所述堿基位置的附近區(qū)域，得到片段約260bpP23945 MboI F5′-gaggatttatcaaaacaggatggacg-3′(SEQ ID NO43)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第20519-20544位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第31918-31943位堿基)P23945 MboI R5′-tgggcggcagcagtggaggataga-3′(SEQ ID NO44)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第20778-20755位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第32177-32154位堿基)用MboI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從IR24 DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有MboI識別位點(GATC)而能被MboI所切割，而從Asominori DNA擴增到的產(chǎn)物不具有MboI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用MboI處理后的DNA片段長度存在差異。
(4)PCR標記P41030 TaqI的確立將實施例2中所確定的IR24重疊區(qū)(SEQ ID NO27)相應(yīng)的基因組堿基序列與Asominori重疊區(qū)(SEQ ID NO28)相應(yīng)的基因組堿基序列進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO27的第45461位堿基是A，而相應(yīng)的SEQ ID NO28的第49164位堿基是G。
為了檢測該堿基的變化，首先利用下述引物通過PCR反應(yīng)擴增所述堿基位置的附近區(qū)域，得到片段約280bpP41030 TaqI F5′-aagaagggagggttatagaatctg-3′(SEQ ID NO45)
(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第45369-45392位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第49072-49095位堿基)P41030 TaqI R5′-atatcaggactaacaccactgctc-3′(SEQ ID NO46)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第45468-45625位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第49351-49328位堿基)用TaqI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從Asominori DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有TaqI識別位點(TCGA)而能被TaqI所切割，而從IR24 DNA擴增到的產(chǎn)物不具有TaqI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用TaqI消化后的DNA片段長度存在差異。
(5)PCR標記P45177 BstUI的建立將實施例2中所確定的IR24重疊區(qū)(SEQ ID NO27)相應(yīng)的基因組堿基序列與Asominori重疊區(qū)(SEQ ID NO28)相應(yīng)的基因組堿基序列進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO27的第49609位堿基是A，而相應(yīng)的SEQ ID NO28的第53311位堿基是G。
為了檢測該堿基的變化，首先利用下述引物通過PCR反應(yīng)擴增所述堿基位置的附近區(qū)域，得到片段約812bpP45177 BstUI F5′-acgagtagtagcgatcttccagcg-3′(SEQ ID NO47)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第49355-49378位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第53057-53080位堿基)P45177 BstUI R5′-cagcgtgaaactaaaaacggaggc-3′(SEQ ID NO48)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第50166-50143位堿基)(相應(yīng)于SEQ ID NO28的第53868-53845位堿基)用BstUI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從IR24 DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有2個BstUI識別位點(CGCG)而被BstUI切割成3個片段，而從Asominori DNA擴增到的產(chǎn)物具有3個BstUI識別位點而被切割成4個片段，這就導(dǎo)致了用BstUI消化后的DNA片段長度存在差異。
(6)PCR標記B60304 MspI的建立將實施例2中所確定的IR24重疊區(qū)(SEQ ID NO27)相應(yīng)的基因組堿基序列與上述的BAC克隆堿基序列(Accession No.AC068923)進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO27的第56368位堿基是T，而在AC068923中相應(yīng)位置的堿基是C。
為了檢測該堿基的變化，首先利用下述引物通過PCR反應(yīng)擴增所述堿基位置的附近區(qū)域，得到片段約330bpB60304 MspI F5′-atcccacatcatcataatccgacc-3′(SEQ ID NO49)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第56149-56172位堿基)B60304 MspI R5′-agcttctcccttggatacggtggcg-3′(SEQ ID NO50)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第56479-56455位堿基)用MspI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從Nipponbare DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有MspI識別位點(CCGG)而能被MspI所切割，而從IR24 DNA擴增到的產(chǎn)物不具有MspI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用MspI消化后的DNA片段長度存在差異。
該標記的建立適用于dCAPS方法(Michaels and Amasino 1998，Neff etal.，1998)。具體地說，通過利用上述的B60304 MspI R引物在SEQ ID NO27的第56460位用t取代g。結(jié)果，SEQ ID NO27的第56460-56463位的MspI識別序列CCGG變成了ccgt，而不能被MspI所切割。這樣，由于IR24的片段不具有MspI識別序列，而Nipponbare的DNA中與SEQ IDNO27的第56367-56370位堿基相應(yīng)的區(qū)域中具有一個MspI識別序列。
(7)PCR標記B59066 BsaJI的建立將實施例2中所確定的IR24重疊區(qū)(SEQ ID NO27)相應(yīng)的基因組堿基序列與上述的BAC克隆堿基序列(Accession No.AC068923)進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO27的第57629位堿基是C，而在AC068923中相應(yīng)位置的堿基是CC。
為了檢測該堿基的變化，首先利用下述引物通過PCR反應(yīng)擴增所述堿基位置的附近區(qū)域，得到片段約420bp
B59066 BsaJI F5′-atttgttggttagttgcggctgag-3′(SEQ ID NO51)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第57563-57586位堿基)B59066 BsaJI R5′-gcccaaactcaaaaggagagaacc-3′(SEQ ID NO52)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第57983-57960位堿基)用BsaJI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從Nipponbare DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有BsaJI識別位點(CCNNGG)而能被BsaJI所切割，而從IR24 DNA擴增到的產(chǎn)物不具有BsaJI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用BsaJI消化后的DNA片段長度存在差異。
(8)PCR標記B56691 XbaI的建立將實施例2中所確定的IR24重疊區(qū)(SEQ ID NO27)相應(yīng)的基因組堿基序列與上述的BAC克隆堿基序列(Accession No.AC068923)進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO27的第66267位堿基是G，而在AC068923中相應(yīng)位置的堿基是C。
為了檢測該堿基的變化，首先利用下述引物通過PCR反應(yīng)擴增所述堿基位置的附近區(qū)域，得到片段約670bpB56691 XbaI F5′-cctcaagtctcccctaaagccact-3′(SEQ ID NO53)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第66129-66152位堿基)B56691 XbaI R5′-gctctactgctgataaaccgtgag-3′(SEQ ID NO54)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第66799-66776位堿基)用XbaI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從Nipponbare DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有XbaI識別位點(TCTAGA)而能被XbaI所切割，而從IR24 DNA擴增到的產(chǎn)物不具有XbaI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用XbaI消化后的DNA片段長度存在差異。
(9)PCR標記B53627 BstZ17I的建立將實施例2中所確定的IR24重疊區(qū)(SEQ ID NO27)相應(yīng)的基因組堿基序列與上述的BAC克隆堿基序列(Accession No.AC068923)進行比較，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO27的第69331位堿基是T，而在AC068923中相應(yīng)位置的堿基是C。
為了檢測該堿基的變化，首先利用下述引物通過PCR反應(yīng)擴增所述堿基位置的附近區(qū)域，得到片段約620bpB53627 BstZ17I F5′-tggatggactatgtggggtcagtc-3′(SEQ ID NO55)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第68965-68988位堿基)B53627 BstZ17I R5′-agtggaagtggagagagtagggag-3′(SEQ ID NO56)(相應(yīng)于SEQ ID NO27的第69582-69559位堿基)用BstZ17I處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從IR24 DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有BstZ17I識別位點(TCTAGA)而能被BstZ17I所切割，而從Nipponbare DNA擴增到的產(chǎn)物不具有BstZ17I識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用BstZ17I消化后的DNA片段長度存在差異。
(10)PCR標記B40936 MseI的建立下述PCR標記(10)-(12)的建立需要分析相應(yīng)于SEQ ID NO27 3′末端第76363位堿基的進一步下游區(qū)(3′)的堿基序列。
下述引物對是按上述BAC克隆(Accession No.AC068923)的堿基序列來設(shè)計的。
5′-tacgacgccatttcactccattgc-3′(SEQ ID NO57)和5′-catttctctatgggcgttgctctg-3′(SEQ ID NO58)利用這對引物以MS-FR Koshihikari(在Rf-1位點的基因型Rf-1 Rf-1)和Koshihikari的總DNA為模板以常規(guī)方法進行PCR反應(yīng)。所得到的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳表明大小約1300bp，并用QIAEXII(QIAGEN)進行純化。用DNA測序儀377(ABI)對純化DNA的堿基序列進行測序，顯示出數(shù)個多態(tài)性位點。
通過對所述位置周圍進行PCR擴增可以檢測到其中一個多態(tài)性位點，所用引物B40936 MseI F
5′-acctgtaggtatggcaccttcaacac-3′(SEQ ID NO59)和B40936 MseI R5′-ccaaggaacgaagttcaaatgtatgg-3′(SEQ ID NO60)用MseI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動距離的差別來顯示，這是因為從MS-FRKoshihikari(Rf-1 Rf-1)的DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有MseI識別位點(TTAA)而能被MseI所切割，而從Koshihikari的DNA擴增到的產(chǎn)物不具有MseI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用MseI消化后的DNA片段長度存在差異。
該標記通過利用dCAPs方法得以確立。
(11)PCR標記B19839 MwoI的建立下述引物對是按上述BAC克隆(Accession No.AC068923)的堿基序列來設(shè)計的。
5′-tgatgtgtttgggcatccctttcg-3′(SEQ ID NO61)和5′-gagataggggacgacagacacgac-3′(SEQ ID NO62)利用這對引物以MS-FR Koshihikari(在Rf-1位點的基因型Rf-1 Rf-1)和Koshihikari總DNA為模板以常規(guī)方法進行PCR反應(yīng)。所得到的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳表明大小約1200bp，并用QIAEXII(QIAGEN)進行純化。用DNA測序儀377(ABI)對純化DNA的堿基序列進行測序，顯示出數(shù)個多態(tài)性位點。
通過對所述位置附近進行PCR擴增，可以檢測到其中一個多態(tài)性位點，所用引物B19839 MwoI F5′-tcctaggctgtttagaaactgcaca-3′(SEQ ID NO63)和B19839 MwoI R5′-caagttcaaacataactggcgttg-3′(SEQ ID NO64)用MwoI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從的KoshihikariDNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有MwoI識別位點(GCNNNNNNNGC)而能被MwoI所切割，而從MS-FR Koshihikari(Rf-1 Rf-1)的DNA擴增到的產(chǎn)物不具有MwoI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用MwoI消化后的DNA片段長度存在差異。
該標記通過dCAPS方法來創(chuàng)建。
(12)PCR標記B2387 BfaI的建立下述引物對是按上述BAC克隆(Accession No.AC068923)的堿基序列來設(shè)計的。
5′-cactgtcctgtaagtgtgctgtgc-3′(SEQ ID NO65)和5′-caagcgtgtgataaaatgtgacgc-3′(SEQ ID NO66)利用這對引物以MS-FR Koshihikari(在Rf-1位點的基因型Rf-1 Rf-1)和Koshihikari的總DNA為模板以常規(guī)方法進行PCR反應(yīng)。所得到的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳表明大小約1300bp，并用QIAEXII(QIAGEN)進行純化。用DNA測序儀377(ABI)對純化DNA的堿基序列進行測序，顯示出數(shù)個多態(tài)性位點。
通過對所述位置附近進行PCR擴增，可以檢測到其中一個多態(tài)性位點，所用引物B2387 BfaI F5′-tgcctactgccattactatgtgac-3′(SEQ ID NO67)和B2387 BfaI R5′-acatactaccgtaaatggtctctg-3′(SEQ ID NO68)用BfaI處理擴增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。這樣，所述變化通過在瓊脂糖凝膠電泳中泳動的差別來顯示，這是因為從的Koshihikari DNA擴增到的擴增產(chǎn)物中具有BfaI識別位點(CTAG)而能被BfaI所切割，而從MS-FR Koshihikari(Rf-1 Rf-1)的DNA擴增到的產(chǎn)物不具有BfaI識別位點而不能被切割，這就導(dǎo)致了用BfaI消化后的DNA片段長度存在差異。
(13)分離分析在實施例1中獲得了在Rf-1和S12564 Tsp509I位點之間的2個重組體(RS1和RS2)和在Rf-1和C1361 MwoI位點之間的8個重組體(RSC1到RSC8)，通過對上述(1)到(12)中創(chuàng)建的12個DNA標記位點的檢測來確定這些重組體的基因型。結(jié)果列于表4，其中顯示了在S12564 Tsp509I和C1361MwoI位點的每一個重組體的基因型。
表4在Rf-1位點附近的重組體中不同標記位點的基因型基因座 RS1 RS2 RC1 RC2 RC3 RC4 RC5 RC6 RC7 RC8S12564 Tsp509I JJHHHHHHHHP4497 MboI JJHHHHHHHHP9493 BslI HHHHHHHHHHP23945 MboI HHHHHHHHHHP41030 TaqI HHHHHHHHHHP45177 BstUIHHHHHHHHHHB60304 MspI HHHHHHHHHHB59066 BsaJIHHHHHHHHHHB56691 XbaI HHHHHHHJHHB53627 BslZ17I HHHHHHHJHHB40936 MseI HHHHHHHJHHB19839 MwoI HHHHHJHJHHB2387 BfaI HHHHHJHJHJC1361 MwoI HHJJJJJJJJJ純合Koshihikari型H雜合Koshihikari型/MS-FR Koshihikari型表4顯示所有重組體具有來自秈稻中在P9493 BslI和B59066 BsaJI之間的Rf-1染色體區(qū)。結(jié)果表明重組體花粉具有如圖3所示的染色體組織結(jié)構(gòu)，為可育性花粉，即Rf-1基因的功能在這些花粉中發(fā)揮著作用。這意味著可確定Rf-1基因功能存在的序列被包括在這些重組體花粉共同具有的秈稻區(qū)域中，即按最大可能性來估計它被包括在位點P4497 MboI和B56691 XbaI之間(約65kb)的區(qū)域內(nèi)。
然而，存在這種可能，即對于Rf-1基因遺傳功能的表達非常重要的是，Rf-1基因只是秈稻基因型的一部分，而不管其余區(qū)域是粳稻還是秈稻基因型，其遺傳功能可能沒有明顯變化。因此，還不能得出結(jié)論認為上述的共同秈稻區(qū)域(SEQ ID NO27的第1239-66267位堿基之間)完全包含了完整的Rf-1基因。然而，基于以下分析，可以確定至少SEQ ID NO27完全包含了完整的Rf-1基因1)基因通常的大小為數(shù)kb而很小超過10kb；2)本發(fā)明鑒定的IR24的基因組堿基序列(SEQ ID NO27)完全包含上述共同秈稻區(qū)域；3)SEQ ID NO27的5′端位于上述共同秈稻區(qū)域的上游1238bp處，且構(gòu)成另一個基因的一部分(S12564)；和4)SEQ ID NO27的3′端位于上述共同秈稻區(qū)域的下游10096bp處。
實施例4來自XSE1的9.7kb片段的互補分析
(材料和方法)用NotI對λ噬菌體克隆XSE1(圖1和圖5)進行完全消化，以瓊脂糖凝膠進行電泳。分離出的9.7kb片段(包括SEQ ID NO27的第1-9657位堿基)用QIAEXII(QIANGEN)進行純化。
另一方面，以pSB11(Komari et al.，如上)為基礎(chǔ)制備具有潮霉素抗性基因表達盒的中間載體pSB200。具體地說，胭脂堿合酶終止子(Tnos)首先與泛素啟動子和泛素內(nèi)含子(Pubi-ubiI)進行融合。在獲得的Pubi-ubiI-Tnos復(fù)合體中ubiI和Tnos之間插入潮霉素抗性基因(HGY(R))，而構(gòu)建成了Pubi-ubiI-HYG(R)-Tnos。再將其與pSB11的HindIII/EcoRI片段進行整合得到pKY205。帶有限制性內(nèi)切酶如NotI、NspV、EcoRV、KpnI、SacI、EcoRI識別位點的接頭序列插入到該pKY205中Pubi的上游HindIII位點，獲得含有潮霉素抗性基因表達盒的pSB200。
用NotI對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上純化回收載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段即來自XSE1的9.7kb和載體片段進行連接反應(yīng)。反應(yīng)后，用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于純凈水(用Millipore系統(tǒng)制備)，然后與E.coli DH5α細胞混合，進行電激。電激后的細胞與LB培養(yǎng)基一起在37℃下溫育1hr，涂布于含有壯觀霉素(spectinomycin)的LB平板上，并于37℃溫育16hr。從獲得的24個克隆中分離出質(zhì)粒。對質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶片段的長度模式及其邊界堿基序列進行分析，以選擇出轉(zhuǎn)化有預(yù)期重組質(zhì)粒的E.coli。
上述選擇出的E.coli用于與根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404/pSB1(Komari etal.，1996)和輔助(helper)E.coli HB101/pRK2013(Ditta et al.，1980)進行三親雜配。在含有壯觀霉素的AB平板上形成6個克隆，從其中分離出質(zhì)粒，并分析其限制性內(nèi)切酶片段的長度模式分析以選擇出預(yù)期的農(nóng)桿菌細胞。
根據(jù)Hiei等(1994)的方法，用上述選擇出的農(nóng)桿菌細胞轉(zhuǎn)化MSKoshihikari(具有BT細胞質(zhì)且在核心基因上與Koshihikari基本上是相同的)。用Koshihikari對MS Koshihikari進行授粉來獲得所需用于轉(zhuǎn)化的未成熟種子。
適應(yīng)性培養(yǎng)之后，將轉(zhuǎn)化植物轉(zhuǎn)移到長日照條件的溫室中。將生長到適合移植的48株個體移植到1/5000a Wagner罐中(4株/罐)，并轉(zhuǎn)移到短日照條件的溫室中繼續(xù)生長3-4周。抽穗后約1個月，對直立植株的種子進行育性檢測。
(結(jié)果和討論)所有48個轉(zhuǎn)化植株個體都是不育的。這表明9.7kb插入片段至少沒有包含全長的Rf-1基因。
實施例5對來自XSE7的14.7kb片段的互補分析(材料和方法)用EcoRI對λ噬菌體克隆XSE7(圖1和圖5)進行完全消化，用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用DNA鈍化試劑盒(TAKARA)進行鈍化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收14.7kb片段(SEQ ID NO27中第2618-17261位堿基)。
另一方面，用SacI對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA。回收的DNA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化，并用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，用DNA鈍化試劑盒(TAKARA)進行鈍化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段即來自XSE7的14.7kb和載體片段進行連接反應(yīng)。然后，根據(jù)實施例4中描述的方法制備轉(zhuǎn)化植物和進一步的研究。
(結(jié)果和討論)所有48個轉(zhuǎn)化植株個體都是不育的。這表明14.7kb插入片段至少沒有包含全長的Rf-1基因。
實施例6對來自XSF4的21.3kb片段的互補分析(材料和方法)用NotI對λ噬菌體克隆XSF4(圖1和圖5)進行部分消化，以瓊脂糖凝膠進行電泳。分離出的21.3kb片段(包括SEQ ID NO27的第12478-33750位堿基)用QIAEXII(QIANGEN)進行純化。
另一方面，用NotI對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收純化載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段即來自XSF4的21.3kb和載體片段進行連接反應(yīng)。然后，根據(jù)實施例4中描述的方法制備轉(zhuǎn)化植物和進一步的研究。
(結(jié)果和討論)所有48個轉(zhuǎn)化植株個體都是不育的。這表明21.3kb插入片段至少沒有包含全長的Rf-1基因。
實施例7對來自XSF20的13.2kb片段的互補分析(材料和方法)用SalI對λ噬菌體克隆XSF20(圖1和圖5)進行完全消化，回收的DNA溶于TE溶液中，然后用DNA鈍化試劑盒(TAKARA)進行鈍化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上分離13.2kb片段(包含SEQ ID NO27中第26809-40055位堿基)另一方面，用EcoRV對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收純化載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段即來自XSF20的13.2kb和載體片段進行連接反應(yīng)。然后，根據(jù)實施例4中描述的方法制備轉(zhuǎn)化植物和進一步的研究。
(結(jié)果和討論)所有44個轉(zhuǎn)化植株個體都是不育的。這表明13.2kb插入片段至少沒有包含全長的Rf-1基因。
實施例8對來自XSF18的16.2kb片段的互補分析(材料和方法)λ噬菌體克隆XSF18與λ噬菌體克隆XSF20在5′和3′端(分別是SEQ IDNO27中第20328和41921位堿基)是相同的，但缺乏內(nèi)部第33947-38591位堿基。因此，它包含了SEQ ID NO27中第20328-33946位堿基和第38592-41921位堿基。這是因為XSF18克隆最初被分離時，分離后在擴增期間就發(fā)現(xiàn)包含上述缺失，因此重新進行了擴增步驟而克隆到了完整克隆，稱為XSF20。
用NotI對λ噬菌體克隆XSF18(圖5)進行完全消化。在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收16.2kb片段(包含SEQ IDNO27中第38592-41921位堿基)另一方面，用NotI對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收純化載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段即來自XSF18的16.2kb和載體片段進行連接反應(yīng)。然后，根據(jù)實施例4中描述的方法制備轉(zhuǎn)化植物和進一步的研究。
(結(jié)果和討論)所有48個轉(zhuǎn)化植株個體都是不育的(圖6)。這表明16.2kb插入片段至少沒有包含全長的Rf-1基因。
實施例9對來自XSG22的12.6kb片段的互補分析(材料和方法)用NotI對λ噬菌體克隆XSG22(圖1和5)進行部分消化。在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收分離12.6kb片段(包含SEQ ID NO27中第31684-44109位堿基)另一方面，用NotI對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收純化載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段即來自XSG22的12.6kb和載體片段進行連接反應(yīng)。然后，根據(jù)實施例4中描述的方法制備轉(zhuǎn)化植物和進一步的研究。
(結(jié)果和討論)所有48個轉(zhuǎn)化植株個體都是不育的。這表明12.6kb插入片段至少沒有包含全長的Rf-1基因。
實施例10(1)對來自XSG16的15.7kb片段的互補分析
(材料和方法)用NotI對λ噬菌體克隆XSG16(圖1和5)進行部分消化。在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收純化15.7kb片段(包含SEQ ID NO27中第38538-54123位堿基)。
另一方面，用NotI對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收純化載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段即來自XSG16的15.7kb和載體片段進行連接反應(yīng)。然后，根據(jù)實施例4中描述的方法制備轉(zhuǎn)化植物和進一步的研究。
(結(jié)果和討論)在47個轉(zhuǎn)化植株個體中，至少有37株個體明顯的恢復(fù)了育性(圖6)。這表明在來自水稻(IR24)的15586個堿基(包含SEQ ID NO27中第38538-54123位堿基)的15.7kb插入片段包括了全長的Rf-1基因。
(2)對來自XSG16的內(nèi)部序列11.4kb片段的互補分析(材料和方法)用AlwNI和BsiWI對λ噬菌體克隆XSG16(圖1和5)進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用DNA鈍化試劑劑盒(TAKARA)進行鈍化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳分離11.4kb片段，用QIAEXII(QIAGEN)進行純化。
用SmaI對質(zhì)粒載體pSB11(Komari et al.Plant Journal，1996)進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收純化載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段進行連接反應(yīng)?；厥盏腄NA溶于純凈水(用Millipore系統(tǒng)制備)，然后與E.coliDH5α細胞混合，將混合物進行電激。之后，溶液在LB培養(yǎng)基一起在37℃下振蕩培養(yǎng)1hr，涂布于含有壯觀霉素的LB平板上，并于37℃溫育16hr。從獲得的克隆14個中分離質(zhì)粒。對質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶片段的長度模式及其邊界堿基序列進行分析，以選擇出預(yù)期E.coli。
上述選擇出的E.coli與根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404/pSB4U(Takakura et al.，日本專利申請No.2001-269982(WO02/019803))和輔助E.coliHB101/pRK2013(Ditta et al.，1980)進行三親雜配。在含有壯觀霉素的AB平板上形成克隆中的12個，從中分離出質(zhì)粒，并分析其限制性內(nèi)切酶片段的長度模式以選擇出預(yù)期的農(nóng)桿菌細胞。
根據(jù)Hiei等(1994)的方法，用上述選擇出的農(nóng)桿菌細胞轉(zhuǎn)化MSKoshihikari(具有BT細胞質(zhì)且在核心(nucleus)基因上與Koshihikari基本上是相同的)。用Koshihikari對MS Koshihikari進行授粉來獲得所需用于轉(zhuǎn)化的未成熟種子。
適應(yīng)性培養(yǎng)之后，將轉(zhuǎn)化植物轉(zhuǎn)移到長日照條件的溫室中。將生長到適合移植的120株個體移植到1/5000a Wagner罐中(4株/罐)，并轉(zhuǎn)移到短日照條件的溫室中繼續(xù)生長約1月。抽穗后約1個月，從每一植株中取一典型穗作為樣品用于評價種子育性(可育的谷粒數(shù)在總谷粒數(shù)中所占的百分比)。
(結(jié)果和討論)在120個轉(zhuǎn)化植株個體中，有59株個體顯示了10％或更高的種子育性，其中有19株個體顯示了70％或更高的種子育性。這表明11.4kb插入片段(包含SEQ ID NO27中第42357-53743位堿基)包含了表達育性恢復(fù)功能所必需的Rf-1基因。
(3)對來自XSG16的內(nèi)部序列6.8kb片段的互補分析(材料和方法)用HpaI和AlwNI對λ噬菌體克隆XSG16進行完全消化。用QIAEXII(QIAGEN)純化分離的6.8kb片段。
后面的步驟包括質(zhì)粒載體pSB11的制備按在上述第(2)中所描述的方法進行。
(結(jié)果和討論)在120個轉(zhuǎn)化植株個體中，有67株個體顯示了10％或更高的種子育性，其中有26株個體顯示了70％或更高的種子育性。這表明在6.8kb插入片段(包含SEQ ID NO27中第42132-48883位堿基)包含了表達育性恢復(fù)功能所必需的Rf-1基因。
實施例11對來自XSG8的16.9kb片段的互補分析(材料和方法)
用NotI對λ噬菌體克隆XSG8(圖1和5)進行完全消化。在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收16.9kb片段(包含SEQ IDNO27中第46558-63364位堿基)另一方面，用NotI對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA?；厥盏腄NA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收純化載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段即來自XSG8的16.9kb和載體片段進行連接反應(yīng)。然后，根據(jù)實施例4中描述的方法制備轉(zhuǎn)化植物和進一步的研究。
(結(jié)果和討論)所有48個轉(zhuǎn)化植株個體都是不育的(圖6)。這表明16.9kb插入片段至少沒有包含全長的Rf-1基因。
實施例12對來自XSH18的20.0kb片段的互補分析(材料和方法)用NotI對λ噬菌體克隆XSH18(圖1和5)進行部分消化。在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收20.0kb片段(包含SEQ IDNO27中第56409-76363位堿基)另一方面，用NotI對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA。回收的DNA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收純化載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的兩個片段即來自XSH18的20.0kb和載體片段進行連接反應(yīng)。然后，根據(jù)實施例4中描述的方法制備轉(zhuǎn)化植物，并進行研究。
(結(jié)果和討論)所有44個轉(zhuǎn)化植株個體都是不育的(圖6)。這表明20.0kb插入片段至少沒有包含全長的Rf-1基因。
實施例13對來自XSG8和XSH18重疊區(qū)的19.7kb片段的互補分析(材料和方法)在實施例11中通過連接獲得的質(zhì)粒(XSG8SB200F)，可從預(yù)期E.coli中分離該質(zhì)粒，用SalI和StuI進行完全消化。在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收12.8kb片段(包含SEQ ID NO27中第50430-63197位堿基)另一方面，在實施例12中通過連接獲得的質(zhì)粒(XSH18SB200R)，可從預(yù)期的E.coli中分離該質(zhì)粒，用SalI、StuI和XhoI進行完全消化。在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠中分離6.9kb片段(包含SEQID NO27中第63194-70116位堿基)。
進一步，用EcoRV對質(zhì)粒載體pSB200進行完全消化，再用乙醇沉淀法回收DNA。回收的DNA溶于TE溶液中，然后用CIAP(TAKARA)進行去磷酸化。反應(yīng)后的溶液在瓊脂糖凝膠上進行電泳，再用QIAEXII(QIAGEN)從凝膠上回收載體片段。
用DNA Ligation試劑盒Ver.1(TAKARA)對上述所獲得的三個片段即來自XSG8的12.8kb、來自XSH18的6.9kb和載體片段進行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物包含19.7kb片段，其來自XSG8和XSH18的重疊區(qū)(包含SEQ ID NO27中第50430-70116位堿基)(圖5中的XSX1)。然后，根據(jù)實施例4中描述的方法制備轉(zhuǎn)化植株個體和進一步的研究。
(結(jié)果和討論)所有40個轉(zhuǎn)化植株個體都是不育的(圖6)。這表明19.7kb插入片段至少沒有包含全長的Rf-1基因。
序列表<110>日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社(JAPAN TOBACCO INC.)欣根塔有限公司(Syngenta Limited)<120>一種利用水稻BT-雄性不育細胞質(zhì)的育性恢復(fù)基因來賦予或控制育性的方法及鑒定育性恢復(fù)基因存在的方法<130>YCT739<150>JP 2001-285247<151>2001-09-19<150>JP 2001-309135<151>2001-10-04<150>JP 2002-185709<151>2002-06-26<160>68<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增R1877 EcoRI標記序列的寡核苷酸引物<400>1cattcctgct tccatggaaa cgtc24<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于擴增R1877 EcoRI標記序列的寡核苷酸引物<400>2ctctttctgt atacttgagc tttgacatct gac 33<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增G4003 HindIII標記序列的寡核苷酸引物<400>3gatcgacgag tacctgaacg 20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增G4003 HindIII標記序列的寡核苷酸引物<400>4aatagttgga ttgtcctcaa aggg 24<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增C1361 MwoI標記序列的寡核苷酸引物
<400>5aaagcaaccg acttcagtgg catcacc 27<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增C1361 MwoI標記序列的寡核苷酸引物<400>6ctggacttca tttccctgca gagc 24<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增G2155 MwoI標記序列的寡核苷酸引物<400>7gaccaccaat taactgatta agctggc 27<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增G2155 MwoI標記序列的寡核苷酸引物<400>8
tttctggctc caataatcag ctgtagc 27<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增G291 MspI標記序列的寡核苷酸引物<400>9ctgctgcagc aagctgcacc gaaccgg 27<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增G291 MspI標記序列的寡核苷酸引物<400>10acattttttc ttccgaaact tccg 24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增R2303 BslI標記序列的寡核苷酸引物<400>11
atggaaagat acactagaat gagc 24<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增R2303 BslI標記序列的寡核苷酸引物<400>12atcttatata gtggcaggaa agcc 24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增S10019 BstUI標記序列的寡核苷酸引物<400>13aacaatctta tcctgcacag actg 24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增S10019 BstUI標記序列的寡核苷酸引物<400>14gtcacataga agcagatggg ttcc 24
<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增S10602 KpnI標記序列的寡核苷酸引物<400>15agctgttgag agttctatgc cacc 24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增S10602 KpnI標記序列的寡核苷酸引物<400>16tagccatgca acaagatgtc atac 24<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增S12564 Tsp509I標記序列的寡核苷酸引物<400>17ctagttagac cgaataactg aggttc 26<210>18<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增S12564 Tsp509I標記序列的寡核苷酸引物<400>18tttgtgggtt tgtggcattg agaaaat 27<210>19<211>2240<212>DNA<213>稻(Oryza sativa L.)<223>PCR標記物G4003 HindIII<400>19gcggccgctc cgggaagtcg agcgagtaga cgcccctgac gccgtacgcg tcggcgagcc 60gcagcggcgt ctctggcggt gtgaaggaca gcccgttcag cgtcgcgcgg cgccgcccgt 120tgatcgtcac cggcgccgtg ctccgcagca ggtacgcctg cgtcacgttg atcgacgagt 180acctgaacga tccctgtggg ttcggcctcg ccgctccggc actcaggttc cacctgccca 240atgcaaaaaa ccaaaaccca aaagcttaat gcgaataata catcattcca cgtatttaaa 300aaaataattt ataggtaaaa tttttataat gtattttagc gacgtaaatg tcaatgctga 360gaaataaacg ataatacttt aaatgaagtt ctaaaattta aattttggca tcggttgatg 420ttggataaag aaaacgatgg aggctagtaa tttttcttct tttttaagta tctagattgt 480catatattga atttttcagt ttttcatccc tttgaggaca atccaactat tattttcctt 540ttcttatgta aaaggttgaa caacatattc aaacataaaa aaataaaatt aaatgaaata 600aatttacaat tcataaaatt tacagaattt atgttaagaa aatattcaaa cttagataat 660aataaagcaa caaaatcgta ctaaaaagaa gtataattgt acattgtata ctactactcc 720tacaatttta gacttagaat ttttaatttc ctgaaatcta gtaatgccat ttttttcttt 780ctagttgaac cagacagtaa gtttaactcg aaacttataa gctaatgagc gaagtcgggc 840aattcactcg tacctgacgg agcgagcttg gttcatggag aaggacttgt cgaactggtc 900ctggggaggg tcggggagcg ggccggaggc ccgcccccgg gagttggagt agcggaggac 960
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tcttgctgag atccaagttg cggtaacttt gcccttttct ttttttcttc tcttctgaat 60tttttcatgg tttttgggag agattttcgt aacttgatta cagttctagg aaaaggccac 120cttgttcaaa cagggctttc ttgaaaggga tcaatttgct aggagtacat gattctaaaa 180gcgatttcga aataaaacac agttctcgat ctcatacctg aaaacaaaag gcccatactg 240tgtaaactgt gattatgctt ctgttaaatg ggatatttgt acaaaattga cgccaaccac 300ctataaacag attgtgagct tttatcttag taaaataaaa tgtgacattc tactcagtgt 360tcagtgatcc gatgtcgtct cttctgcgta caacttctaa cagccgtttt cggtagtaca 420aactagcgaa acaccaaaaa cgcagcattt gagttctgga atacgctgaa attgttagaa 480tcaaccacga aaccaaaatc attgttcaga aacgttgcaa cgagataaaa cacaagaact 540tgttttaaca aagcatacgg acagtacata tacggttaca acacccagtc tttatacagt 600tctgctggag ttccatctac tggctgtcat tgtatctcag gacagacagg ttaacatagg 660tacaacacaa ttacaggcta aaccgaagcg aactacactg tcagcatctc taacagtatc 720gtcaagcaag cttatttaca gctgctctag taaatttaca acgtccctgg cagaatccct 780ctcgtttctg gcagcgacga ggcacggtcc atggccttag caggacatct cacccgtcag 840ctgcatagaa agcaaccgac ttcagtggaa tcacctcctg ctcctgcaaa aaagttggtt 900cgatcaatca cgcgtttaat ccaaaacaaa atgggtatta attatgctag cctatgaagc 960tacctcagag ttctctattt gctctgcagg gaaatgaagt ccagtggaac agttctcaag 1020cacctcaggg ctcttcatcc atgctttgtg tgcttcaatg gctttcagct tatagcgaaa 1080catctgcgat acggatctaa aattaaggat gtcgacaatt acttaacaca acaaataatt 1140gaagcaggtc cagttaaaga aaagtagcag cgaagaatag cactctgaag tctgaacctc 1200agataaagaa atggttggtt tttccagttc atctccctca acatggattc cagtaccctg 1260gcattctggg caaaggatgg atgttatttt cttaggtgca ttttttgcct ttcttcctcg 1320attgcttttt cccttgcttg caattttgtc tgctagcatc tcatattggc ataaaatagt 1380ccagtgcaca aggcaagaag tgtgaaacaa atgaaatgcc tgcaaaatta gccgtacaaa 1440gtcattggag gttgcagcag aatactacaa atttttaaag aagaaactat acactgtcta 1500tgttttgctt gaaatgaatt caaccacttt gcattatacg gtttggaatc cctggtttgt 1560gagaactgta attccattac aacagtgaag aagttaccat aactaatgaa tggaaattag 1620tcaaatgcct aattttttag gtttgcttta atttatttat ctgtgagaaa tgctaagcat 1680gtcatgcgtt gctatcttca agaaatacta agaaactgca aaggcaaaga atgtttgaaa 1740
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<211>1059<212>DNA<213>稻(Oryza sativa L.)<223>PCR標記物Tsp509I<400>26gcgagatcat gaacttgatt ttctggttgc catattgggc ttgcttgtta accttgtaga 60gaaggatagc cttaataggt aagtccctca catgcttcct tccatttgct caattcatat 120cagtgttact gttctggcag ttccttgggg tcaggactca gaaacatcca attaatgttc 180atgttctctt aacgactcag aaatacttta taacctctcc acagggtacg gctttcatct 240gcccgtgttc ctgttgatct atctcagaat ccacagagtg aagagacaca gagagatgtc 300atagcactcc tctgttctgt attcttagca agtcaaggtg ctagtgaagc ttctggaact 360atatcaccgg taattcaaaa ttcttcaagt tccttttgta tgtagattat atctttgtaa 420aactcggcat ttattacctg ctctttgttt caaaaagcag tattttattt tgctccttag 480cataggtcag cagaacagtt gatcttattc agaaaacaat attttgcatg taacatactg 540ttatctatga gatgaaaatt aatgcatgtg taataatgtc aatgataaat atttgctatc 600tgaatccagt ctaccaactc tagttagacc gaattactga ggttctattt caaagaataa 660tttagtgcac catttgttca actactatga agtaaaatgg tattcccttc tattgacatc 720gggttagaag tgaaaggcca tcttaatgcg atgttctcaa tgccacaaac ccacaaattt 780cattaacaca tacagattat tattaacata gctataaatt ggatttccag aagcttgagt 840tgaatttatt ttgttacaat tgaaagcact gggaacatta gcattttttt ttagttcttg 900gttattgcaa tttataatgt tatacagaac tgtgtacctc acaatgcatt cattatgaca 960ttctatgaac catttgattg actgttgctt gtaaacaaca ggatgatgag gagtctttga 1020tgcaaggagc acgggaagct gaaatgatga tcgtagagg 1059<210>27<211>76363<212>DNA<213>稻(Orza sativa)IR24<400>27
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<212>DNA<213>稻(Orza sativa)Asominori<400>28gatcagtgag tgagagtgat gtgctattga ttttcgtcta ggattttgct gtgctcttct 60tcttcttctc ctctctacca agaaagatcg atggaggaga atttgtagga cgcgtttctc 120acgaattact tagctgttaa tgatcagctt gatgtgtacg atatgatggt gcagagtgaa 180agttgtgttg ttcactggtg gatcatggga tgggaatatg ggattgttgt aagatgtaac 240tcaagtgttt tcttttttgg gattactttt ggtaataaga gcttgggtga tcgaaaacta 300cagatggttt ttcttttaag ttgtatgatc tctgtagagt ttttgagtaa tttgtagttt 360tgtaccctat caaagatcat ctctagctgc ctctgagctc tccaactcta tatgtccatc 420tctagtatat atgtcccata tttctgactg aaaattttca agtcggttgg ttccctccgc 480ctggatattc tttcagctaa ttagattttt tttaaatgat aaatttgcta aaagcttgtt 540caaattcagc taagatctat tcaaacttca atttctctat cgaaattccc ggaaatttca 600attcaatcat tccccaatac atgccgattt ccgtaatatt gaaccatgac atgtaaacaa 660cgaaggaatc aagggcatat ttagtttcat ctcacatcga atatacggac acacatttga 720agtattaaat gcactctaat aacaaaacaa attacagatt ccgccagaaa actacgagac 780gaatctatta agcctaatta atacatcatt agcaaatgtt tactatagca ccacattgtc 840aactcatgac gcaattaggc ttaaaagatt cgtctcgcag tttcctgacg aaccgtgtaa 900ttattatttt ttctacgttt aatactttat gtatgtgccc aaatattcaa tgtgacaacg 960tgaaaatttt tatttggaac taaataggcc ctaatattct ttcaagatat tagaatagtt 1020atccctctcc acctccctgc acaaacagtg aacttctttc tccttgggca caggagtagt 1080agcagctccc ggaaacagaa agcaatcaag caaagtcctg aacctgaagc atcctgaaac 1140cagcagacgg cagaaaccag tgggcgcagg cgatagcagt ttttcgtggt ccggcgtaca 1200gccaaaatac tggccatcgg gtgcctacat agaatgagtc cactggacgc agctaccacc 1260gtgtgtgcta cactgaccgc cgctgctcgt cgaccagttg tacggggctg acttattctg 1320aatttctaat ggtttatttg ggggtttaga acactgaggg gtgctttaga tccaaagatg 1380tgaagtttgg gcgtgtcaca tcgggtatta tatatagtgt cgcacagggt gtttgggcac 1440taataaaaat actaattatt gatcctatac gataagctat ataatactcg atgtgacacg 1500ccaaaacttt acatccctga atctaaacac ccttttaaat agagtatttg gtgtgaaata 1560
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gtttcattaa atttcatcta tgtgtactgt ttaggtgttg aatagtttga cttgtttttt 50340aactgaacaa aagatatgtc tgaagctttg ttctttacca aatgcagtac tgatcatcac 50400aatatatttt ttatggaaca agattggatt gtatagaatg gtttccgatc tgattatctt 50460atctcaacgt attattatgc acatgtacta atcatgaaat atctgatgga atgatgtttc 50520tatttacctg tgtgaggcag caaggagtga gatggataac accacatact ccctctatcc 50580cagaatataa gaagttttag agttggacac gattattaag aaagtaggta gaagtgagta 50640gtggagggtt gtgattgcat gagtagtgga ggtaggtggg aaaagtgaat ggtggagggt 50700tgtgattggt tgggaagaga atgttggtag agaagttgtt atattttggg gagtacatta 50760ttattctaga acaatactgt tgtgctcaag aagcgttcca aagatgtttc acaacctgtg 50820ctcgatgggt tttgagctta atcctgggac attcagtatc atgatctgtc tcattcttaa 50880acatggaata aaggatgaca gcatgatttc tttgtctcta taatcttttg gctacccaca 50940gataatagct gtaaatctat actactttaa aaggagtagt ggtggtggtg agtggtgaat 51000ctgccaccac cccaccacca actctcaaaa ttctgacatg tgggatcact gtcaatccct 51060tctccaagac atgtgggatc actgtcaatc ccttctccaa accaattgta tgatagaaca 51120gtggaaatca cggacagacc atggagctct caaccataat catccttgcg agttaataac 51180aaatggagcg taaacttggc aagcaaaaaa ctcaaattaa ttctaaaatt aagctctagg 51240attcaaaata gatttcctct ctgcattgtg ctgttatgat ttttaattcc gtaacaacgc 51300aaatgcattt tgctagtctt ataaagaagg gttaatgcaa atattctgat taaatgattg 51360tatctatgaa gtttgaatgc tagtggaagc tcctttgacc atgttttgtt gtgcgagcat 51420ttaagagagt gaagagaatg cttctttggt gctgttctgg tatggaagga tccacagata 51480aaattcaggt tctactgctt ctctgcttgt aattttcatg aagctgcagt gaataccttg 51540ttgaccactt gatctgttgc tttgaaggag aatatagtag tggccaaggt tggtgacggt 51600gatggtggca tgtgatcccc cagatcttca gtgacccaga gaggagggga cggcgcgtgg 51660tgagctacaa ggcatactca gtggagggca agatcaaggc ctcccgtccg taggggactc 51720cgctgcatca aggccaactg ctccgaactg atcaatttct ggtacggatc acttctcctt 51780tccttttttt tttcacctta agcactctct tgattcttcg ctgctacctc ccttaatttc 51840tttcaatata ttgtggcact tgatcatggc ggagacccac cttccagtgt gaatggattt 51900tgtcaaagaa ctaaatttat tccattagct tattttctga ttacatggaa gacattcttt 51960tctggaataa atacagaact aaatcctgtt tcctgaataa aagttgttag tgtgtggcat 52020
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<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>29atcaggagcc ttcaaattgg gaac 24<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>30ctcgcaaatt gcttaatttt gacc 24<210>31<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>31
tgaaggagtt atgggtgcgt gacg 24<210>32<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>32ttgccgagca cacttgccat gtgc 24<210>33<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>33gcgacgcaat ggacatagtg ctcc 24<210>34<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>34ttacctgcca agcaatatcc atcg 24
<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>35aaggcatact cagtggaggg caag 24<210>36<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>36ttaacctgac cgcaagcacc tgtc 24<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>37tggatggact atgtggggtc agtc 24<210>38<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>38agtggaagtg gagagagtag ggag 24<210>39<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>39ccctccaaca cataaatggt tgag 24<210>40<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>40tttctgccag gaaactgtta gatg 24<210>41<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>41gcgatcttat acgcatacta tgcg24<210>42<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>42aaagtctttg ttccttcacc aagg24<210>43<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>43gaggatt tat caaaacagga tggacg 26<210>44<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物
<400>44tgggcggcag cagtggagga taga 24<210>45<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>45aagaagggag ggttatagaa tctg 24<210>46<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>46atatcaggac taacaccact gctc 24<210>47<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>47acgagtagta gcgatcttcc agcg 24
<210>48<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>48cagcgtgaaa ctaaaaacgg aggc 24<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>49atcccacatc atcataatcc gacc 24<210>50<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>50agcttctccc ttggatacgg tggcg 25<210>51
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>51atttgttggt tagttgcggc tgag 24<210>52<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>52gcccaaactc aaaaggagag aacc 24<210>53<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>53cctcaagtct cccctaaagc cact 24<210>54<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>54gctctactgc tgataaaccg tgag 24<210>55<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>55tggatggact atgtggggtc agtc 24<210>56<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>56agtggaagtg gagagagtag ggag 24<210>57<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>57tacgacgcca tttcactcca ttgc 24<210>58<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>58catttctcta tgggcgttgc tctg 24<210>59<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>59acctgtaggt atggcacctt caacac 26<210>60<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>60
ccaaggaacg aagttcaaat gtatgg 26<210>61<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>61tgatgtgttt gggcatccct ttcg24<210>62<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>62gagatagggg acgacagaca cgac24<210>63<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>63tcctatggct gtttagaaac tgcaca 26
<210>64<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>64caagttcaaa cataactggc gttg 24<210>65<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>65cactgtcctg taagtgtgct gtgc 24<210>66<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>66caagcgtgtg ataaaatgtg acgc 24<210>67<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>67tgcctactgc cattactatg tgac 24<210>68<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增的寡核苷酸引物<400>68acatactacc gtaaatggtc tctg 2權(quán)利要求
1.一種恢復(fù)水稻育性的方法，包括將核酸導(dǎo)入到水稻中，其中所述核酸具有恢復(fù)育性的功能，并具有SEQ ID NO.27所示堿基序列或具有與SEQ IDNO.27所示堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。
2.一種恢復(fù)水稻育性的方法，包括將核酸導(dǎo)入到水稻中，其中所述核酸具有恢復(fù)育性的功能，并具有SEQ ID NO.27的第38538至54123位的堿基序列或具有與SEQ ID NO.27的第38538至54123位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。
3.一種恢復(fù)水稻育性的方法，包括將核酸導(dǎo)入到水稻中，其中所述核酸具有恢復(fù)育性的功能，并具有SEQ ID NO.27的第42132-48883位的堿基序列或具有與SEQ ID NO.27的第42132-48883位堿基序列有至少70％的同一性的堿基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意之一項的方法，其中所述核酸具有與SEQ IDNO.27或與SEQ ID NO.27的第38538至54123位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列，并滿足以下1)和2)中至少一個條件1)與SEQ ID NO.27的第45461位堿基相應(yīng)的堿基是A；和2)與SEQ ID NO.27的第49609位堿基相應(yīng)的堿基是A。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項的方法，其中將包含水稻恢復(fù)基因基因座的核酸導(dǎo)入到水稻中，且除水稻恢復(fù)基因之外不包含任何結(jié)構(gòu)基因。
6.一種鑒定被測個體或其種子是否具有水稻恢復(fù)基因(Rf-1基因)的方法，其中利用了可確定Rf-1基因功能存在的序列，該序列位于水稻第10號染色體上的多態(tài)性檢測標記位點P4497 MboI和B56691 XbaI之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中Rf-1基因存在于具有SEQ ID NO.27堿基序列的核酸，或具有與SEQ ID NO.27的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列的核酸中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中Rf-1基因存在于具有SEQ ID NO.27第38538至54123位堿基序列的核酸，或具有與SEQ ID NO.27第38538至54123位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列的核酸中。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中Rf-1基因存在于具有SEQ ID NO.27第42132至48883位堿基序列的核酸，或具有與SEQ ID NO.27第42132至48883位的堿基序列有至少70％同一性堿基序列的核酸中。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項的方法，其中在所述核酸具有與SEQ IDNO.27或與SEQ ID NO.27的第38538至54123位堿基序列有至少70％同一性的堿基序列，并滿足以下1)和2)中至少一個條件時，可確定被測水稻個體或其種子具有Rf-1基因1)與SEQ ID NO.27的第45461位堿基相應(yīng)的堿基是A；和2)與SEQ ID NO.27的第49609位堿基相應(yīng)的堿基是A。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項的方法，其中包括i)根據(jù)包括了下述任何一個堿基鄰近區(qū)域的堿基序列制備引物對1)與第45461位堿基相應(yīng)的堿基；或2)與第49609位堿基相應(yīng)的堿基；以擴增上述的堿基及其附近的區(qū)域；ii)用被測水稻個體或其種子的基因組DNA作為模板進行核酸擴增反應(yīng)；和iii)根據(jù)所述的核酸擴增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性來確定被測水稻個體或其種子中是否存在Rf-1。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中當步驟iii)滿足下面的1)和2)中至少一個條件時，可確定被測水稻個體或其種子中存在Rf-1基因1)包含與SEQ ID NO.27的第45461位相應(yīng)堿基的區(qū)域不存在任何TaqI識別序列；和2)包含與SEQ ID NO.27的第49609位相應(yīng)堿基的區(qū)域不存在任何BstU識別序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中利用的引物對具有選自SEQ IDNO45和46，及SEQ ID NO47和48的堿基序列。
14.一種抑制Rf-1基因的功能以恢復(fù)育性的方法，通過導(dǎo)入長度至少100個連續(xù)堿基的反義序列，其具有的堿基序列互補于具有SEQ ID NO.27或與SEQ ID NO.27的堿基序列有至少70％同一性堿基序列的核酸，并且有恢復(fù)育性的功能。
15.一種抑制Rf-1基因的功能以恢復(fù)育性的方法，通過導(dǎo)入長度至少100個連續(xù)堿基的反義序列，且其序列選自互補于具有SEQ ID NO.27第38538-54123位或與SEQ ID NO.27第38538-54123位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列的核酸來達到的，其具有恢復(fù)育性的功能。
16.一種核酸，具有恢復(fù)育性功能，并具有SEQ ID NO.27或與SEQ IDNO.27的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。
17.一種核酸，具有恢復(fù)育性功能，并具有SEQ ID NO.27第38538-54123位或與SEQ ID NO.27第38538-54123位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。
18.一種核酸，具有恢復(fù)育性功能，并具有SEQ ID NO.27第42132-48883位的堿基序列或者具有與SEQ ID NO.27第42132-48883位的堿基序列有至少70％同一性的堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用BT型雄性不育細胞質(zhì)來使水稻具備育性或控制其育性的方法，以及鑒定恢復(fù)基因是否存在的方法。本發(fā)明利用了具有SEQ IDNO.27所示堿基序列的核酸或與SEQ ID NO.27所示堿基序列有至少70％同一性的核酸，其具有恢復(fù)育性的功能?；蛘?，可以利用具有SEQ ID NO.27的第38538至54123位堿基序列的核酸，或與SEQ ID NO.27的第38538至54123位堿基序列有至少70％同一性的核酸，它們也具有恢復(fù)育性的功能。
文檔編號C07K14/415GK1589325SQ02823020
公開日2005年3月2日 申請日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月19日
發(fā)明者小森俊之, 太田象三, 村井宣彥, 樋江井佑弘 申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社, 欣根塔有限公司