專利名稱：稻瘟病菌單克隆抗體及檢測(cè)包被和在抗原表面的定位方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種稻瘟病菌單克隆抗體及檢測(cè)包被和在抗原表面的定位方法。
背景技術(shù)：
稻瘟病是水稻的毀滅性病害，世界上幾乎栽培水稻的地區(qū)都有此病發(fā)生。稻瘟病菌以菌絲體和分生孢子在病稻草和病谷上越冬，病稻草和病谷是翌年病害初次侵染的主要來(lái)源。附著胞形成是病菌成功侵入寄主完成整個(gè)侵染循環(huán)的關(guān)鍵步驟之一。因此，開(kāi)展稻瘟病菌附著胞形成機(jī)理的研究成為必要。世界上還沒(méi)有利用單抗來(lái)分析稻瘟病菌抗原結(jié)構(gòu)及其對(duì)菌附著胞形成的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種稻瘟病菌單克隆抗體及檢測(cè)包被和在抗原表面的定位方法。
4株抗稻瘟病菌的單克隆抗體是4A1、2B4、2H4、1D1，能與稻瘟病病菌有特異性免疫反應(yīng)。
抗稻瘟病菌單克隆抗體的ELISA檢測(cè)包被方法是，用滅菌的Millipore水懸浮分生孢子，3-6×105個(gè)/mL稻瘟病菌分生孢子懸液50ul/孔于96孔的ELISA板中，20℃培養(yǎng)24h，使孢子發(fā)芽形成附著胞，并緊密粘附在小孔底壁，再用0.5-1％的戊二醛固定0.5h。
抗稻瘟病菌單克隆抗體的在抗原表面的定位方法的步驟如下1)pH7.2 0.02mol/L PBS配制稻瘟病菌分生孢子懸液，取100uL于無(wú)菌干凈的載玻片上，20℃培養(yǎng)24h，使孢子發(fā)芽形成附著胞，并緊密粘附在載玻片上；2)用上述PBS洗一次，5min，以正常的小鼠血清作為陰性對(duì)照；以稻瘟病菌多克隆小鼠抗體為陽(yáng)性對(duì)照；以1∶100-200倍稀釋單抗作為待測(cè)樣品；上述各樣品在載玻片上加300-1000uL，重復(fù)3片，室溫下1-2h；3)PBS洗三次，每次5min，加入稀釋度為1∶40-100的FITC接合的經(jīng)親和層析提純的羊抗鼠IgG300-1000uL，室溫下處理1-2h；4)PBS洗三次，每次5min。9份甘油加1份PBS的滴加緩沖甘油，用蓋玻片封液，并在激發(fā)波長(zhǎng)為450-490的熒光顯微鏡下觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
為了試圖制備稻瘟病菌表面抗原的單克隆抗體來(lái)探討單克隆抗體對(duì)附著胞形成機(jī)理的作用和對(duì)抗原結(jié)構(gòu)的分析，并進(jìn)一步把單克隆抗體作為探針來(lái)篩選分生孢子cDNA表達(dá)文庫(kù)，以獲得與附著胞形成相關(guān)基因。因此，我們用完整的發(fā)芽孢子免疫BALB/C小白鼠，并用完整的發(fā)芽孢子抗原篩選陽(yáng)性孔。這一點(diǎn)對(duì)我們獲得稻瘟病菌表面抗原的單克隆抗體至關(guān)重要，但也大大地增加了間接ELISA篩選陽(yáng)性孔時(shí)包被的難度。我們?cè)诒狙芯窟^(guò)程中摸索出本論文中的包被方法，效果良好。并且在ELISA過(guò)程中，可隨時(shí)在倒置顯微鏡上檢查孔中的抗原數(shù)量。這一方法也是由于稻瘟病菌孢子能形成緊密粘附于基膜的芽管和附著胞這一特性所決定。應(yīng)用本文中的包被方法在洗滌和加樣過(guò)程中要做到盡量溫和，切忌拍打ELISA反應(yīng)扳，用吸水紙吸干即可。同時(shí)，我們用免疫熒光技術(shù)來(lái)定位單克隆抗體在稻瘟病菌表面的分布。
利用單克隆抗體作為探針，來(lái)篩選稻瘟病菌產(chǎn)生孢子的cDNA表達(dá)文庫(kù)，以獲得與附著胞形成相關(guān)的基因，是一條行之有效的途徑，目前我們利用2B4單克隆抗體己從分生孢子cDNA表達(dá)文庫(kù)中獲得陽(yáng)性克隆，該陽(yáng)性克隆的基因DNA序列已完成，發(fā)現(xiàn)是一個(gè)新的基因，其功能還在研究之中。因此，稻瘟病菌的單克隆抗體研制為水稻稻瘟病發(fā)病機(jī)理以及其抗體基因轉(zhuǎn)化水稻的研究打下基礎(chǔ)。


圖1是采用間接免疫熒光技術(shù)顯示各種稻瘟病菌單克隆抗體在病菌表面的結(jié)合狀況圖；圖2是單克隆抗體的Western-blot分析圖。
具體實(shí)施例方式
為了分析稻瘟病菌的結(jié)構(gòu)成份，并探討其對(duì)附著胞形成的作用，本發(fā)明利用單克隆抗體技術(shù)首次制備了稻瘟病菌的單克隆抗體。發(fā)現(xiàn)單克隆抗體在適當(dāng)濃度下能有效地封閉病菌表面抗原因子，干擾病菌的附著胞形成，抑制病菌侵染寄主形成病斑。單克隆抗體這一特性為稻瘟病的防治提供了一條新的思路。而且，我們利用單克隆抗體為探針，篩選稻瘟病菌分生孢子的cDNA表達(dá)文庫(kù)，已獲得一個(gè)與附著胞形成相關(guān)的基因，為稻瘟病菌附著胞形成的分子生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)。1.發(fā)芽孢子和附著胞抗原制備稻瘟病菌91-11B1菌種在OMTA上培養(yǎng)。通過(guò)混合培養(yǎng)產(chǎn)生大量孢子后，用0.25％明膠，輕輕地在培養(yǎng)基表面洗擦，收集懸浮液，經(jīng)羊毛紙過(guò)濾后得純分生孢子。分生孢子懸液經(jīng)5,000g離心5min，收集沉淀孢子，用滅菌的去離子水(Mil-lipore)懸浮稀釋至104個(gè)分生孢子/mL濃度。取該濃度的分子孢子懸液50uL，然后用移液槍小心逐滴加到洗凈滅菌的玻璃培養(yǎng)皿(直徑9cm)上，每皿64滴，保持一定距離，注意防止水滴之間相遇連合，23℃培養(yǎng)10h后，此時(shí)不發(fā)芽孢子所占比例為5.4％，發(fā)芽孢子未形成附著胞比例為61.3％，發(fā)芽孢子已形成附著胞的比例為33.3％。用洗凈滅菌的小橡皮輕輕擦刮，收集上述培養(yǎng)皿上的稻瘟病菌培養(yǎng)物，然后離心收集含有孢子、芽管和附著胞的混合物，4℃保存，作為抗原備用。2.單克隆抗體的制備免疫動(dòng)物將抗原與等體積的福氏完全佐劑(Sigma)充分乳化，對(duì)4-8周齡的BALB/C雌鼠作腹腔注射，3-4周后，把同樣劑量抗原乳化在等體積的福氏不完全佐劑中，作第二次腹腔免疫。2-3周后，用加倍劑量的抗原作再次加強(qiáng)免疫，3天后無(wú)菌取小鼠脾臟用于細(xì)胞融合。細(xì)胞融合取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在無(wú)血清的RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用分子量為3350的50％PEG(Sigma)作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞及陽(yáng)性孔的篩選和克隆5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10％-50％時(shí)，采用間接ELISA方法篩選對(duì)分泌稻瘟病菌的抗體細(xì)胞孔，方法如下1)包被稻瘟病菌分生孢子懸液(3×105個(gè)分生孢子1mL)50ul/孔于96孔的ELISA板中，20℃培養(yǎng)24h，使孢子發(fā)芽形成附著胞，并緊密粘附在小孔底壁，作為包被的抗原。如再用1％的乙醛固定0.5h，效果更好。
2)用5％小牛血清(用PBST稀釋)封閉液100ul/孔37℃封閉30min。
3)加樣待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清每孔加50ul，重復(fù)2孔。每塊反應(yīng)板上設(shè)多克隆血清陽(yáng)性對(duì)照和稀釋液陰性對(duì)照各2孔，37℃溫育1h。
4)PBST洗液洗三次，每次3min，加1∶2000稀釋的辣根過(guò)氧化合酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG結(jié)合物50ul/孔，37℃溫育30min。
5)PBST洗液洗三次，每次3min。加新鮮配制的底物溶液〔鄰苯二胺溶液〕每孔50ul，37℃溫育10min。
6)加終止液〔2mol/L H2SO4〕每孔25ul，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)讀數(shù)儀判定，用酶標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)讀各反應(yīng)孔在490nm處的光度值〔OD〕。按下式計(jì)算P/N＝待檢孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值，被檢上清孔的P/N值＞2.1者判為陽(yáng)性。共測(cè)定了850個(gè)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，發(fā)現(xiàn)230個(gè)細(xì)胞株的培養(yǎng)上清能夠在間接ELISA顯色中呈陽(yáng)性，其中23個(gè)細(xì)胞株的TCS呈強(qiáng)陽(yáng)性。進(jìn)一步克隆得4株細(xì)胞株，其特征見(jiàn)表1。
表1稻瘟病菌單克隆抗體的性質(zhì)

對(duì)分泌抗體的陽(yáng)性細(xì)胞孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行三次克隆，獲單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備單克隆抗體腹水。單克隆抗體的制備和純化取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見(jiàn)小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體。取1倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4℃澄清1小時(shí)，12000rpm離心20min，收集上清，再用50％飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4℃流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70℃保存。3.用間接免疫熒光技術(shù)確定抗體在抗原表面的分布采用間接法并略作改動(dòng)，主要是利用孢子發(fā)芽后能緊密粘附于載玻片上的特性省去固定這一步。具體步驟如下①用pH7.2 0.02mol/L PBS配制稻瘟病菌分生孢子懸液(104個(gè)分生孢子/mL).取100uL于無(wú)菌干凈的載玻片上，20℃培養(yǎng)24h，使孢子發(fā)芽形成附著胞，并緊密粘附在載玻片上。②用上述PBS洗一次，5min。③以正常的小鼠血清(Sigma)作為陰性對(duì)照；以稻瘟病菌多克隆小鼠抗體為陽(yáng)性對(duì)照；1∶100單抗作為待測(cè)樣品；上述各樣品在載玻片上加300uL，重復(fù)3片，室溫下處理2h。④PBS洗三次，每次5min。⑤加入釋度為1∶40的FITC接合的經(jīng)親和層析提純的羊抗鼠IgG(全分子，Saint Lauis，USA)300uL，室溫下處理2h。⑥PBS洗三次，每次5min。⑦滴加緩沖甘油(9份甘油加1份PBS)，用蓋玻片封液，并在激發(fā)波長(zhǎng)為450-490的熒光顯微鏡下觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4株單抗抗原結(jié)合位點(diǎn)在稻瘟病菌的分生孢子、芽管和附著胞表面分別具有不同的分布狀況。見(jiàn)圖1，A2B4能夠與分生孢子、芽管和附著胞都具有結(jié)合作用；B4A1能夠?qū)︽咦泳哂泻軓?qiáng)的結(jié)合作用，但對(duì)芽管和附著胞反應(yīng)很弱，C1D1僅對(duì)芽管具有結(jié)合作用，對(duì)分生孢子和附著胞不結(jié)合。D2H4只能與附著胞起著很強(qiáng)的結(jié)合作用，但對(duì)分生把子和芽管不作用；4單克隆抗體對(duì)附著胞形成的干擾作用測(cè)定將各單抗小鼠腹水IgG稀釋成5，10和20ug/mL三個(gè)濃度梯度。取各單抗小鼠腹水IgG的各稀釋度20uL加到洋蔥表皮上和24孔培養(yǎng)板的小孔中，然后加20uL的2×104個(gè)分生孢子/mL的孢子懸液，混合后使孢子濃度和IgG濃度都釋稀一倍。以正常小鼠血清IgG(Sigma)作為陽(yáng)性對(duì)照，重復(fù)三次。28℃下18h后測(cè)定附著胞的形成率。試驗(yàn)重復(fù)二次。結(jié)果表明2B4、4A1、1D1和2H4能夠在洋蔥表皮和24孔聚乙烯培養(yǎng)扳上有效地抑制稻瘟病菌附著胞的形成。2B4作用效果最佳，即使其IgG的濃度為5ug/mL還能起抑制作用；在洋蔥表皮表面尤為明顯，10h后觀察已發(fā)現(xiàn)有抑制作用，但對(duì)照此時(shí)形成的附著胞率還不高，因此，對(duì)比不明顯，而18h后對(duì)照附著胞形成率達(dá)100％，而實(shí)驗(yàn)組附著胞形成率與10h后幾乎一樣，抑制效果明顯。5.單克隆抗體對(duì)稻瘟病菌的致病性抑制作用測(cè)定取五葉期稻葉，剪成5.00cm長(zhǎng)片段，然后置于含濕的滅菌棉花球的培養(yǎng)皿(直徑為9cm)中，葉背朝上，備用。同時(shí)，采用對(duì)稻瘟病菌附著胞具有抑制作用的單抗IgG與分生孢子懸液混合，使分生孢子濃度為104個(gè)分生孢子/mL，單抗IgG濃度相應(yīng)稀釋到原先相對(duì)應(yīng)對(duì)附著胞具有抑制作用的濃度。然后共取10uL加到水稻片段的葉背面一側(cè)(以中脈為界)，每葉3滴，在葉背面相對(duì)應(yīng)另一側(cè)加10uL同樣濃度但不含單抗的分生孢子懸液(104個(gè)分生孢子/mL)，同樣3滴，每皿3片葉片，重復(fù)3皿。將上述培養(yǎng)皿置于28℃下光暗(13h/11h)培養(yǎng)5d，每天記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。試驗(yàn)表明，單克隆抗體2B4、4A1、1D1和2H4均對(duì)稻瘟病菌的病斑形成具有有效的抑制作用。單抗2B4表現(xiàn)最強(qiáng)的作用，其IgG濃度僅為5ug/mL時(shí)，就可以對(duì)病斑具有有效抑制作用。單抗對(duì)病菌致病性的影響主要是干擾病菌在稻葉表面形成附著胞從而完全抑制或延緩病斑的形成。6.單克隆抗體的Western-blot分析1)樣品處理收集分生孢子和帶發(fā)芽的分生孢子各0.5g，分別加1％SDS含1mmol/LPMSF和40mmol/Lβ-巰基乙醇0.5mL，置于Eppendorf離心管中，在沸水中煮30min，然后8,000r/min離心5min，取上清，加含SDS蛋白電泳上樣緩沖液。電泳備用。另收集分生孢子和帶發(fā)芽的分生孢子各0.5g，分別加0.5mL的冷100％三氟乙酸(TFA)，充分混勻10min，8,000r/min離心10min，低溫抽真空，干燥后，加含SDS蛋白電泳緩沖掖，混勻備用。
2)SDS-PAGE、Western blotting分析參考常規(guī)方法進(jìn)行，結(jié)果表明，單克隆抗體2B4能與15KDa的蛋白抗原起結(jié)合作用。由于該蛋白抗原存在于分生孢子和芽管表面的冷100％TFA提取物，而不存在于熱1％SDS提取物中，故而推測(cè)該蛋白可能是某種疏水蛋白。Western blotting分析表明，其它三株單克隆抗體，4A1、1D1和2H4均不能與分生孢子或芽管表面的冷100％TFA提取物任何蛋白條帶起結(jié)合作用。4A1僅對(duì)溶于熱1％SDS的分生孢子提取物31kD蛋白及來(lái)自分子量marker(Promega，USA)組分31kD的羧化酶蛋白起結(jié)合作用，對(duì)芽管提取物及冷的100％TFA提取物不起結(jié)合作用，1D1僅識(shí)別溶于熱1％SDS的芽管提取物中的60kD蛋白；2H4對(duì)上述各種物質(zhì)〔TFA和SDS提取物〕均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異的結(jié)合條帶圖2。
權(quán)利要求
1.一種抗稻瘟病菌的單克隆抗體，其特征在于，4A1、2B4、2H4、1D1能與稻瘟病病菌有特異性免疫反應(yīng)。
2.一種抗稻瘟病菌單克隆抗體的ELISA檢測(cè)包被方法，其特征在于用滅菌的Millipore水懸浮分生孢子，3-6×105個(gè)/mL稻瘟病菌分生孢子懸液50ul/孔于96孔的ELISA板中，20℃培養(yǎng)24h，使孢子發(fā)芽形成附著胞，并緊密粘附在小孔底壁，再用0.5-1％的戊二醛固定0.5h。
3.一種抗稻瘟病菌單克隆抗體在抗原表面的定位方法，其特征在于它的步驟如下1)pH7.2 0.02mol/L PBS配制稻瘟病菌分生孢子懸液，取100uL于無(wú)菌干凈的載玻片上，20℃培養(yǎng)24h，使孢子發(fā)芽形成附著胞，并緊密粘附在載玻片上；2)用上述PBS洗一次，5min，以正常的小鼠血清作為陰性對(duì)照；以稻瘟病菌多克隆小鼠抗體為陽(yáng)性對(duì)照；以1∶100-200倍稀釋單抗作為待測(cè)樣品；上述各樣品在載玻片上加300-1000uL，重復(fù)3片，室溫下1-2h；3)PBS洗三次，每次5min，加入稀釋度為1∶40-100的FITC接合的經(jīng)親和層析提純的羊抗鼠IgG300-1000uL，室溫下處理1-2h；4)PBS洗三次，每次5min，9份甘油加1份PBS的滴加緩沖甘油，用蓋玻片封液，并在激發(fā)波長(zhǎng)為450-490的熒光顯微鏡下觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗稻瘟病菌單克隆抗體及檢測(cè)包被和在抗原表面的定位方法。稻瘟病菌的分生孢子、芽管、附著胞的混合物作為抗原免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50％PEG下融合成雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA篩選陽(yáng)性孔，獲4株雜交瘤細(xì)胞及其單克隆抗體。間接免疫熒光試驗(yàn)表明其中4株單克隆抗體分別與稻瘟病菌孢子、芽管或附著胞有特異性結(jié)合；Western blotting分析發(fā)現(xiàn)2B4、4A1、1D1單克隆抗體分別與孢子、芽管表面的提取物有不同的結(jié)合帶。此四株單克隆抗體均干擾稻瘟病菌附著胞形成，并抑制稻瘟病菌在水稻葉表的致病性。
文檔編號(hào)C07K16/12GK1431222SQ0311518
公開(kāi)日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2003年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月23日
發(fā)明者吳建祥, 林福呈, 李德葆, 陳正賢 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)