專利名稱：檢測ChIFN-γ的雙單克隆抗體夾心ELISA方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學檢測方法領域，具體涉及檢測家禽細胞因子的雙單克隆抗 體夾心ELISA方法。
背景技術：
Y-干擾素(IFN-Y，又稱作免疫干擾素或II型干擾素)是細胞免疫應答的重 要媒介，在機體免疫應答調節(jié)方面具有重要功能，尤其對誘導及維持Thl細胞 免疫應答具有重要作用。Thl應答對抵抗胞內病原的感染非常重要，而IFN-y分 泌性T淋巴細胞的出現(xiàn)是Thl應答的標志。生物樣品中IFN-Y的水平及IFN-y 分泌細胞的出現(xiàn)通常作為評價Thl免疫應答發(fā)生的標志。
目前檢測細胞因子的方法很多，主要有生物活性測定法、免疫學檢測法，利 用核酸標記技術檢測細胞因子等。但在復雜的生物樣品中，對既定的細胞因子的 功能分析很多情況下并不能反映其實際的功能。如，在保護細胞抵抗病毒感染的 作用方面，I、 IIIFN均具有這種功能，盡管這兩類IFN的結構并不是非常密切 相關的，且由不同的細胞所分泌，但如果僅從功能上進行分析，并不能準確反映 特定細胞因子的實際情況。而且，對特定的細胞因子而言，其活性半衰期很短， 導致對其功能的分析不再能進行，盡管在樣品收集時，這些細胞因子是存在的，
在蛋白質水平上仍能分析，但由于其活性的半衰期很短，導致功能上的分析不再 能進行。Northern blot， RNase protection及PCR等基因分析方法均高度敏感，且 與目的基因完全匹配，但其只能停留在基因轉錄水平上的分析，很多信息是難以 捕獲的。
因此，急需一種能夠定性和定量檢測生物樣品中IFN-Y的檢測方法。尤其是 針對胞內菌、寄生蟲、病毒及其它病原引起的胞內感染，快速有效的細胞因子檢 測工具及檢測方法對這類疾病的檢測和診斷非常有益。目前，由于缺乏有效的檢 測工具及檢測方法，對疾病條件下免疫狀態(tài)的分析及評價很困難，為了改善這種 現(xiàn)狀，人們進行了許多努力，如生產(chǎn)重組細胞因子，研制特異性抗細胞因子mAb 改進檢測方法。隨著單克隆抗體技術的發(fā)展，檢測細胞因子的酶聯(lián)免疫吸附捕獲方法 (ELISA)得到了大力的發(fā)展。在其他的物種中，ELISA得到了很大的發(fā)展，并 且被證明是一種非常穩(wěn)定、可信、簡單、易行的細胞因子檢測方法，可用于檢測 經(jīng)活化釋放的細胞因子，因而，人們認為該方法是評價細胞免疫應答(CMI)的 很好的指示方法。而且，這種檢測方法是多用途的，不但可以用于檢測絲裂原或 許多病原再次刺激誘導的CMI，而且可用于檢測免疫后激發(fā)的CMI。
雞在大量的家禽胞內感染疾病方面是一個重要的動物模型，到目前為止，選 擇雞作為家禽疾病的動物模型受到了許多限制，主要是因為缺乏適當?shù)臋z測工具
和檢測系統(tǒng)。1995年Digby等成功克隆、表達出ChIFN-Y基因，對ChIFN-Y的研究 蓬勃開展，其功能研究工作也在進行當中。2000年，CheolH.等利用天然的或重 組的ChIFN-Y研制出抗ChIFN-Y mAb，并建立了直接ELISA方法檢測艾美爾球蟲 感染雞的血清ChIFN-Y水平；隨后，B. Lambrecht等利用基因槍免疫法制備出抗 CMFN-YmAb，并運用純化的抗ChIFN-Y多抗作為捕獲抗體，生物素標記的mAb 作為檢測抗體，建立了檢測CMFN-Y的雙抗體夾心ELISA方法。本發(fā)明采用原核 表達的重組ChIFN-Y為免疫抗原及檢測抗原，制備出抗ChIFN-YmAbs，運用純化 的抗ChIFN-YmAb作為捕獲抗體，生物素標記的mAb作為檢測抗體，建立檢測生 物樣品中ChIFN-Y的雙單抗夾心ELISA方法，該方法避免了運用多抗作為捕獲抗 體，保證了包被抗體的穩(wěn)定性和均一性，因為不同批次制備出的多抗可能存在很 大的差異，較難標準化，而mAb細胞株的優(yōu)越性在于可以無限量地生產(chǎn)出具有均 一特性的mAb。
ChIFN-Y抗原捕獲ELISA可以在蛋白質水平上對ChIFN-Y進行評價，較生 物學方法更為簡便、實用、靈敏，便于操作和大面積使用。該方法的建立為檢測 雞CMI提供靈敏的檢測工具。而且，該方法將有利于研究ChIFN-Y在家禽的不 同的免疫應答機制中的作用。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于建立一種簡捷、實用、靈敏、高效的檢測ChIFN-Y雙單克 隆抗體夾心ELISA方法。
本發(fā)明的技術方案是檢觀iJChIFN-Y的雙單克隆抗體夾心ELISA方法，是 采用抗ChIFN-Y特異性mAb試劑，建立檢湖iJChIFN-Y特異性雙mAb夾心ELISA方法。該方法以mAb3E5作為捕獲抗原，以生物素標記的mAb3E3作為檢測抗體， 建立檢領UChIFN-Y的雙mAb夾心ELISA方法。該方法可以靈敏地檢測到微量的 ChIFN-Y。
上述方法具體的步驟是
① 將捕捉抗體固定在固相支持物上，其中捕捉抗體為純化的ChIFN-Y單克隆 抗體3E5;
② 將生物樣品與固相化的捕捉抗體保溫，使ChIFN-Y與捕捉抗體結合；
③ 使結合到固相化捕捉抗體上的ChlFN-Y與生物素標記的抗ChlFN-Y單克隆 抗體3E3接觸，來檢測CMFN-Y。
所說的生物樣品可分離自雞血清、雞血漿或細胞培養(yǎng)上清。
上述方法中，mAb 3E5的包被濃度為85 u g/ml， mAb 3E3的工作濃度為0.67 U g/ml。該方法可以靈敏的檢測到125-500 pg/ml的CWFN-y。
應用本發(fā)明方法進行天然ChIFN-Y的檢測無菌制備雞脾臟淋巴細胞，用伴 刀豆蛋白(ConA， Sigma公司)刺激雞脾臟淋巴細胞，取培養(yǎng)48小時的細胞培 養(yǎng)上清，獲得天然ChIFN-Y，用建立的雙單抗夾心ELISA方法測定天然的 ChIFN-Y,非常顯著地檢測到天然ChIFN- Y 。
上述夾心ELISA方法中抗體的包被緩沖液為pH 7.2的PBS，檢測抗體稀釋 液為含0.05% Tween 20及1% BSA的PBST， avidin-HRP的稀釋液為PBST(0.05% Tween-20、 1% BSA及10%小牛血清)，TMB顯色，2MH2S04終止反應。
本發(fā)明所建立的ChIFN-Y特異性捕獲ELISA可以敏感的檢測到經(jīng)Con A刺 激的細胞培養(yǎng)上清中存在的天然ChIFN-Y。所建立的ELISA方法為評價Thl細 胞免疫應答提供了很好的檢測工具。
圖1是雞干擾素-Y雙單抗夾心ELISA方法的敏感性實驗(His-ChIFN-Y的濃度為1 000ng/ml，系列倍比稀釋進行)單抗3E5作為捕獲抗體，生物素標記的單抗3E3 作為檢測抗體，可以檢測到125-500 pg/ml重組雞，干擾素(His-ChIFN-Y)
圖2雙單抗夾心ELISA的特異性實驗雙單抗夾心ELISA檢測系列倍比稀釋的重組 雞Y-干擾素(His-ChIFN-Y， 20ng/ml)及天然雞？干擾素(Con A刺激雞脾臟淋巴細胞所產(chǎn) 生)雞？干擾素雙單克隆抗體夾心ELISA的特異性實驗(His-ChIFN-Y 20 ng/ml，系列倍比稀釋進行；Con A刺激72 h的雞脾臟淋巴細胞培養(yǎng)上清，倍比稀釋進 行，X軸以Log2為單位)
圖3雙單抗夾心ELISA檢測不同數(shù)量雞脾臟淋巴細胞(lxloe個細胞/ml、 2.5xl(^個細 胞/ml、 5xl(^個細胞/ml)經(jīng)ConA (12ug/ml)刺激，不同培養(yǎng)時間段(24小時、48小時、 72小時、96小時)細胞上清中雞Y-干擾素。雞Y干擾素雙單抗夾心ELISA檢測不同數(shù)量雞 脾臟淋巴細胞(lxl()S個細胞/ml、 2.5xl()S個細胞/ml、 5><106個細胞/1 1)培養(yǎng)上清中雞y-干 擾素(ConA: 12ng/ml)
具體實施例方式
在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明， 一般具有本領域普通技術人員 通常理解的含義。
下面結合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這 些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方 法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標 明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。
本發(fā)明中抗CMFN-Y特異性單克隆抗體3E3、 3E5、 IGIO、 2C3分別是由雜 交瘤細胞株3E3、 3E5、 1G10、 2C3分泌，其中雜交瘤細胞株3E3、 3E5、 1G10、 2C3 (抗雞Y-干擾素單克隆抗體的研制及鑒定，揚州大學雜志(農(nóng)業(yè)與生命科學 版)，2007， 28(4): 6-9.)由揚州大學的人獸共患病學重點實驗室構建保存，自 申請日起20年內向公眾提供。
實施例1:本發(fā)明檢測ChIFN-Y的雙單克隆抗體夾心ELISA方法的確立 1.純化和標記抗CMFN-Y特異性單克隆抗體3E3、3E5、 1G10、2C3(mAbs)， 采用Proein G純化mAb，用生物素標記mAb，具體操作按照標準方法進行。2. ChlFN々抗原捕獲ELISA的初步確立以原核表達的rChlFN-^y作為捕
獲抗原(抗雞Y-干擾素單克隆抗體的研制及初步鑒定，細胞與分子免疫學雜志， 2006， 22(4): 510-512)，將上述標記的3E3、 3E5、 1G10、 2C3mAbs與市售的 mAbs(如Abs: Serotec: Rabbit anti chicken interferon gamma (polyclonal antibody, AHP945Z)之間進行配對實驗，棋盤法找出建立ChIFN-Y抗原捕獲ELISA的最 佳抗體(包被mAbs為3E5，檢測抗體為生物素標記的mAb 3E3)及其最適濃度， 固定avidin-HRP (BD公司)的工作濃度為1: 2500 (參照說明書)，同時設立陰 性對照(1%BSA)、空白對照，建立捕獲ELISA方法；
3. ChIFN-Y抗原捕獲ELISA靈敏度的測定根據(jù)"2"建立的條件進行 mAb 3E5的包被濃度為85 u g/ml， bio-m3E3的工作濃度為0. 67ix g/ml， avidin-HRP工作濃度為1: 2500，將rChIFN-Y倍比稀釋，同時設立陰性對照(1%
BSA)，該方法可檢測到125-500pg/ml的rCMFN-Y (圖1)。
實施例2:應用本發(fā)明方法檢測天然ChIFN- y
天然ChIFN-Y的制備無菌摘取4周齡SPF雞脾臟，研磨后200目銅網(wǎng)過 濾；收集濾液，4'C離心，1000 rpm， 5 min;淋巴細胞分離液(Sigma公司)分 離淋巴細胞，21°C， 2000 rpm， 30 min，離心；收集中間云霧狀層，即為淋巴細 胞，將收集的細胞離心用PBS洗滌2遍，再用完全RPMI 1640 (10%胎牛血清， 100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素)洗滌1遍，最后用完全RPMI 1640將細胞懸 浮，調整細胞濃度至1Xl(^個/ml、 5Xl()S個/ml、 2Xl()S個/ml;取96孔細胞培 養(yǎng)板，加入100ul細胞，然后再加入含刺激劑Con A (Sigma公司)的培養(yǎng)基100 Ul，使得ConA的終濃度為12yg/ml，同時設立陰性對照(完全RPMI 1640); 置4rC， 5%(302細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，收集培養(yǎng)72h的細胞培養(yǎng)上清，獲得天然的 ChIFN卞
夾心ELISA方法檢測天然ChIFN- y :
將mAb 3E5用包被緩沖液(0.01 M PBS pH 7.2)稀釋成85 u g/ml，包被ELISA 板，100 ul/孔，4°C， 24 h; PBS-T(0.5o/oTween隱20)洗滌3次，5min/次;用含 2。/。BSA的PBS-T封閉，200 ul/孔，37°C.， 2 h;同上洗滌，加入待檢測樣品， 100 "l/孔，37°C.， 2h;同上洗滌；加入工作濃度的bio-3E3 (0.67 u g/ml)， 37°C.， lh;同上洗滌后加入avidin-HRP (1: 2500，稀釋液為含1%BSA、 10% 優(yōu)級小牛血清的PBS-T， 100 lU/孔，37°C， 30min;同上洗滌7次，加入TMB，100ul/孔，37°C.， 15min， 2MH2S04終止，酶標儀讀取OD450 nm值。同時設陽 性對照、陰性對照及空白對照。
運用該夾心ELISA方法可以非常顯著地檢測到天然ChIFN- y (圖2、 3)。 本方法中使用的ELISA板為輻照板(廈門云鵬科技發(fā)展有限公司)；包被緩 沖液為PBS， pH7.2;稀釋rChIFN-Y及檢測抗體的稀釋緩沖液為含0.05% Tween-20、 1% BSA的PBST， avidin-HRP的稀釋液為0.05% Tween-20、 1% BSA、 及10%優(yōu)級小牛血清(蘭州民海生物工程公司)的PBST， TMB (eBioscience 公司)顯色，2MH2S04終止反應。
綜上，本發(fā)明所建立的ChIFN-Y特異性捕獲ELISA可以敏感的檢測到經(jīng)Con A刺激的細胞培養(yǎng)上清中存在的天然ChIFN-Y。所建立的ELISA方法為評價Thl 細胞免疫應答提供了很好的檢測工具。
權利要求
1、一種用于檢測生物樣品中ChIFN-γ的雙單克隆抗體夾心ELISA方法，其包括以下步驟①將捕捉抗體固定在固相支持物上，其中捕捉抗體為純化的ChIFN-γ單克隆抗體3E5；②將生物樣品與固相化的捕捉抗體保溫，使ChIFN-γ與捕捉抗體結合；③使結合到固相化捕捉抗體上的ChIFN-γ與生物素標記的抗ChIFN-γ單克隆抗體3E3接觸，來檢測ChIFN-γ。
2、 如權利要求l的方法，其中生物樣品分離自雞血清、雞血漿或細胞培養(yǎng) 上清。
3、 權利要求1的方法，其中步驟①的保溫溫度為4°C，保溫時間為24小時； 步驟②的保溫溫度為37'C，保溫時間為2小時；步驟③的保溫溫度為37。C，保 溫時間為1小時
4、 權利要求1-3之一的方法，其中捕捉抗體是固相化單克隆抗體。
5、 權利要求4的方法，固相化的捕捉抗體的量為85 ^tg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測雞γ-干擾素(IFN-γ)的雙單克隆抗體夾心ELISA方法。采用抗ChIFN-γ特異性單克隆抗體(mAbs)建立檢測ChIFN-γ特異性雙單克隆抗體夾心ELISA方法。該方法以mAb3E5作為捕獲抗體，以生物素標記的mAb 3E3作為檢測抗體，建立檢測ChIFN-γ的雙單抗夾心ELISA方法，可以靈敏的檢測到微量的ChIFN-γ(125-500pg/ml)。該方法便捷、實用、靈敏、多效，可以用于檢測生物樣品中的ChIFN-γ及重組的ChIFN-γ，為檢測和評價家禽的細胞免疫應答提供了靈敏的檢測工具，將有利于研究ChIFN-γ在家禽不同的免疫應答機制中的作用，有效彌補了現(xiàn)有ChIFN-γ檢測方法的不足。
文檔編號G01N33/543GK101441220SQ200810235438
公開日2009年5月27日 申請日期2008年11月25日 優(yōu)先權日2008年11月25日
發(fā)明者林 孫, 華 戴, 潘志明, 焦新安, 鄭佳玉, 祥 陳, 陳俊華 申請人:揚州大學