專利名稱：醋酸奧曲肽的固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽的合成領(lǐng)域，尤其是一種醋酸奧曲肽的固相合成方法。
背景技術(shù)：
醋酸奧曲肽的結(jié)構(gòu)是一含有7個氨基酸殘基和1個蘇氨醇的多肽。醋酸奧曲肽(Octreotide Acetate)主要臨床應(yīng)用于以下疾病的治療肝硬化所致食道-胃靜脈曲張出血的緊急治療，與特殊治療(如內(nèi)窺鏡硬化劑治療)合用、消化性潰瘍及應(yīng)急性潰瘍、急性胰腺炎、急性胰腺炎、預(yù)防胰腺術(shù)后并發(fā)癥、經(jīng)手術(shù)、放射治療或多巴胺受體激動劑治療失敗的肢端肥大癥患者，可控制癥狀、降低生長激素及生長素介質(zhì)C的濃度。亦適用于不能或不愿手術(shù)的肢端肥大癥患者，以及放射治療尚未生效的間歇期患者。
在最近醋酸奧曲肽及其類似物的合成專利文獻(xiàn)里，主要采用液相合成方法。2002年6月26日公開的中國發(fā)明專利(CN1355173A)就是醋酸奧曲肽的液相合成方法，其片段分為N-端三肽和N-端五肽，保護策略為BOC(叔丁氧羰基)/BZL(芐基)策略，其接肽方法主要采用HOBt-DCC方法。
綜合參考國內(nèi)外關(guān)于奧曲肽的合成方法特點，我們系統(tǒng)的探索了有關(guān)報道的固相奧曲肽合成方法和國內(nèi)文獻(xiàn)關(guān)于奧曲肽液相合成方法，得出技術(shù)中的方法存在著一些不足，主要表現(xiàn)為1.液相合成中制備時間長，每一步產(chǎn)品需要進(jìn)一步純化，并且在最后的轉(zhuǎn)鹽過程耗時且浪費有機溶劑。2.Boc-HF脫保護系統(tǒng)反應(yīng)條件劇烈，而且HF具有強腐蝕性污染環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種合成工藝簡單、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間短、配比小、成本低、產(chǎn)率高、設(shè)備簡單、便于操作、環(huán)境污染小、有益于大批量生產(chǎn)的合成方法，該方法克服了現(xiàn)有制備醋酸奧曲肽技術(shù)中的不足。
本發(fā)明中醋酸奧曲肽的固相合成方法步驟如下將把柄化合物Fmoc-Thr-ol與樹脂鍵合成如下式
將其與保護氨基酸殘疾按順序依次反應(yīng)，連接后生成帶保護八肽樹脂 然后與TFA溶液反應(yīng)，脫保護得到直鏈八肽D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol將所得八肽制成水溶液后經(jīng)過空氣氧化，得到奧曲肽。
將奧曲肽水溶液加入適量冰醋酸，得到醋酸奧曲肽，將所得醋酸奧曲肽經(jīng)冷凍干燥，制得醋酸奧曲肽干粉。
本發(fā)明的醋酸奧曲肽的固相合成方法簡述為，過程包括合成八肽；將八肽制成水溶液在空氣中自然氧化后制成奧曲肽；向奧曲肽水溶液中加入冰醋酸后凍干，制成醋酸奧曲肽凍干粉。所說的合成八肽的過程是將芴甲氧羰基蘇胺醇與對羧基苯甲醛反應(yīng)生成芴甲氧羰基蘇胺醇對羧基苯縮醛，將其鍵合在高分子樹脂載體上，然后按順序與保護氨基酸殘基依次鍵合后得到八肽樹脂，將八肽從樹脂上切落。
所說的樹脂，是高分子樹脂載體，可以是氨基AM樹脂(Rink Amide-AMResin)或氨基MBHA樹脂(Rink Amide-MBHA Resin)。
在本發(fā)明中使用的縮寫具有下面的含義Phe苯丙氨酸Cys半胱氨酸Trp色氨酸Lys賴氨酸DCM二氯甲烷DMFN，N-二甲基甲酰胺DCC二環(huán)己基碳二亞胺HOBt1-羥基苯駢三唑Boc叔丁氧羰基Fmoc芴甲氧羰基
Trt三苯甲基tBu叔丁基2-Cl-Z2-氯芐基Acm乙酰胺甲基HPO3Bzl偏磷酸芐基Acetal縮醛NMPN-甲基吡咯烷酮TFA三氟乙酸THF四氫呋喃TsOH對甲苯磺酸HBTUO-(Benzotriazol-1-yl)-N，N，N’，N’-tetramethyl uroniumhexafluorophosphateLys賴氨酸Thr蘇氨酸Fmoc-Thr-OH芴甲氧羰基蘇胺酸Fmoc-Thr-ol芴甲氧羰基蘇胺醇Fmoc-Thr-ol-Acetal芴甲氧羰基蘇胺醇對羧基苯縮醛根據(jù)本發(fā)明更具體地講，本發(fā)明醋酸奧曲肽制備方法中的合成路線如下制備縮醛化產(chǎn)物將Fmoc-Thr-ol、對羧基苯甲醛和對甲苯磺酸(摩爾比為1∶1.0～2.0∶0.1～0.5)溶于無水氯仿，于油浴中加熱回流反應(yīng)，用TLC監(jiān)測反應(yīng)，待反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓濃縮去除溶劑，得到把柄化合物。
其中Fmoc-Thr-ol可以直接使用，也可以通過合成制得。
縮醛化反應(yīng)中使用的對甲苯磺酸是催化劑。
接樹脂將氨基樹脂、縮醛化產(chǎn)物、DCC、HOBt(摩爾比為1∶1.0～2.2∶1.0～2.2∶1.0～2.2)溶于NMP中于固相反應(yīng)器中攪拌反應(yīng)60～90分鐘，然后洗滌，脫掉保護，通氣充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)6～10小時。
采用DCC/HOBt法，反應(yīng)速度快、產(chǎn)率高、效果好。
按順序逐步接肽將HOBt、HBTU分別和保護氨基酸殘基(摩爾比為1∶1.0～2.2∶1.0～2.2∶1.1～1.8)依次加入到固相反應(yīng)器內(nèi)，有所不同的是二肽保護氨基酸殘基為Fmoc-Cys(Trt、Acm、OtBu、tBu)；三肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-Thr(tBu、Trt、HPO3Bzl)-OH；四肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-Lys(Boc、Ac、2-Cl-Z)-OH；五肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-D-Trp(Boc)-OH；六肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-Phe-OH；七肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-Cys(Trt、Acm、OtBu、tBu)-OH；八肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-D-Phe-OH。
這里的保護氨基酸均為芴甲氧羰基保護。
切肽向裝有完成八肽合成樹脂的固相反應(yīng)器中加入上述三氟乙酸溶液，通入氮氣室溫反應(yīng)2小時，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，經(jīng)過重結(jié)晶后即可制成八肽。
氧化八肽將八肽溶解于水中，濃度配成0.1～10mmoL/mL，用氨水調(diào)節(jié)pH＝7.0～7.5，電磁攪拌器攪拌、室溫反應(yīng)24～72小時，即可保證反應(yīng)充分完全。
凍干向奧曲肽溶液中加入一定量的冰醋酸，使冰醋酸在奧曲肽水溶液中的濃度是1～10％，然后經(jīng)過冷凍干燥，制成醋酸奧曲肽。
與已有的醋酸奧曲肽合成方法相比，本發(fā)明中醋酸奧曲肽固相合成策略具有以下優(yōu)點1)在縮醛化產(chǎn)物與樹脂鍵合時，采用DCC/HOBT為催化縮合劑，該方法反應(yīng)速率快、產(chǎn)率高、副反應(yīng)少。
2)在接肽過程中，采用HOBt、HBTU為催化縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，該方法結(jié)合率高、副產(chǎn)物少、反應(yīng)時間短、以及減少消旋等特點，此方法達(dá)到最小保護策略，可以放大量合成。
3)本發(fā)明固相合成中加入的各保護氨基酸殘基摩爾配比為1.0～1.8，節(jié)約原料，且收率穩(wěn)定；4)氧化過程中采用水溶液，并且濃度為0.1～1mmol/ml，這樣避免了液相合成中體積過大。
5)奧曲肽的轉(zhuǎn)鹽采用在經(jīng)過HPLC分純后直接加入冰醋酸的方法，這樣節(jié)省溶劑且省時。
因此我們認(rèn)為開發(fā)新的制備醋酸奧曲肽的方法是必要的。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明中醋酸奧曲肽的固相合成方法做進(jìn)一步說明。
實施例1Fmoc-Thr-ol-Acetal的合成將Fmoc-Thr-ol(3.28g)加入四口燒瓶中，用無水氯仿(200ml)溶解，加入對羧基苯甲醛1.90g，并加入對甲苯磺酸100mg，然后于60℃水浴加熱回流反應(yīng)，TLC監(jiān)測，反應(yīng)完全后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮去除溶劑，得到淡黃色粘稠物。將粘稠物稀釋后，上硅膠層析，用展開液二氯甲烷∶乙酸乙脂(3∶1)，收集溶液，蒸餾后得產(chǎn)物3.0g。
其中Fmoc-Thr-ol可以直接使用，也可以通過下面實施例方法制得Fmoc-Thr-OH(7.5g)加入到100ml THF中溶解，然后加入氯甲酸乙酯3.1mL、NMM3.5mL，并于0℃下反應(yīng)10min，然后加入NaBH41.50g，反應(yīng)10min后于0℃下攪拌反應(yīng)3h，加入1N HCl(230ml)，然后用DCM萃取二次(每次150ml)，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑，重結(jié)晶得白色粉末4.8g。
實施例2 第一肽的合成1)將縮醛化產(chǎn)物(3.4g)、DCC(1.2g)、HOBt(1.6g)于冰浴下加入NMP(30ml)，電磁攪拌，室溫反應(yīng)1小時。
2)將樹脂(5.00g)置于固相反應(yīng)器中，加入二氯甲烷/二甲基甲酰胺＝1/1 30ml溶劑，并通入高純氨氣攪拌60分鐘。
3)將縮醛化產(chǎn)物的反應(yīng)液加入到固相反應(yīng)器中，通氣攪拌，室溫反應(yīng)16小時。
實施例3第二肽的合成1)將反應(yīng)溶液用氣體通過廢液出口壓出，用二氯甲烷清洗，然后向固相反應(yīng)器內(nèi)樹脂中加入二氯甲烷30mL、乙酸酐1.5mL吡啶1.5mL，攪拌室溫反應(yīng)2小時。
2)將反應(yīng)溶液用氣體通過廢液出口壓出，用二氯甲烷清洗，然后加入六氫吡啶、二甲基甲酰胺各15mL，室溫反應(yīng)1小時。
3)將反應(yīng)溶液用氣體通過廢液出口壓出，用二氯甲烷清洗，然后將Fmoc-Cys(Trt)-OH(4.34g)、HOBt(1.10g)、HBTU(3.10g)加入到裝有上步反應(yīng)樹脂的固相反應(yīng)器中，向其中加入NMP(30ml)，同時通入氮氣，室溫過夜反應(yīng)16小時。
實施例4第三～八肽的合成反應(yīng)步驟同實施例3，所不同的是三肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-Thr(tBu)-OH(2.94g)。
四肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-Lys(Boc)-OH(3.47g)。
五肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-D-Trp(Boc)-OH(3.90g)。
六肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-Phe-OH(2.87g)。
七肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-Cys(Trt)-OH(4.34g)。
八肽所用的保護氨基酸殘基為Fmoc-D-Phe-OH(2.87g)。
實施例5直鏈八肽的制備1)反應(yīng)溶液用氣體通過廢液出口壓出，用二氯甲烷清洗，然后向固相反應(yīng)器內(nèi)樹脂中加入二氯甲烷30mL、乙酸酐1.5mL吡啶1.5mL，攪拌室溫反應(yīng)2小時。
2)反應(yīng)溶液用氣體通過廢液出口壓出，用二氯甲烷清洗，然后加入六氫吡啶、二甲基甲酰胺各15mL，室溫反應(yīng)1小時。
3)苯酚(8.0g)、茴香硫醚(6.0ml)、乙二硫醇(6.0ml)、三氟乙酸(70ml)，加入到三角瓶中，充分震蕩后，放入冰浴中保存1小時。然后將其加入裝有完成八肽合成樹脂的固相反應(yīng)器中，通入氮氣，室溫反應(yīng)2小時。使用氣體將反應(yīng)液體壓出。
4)液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，加入冰乙醚(200ml)，有白色沉淀產(chǎn)生，過濾收集沉淀，真空干燥10小時以上。收集干燥后白色沉淀(3.1克)，裝于棕色玻璃瓶中密閉于-20℃條件下保存。
實施例6奧曲肽的氧化將實施例6所得到的含有雜質(zhì)的還原型奧曲肽溶解于水中，使還原型奧曲肽的終濃度達(dá)到0.1～10mmol/ml，使用1M氨水調(diào)節(jié)pH＝7.0～7.5，電磁攪拌器攪拌、室溫反應(yīng)24～72小時，用分析型HPLC監(jiān)測氧化反應(yīng)是否完全。
實施例7奧曲肽的分離純化將氧化后的溶液，使用0.8um膜過濾。
流動相A0.1％TFA/水流動相B0.1％TFA/65％乙腈/水流速20ml/min分離純化梯度條件

收集主產(chǎn)物峰(保留時間為18分鐘左右)。
實施例8醋酸奧曲肽的制備將收集的奧曲肽產(chǎn)物溶液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃進(jìn)行濃縮。去除乙腈，旋蒸至無液體流出，得到純奧曲肽溶液。準(zhǔn)確量出體積后，加入冰乙酸使其濃度達(dá)到1-10％，電磁攪拌30分鐘，進(jìn)行凍干。得到奧曲肽的醋酸鹽1.13g，產(chǎn)率33.3％?？偸章?3.44％。
經(jīng)鑒定FAB-MS(M++H)1019.8(理論分子量為1019.3)氨基酸順序分析從N-端到C-端7個氨基酸殘基依次分別為Phe、Cys、Phe、Trp、Lys、Thr、Cys。
氨基酸組分分析理論值實際值苯丙氨酸 2(1.5～2.2) 1.59賴氨酸1(0.4～1.1) 0.98蘇氨酸1(0.5～1.1) 0.69色氨酸1(0.4～1.1) 0.61比旋度 -40°～50° -42.3°由此方法合成產(chǎn)物經(jīng)過分析確認(rèn)為醋酸奧曲肽。
權(quán)利要求
1.一種醋酸奧曲肽的固相合成方法，過程是合成八肽；將八肽制成水溶液在空氣中自然氧化后制成奧曲肽；向奧曲肽水溶液中加入冰醋酸后凍干，制成醋酸奧曲肽凍干粉；其特征在于，所說的合成八肽的過程是將芴甲氧羰基蘇胺醇與對羧基苯甲醛反應(yīng)生成芴甲氧羰基蘇胺醇對羧基苯縮醛，將其鍵合在高分子樹脂載體上，然后按順序與保護氨基酸殘基依次鍵合后得到八肽樹脂，將八肽從樹脂上切落。
2.按照權(quán)利要求1所述的醋酸奧曲肽的固相合成方法，其特征在于，縮醛化反應(yīng)中使用的催化劑是對甲苯磺酸。
3.按照權(quán)利要求1所述的醋酸奧曲肽固相合成方法，其特征在于，所說的高分子樹脂載體是氨基AM樹脂或氨基MBHA樹脂。
4.按照權(quán)利要求1所述的醋酸奧曲肽的固相合成方法，其特征在于，所說的保護氨基酸均為芴甲氧羰基保護，其中第二肽和第七肽氨基酸殘基是三苯甲基或乙酰胺甲基或叔丁基，第三肽氨基酸殘基是叔丁基或三苯甲基或偏磷酸芐基，第四肽氨基酸殘基是叔丁氧羰基或乙?；?-氯芐基，第五肽氨基酸殘基是叔丁氧羰基。
5.按照權(quán)利要求1所述的醋酸奧曲肽的固相合成方法，其特征在于，制成八肽水溶液濃度是0.1～10mmoL/mL。
6.按照權(quán)利要求1所述的醋酸奧曲肽的固相合成方法，其特征在于，制成醋酸奧曲肽凍干粉過程中，冰醋酸在奧曲肽水溶液中的濃度是1～10％。
全文摘要
本發(fā)明的醋酸奧曲肽的固相合成方法屬多肽合成領(lǐng)域。首先將縮醛化產(chǎn)物與高分子樹脂鍵合；將鍵合后的產(chǎn)物按順序與保護氨基酸殘基依次鍵合并脫保護得到八肽樹脂；將八肽從樹脂上切落后制成水溶液，并在空氣中自然氧化后制成奧曲肽；向奧曲肽水溶液中加入冰醋酸后凍干，制成醋酸奧曲肽。本發(fā)明合成工藝簡單，容易操作，工藝時間縮短，反應(yīng)配比小，節(jié)約原料，降低了成本，而且產(chǎn)率和純度提高，副反應(yīng)和副產(chǎn)物少，便于純化，有益于大批量生產(chǎn)。
文檔編號C07K7/06GK1569890SQ20041001083
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者賈志丹, 王恩思 申請人:長春力爾凡藥業(yè)有限公司