專利名稱：一種快速大量提純貝殼珍珠層可溶性蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)在較短時(shí)間內(nèi)分離提純大量貝殼蛋白質(zhì)的方法，生產(chǎn)的產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于生物材料和體外培育珍珠的研究和生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
探討貝殼的形成機(jī)制為納米材料、礦物質(zhì)聚合材料和模板晶體等新材料的開(kāi)發(fā)開(kāi)啟了一個(gè)新的思路?？扇苄载悮さ鞍踪|(zhì)(SMP)在貝殼的形成過(guò)程中起了決定性作用，調(diào)控CaCO3晶體的沉積，包括方解石和文石晶體的核化、生長(zhǎng)、物相轉(zhuǎn)換和晶體形態(tài)等。近些年的研究表明貝殼蛋白質(zhì)能夠促進(jìn)人類造骨細(xì)胞的分化、誘導(dǎo)骨的生成、促進(jìn)骨修復(fù)，因而逐漸應(yīng)用到材料醫(yī)學(xué)上?？扇苄载悮さ鞍踪|(zhì)的提取主要是利用EDTA或者乙酸浸泡貝殼粉，離心得到上清液，然后透析上清液得到蛋白質(zhì)。目前，關(guān)于可溶性貝殼蛋白質(zhì)的純化方法主要是通過(guò)SDS-PAGE電泳，從凝膠上回收蛋白質(zhì)。這種方法簡(jiǎn)便、快速，但是產(chǎn)量低且會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。另外一種純化方法是通過(guò)高效液相色譜(HPLC)獲得純化可溶性貝殼蛋白質(zhì)。這種方法提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)量，且一定程度上解決了蛋白質(zhì)變性的問(wèn)題。但是，獲得的可溶性貝殼蛋白質(zhì)在量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足醫(yī)學(xué)中骨修復(fù)的臨床應(yīng)用和體外培育珍珠的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用先進(jìn)的快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)大量提純可溶性貝殼蛋白質(zhì)的方法，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
一種快速大量提純貝殼珍珠層可溶性蛋白質(zhì)的方法，包括對(duì)貝殼進(jìn)行沖洗、酸處理、粉碎、透析、離心和干燥提取貝殼蛋白質(zhì)，其特征是再利用FPLC的脫鹽和陰離子交換層析對(duì)上述貝殼蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。
利用本發(fā)明可以在較短時(shí)間內(nèi)大量獲得純化的可溶性貝殼蛋白質(zhì)，并且能保持其活性。一般在提取到貝殼可溶性蛋白質(zhì)后，通過(guò)FPLC在20分鐘時(shí)間內(nèi)便可完成一次純化循環(huán)。每次循環(huán)可以得到0.3～0.6毫克純化的可溶性貝殼蛋白質(zhì)。本發(fā)明可以加速可溶性貝殼蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)人類骨的生成、促進(jìn)骨修復(fù)的臨床應(yīng)用，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)體外培育高附加值的珍珠奠定技術(shù)基礎(chǔ)。


附圖1為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)對(duì)皺紋盤(pán)鮑貝殼珍珠層可溶性蛋白質(zhì)脫鹽時(shí)得到的色譜圖。
附圖2為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)對(duì)脫鹽后的皺紋盤(pán)鮑貝殼珍珠層可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行陰離子交換層析時(shí)得到的色譜圖。
附圖3為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)對(duì)陰離子交換層析所得的貝殼蛋白質(zhì)B峰進(jìn)行反相層析時(shí)得到的色譜圖。
附圖4為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)陰離子層析和反相層析所得的蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離所得的電泳圖。圖中MW為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，Sample為FPLC陰離子層析或反相層析所得的蛋白峰。
附圖5為不添加任何貝殼蛋白質(zhì)的情況下，CaCO3超飽和溶液中典型的菱形立方方解石沉積的掃描電鏡照片。
附圖6為添加快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)中用陰離子交換層析所得的蛋白B峰的情況下，CaCO3超飽和溶液中對(duì)稱的猬狀文石沉積的掃描電鏡照片。
具體實(shí)施例方式
將皺紋盤(pán)鮑貝殼表面用自來(lái)水刷洗干凈，放入5％的氫氧化鈉溶液中浸泡10小時(shí)，取出后刷去表面雜質(zhì)及附著物，用蒸餾水沖凈后室溫下陰干24小時(shí)，得到干凈的貝殼。用酸處理貝殼，去除角質(zhì)層和棱柱層，得到純的珍珠層。將珍珠層貝殼粉碎，用含0.01％NaN3的濃度為5％的醋酸溶液透析72小時(shí)以上，再用蒸餾水透析72小時(shí)，得到含有珍珠層可溶性貝殼蛋白質(zhì)的溶液，將其在20,000g下離心30分鐘。取上清液，真空干燥，得到干粉狀可溶性蛋白質(zhì)。
利用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)兩種手段進(jìn)行貝殼蛋白質(zhì)的分離提純，具體方法和結(jié)果如下(1)脫鹽。將可溶性貝殼蛋白質(zhì)干粉溶于超純水，在FPLC系統(tǒng)中脫鹽，條件是脫鹽柱HiTrapTMDesalting G25；洗脫液pH8.0的20mMTris-Hcl；平衡1個(gè)柱床；洗脫4個(gè)柱床；流速6毫升/分鐘；三個(gè)脫鹽柱聯(lián)用。所得的峰譜如圖1。
(2)陰離子交換分離。將脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液在FPLC系統(tǒng)中用陰離子交換柱進(jìn)行分離，條件是離子交換柱HiTrapTMDEAE Sepharose；洗脫液ApH8.0的20mM Tris-Hcl；洗脫液BpH8.0的20mM Tris-Hcl+1MNaOH；平衡2個(gè)柱床；沖洗2個(gè)柱床；洗脫梯度洗脫液B在10個(gè)柱床內(nèi)保持24％，然后在5個(gè)柱床內(nèi)升至70％；流速2毫升/分鐘。陰離子交換層析得到三個(gè)峰，分別是流穿峰、蛋白A峰和蛋白B峰，所得的峰譜如圖2。
(3)反相分離。將陰離子交換得到的蛋白B峰在FPLC系統(tǒng)中用反相柱進(jìn)行提純，條件是反相柱RESOURCETMRCP；洗脫液ApH2.17濃度為0.065％的三氟乙酸(TFA)+2％的乙睛；洗脫液BpH1.75濃度為0.05％的TFA+80％乙睛；平衡2個(gè)柱床；沖洗2個(gè)柱床；洗脫梯度洗脫液B在15個(gè)柱床內(nèi)由0％升至100％，保持2個(gè)柱床；流速1毫升/分鐘。反相層析只得到一個(gè)峰，峰譜如圖3。
(4)SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳。將陰離子層析或反相層析得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分離，二者都只得到1條帶，并且其分子量相同(15.1kDa)。條件是分離膠18％；濃縮膠24％；電壓150V；電泳時(shí)間90分鐘；電泳槽Mini-PROTEAN II(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)。電泳結(jié)果表明反相層析得到的峰，即陰離子交換層析得到的蛋白B峰為1種純的蛋白質(zhì)。電泳圖見(jiàn)圖4。
在此基礎(chǔ)上，配制CaCO3超飽和溶液，分別觀察在不添加任何貝殼蛋白質(zhì)和添加陰離子交換層析所得的蛋白B峰的情況下生成CaCO3晶體的物相，并用掃描電鏡分析晶體的結(jié)構(gòu)特性。結(jié)果表明A處理得到典型的菱形立方方解石；B處理得到對(duì)稱的猬狀文石(分別如圖5和圖6)。說(shuō)明在FPLC系統(tǒng)中用陰離子交換層析得到的蛋白質(zhì)保留了其生物活性。
應(yīng)用本發(fā)明提純雜色鮑、海灣扇貝、海螺、淡水珍珠蚌和大瓶螺貝殼珍珠層的可溶性蛋白質(zhì)，可以得到類似的結(jié)果。
本發(fā)明中脫鹽用洗脫液為pH7.5-8.5的濃度為20mM的Tris-Hcl；2-5個(gè)脫鹽柱聯(lián)用；流速為5-6毫升/分鐘。陰離子交換所用的洗脫液A為pH7.5-8.5的濃度為20mM的Tris-Hcl，洗脫液B為pH7.5-8.5的濃度為20mMTris-HCl+1M NaOH；洗脫梯度為洗脫液B在10個(gè)柱床內(nèi)保持24％，然后在5個(gè)柱床內(nèi)升至70％；流速為1-2毫升/分鐘。
權(quán)利要求
1.一種快速大量提純貝殼珍珠層可溶性蛋白質(zhì)的方法，包括對(duì)貝殼進(jìn)行沖洗、酸處理、粉碎、透析、離心和干燥提取貝殼蛋白質(zhì)，其特征是再利用FPLC的脫鹽和陰離子交換層析對(duì)上述貝殼蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的脫鹽用洗脫液為pH 7.5-8.5的濃度為20mM的Tris-Hcl；2-5個(gè)脫鹽柱聯(lián)用；流速為5-6毫升/分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的陰離子交換所用的洗脫液A為pH 7.5-8.5的濃度為20mM的Tris-Hcl，洗脫液B為pH7.5-8.5的濃度為20mMTris-HCl+1M NaOH；洗脫梯度為洗脫液B在10個(gè)柱床內(nèi)保持24％，然后在5個(gè)柱床內(nèi)升至70％；流速為1-2毫升/分鐘。
全文摘要
一種快速大量提純貝殼珍珠層可溶性蛋白質(zhì)的方法，包括對(duì)貝殼進(jìn)行沖洗、酸處理、粉碎、透析、離心和干燥提取貝殼蛋白質(zhì)，其特征是再利用FPLC的脫鹽和陰離子交換層析對(duì)上述貝殼蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。利用本發(fā)明可以在較短時(shí)間內(nèi)大量獲得純化的可溶性貝殼蛋白質(zhì)，并且能保持其活性。一般在提取到貝殼可溶性蛋白質(zhì)后，通過(guò)FPLC在20分鐘時(shí)間內(nèi)便可完成一次純化循環(huán)。每次循環(huán)可以得到0.3～0.6毫克純化的可溶性貝殼蛋白質(zhì)。本發(fā)明可以加速可溶性貝殼蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)人類骨的生成、促進(jìn)骨修復(fù)的臨床應(yīng)用，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)體外培育高附加值的珍珠奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1613871SQ20041002458
公開(kāi)日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2004年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者張文兵, 麥康森, 徐瑋, 李靜, 董瑞娜, 趙建民, 譚北平, 艾慶輝, 劉付志國(guó), 馬洪明 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)