專利名稱：治療腫瘤和血管再狹窄的微管穩(wěn)定劑埃坡霉素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)定向篩選獲得，以埃坡霉素D為主要代謝產(chǎn)物而不產(chǎn)生埃坡霉素A和B的新菌株S.cellulosum BGS4。并采用埃坡霉素D作為起始原料，生產(chǎn)制得新型埃坡霉素衍生物，反式-9，10-脫氫埃坡霉素D；本發(fā)明還進(jìn)一步涉及埃坡霉素在制備抗增生性疾病的藥物組合物中的應(yīng)用，以及埃坡霉素類化合物在包覆可植入體內(nèi)的支架中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
埃坡霉素是16元大環(huán)內(nèi)酯化合物。它們首先被G.Hofle及其同事從粘細(xì)菌Sorangium cellulosum中分離提取出來(lái)，主要成分為埃坡霉素A(EpothiloneA)和B(Epothilone B)(結(jié)構(gòu)式如下所示)，它們?cè)谠摼幸?∶1的比例產(chǎn)生，且具有抗真菌的活性(參見(jiàn)K.Gerth等，1996，J.Antibiotics 49560-563和德國(guó)專利DE 4138042)。埃坡霉素A和B后來(lái)被認(rèn)為是一類新型的天然存在的微管解聚抑制劑。盡管在結(jié)構(gòu)上和紫杉醇(Taxol)并不相同，但它們?cè)谧鳛槲⒐芫酆虾臀⒐芊€(wěn)定劑方面有相似的作用機(jī)理(Hofle，G.，等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.351567-1569，1996和Bollag，D.M.，等，1995.Cancer Res 55，2325-2333)。在現(xiàn)有治療腫瘤的具有細(xì)胞毒活性的藥物中，紫杉醇不但在臨床上很重要，而且商業(yè)上也很成功。因此埃坡霉素被廣泛地認(rèn)為是繼紫杉醇以后可成為又一高效的細(xì)胞毒抗癌劑。
埃坡霉素C(Epothilone C)和D(Epothilone D)(結(jié)構(gòu)式如下所示)，即分別為埃坡霉素A和B的12，13-脫氧-配對(duì)物，在目前研究的天然產(chǎn)生的埃坡霉素中，埃坡霉素D顯示出最低的毒性(Chou等，Proc Natl Acad Sci USA95，15798(1998))，以及對(duì)多種癌癥和其他不正常細(xì)胞增生癥的最大療效(參見(jiàn)Harris等.，1999，Soc.Chim.Ther.25187)。
R＝H，epothilone A R＝H，epothilone CR＝CH3，epothilone BR＝CH3，epothilone D然而，在天然菌株S.cellulosum(So ce 90)的發(fā)酵物中，埃坡霉素D只作為埃坡霉素復(fù)合混合物中的微量成分存在。而實(shí)際上為了滿足臨床治療的需要，必須具有較經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵方法生產(chǎn)足量的埃坡霉素D，才具有實(shí)際的應(yīng)用及開(kāi)發(fā)價(jià)值。另一方面，如果能獲得大量的埃坡霉素D，則可利用它生產(chǎn)活性更好的埃坡霉素衍生物。
對(duì)埃坡霉素生物合成基因族中的基因進(jìn)行克隆分析，以及對(duì)埃坡霉素的異源表達(dá)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了以下的生物合成途徑首先，由埃坡霉素聚酮化合物合成酶(PKSs)合成埃坡霉素C和D(以2∶1的比例產(chǎn)生)作為中間產(chǎn)物；然后，epoK基因產(chǎn)物-細(xì)胞色素P450氧化酶作用于埃坡霉素C和D，而分別形成環(huán)氧化產(chǎn)物埃坡霉素A和B。盡管在S.cellulosum中，埃坡霉素C和D先被合成出來(lái)，但其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于埃坡霉素A和B。由于非環(huán)氧化形式的埃坡霉素C和D在毒性上遠(yuǎn)低于埃坡霉素的環(huán)氧化配對(duì)物，因此埃坡霉素C和D的產(chǎn)量成為有效開(kāi)發(fā)的重要因素。目前，缺乏一個(gè)高效生產(chǎn)埃坡霉素D的發(fā)酵工藝已經(jīng)成為將該類化合物開(kāi)發(fā)成更好的抗癌藥或其它治療劑的一大阻礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠大量生產(chǎn)以埃坡霉素D為主要代謝產(chǎn)物的新菌株Sorangium cellulosum BGS4，并于2004年8月11日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCC NO.1206。。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的埃坡霉素衍生物，反式-9，10-脫氫埃坡霉素D，它是一種具有更好的抑制細(xì)胞增生性能的埃坡霉素衍生物。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種埃坡霉素在制備抗增生性疾病的藥物組合物，尤其涉及埃坡霉素化合物的凍干粉制劑在制備口服或非腸胃給藥劑型，用于治療如癌癥及其它非癌類的增生性疾??；以及埃坡霉素化合物在包覆可植入體內(nèi)的支架的藥物組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用定向突變篩選方法，獲得了一種以埃坡霉素D為主要代謝產(chǎn)物的新菌株S.cellulosum BGS4。獲得的新菌株由于缺乏EpoK氧化酶功能，在其他條件相同的情況下，該類菌株只產(chǎn)生埃坡霉素C和D作為主要產(chǎn)物，而不產(chǎn)生埃坡霉素A和B。這一變異菌株可通過(guò)一次或多次的基因誘變及定向篩選(產(chǎn)物鑒定)而獲得。同樣也可獲得埃坡霉素D的產(chǎn)量遠(yuǎn)大于埃坡霉素C的誘變菌株。實(shí)施例中描述了菌株S.cellulosum BGS4的獲得以及用這一菌株生產(chǎn)埃坡霉素D的發(fā)酵過(guò)程。
本發(fā)明提供的新的埃坡霉素衍生物，反式-9，10-脫氫埃坡霉素D，它是以埃坡霉素D為起始原料通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化制得的，表現(xiàn)出更好的抑制細(xì)胞增生的性能。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種埃坡霉素在制備抗增生性疾病的藥物組合物，以及在包覆可植入體內(nèi)的支架的藥物組合物中的應(yīng)用。在此提到的埃坡霉素以及之后提到的埃坡霉素是指任何的埃坡霉素或埃坡霉素衍生物，尤其指埃坡霉素D和反式-9，10-脫氫埃坡霉素D及其相關(guān)聯(lián)的化合物。
微管穩(wěn)定劑埃坡霉素可用于治療不同種類的增生性疾病，如癌癥及其它非癌類的增生性疾病，包括但不限于以下的各種疾病頭部和頸部及肝和膽部的癌癥；乳腺癌，卵巢癌，肺癌，腦癌，腸癌，白血病，惡性腫瘤，以及淋巴瘤。可以重復(fù)該治療方法，以根治癌癥或者防止癌擴(kuò)散。
埃坡霉素也能抑制血管生成，從而影響癌的生長(zhǎng)。利用這一性質(zhì)可對(duì)癌和與癌有關(guān)的疾病進(jìn)行治療。此性質(zhì)也可用于對(duì)血管生成抑制劑敏感的其它疾病的治療，該類疾病包括但不限于與視網(wǎng)膜血管相關(guān)的盲癥，關(guān)節(jié)炎，尤其是發(fā)炎性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，血管再狹窄以及牛皮癬等。另一方面，埃坡霉素可用于治療以細(xì)胞過(guò)度增生為特征的非癌類疾病。
埃坡霉素能誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡，這是一個(gè)對(duì)正常發(fā)育和生理平衡很重要的正常細(xì)胞死亡過(guò)程。凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑的改變可導(dǎo)致許多不同人類疾病的發(fā)生。
現(xiàn)代治療實(shí)體腫瘤的典型方法是采取多種手段外科切除，放射治療和化療等。這些都是最普遍的治療方式，它們還通常聯(lián)合使用。
化療需要對(duì)病人施用細(xì)胞毒藥物。使用這類藥劑是由于它們具有選擇性的細(xì)胞毒活性，它們對(duì)腫瘤組織的作用比對(duì)正常組織的作用高出多倍。如果有目的地把足量的藥直接輸送到預(yù)定的部位，在此情況下，大部分的藥都具有治療作用而只有小部分的藥帶來(lái)了副作用。
本發(fā)明的藥物組合物包括至少一種埃坡霉素或埃坡霉素前體藥(prodrug)和一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其可以通過(guò)非腸胃給藥或/和口服劑型的方式給藥來(lái)治療癌癥。
多重抗藥性使常規(guī)化療藥對(duì)病人不起作用，這種抗藥性的產(chǎn)生是因?yàn)樗幬锉籔-糖蛋白排出細(xì)胞外。在治療癌癥以及其它增生性疾病中，埃坡霉素可以單獨(dú)使用，也可以和其它抗癌藥物和治療手段聯(lián)合使用；埃坡霉素組合物在用于增強(qiáng)其它化療劑的藥效，以及控制多重抗藥性方面非常有用。
埃坡霉素可以和其它的化學(xué)治療劑一起，用于聯(lián)合治療癌癥以及其它增生疾病，尤其是用于癌癥的輔助治療和/或協(xié)同治療，對(duì)于需要此種治療的哺乳動(dòng)物(如人類)給予有效劑量的埃坡霉素與至少一種其它抗癌藥物形成的組合藥劑。例如，可以和埃坡霉素一起用于聯(lián)合治療的其它化學(xué)治療劑可選自抗代謝物，如氟尿嘧啶和健澤(Gemcitabine)，或者選自烷化劑如卡鉑(Carboplatin)和順鉑(Cisplatin)，或者選自信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑如Iressa，Herceptin和geldanamycins以及它們的衍生物。聯(lián)合治療可以采用先后給藥方式，也就是先用第一種藥劑治療然后用第二種藥劑，或者兩種藥劑在治療中同時(shí)使用的方式。
本發(fā)明提供了對(duì)紫杉烷(taxane)類的抗癌藥有抗性的患者的治療方法。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以推知埃坡霉素化合物的有效劑量。對(duì)人類的典型劑量為約0.05-200mg/kg/天。這一劑量通常以單一劑量形式使用，但也可以研制口服劑及腸胃外給藥，以多劑量使用。
埃坡霉素化合物難于形成制劑，原因在于它們?cè)谒橘|(zhì)中的溶解度較低，并在水溶液中穩(wěn)定性較差。本發(fā)明提供了埃坡霉素在制備抗增生性疾病的藥物組合物中的應(yīng)用，進(jìn)一步涉及該藥物組合物的凍干粉制劑。埃坡霉素制成凍干劑，并于使用前重新加入載體。載體可以為溶劑或者分散介質(zhì)，例如水，乙醇，丙三醇，聚乙烯乙二醇(PEG)，或其合適的混合物，以及植物油等。比較理想的溶劑為酒精，酒精/水混合物，聚乙烯乙二醇300。
本發(fā)明公開(kāi)了腸胃外給藥的埃坡霉素制劑的制備方法，其中埃坡霉素D開(kāi)始被溶解在體積至少占50％的叔丁醇水溶液的混合物中，然后在優(yōu)化的條件下凍干。使用時(shí)，凍干劑首先用Cremophor，丙烯乙二醇和乙醇的混合物重新溶解，然后用乳酸化的林格氏(Ringer’s)試劑稀釋到合適的給藥濃度。此外，該凍干粉制劑還可進(jìn)一步制備成其它注射給藥劑型，如粉針劑。
該凍干粉制劑可進(jìn)一步制備成口服給藥劑型。含有該活性化合物的口服藥可以制成任何通常使用的口服劑型，包括片劑、膠囊、口腔含片、口服懸浮液或溶液，以及和藥學(xué)上可接受的中和緩沖劑相結(jié)合。本方法中緩沖劑的作用在于暫時(shí)中和胃液中的胃酸并因此減少埃坡霉素在病人胃中的降解。
抗酸劑，例如鋁和鎂的氫氧化物、碳酸鹽、硅酸鹽、磷酸鹽都能在服用埃坡霉素時(shí)以及服用前后用于中和胃酸。埃坡霉素和中和緩沖劑的組合既可作為固體口服劑型或可作為液體口服劑。在服藥前，用合適的溶劑或共溶劑溶解埃坡霉素和緩沖成分，以形成溶液或懸浮液。由此所具有的生物活性物質(zhì)利用率應(yīng)至少為20％，最好是不低于50％。
埃坡霉素也可以采用其它制備低水溶性藥物如紫杉醇的制劑方法制得。例如，埃坡霉素可以和維生素E和/或PEG化的維生素E(PEG1000-琥珀酸維生素E)衍生物形成乳劑(參見(jiàn)文獻(xiàn)WO00/71163和US6458373B1)。通常，先將埃坡霉素溶于乙醇，然后加入維生素E和/或PEG化的維生素E衍生物形成治療劑溶液。將乙醇除去，然后形成前體乳劑或者加入含表面活性劑(穩(wěn)定劑)的水溶液來(lái)形成前體乳劑。用于靜脈內(nèi)注射時(shí)，可將前體乳劑分散形成均勻的乳劑。用于作口服藥劑，前體乳劑一般置于凝膠膠囊中。較強(qiáng)水溶性埃坡霉素藥物的制劑方法也可以通過(guò)直接PEG化的埃坡霉素(PEGylated埃坡霉素)；或通過(guò)埃坡霉素上的羥基(如7-OH)直接共價(jià)結(jié)合溶于水的氨基酸多聚體，如聚谷氨酸(poly-l-glutamic acid)。聚谷氨酸的分子量可優(yōu)選25KD至50KD，每個(gè)聚谷氨酸的分子可結(jié)合5至25個(gè)埃坡霉素分子，以增加化合物在水介質(zhì)中的溶解度，以及達(dá)到藥物在體內(nèi)持續(xù)釋放和增強(qiáng)在體內(nèi)的半衰期的目的，同時(shí)也可改善藥物毒性、療效和藥物動(dòng)力學(xué)等方面的特性。
本發(fā)明的埃坡霉素藥物組合物的應(yīng)用，另一方面還涉及該藥物組合物用于包被可植入性醫(yī)療裝置，特別是包被動(dòng)脈或靜脈血管支架，如氣囊膨脹支架(balloon-expandable stents)。埃坡霉素用于包覆支架(類似于線-網(wǎng)管的裝置)以終止血管內(nèi)壁細(xì)胞生長(zhǎng)，從而防止血管再狹窄或動(dòng)脈的再阻塞。
因?yàn)閯?dòng)脈受損后的SMC表型增生類似于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此抗癌藥物可用于防止新內(nèi)膜(neointimal)平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)的生長(zhǎng)。抗細(xì)胞增生劑包覆的支架能在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)釋放足夠濃度的該抑制劑，以阻止內(nèi)膜和基質(zhì)的生長(zhǎng)并進(jìn)入到內(nèi)腔，從而減少血管再狹窄。當(dāng)用于治療再狹窄時(shí)，較為理想的情況是將該化合物用于治療血管成形術(shù)后發(fā)生的再狹窄。當(dāng)用于治療血管成形術(shù)后發(fā)生的再狹窄時(shí)，埃坡霉素在術(shù)前、術(shù)中或術(shù)后使用，或在上述不同時(shí)機(jī)結(jié)合給藥均可。
一方面，本發(fā)明提供了一種藥物輸送方法，該方法采用最小的入侵性技術(shù)，例如導(dǎo)管插入或經(jīng)套管針，將一個(gè)藥物包被的可植入性裝置放置到身體的特定位置例如腫瘤或創(chuàng)傷處，使藥物持續(xù)釋放到這些特定位置。這種裝置可以包括一載體基質(zhì)和在該基質(zhì)上的包覆物。其上的包覆物包括至少一層含有一種或多種藥用的多聚體材料。包覆物的作用在于控制治療劑的釋放。藥用聚合體層可以包含親水性/疏水性多聚體成分。聚合包覆物可選自聚合羧酸，纖維聚合物，白明膠，聚氨酯，聚丙烯酸酯，聚胺類，聚乙烯醇，聚乙烯氧化物，聚酯，聚乙烯丙三醇和多聚糖等。尤其是從例如聚氨酯分散物(BAYHYDROL等)和丙烯酸乳液分散劑等聚合分散物制備而得的包覆物可與本發(fā)明的化合物一起應(yīng)用。
此處描述的藥物可用于已經(jīng)被聚合物包覆的支架。通過(guò)將支架浸入包含有藥物的溶液中，或用含有藥物的溶液噴涂充分的時(shí)間(例如5分鐘)以達(dá)到有效抑制平滑肌細(xì)胞增生的量，以抑制血管再狹窄；然后將包覆的支架干燥，最好通過(guò)風(fēng)干一段時(shí)間(例如30分鐘)達(dá)到干燥。藥物覆蓋的支架然后可通過(guò)球囊導(dǎo)管輸送至冠狀血管處。
本發(fā)明還涉及藥用裝置的多層包覆，其既作為生物相容的表面，也作為藥物傳輸工具。由于這些包覆物能用在對(duì)高處理溫度敏感的裝置上，因此它們特別有優(yōu)勢(shì)，并且它們也可作為將治療劑輸送到身體內(nèi)特定靶區(qū)域的傳輸介質(zhì)。在這一方面，本發(fā)明公開(kāi)了液態(tài)的雙成分生物相容的包覆物的應(yīng)用。進(jìn)一步地，因?yàn)樯锘钚员砻嬉怨矁r(jià)鍵與第一層包覆物的多聚體連接，因此該包覆層永久地連接在基質(zhì)上。于是，生物活性表面具有持久的生物相容性，而第一包覆層允許治療劑，例如抗SMC增生劑被釋放，其作用在于通過(guò)減少血栓形成或SMC增生，從而減少或阻止內(nèi)置管術(shù)后的再狹窄。
在一種方式中采用多層包覆組合物，具生物活性的組合物可形成一個(gè)第二層包被。提供的包覆組合物能賦予基質(zhì)生物相容性，并在體內(nèi)將單層或多層包覆藥釋放并輸送出去。這一包覆組合包括含有有機(jī)酸官能團(tuán)聚合物的分散液或乳液，以及能與聚合物的有機(jī)酸官能團(tuán)反應(yīng)的過(guò)量的聚合交聯(lián)劑。藥物本身基本上與聚合物或與交聯(lián)劑不起反應(yīng)，只不過(guò)分散在分散液或乳液中。將第一層包覆物干燥，使其與基質(zhì)表面結(jié)合，其中未反應(yīng)的多功能交聯(lián)劑仍存在于第一層交聯(lián)包覆物中。之后在已干燥的第一層包覆物上涂敷第二層包覆物，使基質(zhì)上形成連續(xù)的生物活性表面包覆層，第二層包覆可為液態(tài)生物活性劑的溶液或分散劑，或是化學(xué)修飾過(guò)的含有有機(jī)酸官能團(tuán)或金屬鹽的功能等同物。
在本發(fā)明中，分散液或乳液中用于第一層包覆物的含有有機(jī)酸官能團(tuán)的聚合物的選擇取決于被包覆基體的性質(zhì)。第一層包覆組合物中的聚合物可以為均聚物或共聚物，例如乙烯單體單元，聚氨酯環(huán)氧樹(shù)脂以及它們之間的任意組合等。不過(guò)，第一層包覆組合物中的聚合物最好包括含有有機(jī)酸官能團(tuán)的聚氨酯，聚丙烯酸酯，以及聚甲基丙烯酸酯等，特別是含有內(nèi)部乳化劑，例如羧酸或磷酸等乳化了的親水聚氨酯。第一層包覆物中聚合物的濃度約為1～40wt％。第一層包覆物還包括一種或多種多官能交聯(lián)劑，其可與有機(jī)酸官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。優(yōu)先選擇的多官能交聯(lián)劑包括多官能氮丙啶，以及多官能炭化二亞胺。在本發(fā)明中，其他可使用的交聯(lián)劑包括例如Zeneca resins出售的商品名為NeoCryl CX100的制劑。第一層包覆組合物中交聯(lián)劑的濃度范圍占固體成分的0.5～20wt％，理想的干燥溫度范圍為約15℃～35℃。在許多情況下，室溫干燥12小時(shí)就可以了。本發(fā)明的治療劑應(yīng)為埃坡霉素D或其功能等同物，包括同族物、類似物及其衍生物等。在這一實(shí)施方式中，埃坡霉素D或其功能等同物分散在第一包覆層中。一旦進(jìn)入體內(nèi)，埃坡霉素D從第一包覆層可控制地逐漸釋放到周圍的環(huán)境中，作為SMC抑制劑阻止或減少新內(nèi)膜在基質(zhì)表面生長(zhǎng)。這種藥物包覆支架通過(guò)球囊導(dǎo)管可傳輸?shù)焦跔钛苤小?br> 本發(fā)明使用的第二層包覆物的生物活性物質(zhì)可以是含有機(jī)酸官能團(tuán)的多聚糖。本發(fā)明優(yōu)先考慮的多聚糖生物活性試劑為糖胺聚糖(GAGs)。GAGs帶有大量負(fù)電荷，非常適合通過(guò)交聯(lián)劑上過(guò)量的、未反應(yīng)的官能團(tuán)，以共價(jià)鍵的形式與第一層包覆物連接。GAGs生物活性試劑最好優(yōu)選肝素或其功能等同物。第一和第二包覆層干燥后，通過(guò)過(guò)剩的未反應(yīng)的多官能交聯(lián)劑使生物活性劑的有機(jī)酸官能團(tuán)和聚合物之間形成共價(jià)鍵連接。詳見(jiàn)實(shí)施例的敘述。


圖1為S.cellulosum BGS4中埃坡霉素的產(chǎn)生圖2A為實(shí)施例2中從BGS4培養(yǎng)物XAD洗脫液獲得的產(chǎn)品的HPLC色譜圖.
圖2B為埃坡霉素D的質(zhì)譜圖.
圖3為埃坡霉素D的1H-NMR4埃坡霉素D和紫杉醇對(duì)裸鼠人非小細(xì)胞肺癌模型的療效具體實(shí)施方式
實(shí)施例1通過(guò)基因誘變和定向篩選的方法，得到含有一個(gè)失活epoK基因的S.cellulosum的突變菌株BGS4。
所用的S.cellulosum菌株So ce 90是從德國(guó)微生物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms)得到，保藏號(hào)為DMS6773。
將含DMS6773菌株的安瓿轉(zhuǎn)移到裝有10ml G52培養(yǎng)基的50-ml的錐形燒瓶中，并在30℃，180rpm攪拌條件下培養(yǎng)6天。將5ml的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml G52培養(yǎng)基的250-ml錐形燒瓶中，在30℃，180rpm攪拌條件下培養(yǎng)3天。G52培養(yǎng)基包含0.2％酵母提取物，低鹽(BioSpringer，Maison Alfort，F(xiàn)rance)；0.1％ MgSO4.7H2O；0.1％ CaCl2.2H2O；0.2％脫脂大豆粉Soyamine50T(Lucas Meyer，Hamburg，Germany)；0.8％土豆淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，Switzerland)；0.2％脫水葡萄糖；1ml/L的EDTA-Fe(III)-Na鹽(8g/L)；用KOH調(diào)節(jié)PH值到7.4(其中的百分?jǐn)?shù)是質(zhì)量百分含量，下同)。
將0.1ml的上述培養(yǎng)物鋪到含有瓊脂培養(yǎng)基S42的幾個(gè)有蓋培養(yǎng)皿上。S42培養(yǎng)基包含0.05％胰化蛋白胨，0.15％ MgSO4.7H2O，1.2％ HEPES和1.2％瓊脂，用KOH調(diào)節(jié)PH值到7.4。高壓滅菌后，在每升S42培養(yǎng)基中加入如下物質(zhì)10ml的過(guò)濾滅菌了的10％ CaCl2.2H2O，1ml的6％K2HPO4，1ml的EDTA-Fe/亞硫酸氫鈉溶液，8ml的40％過(guò)濾滅菌了的葡萄糖，10ml的5％硫酸胺和35ml的高壓滅菌過(guò)的Spent培養(yǎng)基。然后將該平皿曝露在UV光下(最大射線范圍為250-300nm)，在500μ瓦/cm2下維持90-120秒。然后在30℃培養(yǎng)6-9天，直到獲得1-2mm大的單獨(dú)的菌落。通過(guò)扇形塑料環(huán)，將100-150個(gè)菌落分別移到含有S42瓊脂的有蓋培養(yǎng)皿上(每個(gè)平皿4部分)，在30℃培養(yǎng)7天。用塑料環(huán)將在瓊脂上長(zhǎng)成的約1cm2菌落轉(zhuǎn)移到含有10ml G52培養(yǎng)基的50-ml錐形燒瓶中，在30℃，180rpm攪拌條件下培養(yǎng)7天。將5ml的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有50ml G52培養(yǎng)基的250-ml錐形燒瓶中，在30℃，180rpm攪拌條件下培養(yǎng)3天。將10ml的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml 23B3培養(yǎng)基中，在30℃，180rpm攪拌條件下培養(yǎng)7天。23B3培養(yǎng)基包括0.2％葡萄糖；2％土豆淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，Switzerland)酵母提取物；1.6％脫脂大豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，Hamburg，Germany)；1ml/L的EDTA-Fe(III)-Na鹽(8g/L)；0.5％HEPES(Fluka，Buchs，Switzerland)；2％聚苯乙烯XAD-16(Rohm & Haas)；用NaOH調(diào)節(jié)PH值到7.8。
使用下列方法測(cè)定培養(yǎng)物中形成的埃坡霉素C和D50ml的培養(yǎng)物用尼龍篩(150μm孔徑)過(guò)濾，用少量水沖洗保留在篩上的XAD-16，然后與濾膜一并放入到50ml離心管中。將10ml異丙醇加入試管中。在180rpm下?lián)u動(dòng)密封好的試管達(dá)1小時(shí)，以溶解與樹(shù)脂結(jié)合的埃坡霉素。接下來(lái)，離心分離1.5ml的液體，將約0.8ml的上清液用移液管轉(zhuǎn)移到HPLC試管中。樣品的HPLC分析結(jié)果如下所述。HPLC分析決定了哪一個(gè)培養(yǎng)物中含有最高含量的埃坡霉素C和D。在上述相應(yīng)菌落的部分平皿上(平皿同時(shí)在4℃存放)，用塑料環(huán)將約1cm2瓊脂區(qū)域的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10ml G52培養(yǎng)基中，在30℃，180rpm攪拌條件下培養(yǎng)7天。將5ml的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到250-ml錐形燒瓶中的50ml G52培養(yǎng)基中，在30℃，180rpm攪拌條件下培養(yǎng)3天。第一次基因突變獲得了含有epoK突變的菌株，并且只產(chǎn)生了埃坡霉素C和D。進(jìn)一步的篩選和突變能夠獲得埃坡霉素D產(chǎn)量提高的菌株，也就是與埃坡霉素C相比，埃坡霉素D的產(chǎn)量更高。在第二，第三次的誘變中，方法與前述的第一次誘變相同，在后一步驟中選用前一步基因誘變中最好的菌落。
將一個(gè)突變篩選的菌株命名為BGS4，并于2004年8月11日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCCNO.1206，該菌株只產(chǎn)生埃坡霉素C和D為主要產(chǎn)物而不產(chǎn)生埃坡霉素A和B。圖1揭示了BGS4中埃坡霉素C和D的產(chǎn)生。
菌株BGS4的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)描述該菌株可以在纖維素作為唯一碳源，并且KNO3作為唯一氮源的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，例如，在ST2礦物鹽瓊脂上的濾紙上生長(zhǎng)(0.1％ KNO3；0.1％ MgSO4.7H2O；0.1％ CaCl2.2H2O；0.1％ K2HPO4；0.01％ MnSO4.7H2O；0.02％ FeCl3；0.002％酵母提取物；標(biāo)準(zhǔn)微量元素溶液；1％瓊脂)。在這種培養(yǎng)基上，形成了暗微紅-褐色到黑色-褐色子實(shí)體(fruitingbodies)。該生長(zhǎng)桿菌(vegetative bacilli)具有Sorangium菌種典型的形狀(相當(dāng)?shù)木o密度，在相差顯微鏡下，可觀察到暗的，帶有寬的圓末端的圓柱狀的桿菌，平均為3-6um長(zhǎng)和1um厚)。
實(shí)施例2從突變菌株S.cellulosum BGS4中生產(chǎn)埃坡霉素D主要培養(yǎng)基1B12馬鈴薯淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，Swizerland)2％，脫脂大豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，Hamburg，Germany)1.1％，EDTA-Fe(III)-Na鹽(8g/l)1ml，用KOH調(diào)節(jié)PH到7.8。
維持種子培養(yǎng)物從液氮中取出1ml的冷凍細(xì)胞庫(kù)接種到10ml的G52中，并在30℃，180rpm，25mm位移的條件下培養(yǎng)3天。將5ml種子培養(yǎng)物加入45ml的G52中生長(zhǎng)3天，然后將此50ml的培養(yǎng)物加入450ml的G52中生長(zhǎng)3天。以后每3-4天，以10％接種量將50ml種子培養(yǎng)物接種到450ml的G52中，以進(jìn)行連續(xù)的種子培養(yǎng)。
20L中間種子培養(yǎng)物將含有18L G52培養(yǎng)物培養(yǎng)基在30L的發(fā)酵罐中用2L前種子培養(yǎng)液接種，并持續(xù)培養(yǎng)3-4天，條件為30℃，250rpm，0.5L空氣/L/分鐘，過(guò)壓為0.5bars，不控制PH值。加入10ml硅樹(shù)脂消泡劑(Tegosipon，Goldschidt AG，Essen)，以防止泡沫形成。
100L主要發(fā)酵培養(yǎng)物100L發(fā)酵罐加入60L的1B12培養(yǎng)基及2％XAD-16后進(jìn)行滅菌，接種15L中間種子培養(yǎng)物。發(fā)酵培養(yǎng)6-7天，條件為30℃，200rpm，0.5L空氣/L/分鐘，過(guò)壓為0.5bars，用H2SO4控制PH值為7.6+/-0.5。
產(chǎn)品分析從發(fā)酵罐中取出50ml含聚苯乙烯樹(shù)脂AmberliteXAD-16(Rohm+Haas，F(xiàn)rankfurt，Germany)的樣品。用150μm的尼龍篩過(guò)濾樹(shù)脂，用少量水洗滌后，將濾液合并到15ml的Nunc管中。加入10ml甲醇并在室溫下?lián)u動(dòng)30分鐘。取2ml離心后的上清液用于HPLC分析。樣品注射通過(guò)4.6×10mm的保護(hù)柱(guard column)中(Inertsil，ODS-3，5μm)，然后以從35％到100％乙腈的梯度，以1ml/min的流速，在UV250nm下10分鐘內(nèi)通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)分離柱(4.6×150mm，Inertsil，ODS-3，5μm)。埃坡霉素D在9.9分鐘時(shí)洗脫出來(lái)，埃坡霉素C在9.1分鐘時(shí)洗脫出來(lái)(而埃坡霉素A和B應(yīng)分別在6.5分鐘和7.3分鐘時(shí)洗脫出來(lái))。
從100L發(fā)酵培養(yǎng)物中分離代謝產(chǎn)物用過(guò)濾器收集XAD。用水洗滌后，加入30L甲醇并攪拌30分鐘洗脫。通過(guò)蒸發(fā)器濃縮洗脫液并除去甲醇，用EtOAc抽提余下的水相3次。提取物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至干，然后溶解于500ml甲醇中，用折疊的過(guò)濾器濾去不溶物。將溶液加入Sephadex LH20柱中并用甲醇洗脫。將含有代謝物的提餾部分濃縮至干并再次溶解在50％的甲醇中，并裝載在C18反相色譜柱上(55×4.8cm，Bakerbond，40μm)，該色譜柱預(yù)先被3體積50％的甲醇溶液平衡過(guò)(裝載流速平均為100ml/分鐘)。并依次用0.5L 50％，1.1L 55％，1.3L 60％，0.5L 65％的甲醇(流速為100mL/分鐘)洗脫裝載柱。餾分用UV監(jiān)測(cè)儀在250nm監(jiān)測(cè)。將產(chǎn)品庫(kù)稀釋至40％，用泵打入70ml的C18反相色譜柱上(9×10cm)，流速平均為360ml/分鐘。用0.1L 40％的甲醇洗滌，并用350ml 100％的乙醇洗脫裝載柱。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將洗脫液蒸發(fā)至干。(4)在10ml丙酮中重懸浮固體，用Whatman 2號(hào)濾紙過(guò)濾除去不溶物。在丙酮濾液中加入0.2g脫色碳。攪拌該混合物達(dá)1小時(shí)，然后用Whatman 50號(hào)濾紙過(guò)濾。合并濾液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥。埃坡霉素D餾分的結(jié)晶條件為在良好的攪拌下，在大口杯中以15ml 100％的甲醇重懸浮干燥物，并緩緩加入7.7ml水(于66％時(shí)達(dá)到飽和)。必要時(shí)加入少量(1mg)晶種以促進(jìn)晶體的形成。
圖2A為從BGS4培養(yǎng)物XAD洗脫液獲得的產(chǎn)品的HPLC色譜圖。圖2B為埃坡霉素D的質(zhì)譜圖。埃坡霉素D的1H NMR(400MHz)的數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3，以QNP zaxis梯度探測(cè)頭裝備的Bruker DRX400分光計(jì)在300K下CDCl3溶液環(huán)境下測(cè)得的。CDCl3溶液的化學(xué)變化是指1H譜中的δ7.26。埃坡霉素DHRESITOFMS m/z；C27H42NO5S計(jì)算值492.2778；[M+H]+492.2775。
實(shí)施例3使用埃坡霉素D作為起始原料合成反式9，10-脫氫埃坡霉素D衍生物(VIII)反應(yīng)路線1 反應(yīng)路線2
反應(yīng)路線3 通過(guò)埃坡霉素D降解生產(chǎn)甲基酮I是已知的。Baeyer-Villiger氧化產(chǎn)生了乙酸酯II，其經(jīng)過(guò)水解和氧化后又能產(chǎn)生醛III。通過(guò)已知的方法形成不飽和的醛IV，其隨后可轉(zhuǎn)化為烯丙基乙酸酯V。通過(guò)丙烯基乙酸酯V和乙烯基銅VI的烷基化反應(yīng)，繼而通過(guò)內(nèi)酯環(huán)化(macrolactonization)反應(yīng)，制備得到新型的化合物9，10-脫氫埃坡霉素D(VIII)，其中，該乙烯基銅VI是從相應(yīng)的乙烯碘(反應(yīng)路線3)而制得的。
9，10-脫氫埃坡霉素DHRESITOFMS m/z；C27H40NO5S計(jì)算值490.2622；[M+H]+490.2631。1H-NMR選擇信號(hào)delta＝5.59(ddd，H-10)，5.54(dd，H-9)，5.18(ddd，H-13)，2.98(dd，H-11a)，2.61(dd，H-11b)，2.53(m，H-8)，1.23(d，3H-25)。
實(shí)施例4組合物和制劑凍干粉制劑的制備9.86g埃坡霉素D被潤(rùn)濕并部分溶解于預(yù)先冷卻至5℃，用作USP注射液的600ml 9∶1(V∶V)的叔丁醇和水的混合溶劑中。當(dāng)藥物粉末完全濕潤(rùn)后，再加入預(yù)冷至5℃的用于注射用的600ml 1∶9的叔丁醇和水的混合溶劑，得到最后比例為1∶1的混合物溶液，溶解在避光條件下進(jìn)行。上述形成的溶液在-16℃下經(jīng)過(guò)48小時(shí)迅速凍干(優(yōu)選約200毫托)，然后在15℃高真空下經(jīng)過(guò)48小時(shí)進(jìn)一步干燥(優(yōu)選150毫托)，凍干劑在無(wú)菌條件下包裝在30ml避光小瓶中，每瓶中含有50mg的藥物。
腸胃外給藥劑型，如粉針劑的制備使用時(shí)，凍干劑用封裝在不同小瓶中的5.5ml的Cremophor EL，丙烯乙二醇和脫水酒精USP的混合液(20∶30∶50(體積比))重新溶解，以使最后藥物的濃度達(dá)到10mg/ml。通過(guò)輕輕旋轉(zhuǎn)小瓶進(jìn)行溶解，在靜脈注射前，通過(guò)每毫升藥物加入用于注射的19ml乳酸化的Ringer’s試劑(每100ml，LR包含氯化鈉USP 0.6g，乳酸鈉0.31g，氯化鉀USP 0.03g，以及二水氯化鈣USP 0.02g)，將藥溶液稀釋達(dá)到最終濃度為0.5mg/ml。此稀釋后的藥溶液可通過(guò)輸液在一到六小時(shí)輸入設(shè)定的劑量。
該藥物可通過(guò)口服、經(jīng)靜脈注射，或兩種途徑合并給藥。用溶劑制備口服液代表了另一種方便的口服劑型。一個(gè)合適的化合物口服液(約2mg/ml，強(qiáng)度)可用PEG∶乙醇∶磷酸緩沖鹽(1M，PH8.0)的混合溶劑(55∶15∶30)(體積比)制備而得。
較高水溶性埃坡霉素前體藥物的制備通過(guò)埃坡霉素上的羥基直接共價(jià)結(jié)合溶于水的聚氨基酸多聚體，如聚谷氨酸(poly-l-glutamic acid)。將0.35g聚谷氨酸(分子量為34K)溶于水中。用0.2M HCl將溶液pH調(diào)到2。收集沉淀，并用蒸餾水透析，然后凍干，得到0.29g的聚谷氨酸。在聚谷氨酸(75mg，重復(fù)單元FW 170，0.44mmol)的DMF(1.5ml)溶液中加入20mg的埃坡霉素D、15mg的二環(huán)己基碳化二亞胺和微量的二甲基氨基吡啶。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行4小時(shí)或者通過(guò)薄層層析來(lái)判斷反應(yīng)的完成。反應(yīng)混合物倒入氯仿中，收集沉淀，真空干燥，得到大約65mg的聚谷氨酸偶聯(lián)的埃坡霉素D。改變反應(yīng)中埃坡霉素D和聚谷氨酸的重量比，可得到含有不同濃度埃坡霉素D的聚合偶聯(lián)物。每個(gè)聚谷氨酸的分子可結(jié)合5至25個(gè)埃坡霉素分子。埃坡霉素前體藥物可加入含表面活性劑(穩(wěn)定劑)的水溶液來(lái)形成前體溶液用于靜脈內(nèi)注射。用于作口服藥劑，埃坡霉素前體藥物可一般置于凝膠膠囊中。
其它埃坡霉素化合物或其衍生物均可采用和上述類似的步驟制得各種口服或注射劑型。
實(shí)施例5多層包覆支架的組合物在攪拌條件下將以下的成分陸續(xù)添加到玻璃大口杯中，直到完全混合，制得第一層包覆物NeoRez R981，280ml；0.5％Fluorad FC-129儲(chǔ)存溶液(將1ml Fluora FC-129在100ml的水中稀釋制得)，10ml；34％NH4OH，4ml；NeoCryl CX100，20ml；20％的埃坡霉素D在N-甲基-pyrrolidone(NMP)中的儲(chǔ)存液，20ml。NeoRez R981(來(lái)自Zeneca Resins)是聚酯基的，含有羧酸官能團(tuán)的酯質(zhì)親水性的聚氨酯，其由三乙胺穩(wěn)定，在25℃下具有32％的固體含量，且pH值為7.5-9.0，其中還包括作為共同溶劑的5.3％NMP。添加的NeoCryl CX100(來(lái)自Zeneca Resins)作為交聯(lián)劑。加入Fluorad FC-129(來(lái)自3M)作為勻染劑.氫氧化銨用于調(diào)節(jié)溶液的PH值。第二層包覆物是通過(guò)以下的方法制備而得加入合適量的肝磷脂到300ml的水中，持續(xù)攪拌幾個(gè)小時(shí)，得到1.2％的肝素溶液(Abbott)。
用第一層包覆組合物均勻噴射不銹鋼支架，進(jìn)行包覆，然后在空氣中干燥30分鐘。重復(fù)上述步驟直到達(dá)到必要的包覆厚度。在干燥后的第一包覆層表面噴涂第二包覆組合物，在空氣中干燥過(guò)夜。然后將包覆后的支架在50℃的真空中放置3小時(shí)。得到的包覆層具有可控釋放的埃坡霉素D，并在表面上有共價(jià)鍵連接的肝素。
實(shí)施例6生物活性的測(cè)定體外抗癌活性體外的抗癌活性通過(guò)對(duì)具多重抗藥性(MDR)和藥物敏感癌細(xì)胞施用埃坡霉素D來(lái)測(cè)試。該化合物抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力通過(guò)硫羅丹明B(SRB)試驗(yàn)(參見(jiàn)Skehan等，Natl.Cancer Inst.821107-1112(1990))進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)。體外抗癌活性的測(cè)定在三十多種不同的腫瘤細(xì)胞株中進(jìn)行。這些細(xì)胞的來(lái)源包括頭頸腫瘤，肝膽腫瘤，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，腦癌，皮膚癌，前列腺癌，白血病以及淋巴瘤等。其中12個(gè)腫瘤細(xì)胞株具有MDR特性(見(jiàn)下表)。埃坡霉素D對(duì)所有這些細(xì)胞的IC50都小于100nM，而絕大部分小于10nM，表明它不但對(duì)一般非耐藥性腫瘤細(xì)胞，而且對(duì)多重耐藥性的腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗生長(zhǎng)活性。這與紫杉醇形成了鮮明的對(duì)照。紫杉醇對(duì)具多重耐藥性的腫瘤細(xì)胞系不表現(xiàn)活性，這表明了埃坡霉素D優(yōu)于紫杉醇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明9，10-脫氫埃坡霉素D是具有更好的抑制細(xì)胞增生性能的埃坡霉素D衍生物。
在體外，埃坡霉素D與健澤聯(lián)合使用對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460產(chǎn)生協(xié)同細(xì)胞毒作用，使得這種聯(lián)合使用產(chǎn)生了比兩者加和更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用。為了觀察到這種協(xié)同作用，這兩種藥劑必須以特定的順序給藥。先用埃坡霉素D處理細(xì)胞，然后再加健澤，即可觀察到這種協(xié)同作用。埃坡霉素D還能與其它一些抗癌藥產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。
體內(nèi)抗癌活性埃坡霉素D的體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)在生長(zhǎng)有人類非—小細(xì)胞(non-smallcell)肺癌A549的無(wú)胸腺裸鼠模型中進(jìn)行。裸鼠皮下植入A549癌細(xì)胞(0.2ml，1×107/鼠)10天，直到腫瘤大小接近20mm3后，通過(guò)尾靜脈隔天輸液注射埃坡霉素D5天(Q2Dx5)。通過(guò)測(cè)量腫瘤的體積測(cè)定其療效。
如圖4所示，在療程結(jié)束時(shí)，顯示埃坡霉素D對(duì)治療該腫瘤特別有效。而與此相反，紫杉醇只顯示出部分抑制作用。試驗(yàn)中這一顯著的差別，加上上述體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)得到的結(jié)果，說(shuō)明了埃坡霉素D比其他傳統(tǒng)的抗癌藥物具有更好的療效。
埃坡霉素D的體內(nèi)抗腫瘤活性也在生長(zhǎng)有人類直腸癌HCT-15的無(wú)胸腺裸鼠模型中進(jìn)行了試驗(yàn)。通過(guò)尾靜脈每天推注埃坡霉素D，連續(xù)注射10天。此模型對(duì)紫杉醇具耐藥性。結(jié)果顯示，紫杉醇確實(shí)對(duì)這一腫瘤無(wú)療效，只有3％的抑制率，而埃坡霉素D的抑制率高達(dá)79％，說(shuō)明埃坡霉素D不但有很好的療效，而且能克服腫瘤的耐藥性。

由上表可以看出，對(duì)于同樣四種癌細(xì)胞系，反式9，10-脫氫埃坡霉素D比埃坡霉素D表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑癌活性。
埃坡霉素D的作用機(jī)理用細(xì)胞水平(cell-based)的微管蛋白聚合試驗(yàn)測(cè)定其作用機(jī)理。試驗(yàn)中，在37℃下，用1μm的每一種化合物對(duì)培養(yǎng)于35mm培養(yǎng)皿中的VSMC或NCI/ADR-RES(簡(jiǎn)稱ADR)細(xì)胞處理1小時(shí)。用2ml不含Ca和Mg的PBS洗滌細(xì)胞兩遍，在室溫下用300μL的裂解液(20Mm Tris，PH6.8，1Mm MgCl2，2mM EDTA，1％Triton X-100，加上蛋白酶抑制劑)處理細(xì)胞5-10分鐘而使細(xì)胞裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5ml的Eppendorf管中。室溫下，裂解液在18000g離心12分鐘。將含有可溶性或未聚合的微管蛋白的上清液與含不溶性或聚合的微管蛋白的粒狀沉淀分離，并轉(zhuǎn)移到新管中。然后用300μL的裂解液重新懸浮粒狀沉淀。通過(guò)SDS-PAGE和用β-微管蛋白抗體進(jìn)行免疫印跡分析每個(gè)樣品，然后用NIH Image計(jì)算機(jī)程序分析印跡上β-微管蛋白量的相對(duì)變化。這種變化通過(guò)P/S比值表達(dá)于下表。其中P代表聚合了的微管蛋白，S代表未聚合的微管蛋白。P/S比值越大，則促微管蛋白聚合的能力就越強(qiáng)。埃坡霉素D，在血管平滑肌細(xì)胞系VSMC和在MDR癌細(xì)胞系NIH/ADR-RES內(nèi)都促進(jìn)了微管蛋白的聚合。但紫杉醇只對(duì)VSMC細(xì)胞起作用，而對(duì)MDR癌細(xì)胞系NIH/ADR-RES幾乎沒(méi)有作用。這一結(jié)果說(shuō)明了通過(guò)利用這一作用機(jī)制，埃坡霉素D不但可用于治療癌癥(特別是MDR癌癥)，而且也可用來(lái)防止血管再狹窄。
埃坡霉素D和紫杉醇在細(xì)胞中的促微管蛋白聚合作用

表中的數(shù)字為P/S值。
抑制血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)(VSMC)的體外活性人類和鼠類的VSMC細(xì)胞用埃坡霉素D處理，以測(cè)定這一化合物對(duì)這些細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。其作用能力的大小由IC50值表達(dá)出來(lái)。埃坡霉素D抗人類VSMC的IC50值為10nM，抗鼠類VSMC的IC50值為15nM，這說(shuō)明了埃坡霉素D對(duì)血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用。這一結(jié)果和我們使用埃坡霉素D及其衍生物包覆支架以防止血管再狹窄的構(gòu)想是相吻合的。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)以埃坡霉素D為主要代謝產(chǎn)物的新菌株Sorangium cellulosumBGS4，保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCC NO.1206。
2.一種新型的埃坡霉素化合物，該化合物是反式-9，10-脫氫埃坡霉素D。
3.權(quán)利要求2所述的化合物在制備抗增生性疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物的應(yīng)用，其特征在于該化合物在包覆可植入體內(nèi)的支架的藥物組合物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物組合物是有效劑量的反式-9，10-脫氫埃坡霉素D與至少一種其它抗癌藥物形成的組合藥劑。
6.埃坡霉素類化合物在制備抗增生性疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的埃坡霉素的應(yīng)用，其特征在于所述的增生性疾病包括結(jié)腸腫瘤，泌尿生殖系腫瘤，表皮腫瘤，肺部腫瘤，胸部腫瘤和肝膽腫瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的埃坡霉素的應(yīng)用，其特征在于所述的增生性疾病為對(duì)紫杉烷類的抗癌劑有抗性的腸癌，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌，乳腺癌，表皮性的頭頸腫瘤和肝癌。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的埃坡霉素的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物組合物是有效劑量的埃坡霉素與至少一種其它抗癌藥物形成的組合藥劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的埃坡霉素的應(yīng)用，其特征在于所述的抗癌藥物選自抗代謝物氟尿嘧啶和健澤，烷化劑卡鉑和順鉑，以及信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑Iressa，Herceptin和geldanamycins。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的埃坡霉素的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物組合物制劑為口服給藥劑型。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的埃坡霉素的應(yīng)用，其特征在于所述的制劑為注射給藥劑型。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的埃坡霉素的應(yīng)用，其特征在于所述的埃坡霉素在包覆可植入體內(nèi)的支架的藥物組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)定向篩選獲得，以埃坡霉素D為主要代謝產(chǎn)物而不產(chǎn)生埃坡霉素A和B的新菌株S.cellulosum BGS4，并于2004年8月11日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCCNO.1206。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種化合物反式－9，10－脫氫埃坡霉素D，這是一種以埃坡霉素D作為起始原料，生產(chǎn)制得的新型埃坡霉素衍生物。本發(fā)明還涉及了埃坡霉素類化合物在制備抗增生性疾病的藥物組合物，以及在包覆可植入體內(nèi)的支架中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07D407/00GK1629283SQ20041005665
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月15日
發(fā)明者邱榮國(guó) 申請(qǐng)人:北京華昊中天生物技術(shù)有限公司