專利名稱：牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有機(jī)活性成分-糖蛋白的提取純化方法，特別是涉及一種牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前海洋生物活性物質(zhì)的研究是開發(fā)海洋生物資源的一個(gè)熱點(diǎn)，海洋生物的多樣性和特異性，為人類提供種類繁多，生理活性特異的海洋生物天然產(chǎn)物，它是藥物、保健品、食品、生物材料的巨大寶庫。
世界海岸國家對(duì)牡蠣養(yǎng)殖業(yè)都非常重視，美國是世界上牡蠣養(yǎng)殖最發(fā)達(dá)的國家之一，其次是日本和法國，牡蠣養(yǎng)殖居水產(chǎn)養(yǎng)殖的首位。為促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，保護(hù)環(huán)境，已投入大量資金用于牡蠣殼無污染高值開發(fā)。日本開發(fā)以牡蠣殼殼為原料，生產(chǎn)優(yōu)良天然活性鈣，用于營養(yǎng)型清涼飲料、醫(yī)藥等，每年從我國廉價(jià)進(jìn)口殼粉，提制的活性鈣再高值外銷。美國以牡蠣鈣天然有機(jī)鈣作為食品、醫(yī)藥主要鈣源；美國、德國等國科學(xué)家仿生貝殼尤其牡蠣殼研制無機(jī)生物材料。
國內(nèi)目前有將牡蠣殼高溫煅燒成生石灰使用；由于仍然高能耗，且使牡蠣殼中有機(jī)活性成份煅燒后損失殆盡，個(gè)別地區(qū)少量牡蠣殼被作為土壤肥料或飼料添加劑低值利用，大部分地區(qū)牡蠣殼被直接廢棄為垃圾或填海廢棄。據(jù)最新調(diào)查統(tǒng)計(jì)目前全國牡蠣329萬噸(其中殼占近80％)。我國古代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)《本草綱目》已記敘了蠔殼的多種藥用作用，如蠔殼可“化痰軟堅(jiān)，滋陰潛陽，鎮(zhèn)靜斂汗，固精止帶……”。在民間和中藥中蠔殼被用來治療胃酸過多、消腫、治猩紅熱。表明此類其中含有活性成分[4][5]。現(xiàn)代科學(xué)分析也表明，蠔殼除含鈣40％左右外，尚含生物有機(jī)成份與微量元素。據(jù)國外資料最新報(bào)道，日本研究發(fā)現(xiàn)，蠔殼中的鈣鹽能致密毛細(xì)血管、減低血管的的滲透性、調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡，抑制神經(jīng)肌肉的興奮，因而可用來治療胃及十二指腸潰瘍、盜汗、失眠和眩暈等癥。蠔殼中具有生物活性的殼聚多糖不僅能促進(jìn)調(diào)整T、B淋巴細(xì)胞NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，還能促進(jìn)細(xì)胞因子如白介素、干擾素、腫瘤壞死因子。這表明牡蠣殼中存在活性藥用成分。尤其有機(jī)活性成分。由此可見對(duì)牡蠣殼的藥用作用國內(nèi)外均有不少的研究。但迄今有關(guān)牡蠣殼中藥用有機(jī)活性成分的提取純化方法尚未見報(bào)道。因此，開展這項(xiàng)研究工作對(duì)研究發(fā)現(xiàn)牡蠣殼藥用功能的活性成分、高附加值綜合利用牡蠣殼是一項(xiàng)很有實(shí)用意義的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)用、可行的牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法。該方法能有效地將大而厚的牡蠣殼中的糖蛋白提取純化，牡蠣殼中糖蛋白的分離純化可為深入研究該新穎糖蛋白生物活性，開拓其在醫(yī)藥、保健品、化妝品等方面的應(yīng)用，進(jìn)而高附加值開發(fā)利用牡蠣殼提供實(shí)用有效的的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明是一種牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，它包括以下步驟(1)酸消解將干燥、潔凈的牡蠣殼粉末以無機(jī)酸或有機(jī)酸(水溶液)在5-400C溫度下基本消解至全溶態(tài)；(2)堿液處理將酸解后產(chǎn)物加有機(jī)堿或無機(jī)堿，調(diào)至PH值大于8，5-400C下攪拌2-25min，使酸不溶物盡量溶解后靜置，過濾，得濾液；(3)糖蛋白沉淀在濾液中，緩慢攪拌下，加入沉淀劑至無沉淀產(chǎn)生，靜置、過濾，以透析膜透析或凝膠層析純化后，真空干燥得精制糖蛋白。
所述的無機(jī)酸或有機(jī)酸為無機(jī)酸或有機(jī)酸水溶液。
所述的無機(jī)或有機(jī)酸的濃度為0.1-1 5％。
所述的酸包括鹽酸、硫酸(稀)、硝酸(稀)等無機(jī)酸，或丙酸酸、蘋果酸、乳酸等有機(jī)酸。
所述的無機(jī)堿或有機(jī)堿的濃度為0.1-20％。
所述的無機(jī)堿或有機(jī)堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、西佛堿等含胺基有機(jī)物等。
所述的沉淀劑為濃度1-100％的丙酮、或20-100％的乙醇、或1-20％的硫酸銨。
所述的透析膜為蛋白膠膜、或動(dòng)物膜、或火棉膠膜、或超濾膜。所述的凝膠層析為瓊脂糖凝膠(Sapharose)、聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel)、葡聚糖凝膠(Sephadex)及羧甲基-交聯(lián)葡聚糖(CM-Sephadex)。
采用上述方案后，由于本發(fā)明采用酸溶液、堿溶液、沉淀劑等三種化學(xué)藥品；酸性水溶液可將牡蠣殼中水不溶解性無機(jī)鈣鹽、有機(jī)成分消解為溶解游離態(tài)；堿性水溶液可將酸不溶物予以溶解，同時(shí)調(diào)節(jié)體系pH值為堿性；沉淀劑主要作用是使溶液中糖蛋白沉淀。因而，本發(fā)明是從大而堅(jiān)厚的牡蠣殼中高效提取高純度糖蛋白的一種簡單實(shí)用的有效方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取一定重量牡蠣殼(鮮新為佳)，自來水沖洗干凈后，涼干，粉碎(20-60目)。將干燥、潔凈的牡蠣殼粉末放于耐酸反應(yīng)器中，緩慢加入0.1％鹽酸水溶液，控溫400C反應(yīng)，至牡蠣殼粉基本全溶，向其中加入0.1％氫氧化鈉水溶液，至PH等于8，50C下攪拌5min，使酸不溶物盡量溶解后靜置，過濾，得濾液；在濾液中，緩慢攪拌下，加入100％丙酮沉淀劑至無沉淀產(chǎn)生，靜置、過濾，再以100％丙酮將沉淀洗滌3次，以蛋白膠膜純化后，真空干燥得高純糖蛋白。
實(shí)施例2取一定重量牡蠣殼(鮮新為佳)，自來水沖洗干凈后，涼干，粉碎(20-60目。將干燥、潔凈的牡蠣殼粉末放于耐酸反應(yīng)器中，緩慢加入2％稀硝酸溶液，控溫250C反應(yīng)至牡蠣殼粉基本全溶，向其中加入12％氫氧化鉀水溶液，至PH等于9，250C下攪拌8min，使酸不溶物盡量溶解后靜置，過濾，得濾液；在濾液中，緩慢攪拌下，加入100％乙醇至無沉淀產(chǎn)生，靜置、過濾，再以100％乙醇將沉淀洗滌3次，以火棉膠膜透析純化后，真空干燥得糖蛋白純品。
實(shí)施例3取一定重量洗凈/涼干/粉碎至(20-60目)的牡蠣殼(鮮新為佳)粉于耐酸反應(yīng)器中，緩慢加入15％丙酸溶液，控溫260C反應(yīng)至牡蠣殼粉基本全溶，再向其中加入8％氨水液，至PH等于8.5，200C下攪拌2min，使酸不溶物盡量溶解后靜置，過濾，得濾液；緩慢攪拌下，加入20％的硫酸銨水溶液至無沉淀產(chǎn)生，靜置、過濾，再以100％乙醇或100％丙酮將沉淀洗滌3次，以超濾膜純化后，真空干燥得糖蛋白純品。
實(shí)施例4取一定重量洗凈/涼干/粉碎至(20-60目)的牡蠣殼(鮮新為佳)粉于耐酸反應(yīng)器中，緩慢加入12％乳酸溶液，控溫180C反應(yīng)至牡蠣殼粉基本全溶，再向其中加入1％西佛堿液，至PH等于8.6，380C下攪拌3min，使酸不溶物盡量溶解后靜置，過濾，得濾液；緩慢攪拌下，加入13％的硫酸銨水溶液至無沉淀產(chǎn)生，靜置、過濾，再以100％丙酮將沉淀洗滌4次，以動(dòng)物膜純化后，真空干燥得糖蛋白純品。
實(shí)施例5取一定重量洗凈/涼干/粉碎至(20-60目)的牡蠣殼(鮮新為佳)粉于耐酸反應(yīng)器中，緩慢加入5％檸檬酸溶液，控溫80C反應(yīng)至牡蠣殼粉基本全溶，再向其中加入0.6％氫氧化鈉溶液，至PH等于8.4，100C下攪拌5min，使酸不溶物盡量溶解后靜置，過濾，得濾液；緩慢攪拌下，加入丙酮至無沉淀產(chǎn)生，靜置、過濾，棄上清留沉淀，再以丙酮將沉淀洗滌3次，以尿素Tris-HCl緩沖液(pH8.5)溶解沉淀，將此溶解液加樣于天然瓊脂糖(Sapharose凝膠柱，以6mol/L尿素Tris-HCl緩沖液(0.1mol/L，pH8.5)洗脫，由部分收集器按吸收峰分部收集；對(duì)各組份進(jìn)行鑒定，收集蛋白峰，透析，濃縮，真空干燥得糖蛋白純品。
本發(fā)明的原理牡蠣殼中共生糖蛋白經(jīng)酸、堿分步作用變?yōu)橛坞x態(tài)，經(jīng)蛋白沉淀劑沉淀、過濾、洗滌得粗糖蛋白，將此粗糖蛋白經(jīng)透析或凝膠層析純化、真空干燥后得到精制糖蛋白。
權(quán)利要求
1.一種牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，其特征在于它包括以下步驟(1)酸消解將干燥、潔凈的牡蠣殼粉末以無機(jī)酸或有機(jī)酸在5-400℃溫度下基本消解至全溶態(tài)；(2)堿液處理將酸解后產(chǎn)物加有機(jī)堿或無機(jī)堿，調(diào)至PH值大于8，5-400C下攪拌2-25min，使酸不溶物盡量溶解后靜置，過濾，得濾液；(3)糖蛋白沉淀在濾液中，緩慢攪拌下，加入沉淀劑至無沉淀產(chǎn)生，靜置、過濾，以透析膜透析或凝膠層析純化后，真空干燥得精制糖蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，其特征在于所述的無機(jī)酸或有機(jī)酸為無機(jī)酸或有機(jī)酸水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，其特征在于所述的無機(jī)或有機(jī)酸的濃度為0.1-15％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，其特征在于所述的酸包括鹽酸、硫酸(稀)、硝酸(稀)等無機(jī)酸，或丙酸酸、蘋果酸、乳酸等有機(jī)酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，其特征在于所述的無機(jī)堿或有機(jī)堿的濃度為0.1-20％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，其特征在于所述的無機(jī)堿或有機(jī)堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、西佛堿等含胺基有機(jī)物等。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，其特征在于所述的沉淀劑為濃度1-100％的丙酮、或20-100％的乙醇、或1-20％的硫酸銨。
8.據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，其特征在于所述的透析膜為蛋白膠膜、或動(dòng)物膜、或火棉膠膜、或超濾膜。
9.據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，其特征在于所述的凝膠層析為瓊脂糖凝膠(Sapharose)、聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel)、葡聚糖凝膠(Sephadex)及羧甲基-交聯(lián)葡聚糖(CM-Sephadex)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牡蠣殼中糖蛋白提取純化方法，它包括酸消解、堿液處理、糖蛋白沉淀等三個(gè)步驟。本發(fā)明采用酸、堿、沉淀劑等三種成分的化學(xué)藥品；酸性溶液水可將牡蠣殼中水不溶解性無機(jī)鈣鹽、有機(jī)成分消解為溶解游離態(tài)；堿性水溶液可將酸不溶物予以溶解，同時(shí)調(diào)節(jié)體系pH值為堿性；沉淀劑主要作用是使溶液中糖蛋白沉淀。因而，本發(fā)明是一種從大而堅(jiān)厚的牡蠣殼中高效提取高純度糖蛋白的一種簡單實(shí)用的有效方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1660897SQ200410077580
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月16日
發(fā)明者馬建華 申請(qǐng)人:集美大學(xué)