專利名稱：取代氧雜環(huán)壬烷－2－酮類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的取代氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物、制備取代氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在制備細胞周期抑制劑或細胞調(diào)亡誘導劑及抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術：
有關微生物發(fā)酵產(chǎn)物中具有細胞周期抑制、細胞凋亡誘導等抗腫瘤活性的化合物及其制備方法已有較多報道。如在文獻C.-B.Cui，etal.；Novel mammalian cell cycle inhibitors，cyclotryprostatinsA-D produced by Aspergillus fumigatus，which inhibit mammaliancell cycle at G2/M phaseTetrahedron，Vol.53，No.1，pp.59-72，1997和長田裕之等，新規(guī)物質(zhì)アセトフタリジン、細胞周期阻害剤および抗腫瘍剖，日本專利，公開特許広埁螅A)，特開平9-87269，公告日平成9年(1997年)3月31日中就曾報道了cyclotryprostatin類和acetophtalidin等新類型的活性化合物。但上述迄今所有文獻所報道的活性化合物與氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物具有完全不同的母體骨架結構。
迄今報道的氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物僅二十多個，均為人工合成的化合物，生物活性鮮有報道。如文獻W.C.Still，et al.；Chemicalconsequences of conformation in macrocyclic compounds-Aneffective approach to remote asymmetric inductionTetrahedron，Vol.37，No.23，pp.3981-3996，1981和G.Lenoble，et al.；Anchemoselective and regioselective catalytic way to a novelnine-membered lactone Tetrahedron Letters，Vol.42，pp.3697-3770，2001曾報道了9-甲基-氧雜環(huán)壬烷-2-酮、3，9-二甲基-氧雜環(huán)壬烷-2-酮和5，9，9-三甲基-氧雜環(huán)壬烷-2-酮等化合物的人工合成。從化學結構上看，上述迄今已知的全部人工合成的氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物最典型的特征是在母環(huán)骨架上都沒有羥基、氨基等雜原子與環(huán)骨架碳直接相連的取代基。迄今尚未見有任何有關天然氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種具有細胞周期抑制、細胞凋亡誘導等抗腫瘤活性的取代氧雜環(huán)壬烷-2-酮類新化合物。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及式I取代氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物或其藥學上可接受的鹽 式 I其中，R1和R4可以相同也可不同，為氫、羥基、氨基、磺酸基、C1-C6直鏈或支鏈烷基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯基、C1-C6直鏈或支鏈烷氧基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯氧基；R2和R3可以相同也可不同，但其中至少一個為羥基等與環(huán)骨架碳原子直接相連的氧取代基，另一個可以是氫、羥基、氨基、磺酸基、C1-C6直鏈或支鏈烷基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯基、C1-C6直鏈或支鏈烷氧基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯氧基。
本發(fā)明的另一方面涉及含有作為活性成分的式I取代氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物以及一種或多種藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及制備取代氧雜環(huán)壬烷-2-酮的方法，該方法包括通過發(fā)酵培養(yǎng)能夠生產(chǎn)取代氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物的微生物如鏈霉菌屬產(chǎn)素菌，獲得含有該類化合物的發(fā)酵物，再利用常規(guī)方法從發(fā)酵物中分離純化所需化合物的步驟。
本發(fā)明進一步的方面涉及上述式I取代氧雜環(huán)壬烷-2-酮用于制備細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑或腫瘤細胞抑制劑的用途。
具體來說，在本發(fā)明的一個實施方案中，取代的氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物或其藥學上可接受的鹽如式I所示 式I其中，R1和R4可以相同也可不同，為氫、羥基、氨基、磺酸基、C1-C6直鏈或支鏈烷基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯基、C1-C6直鏈或支鏈烷氧基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯氧基；R2和R3可以相同也可不同，但其中至少一個為羥基等與環(huán)骨架碳原子直接相連的氧取代基，另一個可以是氫、羥基、氨基、磺酸基、C1-C6直鏈或支鏈烷基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯基、C1-C6直鏈或支鏈烷氧基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯氧基。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，取代的氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物或其藥學上可接受的鹽如式I所示 式I
其中，R1和R4為甲基或氫，R2和R3為羥基。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，式I所示的取代的氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物中，R1和R4為甲基，R2和R3為羥基，下文中又稱其為化合物I。
本發(fā)明的式I化合物可通過發(fā)酵培養(yǎng)能夠生產(chǎn)取代氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物的微生物，獲取含有該類化合物的發(fā)酵物，再從發(fā)酵物中分離純化而得到。
所述能夠生產(chǎn)氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物的微生物包括鏈霉菌屬產(chǎn)素菌，如鏈霉菌屬的黃直絲鏈霉菌(Streptomyces flavoretus)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所用產(chǎn)素菌是從西雙版納土壤樣品中分離、經(jīng)分類學研究鑒定為黃直絲鏈霉菌的18522株。該菌株已于2003年10月23日保藏在位于北京市海淀區(qū)中關村北一條13號中國科學院微生物研究所內(nèi)的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏登記入冊編號CGMCC No.1022)，建議的分類命名為黃直絲鏈霉菌。該黃直絲鏈霉菌18522 CGMCC 1022株具有如下微生物菌學特征各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征培養(yǎng)特征在高氏合成一號瓊脂、葡萄糖天門冬素瓊脂、蔗糖硝基鹽瓊脂、無機鹽淀粉瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、燕麥粉瓊脂、蘋果酸鈣瓊脂等8種培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7-15天后觀察菌絲體的顏色和色素的產(chǎn)生等情況，有關特征見表1。
表1 菌株18522在8種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基 氣生菌絲基內(nèi)菌絲可溶色素高氏合成一號瓊脂 米黃色 淡繭黃 無葡萄糖天門冬素瓊脂 杏仁黃 杏仁黃 無蔗糖硝基鹽瓊脂 杏仁黃 香水玫瑰黃 無無機鹽淀粉瓊脂 豆汁黃 篾黃無馬鈴薯浸汁瓊脂 淡篾黃 炒米黃 無營養(yǎng)瓊脂 米黃色 淺黃褐 無燕麥粉瓊脂 象牙黃 象牙黃 無蘋果酸鈣瓊脂 淺酪黃 酪黃無形態(tài)特征在高氏合成一號瓊脂和葡萄糖天門冬素瓊脂上28℃培養(yǎng)7～15天后，用光學顯微鏡和電子顯微鏡，按常規(guī)方法進行菌絲及孢子表面特征的觀察，結果關觀察到菌株基絲無橫隔，不斷裂；氣絲分枝較多；孢子絲直絲或柔曲，有時成叢；孢子卵圓形，表面光滑(光學顯微鏡照片和電子顯微鏡照片略)。
化學分類特征胞壁化學組分分析按照Hasegawa的薄層層析(TLC)法進行了該菌株全細胞水解液氨基酸和糖型分析，結果表明，18522菌株全細胞水解液含有LL-DAP(左旋二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)，甘氨酸；無特征性糖(糖型C)。細胞壁化學組分屬于I型。
生理生化特征參照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》Vol.IV的內(nèi)容對菌株進行了生理生化鑒定。該18522菌株的生理生化特征見表2。
表2 菌株的生理生化特征特征 結果特征結果D-葡萄糖 + 明膠液化+L-阿拉伯糖 + 牛奶凝固-D-木糖 - 牛奶胨化+D-果糖 + 淀粉水解+蔗糖 + 硝酸鹽還原 +L-鼠李糖 - 纖維素上生長-D-甘露醇 + H2S產(chǎn)生-棉籽糖 + 黑色素產(chǎn)生 -L-肌醇 -由上述實驗結果，根據(jù)形態(tài)特征與胞壁化學組分定屬原則，該18522菌株無橫隔，不斷裂；氣生菌絲多分枝，孢子絲直絲或柔曲；胞壁I型，糖型C，屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)。根據(jù)培養(yǎng)特征和生理實驗定種的原則，菌株18522的氣生菌絲為黃色調(diào)，與黃直絲鏈霉菌相同，生理特征也與黃直絲鏈霉菌相似，故菌株18522可定名為黃直絲鏈霉菌(Streptomyces flavoretus)。
需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物的鏈霉菌屬微生物，只要能生產(chǎn)氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物的鏈霉菌屬微生物均可用作產(chǎn)素菌用于制備式I化合物。
所述分離純化包括利用本領域技術人員熟知的天然產(chǎn)物分離純化的常規(guī)方法，如液液萃取、柱層析、薄層層析及重結晶等。
本發(fā)明采用麗絲胺羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)法測試了式I化合物對人慢性髓性白血病K562細胞、人大腸癌HCT-15細胞、人卵巢癌A2780細胞、人肺癌A549細胞和人宮頸癌Hela細胞的細胞增殖抑制作用，并采用流式細胞術結合顯微鏡下檢測細胞形態(tài)特征的方法測試了式I化合物對tsFT210、K562及HCT-15細胞的細胞周期抑制和細胞凋亡誘導作用。實驗證實，式I化合物對腫瘤細胞可通過抑制細胞周期并誘發(fā)癌細胞凋亡來顯示抑制腫瘤細胞增殖的生物學活性，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用，因此本發(fā)明的式I化合物可用作細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑或腫瘤細胞抑制劑。
式I化合物還可與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。
本發(fā)明中的術語“藥學上可接受的鹽”可以是藥用無機或有機鹽。本發(fā)明式I中具有堿性基團的化合物可以與無機酸形成藥用鹽，例如硫酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽；也可與有機酸形成藥用鹽，例如乙酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、對甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽等。本發(fā)明式I中具有酸性基團的化合物可以與堿金屬或堿土金屬形成藥用鹽，優(yōu)選但不限于鈉鹽、鉀鹽，鎂鹽或鈣鹽。
本發(fā)明化合物可以單獨或以藥物組合物的形式給藥。給藥途徑可以是口服、非腸道或局部給藥。藥物組合物可根據(jù)給藥途徑配成各種適宜的劑型。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可以以下面的任意方式施用口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲器用藥。其中優(yōu)選口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。
當口服用藥時，本發(fā)明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于片劑、膠囊、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入潤滑劑如硬脂酸鎂。膠囊制劑使用的稀釋劑一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水懸浮液制劑則通常是將活性成分與適宜的乳化劑和懸浮劑混合使用。任選地，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、芳香劑或著色劑。
當局部用藥時，特別是治療局部外敷容易達到的患面或器官，如眼睛、皮膚或下腸道神經(jīng)性疾病時，可根據(jù)不同的患面或器官將本發(fā)明化合物制成不同的局部用藥制劑形式，具體說明如下當眼部局部施用時，本發(fā)明化合物可配制成一種微粉化懸浮液或溶液的制劑形式，所使用載體為等滲的具有一定pH的無菌鹽水，其中可加入也可不加防腐劑如氯化芐基烷醇鹽。對于眼用，也可將化合物制成膏劑形式如凡士林膏。
當皮膚局部施用時，本發(fā)明化合物可制成適當?shù)能浉唷⑾磩┗蛩獎┲苿┬问?，其中將活性成分懸浮或溶解于一種或多種載體中。軟膏制劑可使用的載體包括但不限于礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蠟和水；洗劑或霜劑可使用的載體包括但不限于礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、吐溫60、十六烷酯蠟、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。
本發(fā)明化合物還可以無菌注射制劑形式用藥，包括無菌注射水或油懸浮液或無菌注射溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發(fā)油也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)，如單甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本發(fā)明化合物的使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營養(yǎng)狀況、化合物的活性強度、服用時間、代謝速率、病癥的嚴重程度以及診治醫(yī)師的主觀判斷。優(yōu)選的使用劑量介于0.01～100mg/kg體重/天。
式I化合物亦可作為抑制細胞周期或誘發(fā)細胞凋亡的低分子生物探針用于生命科學研究。當將式I化合物作為細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑用于生命科學研究時，可將其溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可將其溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應用。


圖1是化合物I在甲醇中的紫外吸收光譜；圖2是化合物I的紅外吸收光譜(KBr)；圖3是化合物I在氘代氯仿中的1H核磁共振譜；圖4是化合物I在氘代氯仿中的13C核磁共振譜；圖5是小鼠乳腺癌tsFT210細胞經(jīng)不同濃度的化合物I處理17小時后測得的流式細胞直方圖。左上圖為空白對照組，其余為不同濃度(濃度見每個圖右上方)的化合物I處理組，圖中曲線部為實測數(shù)據(jù)，黑色填充部為計算值。
圖6是人慢性髓性白血病K562細胞經(jīng)不同濃度的化合物I處理24小時后測得的流式細胞術直方圖。左上圖為空白對照組，其余為不同濃度(濃度見每個圖右上方)的化合物I處理組，圖中曲線部為實測數(shù)據(jù)，黑色填充部為計算值。
圖7是人卵巢癌A2780細胞經(jīng)不同濃度的化合物I處理24小時后測得的流式細胞術直方圖。左上圖為空白對照組，其余為不同濃度(濃度見每個圖右上方)的化合物I處理組，圖中曲線部為實測數(shù)據(jù)，黑色填充部為計算值。
具體實施例方式下列實施例將進一步說明本發(fā)明，但并不對本發(fā)明構成限制。
實施例1 化合物I的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)素菌本實施例中用于發(fā)酵生產(chǎn)氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物的產(chǎn)素菌采用從西雙版納土壤樣品中分離并經(jīng)分類學研究鑒定的黃直絲鏈霉菌(Streptomyces flaviretus)18522 CGMCC 1022株。
產(chǎn)素菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取黃直絲鏈霉菌(Streptomycesflavoretus)18522 CGMCC 1022適量，接種到高氏合成1號瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。
取培養(yǎng)7天的斜面，用接種針挑取適量孢子和菌體，接種到一個含100毫升種子培養(yǎng)液(培養(yǎng)基組成豆粉0.5％，可溶性淀粉1.5％，甘油1.5％，蛋白胨1.5％，碳酸鈣0.2％，調(diào)pH7.4)的500毫升三角燒瓶中，置于搖床中，在28℃、每分鐘180轉條件下進行種子培養(yǎng)48小時，獲得黃直絲鏈霉菌18522 CGMCC 1022的種子培養(yǎng)液。
取該種子培養(yǎng)液適量，按10％的接種量接種到100個內(nèi)裝150毫升生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液(培養(yǎng)基組成豆粉0.5％，可溶性淀粉1.5％，甘油1.5％，蛋白胨1.5％，碳酸鈣0.2％，調(diào)pH7.4)的500毫升三角燒瓶中，置于28℃、每分鐘180轉的搖床上進行生產(chǎn)發(fā)酵5天，獲得含有氧雜環(huán)壬烷-2-酮類目標化合物的黃直絲鏈霉菌18522 CGMCC 1022的發(fā)酵培養(yǎng)液約15升。
含化合物I的氯仿提取物的制備將黃直絲鏈霉菌18522 CGMCC 1022的發(fā)酵培養(yǎng)液(約15升)離心，分為上清液和菌絲體。菌絲體用80％丙酮水溶液超聲提取3次，合并提取液，減壓濃縮至不含丙酮后，用等量氯仿萃取三次，得菌絲體提取物的氯仿萃取液。取上清液，直接用等量氯仿萃取三次，得上清液的氯仿萃取液。所得上清液的氯仿萃取液與菌絲體提取物的氯仿萃取液合并，減壓濃縮至干，得到含有化合物I的氯仿提取物7.5克。
化合物I的分離精制取含有化合物I的氯仿提取物(7.5克)，用適量氯仿溶解后加15克200-300目硅膠G(青島海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，裝載到裝填有75克青島海洋化工集團公司產(chǎn)薄層層析用硅膠60H的玻璃減壓柱上，以石油醚(沸點60-90°)-乙酸乙酯混合液為洗脫溶劑系統(tǒng)進行減壓柱層析，洗脫溶劑的極性通過加大乙酸乙酯的用量來梯度遞增，每150毫升為一個餾份，獲得若干餾份。采用小鼠乳腺癌tsFT210細胞的流式細胞術篩選模型，以細胞周期抑制和細胞凋亡誘導活性作為抗癌指標，檢測每個餾份的活性，再結合薄層層析檢測結果，合并石油醚-乙酸乙酯(2∶1)洗脫餾份中的第6-11餾份，得到含有化合物I的活性組分。將該活性組分用適量石油醚(沸點60-90 °)室溫溶解、提取，分為石油醚可溶部分和不溶部分，結果化合物I被濃縮于石油醚不溶部分中。取全部石油醚不溶部分，用制備反相高效液相色譜(色譜柱，SENSHU PAK ODS柱(20×250mm)；流動相，甲醇-水(85∶15v/v)，流速10ml/min；檢測波長215nm)進行層析分離，得到化合物I粗品40mg，繼而在丙酮中重結晶精制，得到化合物I純品(30mg)，其為無色針狀結晶，熔點152-153℃(未校正)，[α]D25+1.22(c1.00氯仿)，分子式C10H18O4。TOF-MS m/z203[M+H]+，185[M+H-H2O]+。HR-TOF-MS m/z實測值185.1182[M-H2O+H]+，計算值185.1178(C10H17O3)。UV λmaxnm(logε)于甲醇204(3.17)，末端吸收。IRνmaxcm-1(KBr)3380(OH)，2928，1728(內(nèi)酯羰基)，1575，1408，1194，1063。1H及13C NMR數(shù)據(jù)見表3。
表3 化合物I在氘代氯仿中的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)a)位置標號 δH(J，Hz)1H-1H COSYb)δcHMBCc)2--- 174.18s3-H.4-H，9-H，3-CH332.50m 3-CH3，4 45.19d 5-H，3-CH344.00q(7.3) 3，579.98d 3-H，5-H，6-H，3-CH351.61m 4，5(δ1.92)， 28.10t 3-H，6-H1.92m 4，5(δ1.61)，61.48m 5，6(δ1.99)， 31.34t 5-H，8-H1.99m 5，6(δ1.48)，73.84m 6，876.30d 5-H，6-H，8-H，9-H81.74m 7，8(δ1.76)， 42.22t 6-H，9-H，9-CH31.76m 7，8(δ1.74)，94.96m 8，9-CH369.00d 7-H，8-H，9-CH33-CH31.08 d 312.80q 3-H，4-H9-CH31.22 d 920.46q 8-H，9-H
a)本表信號歸屬基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFGHMBC圖譜解析結果。碳信號的多重度利用DEPT方法確定并分別用s(單重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。
b)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在PFG1H-1H COSY譜中與相應行中的1H給出偶合相關信號的1H核。
c)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在PFG HMBC(1JCH＝8Hz)中與相應行中的碳信號給出遠程雜核相關(HMBC)信號的1H核。
實施例2 對癌細胞的增殖抑制、細胞周期抑制、細胞凋亡誘導活性的測試實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的純品化合物I。精密稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。
細胞系及細胞的繼代培養(yǎng)活性測試采用人慢性髓性白血病K562細胞、人大腸癌HCT-15細胞、人卵巢癌A2780細胞、人肺癌A549細胞、人宮頸癌HeLa細胞和小鼠乳腺癌tsFT210細胞等哺乳動物的癌細胞系。各種細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32℃(tsFT210細胞)或在37℃(K562細胞、HCT-15細胞、A2780細胞、A549細胞和HeLa細胞)于通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
細胞增殖抑制活性測試方法(SRB法)本發(fā)明采用SRB(sulforhodamine B，麗絲胺羅丹明B)法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性。該SRB法是近來開發(fā)并用于抗癌藥物篩選和評價的新的比色法。麗絲胺羅丹明B即SRB是一種亮粉紅色的氨基夾氧雜蒽類染料(aminoxanthene dye)，分子中具有兩個磺酸基。在微酸性條件下，SRB可定量地結合到經(jīng)三氯醋酸固定的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸殘基上，從而提供測定細胞蛋白質(zhì)含量的很靈敏的定量指標。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量與活細胞的密度呈線性關系，因此，SRB法可用于評價抗癌藥物對癌細胞增殖的抑制活性。
活性測試時，取對數(shù)生長期的K562細胞、HCT-15細胞、A2780細胞、A549細胞和HeLa細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，37℃下培養(yǎng)24小時。取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學特征，繼而在4℃每分鐘3000轉條件下離心3分鐘，吸去上清液。每孔細胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小時，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室溫靜置30分鐘。用1％醋酸水清洗4次，除去未結合的游離SRB染料。每孔加入150微升Tris緩沖液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白結合染料并利用MD公司產(chǎn)SPECTRA MAX Plus型酶標儀測定每孔在520nm處的光密度(OD)值。同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設置三孔，另設三孔作為空白對照。取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照X100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)，再利用Bliss方法，由各種濃度的抑制率(IR％)求得半數(shù)抑制濃度(IC50)。同樣的測試和計算分別進行三次，求得IC50的平均值和標準差。
細胞周期抑制和細胞凋亡誘導活性的流式細胞術測試方法取對數(shù)生長期的tsFT210、K562和A2780細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔板中，每孔加入5微升不同濃度的樣品溶液，32℃下培養(yǎng)17小時(tsFT210細胞)或37℃下培養(yǎng)24小時(K562細胞和A2780細胞)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學特征，必要時進行拍照。繼而將細胞分別從24孔板轉移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4℃下每分鐘3000轉離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩沖溶液(PBS)振蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克檸檬酸鈉和200毫克NP-40)，4℃下染色30分鐘后，加入180微升PBS稀釋，用流式細胞儀分析測定細胞中DNA的含量分布。細胞在細胞周期各時相中的分布利用庫爾特公司產(chǎn)計算機軟件WinCycle進行分析計算。
實驗結果化合物I細胞增殖抑制活性用不同濃度的化合物I分別處理tsFT210細胞17小時、A2780、K562、HCT-15、A549和HeLa細胞各24小后用SRB法測試的活性結果見表4。
表4化合物I細胞增殖抑制活性的SRB法測試結果(平均值±標準差，n＝3)抑制率％濃度(μM)A2780 K562HCT-15 A549HeLa1×10-69.6±1.66.9±9.29.3±7.37.2±1.02.7±7.71×10-59.1±2.610.6±5.4 11.8±5.7 6.7±2.72.1±7.81×10-46.2±5.28.8±12.2 12.0±6.6 9.6±1.44.1±6.01×10-323.4±1.9 15.0±20.0 20.3±12.5 15.8±2.1 10.3±5.71×10-215.6±0.5 18.3±15.2 20.3±4.0 9.0±1.93.1±5.11×10-129.0±1.9 29.0±17.4 25.1±11.9 17.2±1.7 5.4±8.81 50.9±0.8 41.3±4.6 51.7±2.8 46.2±3.4 40.8±2.610 49.9±2.2 45.8±2.5 51.6±2.1 47.7±3.8 42.5±2.7100 50.3±1.3 48.2±11.7 51.8±1.6 44.6±7.8 48.4±4.1IC501.4±0.48.4±4.79.4±2.215.4±5.6 13.7±2.0化合物I活性的流式細胞術分析檢測結果用不同濃度的化合物I分別處理tsFT210細胞17小時、K562和A2780細胞各24小后，用流式細胞術檢測分析得到的化合物I對癌細胞的細胞周期抑制及凋亡誘導活性測試結果見表5至表10。
表5 tsFT210細胞經(jīng)化合物I處理17小時后的測試結果(平均值±標準差，n＝3)濃度(nM)sub-G0/G1％ G0/G1％S％G2/M％對照組 0.9±0.1 32.5±3.2 61.1±3.7 6.4±0.90.951.0±0.1 32.7±4.7 60.2±3.9 7.1±0.81.9 0.9±0.1 35.5±6.2 56.8±7.0 7.7±1.13.8 0.9±0.1 38.5±2.2 54.1±3.0 7.3±0.87.6 1.0±0.1 37.9±1.1 55.4±1.4 6.7±0.415.10.9±0.1 38.3±1.1 54.6±1.1 6.8±0.330.31.0±0.2 39.2±0.3 54.1±0.8 6.8±0.560.51.1±0.3 40.9±5.3 53.7±2.8 5.4±2.9121 1.1±0.1 42.9±5.8 51.9±4.9 5.2±1.0242 1.5±0.1 49.7±3.4 46.6±4.0 3.7±0.5注本表數(shù)據(jù)系將tsFT210細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結果。
表6 tsFT210細胞經(jīng)化合物I處理17小時后測試并經(jīng)統(tǒng)計處理t檢驗結果(n＝3)G0/G1％ t檢驗濃度(nM)試驗1組試驗2組試驗3組平均值±標準差(P值)對照組 29.4 35.7 32.5 32.5±3.2 --0.95 35.0 35.7 27.3 32.7 ±4.70.481.939.8 38.4 28.4 35.5±6.2 0.273.840.0 39.5 36.0 38.5±2.2 0.067.638.2 36.7 38.8 37.9±1.1 0.0715.1 37.0 39.0 38.8 38.3±1.1 0.0230.3 39.4 38.9 39.2 39.2±0.3 0.0460.5 35.8 40.7 46.3 40.9±5.3 0.05121.0 38.6 40.5 49.5 42.9±5.8 0.05242.0 47.3 48.3 53.6 49.7±3.4 0.01注本表數(shù)據(jù)系將tsFT210細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結果。
表7 K562細胞經(jīng)化合物I處理24小時后的測試結果(平均值±標準差，n＝3)濃度(μM)sub-G0/G1％G0/G1％ S％ G2/M％對照組 1.2±0.2 31.6±6.750.1±14.418.3±7.80.0011.5±0.4 33.9±1.245.0±4.5 22.0±3.90.01 1.6±0.3 29.5±6.554.5±15.816.0±9.50.1 1.7±0.4 32.1±3.350.1±5.7 17.7±3.0116.0±1.1 49.7±1.544.1±1.7 6.2±0.410 19.8±2.4 47.2±3.946.9±2.2 8.367±1.0注本表數(shù)據(jù)系將K562細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結果。
表8 K562細胞經(jīng)化合物I處理24小時后測試并t檢驗結果(平均值±標準差，n＝3)濃度(μM) sub-G0/G1％ T檢驗(P值)G0/G1％t檢驗(P值)空白對照 1.2±0.2 --31.7±6.7 --0.0011.5±0.4 0.15 33.9±1.2 0.290.01 1.6±0.3 0.03 29.5±6.5 0.360.1 1.7±0.4 0.04 32.1±3.3 0.451.0 16.0±1.10.00 49.7±1.5 0.0010.0 19.8±2.40.00 47.2±3.9 0.01注本表數(shù)據(jù)系將K562細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結果。
表9 A2780細胞經(jīng)化合物I處理24小時后的測試結果(平均值±標準差，n＝3)濃度(μMl)sub-G0/G1％G0/G1％ S％G2/M％對照組1.2±0.3 52.3±2.7 31.4±1.8 16.4±1.00.001 2.0±0.8 56.0±3.1 28.2±3.4 15.8±2.20.01 1.9±0.8 54.2±4.3 35.3±5.3 10.5±9.20.1 1.9±0.5 74.9±10.6 15.5±7.8 9.5±2.81 1.7±0.5 86.3±0.9 10.0±4.0 3.8±3.3101.9±0.3 84.8±4.6 13.2±6.7 2.4±3.6注本表數(shù)據(jù)系將A2780細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結果。
表10 A2780細胞經(jīng)化合物I處理24小時后測試并經(jīng)統(tǒng)計處理t檢驗結果(n＝3)G0/G1％濃度(μM)t檢驗(P值)試驗1組試驗2組 試驗3組平均值±標準空白對照 55.5 59 60.8 58.4±2.7 --0.001 61.4 60.4 57.1 59.6±2.3 0.350.01 65.9 58.1 62.4 62.1±3.9 0.120.189.4 73.6 72.7 78.6±9.4 0.011 87.3 87.5 89.1 88.0±1.0 0.0010 87.8 86.4 87.5 87.2±0.7 0.00注本表數(shù)據(jù)系將A2780細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結果。
化合物I對癌細胞作用的形態(tài)學檢測結果在光學倒置顯微鏡下觀察到，用不同濃度的化合物I處理后，HCT-15、A2780、A549、HeLa、tsFT210等細胞的形態(tài)沒有特別顯著的變化，但視野中體積較小的細胞的數(shù)目隨化合物I濃度增高而增多并在化合物I的濃度達到一定值以上時基本保持同等水平。而當用不同濃度的化合物I處理時，K562細胞隨著樣品濃度增高細胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化。當化合物I在0.01μM以下時細胞形態(tài)與空白對照組基本相同，但當化合物I的濃度超過0.01μM以上時，隨著樣品濃度的提高，視野中開始出現(xiàn)部分雪花瓣狀以及碎片狀凋亡細胞的形態(tài)，并且，在化合物I達到1μM以上時，呈凋亡形態(tài)的細胞數(shù)基本保持同等水平。
上述形態(tài)學觀測結果與流式細胞術檢測分析結果(表5-表10)完全吻合。
以上實驗結果表明，化合物I可顯著抑制K562細胞、HCT-15細胞、A2780細胞、A549細胞和HeLa細胞等癌細胞的增殖，化合物I抑制這些癌細胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.4±0.4μM(A2780細胞)、8.4±4.7μM(K562細胞)、9.4±2.2μM(HCT-15細胞)、15.4±5.6μM(A549細胞)、13.7±2.0μM(HeLa細胞)流式細胞術檢測分析結果表明，化合物I對tsFT210、K562、A2780細胞G0/G1期抑制作用的MIC值分別為15.1nM(tsFT210細胞)、1.0μM(K562細胞)和0.1μM(A2780細胞)，對K562細胞發(fā)揮細胞凋亡誘導作用的MIC值為0.01μM。
結論化合物I可顯著抑制腫瘤細胞的增殖，并可通過細胞周期G0/G1期抑制及誘發(fā)凋亡來發(fā)揮其抑制腫瘤細胞增殖的抗腫瘤作用。
權利要求
1.式I化合物或其藥學上可接受的鹽 式I其中，R1和R4可以相同也可不同，為氫、羥基、氨基、磺酸基、C1-C6直鏈或支鏈烷基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯基、C1-C6直鏈或支鏈烷氧基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯氧基；R2和R3可以相同也可不同，但其中至少一個為羥基等與環(huán)骨架碳原子直接相連的氧取代基，另一個可以是氫、羥基、氨基、磺酸基、C1-C6直鏈或支鏈烷基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯基、C1-C6直鏈或支鏈烷氧基或C2-C6直鏈或支鏈鏈烯氧基。
2.權利要求1所述的化合物，其中R1和R4為甲基或氫，R2和R3為羥基。
3.權利要求1所述的化合物，其中R1和R4為甲基，R2和R3為羥基。
4.藥物組合物，其含有權利要求1-3任一項中的式I化合物或其藥學上可接受的鹽以及一種或多種藥用載體或賦形劑。
5.權利要求1所述的式I化合物的制備方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)鏈霉菌屬的氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物生產(chǎn)菌、獲取含有該類化合物的發(fā)酵物，繼而從發(fā)酵物中分離純化出式I化合物。
6.權利要求5所述的方法，所述鏈霉菌屬的氧雜環(huán)壬烷-2-酮類化合物生產(chǎn)菌是黃直絲鏈霉菌18522 CGMCC 1022。
7.權利要求1所述的式I化合物用于制備細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑和腫瘤細胞殺傷劑的用途。
8.權利要求1所述的式I化合物用于制備抑制腫瘤細胞增殖和抗腫瘤藥物的用途。
9.黃直絲鏈霉菌18522 CGMCC 1022。
10.權利要求9所述的菌株用于生產(chǎn)權利要求1所述的式I化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及取代氧雜環(huán)壬烷－2－酮類化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明采用黃直絲鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)并制取取代氧雜環(huán)壬烷－2－酮類化合物。經(jīng)實驗證實，該類化合物可用于制備細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑或抗腫瘤劑。
文檔編號C12P17/08GK1660835SQ200410006050
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月27日 優(yōu)先權日2004年2月27日
發(fā)明者崔承彬, 韓冰, 蔡兵 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所