專利名稱：肽制備用固定于固相載體上的金屬螯合物的制作方法
肽的化學合成已被充分認可，主要可分為兩種不同的方法。溶液合成通常非常耗時，因而不適用于科學研究，而固相載體合成允許快速優(yōu)化反應(yīng)循環(huán)。固相肽合成(SPPS)的可行方案基于Merrifield技術(shù)(Merrifield，R.B.，J Amer.Chem.Soc.85，1963，2149)，在不溶性固相載體上合成具有限定序列的肽，所述載體具有可以通過簡單過濾而容易地分離可溶性反應(yīng)物的優(yōu)點。SPPS已經(jīng)極其迅速地發(fā)展成多種變化方案(在此統(tǒng)稱為Merrifield型合成)并由以下步驟組成1.第一步，選擇合適的固相載體基質(zhì)(樹脂)，氨基酸衍生物通過其C端共價固定于所述載體基質(zhì)上。通常借助于鏈接劑將待合成序列中的C端第一氨基酸錨定至固相載體。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)該第一氨基酸的氨基和側(cè)鏈官能團受到保護基團的保護，一般與Fmoc-或Boc-化學相容。
2.第二步，選擇性除去保護第一氨基酸N端的基團。
3.第三步，將對應(yīng)于待合成序列中的第二氨基酸的下一個氨基酸衍生物偶聯(lián)至第一氨基酸的游離端氨基，而其自身具有受適當保護基團保護的氨基和側(cè)鏈官能團。
4.第四步，從剛偶聯(lián)的氨基酸衍生物上除去N端保護基團，并且對下一氨基酸重復第三步驟。
因而，肽的固相合成包括可在固相載體上建立限定序列氨基酸的循環(huán)工藝。該過程結(jié)束時，例如通過使用三氟乙酸(包括不同的清除劑)處理而從固相載體上釋放肽。同時，可以除去可能已存在于氨基酸側(cè)鏈的保護基團，其中通過這些保護基團保護咪唑-、巰基-、羧基-、氨基-、醇基-或其它功能相關(guān)基團。這樣得到最終的肽，這些肽通常需要在合適的色譜設(shè)備上純化，一般使用LC/MS系統(tǒng)，它可以同時分離和分析組分。在肽合成的標準教科書中深入探討了這些步驟和更多的步驟。
雖然利用SPPS技術(shù)合成小肽(至多30個單體)一般沒有問題，但是對大小為40-120(甚至更多)氨基酸的肽存在局限性。它們的性質(zhì)更符合術(shù)語“小蛋白質(zhì)”而非術(shù)語“大肽”。
a)這種大小的肽通常不僅具有一級結(jié)構(gòu)(序列)，而且還有將要構(gòu)建的二級結(jié)構(gòu)(例如螺旋、β-片層)和三級結(jié)構(gòu)(例如亮氨酸-拉鏈、結(jié)構(gòu)域的二硫橋)，然而，SPPS技術(shù)的各種變化方案的目的僅僅是建立一級結(jié)構(gòu)，它們不提供任何工具來以適當?shù)姆绞娇刂品肿觾?nèi)二級和三級結(jié)構(gòu)的形成。對于較大肽折疊的控制機制的缺乏由于以下事實而進一步加劇同時從樹脂上分離全部產(chǎn)物和除去保護基團導致極高的局部產(chǎn)物濃度。在這些條件下不僅僅發(fā)生分子內(nèi)折疊。很多情況下，從樹脂釋放的小蛋白傾向于發(fā)生相互作用，而不是分子內(nèi)折疊。當利用溶劑重構(gòu)含有從LC系統(tǒng)洗脫的純化產(chǎn)物的凍干組分時，也發(fā)生類似的問題。因而，分子內(nèi)折疊和分子間相互作用發(fā)生競爭，并且沒有可行的技術(shù)來充分控制這一過程。這經(jīng)常導致功能失效的多分子聚集體，它們不會表現(xiàn)出任何期望的生物活性。
b)在大肽合成的情況下，對于每一輪合成，優(yōu)選使用適當修飾(保護、部分保護或未保護)的肽片段，而非單一的氨基酸殘基。一般，小片段是通過絡(luò)合物形成或片段縮合技術(shù)來連接，以便使合成步驟數(shù)最少。這是由于這些循環(huán)通常不具有定量的產(chǎn)率并且在非常多的循環(huán)中經(jīng)常產(chǎn)生不可接受的產(chǎn)率下降。此外，單一氨基酸的有問題的偶聯(lián)可簡單通過偶聯(lián)整個片段而不是單一氨基酸來防止。在片段縮合中，在每個偶聯(lián)循環(huán)中出現(xiàn)必須耗費相當長的偶聯(lián)時間的問題。低反應(yīng)速度是受擴散限制的，并且由于固定肽鏈的不擴散和樹脂環(huán)境的孔中的片段的次優(yōu)擴散行為而導致。長反應(yīng)時間經(jīng)常導致待偶聯(lián)片段的C端氨基酸處相當大程度的外消旋作用，這導致需要使反應(yīng)時間盡可能短?？朔搯栴}的最佳方法是在溶液中偶聯(lián)。經(jīng)典的SPPS沒有提供將兩種反應(yīng)配對物引入溶液中并使其在循環(huán)的下一步驟中再連接的方法，而是在合成的每一步驟中重復該過程。
c)通常難以控制起始殘基在聚合物載體上的期望密度，并且將第一氨基酸載入樹脂經(jīng)常伴隨著外消旋作用。雖然大量預(yù)負載樹脂被商品化，然而這并未覆蓋所有的負載，并且對于給定肽合成問題而言最佳值經(jīng)常難以發(fā)現(xiàn)。
目前為止，金屬親和僅僅初步應(yīng)用于肽合成，這記載在Comely等人的出版物中(Journal of the Chemical Society，2001，2526-2531)。這些作者利用例如存在于衍生的苯丙氨酸側(cè)鏈中的芳香π電子體系，將氨基酸與鉻絡(luò)合。這些絡(luò)合物在溶液中生成，并且隨后將預(yù)先存在的鉻絡(luò)合物錨定至固相，成功地進行一個合成循環(huán)。雖然論證了金屬絡(luò)合物錨定至固相的主要適用性，但是該方法在以下方面不同于本文所述的本發(fā)明。
Comely等人首先將金屬離子連接至體系的可溶部分，隨后在第二步驟中將絡(luò)合物錨定至固相，而本文所述的本發(fā)明基于首先將金屬離子連接至固相，隨后將生長肽鏈錨定至固相。這消除了Comely所提出的體系的一個缺點，即在所得的固相處的含鉻絡(luò)合物中，氨基酸側(cè)鏈和鉻之間的配位鍵要強于鉻和固相載體之間的鍵。因而，用競爭物洗脫絡(luò)合物來洗脫總是帶有以化學計量連接至肽的鉻的肽絡(luò)合物。這既不適合于分析和分離，也不適合于肽的預(yù)期藥物用途。通過本文所述的本發(fā)明形成的絡(luò)合物特征在于金屬離子強螯合至固相并且與肽鏈容易地可逆螯合。這以肽洗脫液中基本沒有連接至肽的金屬離子而結(jié)束。
Comely等人使用由芳香體系形成的極不常見的絡(luò)合物，而本文所述的本發(fā)明使用螯合基團，其通過N、P、S或O原子配位結(jié)合金屬離子。這些原子可以是標準有機基團的一部分。該基團可使用全部有機化學技能來為螯合作用和結(jié)合強度而設(shè)計和優(yōu)化，并且不限于芳香體系。因而，本文所述的發(fā)明原理提供比Comely體系更大的靈活性和適用性。
就此來說，Comely所提出的體系是不利的，因為其需要惰性氣氛以保護某些所用試劑。甚至在此條件下，每個步驟產(chǎn)率也不超過90％，這意味著不能期望長于最大十聚體的肽表現(xiàn)出合適的產(chǎn)率。本文所述的本發(fā)明及其所用的絡(luò)合物化學與標準fmoc化學是相容的，并且不需要特殊的氣氛或設(shè)備。Comely采用的苛刻方法既慢且釋放肽時又破壞樹脂(白光下在DCM中用空氣48h氧化基底聚合物)。
雖然目前為止在肽化學合成領(lǐng)域中還沒有利用金屬絡(luò)合物的其他用途，但是金屬親和已經(jīng)在生物分子的重組生產(chǎn)領(lǐng)域中為人所公知。然而，其僅用于色譜中作為用來從粗生物混合物或生物流體中一步純化生物分子的工具。存在使用含亞氨基二乙酸(Iminodiacetate)和氨三乙酸的瓊脂糖衍生物的這種策略的專利(EP-A-253303；US-A-4877830)。適合重組產(chǎn)物色譜純化的珠狀瓊脂糖可從市場上購得。此外，為使用側(cè)鏈固定的過渡金屬絡(luò)合物作為給定肽的熒光標記試劑而構(gòu)建含有金屬親和側(cè)鏈的肽(例如WO-A-9603651A1；EPA-A-0178450)。所有這些描述證實了金屬螯合物技術(shù)在生物分子的分析和/或純化領(lǐng)域的適用性。然而，它們并未暗示如下所述本發(fā)明的特征及應(yīng)用。
待解決的技術(shù)問題是建立用于小肽和包括120個氨基酸以上的大肽的固相合成、純化和再折疊/解聚的合適方法。為了避開SPPS對于大肽的問題，應(yīng)該使肽與固相載體可逆結(jié)合。本發(fā)明的另一目的是使具有不希望的誤折疊結(jié)構(gòu)和/或分子間集聚的合成肽再折疊和分離。
該問題可由權(quán)利要求1的方法解決。
提供了活化固相的用途，所述活化固相包含固相載體、共價結(jié)合至固相載體的金屬螯合配體、配位結(jié)合至所述金屬螯合配體的金屬離子Mn+，其中n＝1-3，所述活化固相提供固相肽合成或肽純化用的肽錨定部分配位、可逆結(jié)合的配位點。
活化固相也稱為“金屬親和樹脂”。
在優(yōu)選實施方案中，肽為“生長中的肽”并且經(jīng)歷肽延伸過程。
優(yōu)選的是，生長中的肽由至少一個氨基酸組成。在另一優(yōu)選實施方案中，在Merrifield型順序反應(yīng)方案中，將單-或寡聚氨基酸加入到“生長中的肽”的羧基端或氨基端(C-或N-端)，優(yōu)選基于fmoc化學。在另一優(yōu)選實施方案中，單-或寡聚氨基酸是/或包含天然和/或非天然氨基酸。此外，可以自由選擇在Merrifield型順序反應(yīng)方案的每一循環(huán)中所連接的受適當保護的氨基酸衍生物或寡聚片段。
優(yōu)選的是，固相載體基于二氧化硅、玻璃或纖維素或聚合物，所述聚合物選自聚苯乙烯樹脂、三聚氰胺樹脂和聚乙烯醇基樹脂。
本發(fā)明其它合適的載體為例如具有官能實體的聚苯乙烯，其中所述官能實體可以用合適的金屬螯合配體共價衍生。該官能實體的實例為氯三苯甲基(chlorotrityl)、氨基、雜環(huán)氮、羧基、羥基、巰基和乙烯基。對于固相肽合成而言，必須保護固相載體上的游離羧基或其它活性基團，以使其不干擾肽增長過程。
在優(yōu)選實施方案中，固相載體包含鐵磁性顆粒。在另一優(yōu)選實施方案中，合成循環(huán)期間液體和活化固相的分離是通過例如篩分、基于大小的分離、離心或磁性顆粒分離技術(shù)來實現(xiàn)的。可以通過與預(yù)先存在的固相載體部分反應(yīng)或者在聚合物的情況下也可以通過與合適的衍生共聚物共聚合來將活性官能團引入固相載體。
在優(yōu)選實施方案中，每個金屬螯合配體包含至少一個氮、氧、磷或硫原子，所述原子能夠建立配位的配體-金屬鍵。
在另一優(yōu)選實施方案中，每個金屬螯合配體包含選自氨基、雜環(huán)氮、羧基、羥基和巰基的至少一個官能團。
金屬螯合配體直接或通過連接基團共價結(jié)合至固相載體。合適的連接基團例如氨基、羧基、亞甲基、氧、亞甲二氧基、聚亞甲二氧基、亞乙二氧基和聚亞乙二二氧基。對于固相肽合成而言，必須保護金屬螯合配體上的游離羧基，以使其不干擾肽增長過程。


圖1a示出用5-氨基-1，10-菲咯啉衍生的固相載體的實施例。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以很容易地例如從數(shù)據(jù)庫中確定能夠配位結(jié)合金屬離子的大量有機基團，所述數(shù)據(jù)庫可用來發(fā)現(xiàn)對根據(jù)本發(fā)明的金屬螯合配體合適的金屬螯合基團。在本發(fā)明的框架內(nèi)，該現(xiàn)有技術(shù)可用來確定在本發(fā)明范圍內(nèi)的合適基團。以本文所述適合實施本發(fā)明的基團的示例性數(shù)據(jù)給出包含各自數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫實例，示于下列表1
表1示例性配體/金屬離子組合的絡(luò)合常數(shù)
pK值為25℃值。pK值定義為結(jié)合常數(shù)K的以10為底的對數(shù)的負數(shù)。在每一列中，示出金屬離子或其絡(luò)合物MLm-1與另外的配體分子L的每一順序結(jié)合步驟的選自A.E.Martell，R.M.Smith，R.J.Motekaitis，“Database 46NIST Critically Selected Stability”。
因而，關(guān)于不同金屬離子與配位分子形成絡(luò)合物的數(shù)據(jù)已知并且可以在一次文獻和數(shù)據(jù)庫中找到。表1中的數(shù)據(jù)摘自Martell及其同事的數(shù)據(jù)庫(2003)并給出了相關(guān)金屬離子配體相互作用的示例性綜述。這些數(shù)據(jù)庫可利用來將金屬離子結(jié)合至固相上。這些配體也可在單或寡聚天然或非天然氨基酸的側(cè)鏈中充當結(jié)合至下述不飽和金屬離子的螯合基團。
在另一優(yōu)選實施方案中，共價結(jié)合至固相載體的各金屬螯合配體包含至少一個基團，所述至少一個基團選自三苯基膦基團、氨基嘌呤基團優(yōu)選6-氨基嘌呤基團、酞菁基團、1，10-菲咯啉基團優(yōu)選5-氨基-1，10-菲咯啉基團、三聯(lián)吡啶基團優(yōu)選4’-氨基-[2，2’；6’，2”]三聯(lián)吡啶基團、三氮雜環(huán)壬烷基團優(yōu)選[1，4，7]三氮雜環(huán)壬烷基團和四氮雜環(huán)十二烷基團優(yōu)選[1，4，7，11]四氮雜環(huán)十二烷基團。
金屬Mn+優(yōu)選選自Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+和鑭系金屬離子，Mn+尤其優(yōu)選為Cu2+、Ni2+、Co2+和Zn2+。
圖1b示出活化固相的實例，其包含固相載體、共價結(jié)合的5-氨基-1，10-菲咯啉金屬螯合配體和螯合的金屬離子Cu2+。
圖1c示出結(jié)合肽的實例，其包含肽殘基和寡聚組氨酸基團錨定部分，其中所述錨定部分共價連接至活化固相，該活化固相包含固相載體、共價結(jié)合的5-氨基-1，10-菲咯啉金屬螯合配體和螯合的金屬離子Cu2+。
可以很容易地控制錨定肽和錨定(單-或寡聚-)氨基酸在活化固相載體表面上的覆蓋范圍，所述錨定(單-或寡聚-)氨基酸是指固相肽合成的起始點。如果活化固相的配位位點均勻散布于表面，則結(jié)合肽和起始點的密度(覆蓋范圍)可以根據(jù)肽合成、純化或再折疊的具體需要來調(diào)節(jié)，并通過在第一結(jié)合步驟期間加入到樹脂中的起始點的量來確定。表面覆蓋范圍可以由已知的表面積值和肽數(shù)量(以摩爾計)和/或直徑來計算。
由于絡(luò)合反應(yīng)通常很快，使得在有機或含水溶劑存在下可以在幾分鐘內(nèi)完成結(jié)合。
提供一種方法，其中肽的錨定部分通過加入競爭配體而從所述活化固相中脫離，其中所述錨定部分配位結(jié)合至所述活化固相的配位點，所述活化固相包含固相載體、共價結(jié)合至固相載體的金屬螯合配體、結(jié)合至所述金屬螯合配體的金屬離子Mn+，n＝1-3。
根據(jù)本發(fā)明，可將競爭試劑加入到錨定肽中，以使肽的錨定部分從活化固相上競爭性解離。優(yōu)選將競爭試劑加入到Merrifield型反應(yīng)方案的偶聯(lián)步驟的試劑混合物中。與肽錨定部分的每個單獨的金屬離子螯合基團對所述配位點的親和性相比，合適的競爭性螯合劑對于活化固相上的游離配位點具有大致相同或更弱的親和性。
在優(yōu)選實施方案中，競爭試劑可溶于偶聯(lián)步驟的試劑混合物中并且不與該試劑混合物的組分反應(yīng)。
在圖2a中，利用肽錨定部分是寡聚組氨酸殘基的實例說明解離原理。
與解離相反，肽的錨定部分可以通過稀釋含有活化固相、競爭試劑和非結(jié)合肽的混合物而再結(jié)合至活化固相。
在Merrifield型反應(yīng)方案中的優(yōu)選實施方案中，在以下漂洗步驟之前進行再結(jié)合。
在圖2b中利用肽錨定部分是寡聚組氨酸殘基的實例說明再結(jié)合原理。
競爭物濃度對給定肽結(jié)合至活化固相的影響的實例示于圖3a，其中競爭物濃度增加的解離過程用于洗脫配位結(jié)合的肽。該過程是可逆的。
在另一所提供的方法中，競爭配體包含至少一個能夠螯合金屬離子的基團，優(yōu)選含氮基團，選自咪唑、N-甲基咪唑、氨基嘌呤、菲咯啉、聯(lián)吡啶、三聯(lián)吡啶、三氮雜環(huán)壬烷和四氮雜環(huán)十二烷、亞氨基二乙酸基團、氨三乙酸基團和乙二胺四乙酸基團。
在另一優(yōu)選實施方案中，競爭配體包含具有配位鍵用電子對的結(jié)構(gòu)基團，如三苯基膦基團、6-氨基嘌呤基團或酞菁基團。
競爭配體的具體實例為谷胱甘肽、乙二胺四乙酸、咪唑、N-甲基咪唑、菲咯啉優(yōu)選5-氨基-1，10-菲咯啉、氨基三聯(lián)吡啶、三氮雜環(huán)壬烷或四氮雜環(huán)十二烷。
在所述方法的優(yōu)選實施方案中，肽為“生長中的肽”，通過錨定部分結(jié)合金屬離子，所述金屬離子結(jié)合至與固相載體結(jié)合的金屬螯合配體并經(jīng)歷肽延伸過程。
術(shù)語“生長中的”肽指肽骨架的序列增加，通常使用n-端和側(cè)鏈保護的氨基酸，例如所有fmoc基肽合成方案的情況。
優(yōu)選將單-或寡聚氨基酸加至Merrifield型順序反應(yīng)方案中的“生長中的肽”的C-或N-端。
如前所述，包含共價結(jié)合至錨定部分金屬離子的至少一個單或寡聚氨基酸的生長中肽被作為固相肽合成的起始點。該起始點的實例是通過其羧基共價結(jié)合至金屬離子絡(luò)合基團的單一甘氨酸殘基。
優(yōu)選起始點包含至少一個側(cè)鏈和/或C-端修飾，以使其可以配位至活化固相的金屬離子。所述氨基酸可以是天然或非天然的。
用于固相肽合成起始點的各錨定單或寡聚氨基酸必須與肽合成方案相容。
肽的錨定部分優(yōu)選包含至少一個金屬離子絡(luò)合基團，每個所述基團包含至少一個含氮、氧、磷或硫的能夠與活化固相的金屬離子配位的基團。
在優(yōu)選實施方案中，每個金屬離子絡(luò)合基團包含1-10個所述含氮、氧、磷或硫的基團。更優(yōu)選每個金屬離子絡(luò)合基團包含1-10個含氨基、雜環(huán)氮、氮雜、羧基、硫和磷的基團。
錨定部分的金屬離子絡(luò)合基團可以衍生，前提是所得衍生物與肽合成方案相容。圖1c、2a和2b示出寡聚組氨酸基團，其氨端基受Fmoc化學保護。
在本發(fā)明的另一實施方案中，金屬螯合配體與活化固相的金屬離子的配位鍵強于肽錨定部分與所述金屬離子的配位鍵。
更優(yōu)選的是能夠與活化固相的金屬離子配位的含氮基團選自氨基、羥基、羧基、巰基、咪唑基、N-甲基咪唑基、氨基嘌呤基團、phenanthrolyl基團、吡啶基團、聯(lián)吡啶基團、三聯(lián)吡啶基團、三氮雜環(huán)壬烷基團、四氮雜環(huán)十二烷基團、亞氨基二乙酸基團、氨三乙酸基團和乙二胺四乙酸基團。
特別優(yōu)選的所述基團包含2-10個天然或非天然氨基酸。包含金屬離子絡(luò)合基團的所述氨基酸的合適側(cè)鏈可優(yōu)選選自咪唑、氨基、羥基、羧基、巰基、菲咯啉、吡啶、聯(lián)吡啶、三聯(lián)吡啶、三氮雜環(huán)壬烷、四氮雜環(huán)十二烷或嘌呤基團及其依然可以形成金屬絡(luò)合物的衍生物。能夠與金屬離子形成配位鍵的合適有機基團可在如表1所舉例示出的數(shù)據(jù)庫中找到。為了確保肽延伸過程，游離羧基必須進行適當保護。
優(yōu)選的是，錨定部分的單或寡聚氨基酸包含咪唑側(cè)鏈，任選地N端受保護。在另一優(yōu)選實施方案中，所述單或寡聚氨基酸是寡聚組氨酸或短序列(1-6個殘基)非天然氨基酸，在其具有至少一個額外氨基酸的側(cè)鏈中含有菲咯啉基團，其中所述額外氨基酸不干擾固相載體，如甘氨酸。
優(yōu)選所述寡聚組氨酸基團包含至少2個組氨酸殘基；更優(yōu)選包含6-10個組氨酸殘基。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述寡聚組氨酸基團含有至少2個連續(xù)L-或D-組氨酸殘基、更優(yōu)選6個L-或D-組氨酸殘基的序列。
在另一優(yōu)選實施方案中，錨定部分的所述單或寡聚氨基酸包含至少一個5-氨基-1，10-菲咯啉基團。
可以反復從活化固相上解離生長中的肽鏈或使生長中的肽鏈再結(jié)合至活化固相。在優(yōu)選實施方案中，在肽合成的偶聯(lián)步驟中實現(xiàn)解離，而再結(jié)合過程則在先于隨后的去保護步驟的漂洗步驟之前通過稀釋反應(yīng)混合物來誘導。使用這些步驟，可以利用“過渡性”液相合成及其優(yōu)點，尤其是用于通過片段縮合方法合成大肽。
所述肽鏈的錨定部分優(yōu)選位于所述肽的C-端和/或至少一個氨基酸側(cè)鏈中。
在又一優(yōu)選實施方案中，所述肽的錨定部分可以通過允許進一步加工和檢測肽的特定基團和/或天然和/或非天然氨基酸序列來延伸。
在優(yōu)選實施方案中，在肽的C-端處錨定部分的至少一個氨基酸通過可以由檢測系統(tǒng)檢測的一個或多個氨基酸來延伸。
在優(yōu)選實施方案中，將允許通過抗體簡單識別最終肽鏈的序列加入到生長中的肽中。該標簽序列的實例為myc-tag。此外，加入生物素化的氨基酸(例如生物素化的D-、L-賴氨酸)，優(yōu)選在寡聚起始點C-端處，將允許基于生物素和抗生物素蛋白類分子之間的特異性相互作用而建立最終產(chǎn)物的簡單定量。
在又一優(yōu)選實施方案中，肽的錨定部分通過提供特定蛋白酶識別位點的氨基酸序列而在其N-端延伸。
在又一優(yōu)選實施方案中，起始點通過為蛋白酶識別位點編碼的短氨基酸序列而延伸。這允許在合成過程和折疊操作之后選擇性除去起始點。
在優(yōu)選實施方案中，通過稀釋含競爭配體的Merrifield型順序反應(yīng)方案的反應(yīng)混合物將肽再結(jié)合至活化固相。
與待解離的肽錨定部分的金屬離子絡(luò)合基團(起始點)的單一殘基的親和力相比，合適的競爭配體具有相似的對活化固相(金屬親和樹脂)的親和力，所述單一殘基優(yōu)選寡聚含氮基團。在寡聚組氨酸作為肽的錨定部分的情況中，合適的競爭配體是咪唑(在含水溶劑中)或N-甲基咪唑(在有機溶劑中)。通過將與結(jié)合肽相比大大過量的競爭配體(通常競爭配體比結(jié)合配體過量102-106摩爾比)加入到溶劑中來實現(xiàn)解離。例如在含水溶劑中100-250mM的咪唑(競爭配體)適合用來完成完全分離。相同條件下，可以通過稀釋含有競爭配體的溶劑，優(yōu)選稀釋10-20倍來實現(xiàn)再結(jié)合。這導致競爭配體濃度下降并使得多齒的肽錨定部分再結(jié)合至載體。對于各自溶劑中的錨定部分和活化固相對，競爭配體與錨定部分的摩爾比率可以容易地通過從金屬親和樹脂洗脫錨定部分的色譜方法來確定。
在又一優(yōu)選實施方案中，用于肽合成的錨定部分(例如寡聚組氨酸)在起始點的稀堿性或中性溶液存在下實現(xiàn)與活化固相的結(jié)合。
另外提供了用來純化含錨定部分的肽的方法，所述肽任選為受保護的，所述錨定部分配位結(jié)合至活化固相的配位位點，所述活化固相包含固相載體、共價結(jié)合至固相載體的金屬螯合配體、結(jié)合至所述金屬螯合配體的金屬離子Mn+，n＝1-3，進行漂洗以洗去雜質(zhì)，如殘余保護基團和清除劑或不期望的肽合成副產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案利用在合成的最后步驟中與肽結(jié)合的螯合基團(在鏈的氨基端，例如甘氨酸-菲咯啉衍生物)。在這種情況下，通過色譜過程，利用肽配位結(jié)合至活化固相來從污染副產(chǎn)物中純化粗產(chǎn)物。該原理可通過利用每個合成循環(huán)中常規(guī)封端游離未偶聯(lián)的氨基基團來應(yīng)用。在應(yīng)用該原理的過程中，可以實現(xiàn)在單次色譜流程中純化粗產(chǎn)物。
解離可以通過加入合適的上述競爭試劑或提高溶劑酸度至臨界程度來實現(xiàn)，所述臨界程度優(yōu)選至少低于pH6，更優(yōu)選pH5或更低，尤其是在水溶液中，這提供了另一極好的方法來從金屬親和樹脂上解離錨定肽。
基于肽與活化固相的前述配位、可逆結(jié)合，提供了另一方法。
一種再折疊誤折疊的結(jié)構(gòu)和/或使任選地受保護的肽的分子間聚集體解聚的方法，其中肽的錨定部分配位、可逆地結(jié)合至活化固相，并重新建立正確折疊的肽結(jié)構(gòu)，該方法包括以下步驟(a)將肽暴露于至少一種離液劑或變性劑中，和
(b)(b)接著暴露于一系列溶劑中，以逐漸減少離液程度并提供再折疊和重建二級和三級結(jié)構(gòu)的可重復條件。
在優(yōu)選實施方案中，離液劑或變性劑選自在合適溶劑中的脲、洗滌劑如十二烷基硫酸鈉、高鹽濃度和巰基乙醇或其混合物。
除了共價結(jié)合至合適的樹脂之外，本發(fā)明還提供在偶聯(lián)步驟中解離生長中肽的可能性，同時可以在以下步驟之前再結(jié)合。此外，將肽可逆錨定至活化固相的相同原理可以用來控制純化產(chǎn)物的折疊。為此，將產(chǎn)物純化并再結(jié)合至活化固相，其中選擇結(jié)合肽分子(以摩爾計)與金屬親和樹脂的表面積之比，使得結(jié)合肽不可能相互作用。這使得分子內(nèi)折疊優(yōu)先于分子間相互作用(集聚)。純化和結(jié)合之后，接著用多種溶劑處理產(chǎn)物，所述溶劑允許逐漸折疊該分子并支持肽鏈的正確的分子內(nèi)構(gòu)象。折疊步驟可以通過在正確位置形成例如二硫鍵來完成。該過程的最后，通過加入競爭配體或通過增加溶劑酸度而從活化固相釋放穩(wěn)定產(chǎn)物。
以再折疊操作方案進行結(jié)合肽的再折疊。對于該方案而言，產(chǎn)物必須溶解于適當溶劑中。一般，最優(yōu)選的溶劑是來自LC-色譜系統(tǒng)的洗脫溶劑，盡管產(chǎn)物可以在合適的溶劑中凍干和重構(gòu)。由該溶液，產(chǎn)物與活化固相配位再結(jié)合。這可以通過包括利用基于未保護的亞氨基二乙酸和氨三乙酸的樹脂來完成。這是可以的，因為再折疊通常不使用活化游離羧基的試劑。選擇極低的結(jié)合密度(表面覆蓋范圍)以避免產(chǎn)物分子相互緊密接觸。完成結(jié)合之后，使一系列溶劑逐步通過樹脂。原則上，第一溶劑是高度變性劑和/或離液劑，以使所有產(chǎn)物分子處于相當?shù)恼郫B狀態(tài)。接下來的步驟和溶劑將逐漸接近支持分子折疊的生理條件。操作結(jié)束時，產(chǎn)物分子處于期望的最終溶劑中，優(yōu)選含水溶劑，任選以例如二硫鍵封閉并且可以從活化固相釋放出來。
在又一優(yōu)選實施方案中，肽的二級和三級結(jié)構(gòu)通過用合適試劑處理而在所述肽的反應(yīng)性側(cè)鏈之間形成的共價連接來保持，其中包括在將肽從活化固相上解離之前形成所述共價連接。
在再折疊肽的反應(yīng)性側(cè)鏈之間形成的共價連接優(yōu)選是二硫鍵、酰胺鍵或穩(wěn)定的芳香族或脂肪族腙。
用來閉合例如二硫橋的合適試劑可以選自不同的氧化還原試劑，如碘、氰亞鐵酸鹽、氧和過氧化物。在傳統(tǒng)溶液相反應(yīng)中用來閉合共價鍵的其它試劑也可選擇。
提供一種方法，其中正確折疊的肽的二級和三級結(jié)構(gòu)通過在氨基酸側(cè)鏈之間形成共價連接來固定，優(yōu)選通過使試劑混合物經(jīng)過結(jié)合在活化固相上的再折疊產(chǎn)物而實現(xiàn)的閉合來自游離巰基的二硫鍵、形成酰胺鍵或形成穩(wěn)定的芳香或脂肪族腙來固定。
還提供一種特殊方法，來合成以下序列的肽HHHH-XX-TIVESCNRWITFAQSIISTLT-βAla-G-G-βAla-TKKTQLQLEHLLLDLQMCLNGINN-XX (1)其中，X＝d-丙氨酸，βAla＝β-丙氨酸，包括在半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵，因而形成 其中X和βAla如上所定義。
使用以上在Merrifield型順序反應(yīng)方案中描述的方法在活化固相上合成所述序列(I)的肽的特殊方法包括至少一個純化和再折疊和在半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵的步驟。同樣適用于其具有氨基酸缺失或氨基酸替換的肽衍生物，因為仍然存在兩個cyctein殘基，它們之間的距離允許形成二硫鍵。
此外，提供了包含錨定部分的肽，所述錨定部分優(yōu)選由用來將肽配位、可逆結(jié)合至活化固相表面的非天然氨基酸構(gòu)成，該錨定部分位于N-或C-端和/或肽的側(cè)鏈中，包含至少一個金屬離子絡(luò)合基團，每個所述基團包含至少一個含氮基團，但有些肽例外，在這些肽中所述金屬離子絡(luò)合基團是2-5個組氨酸殘基的氨基酸序列。
金屬離子絡(luò)合基團優(yōu)選是所提供肽的含氮基團，優(yōu)選將這些基團固定至N-或C-端或至少一個氨基酸的部分側(cè)鏈上，并且所述基團選自氨基、羥基、羧基、巰基、咪唑基、N-甲基咪唑基、氨基嘌呤基團、phenanthrolyl基團、吡啶基團、聯(lián)吡啶基團、三聯(lián)吡啶基團、三氮雜環(huán)壬烷基團、四氮雜環(huán)十二烷基團或其組合。
在另一優(yōu)選實施方案中，氨基酸部分包含單或寡聚天然或非天然氨基酸。
在優(yōu)選實施方案中，錨定部分包含至少一個咪唑基團。更優(yōu)選的是，肽的錨定部分包含1-10個咪唑基團。
在另一優(yōu)選實施方案中，氨基酸包含至少兩個、更優(yōu)選6-10個組氨酸基團。在優(yōu)選實施方案中，氨基酸部分包含至少一個咪唑基團。更優(yōu)選的是，錨定部分包含1-10個咪唑基團。
關(guān)于本發(fā)明的另一優(yōu)點是金屬親和樹脂可以在肽合成之后再利用。這可以通過除去陽離子并將樹脂重新載入相同或其它合適的陽離子來實現(xiàn)。由于各種陽離子的結(jié)合強度彼此不同，因此需要針對作為樹脂表面和合成起始點之間橋連配體的另一陽離子而選擇改進結(jié)合和再結(jié)合過程以及所得絡(luò)合物穩(wěn)定性的方法。
本發(fā)明還通過以下非限制性實施例來說明。
實施例縮寫 物質(zhì)DMFN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級)DCM二氯甲烷(肽合成級)HOBT 1-羥基苯并三唑(無水)DBU1，8-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]十一碳-7-烯98％PyBOP 苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-膦-六氟磷酸酯DIPEA，DIEAN-乙基二異丙基胺98+％TIS三異丙基硅烷99％MeOH 甲醇HPLC(梯度級)TFE2，2，2-三氟乙醇99.8％EDT1，2-乙二硫醇HCl 鹽酸NaOH 氫氧化鈉溶液THF四氫呋喃DMSO-d6二甲基亞砜，氘化br 寬(信號峰)s 單d 雙重t 三重
q 四重p 五重m 多重TFA 三氟乙酸NMI N-甲基咪唑Ni-NTA超流動樹脂(Superflow Resin)(Novagen)實施例1合成Fmoc-Gly-His4-Gly-OMe[TAG1]將2mmol第一氨基酸和4mmol DIPEA溶于10ml干燥DCM中。將該溶液加入1.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)中并且將該混合物在渦旋混合器上反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)結(jié)束時，將樹脂與20ml DCM/MeOH/DIPEA反應(yīng)兩次每次3分鐘，用20ml DCM洗滌兩次并用DMF洗滌兩次。隨后用20ml哌啶/DMF(1∶3)處理兩次，持續(xù)3/20分鐘，并用20ml DMF洗滌6次。
將5mmol氨基酸、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分鐘后加入5mmol PyBOP和10mmol DIPEA，并將該溶液澆在樹脂上。在渦旋混合器上60分鐘后，將樹脂用20ml DMF洗滌6次，用20ml哌啶/DMF(1∶3)處理兩次，持續(xù)20/20分鐘，并用20ml DMF洗滌6次。在N-端氨基酸的情況下，樹脂不用哌啶/DMF處理。
結(jié)合最后的氨基酸之后，用20ml DMF洗滌樹脂6次，用20ml DCM洗滌兩次，接著使其與50ml TFE/DCM(2/8)反應(yīng)60分鐘。將樹脂過濾，真空去除溶劑并使用粗肽片段而不再純化。
將粗肽、10mmol Cl-HOBT、10mmol DIEA和20mmol DIC溶于最小量的干燥DCM中。使該溶液反應(yīng)10分鐘，并加入10mmol DIEA和10mmol Gly-Ome溶液。旋渦混合2h之后，加入100ml DCM并用200ml硫酸氫鈉溶液(1-2mol/l)萃取3次，用200ml濃氯化鈉溶液萃取3次并用200ml碳酸氫鈉溶液(1-2mol/l)萃取3次。有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，除去溶劑并使用粗肽而不再純化。
將粗肽溶于50ml TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)中并使其在旋渦混合器上反應(yīng)60分鐘。通過與DCM共蒸發(fā)除去TFA。將粗肽溶于DMSO并在使用Kromasil RP C18柱的Gilson Nebula LCMS系統(tǒng)上純化1000μl。從含TFA(0.1％)的5％乙腈水溶液經(jīng)30分鐘線性梯度擴展至50％乙腈(含0.085％TFA)。流速為20mL/min并在214nm處監(jiān)測光吸收。
實施例2合成Fmoc-Gly-His6-Gly-OMe[TAG3]將2mmol第一氨基酸和4mmol DIPEA溶于10ml干燥的DCM中。將該溶液加入1.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)中并且將該混合物在渦旋混合器上反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)結(jié)束時，將樹脂與20ml DCM/MeOH/DIPEA反應(yīng)兩次每次3分鐘，用20ml DCM洗滌兩次并用DMF洗滌兩次。隨后用20ml哌啶/DMF(1∶3)處理兩次，持續(xù)3/20分鐘，并用20mlDMF洗滌6次。
將5mmol氨基酸、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分鐘后加入5mmol PyBOP和10mmol DIPEA，并將該溶液澆在樹脂上。在渦旋混合器上60分鐘后，將樹脂用20ml DMF洗滌6次，用20ml哌啶/DMF(1∶3)處理兩次，持續(xù)20/20分鐘，并用20ml DMF洗滌6次。在N-端氨基酸的情況下，樹脂不用哌啶/DMF處理。
結(jié)合最后的氨基酸之后，用20ml DMF洗滌樹脂6次，用20ml DCM洗滌兩次，接著使其與50ml TFE/DCM(2/8)反應(yīng)60分鐘。將樹脂過濾，真空去除溶劑并使用粗肽片段而不再純化。
將粗肽、10mmol Cl-HOBT、10mmol DIEA和20mmol DIC溶于最小量的干燥DCM中。使該溶液反應(yīng)10分鐘，并加入10mmol DIEA和10mmol Gly-Ome溶液。旋渦混合2h之后，加入100ml DCM并用200ml硫酸氫鈉溶液(1-2mol/l)萃取3次，用200ml濃氯化鈉溶液萃取3次并用200ml碳酸氫鈉溶液(1-2mol/l)萃取3次。有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，除去溶劑并使用粗肽而不再純化。
將粗肽溶于50ml TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)中并使其在旋渦混合器上反應(yīng)60分鐘。通過與DCM共蒸發(fā)除去TFA。將粗肽溶于MeOH并在使用Kromasil RP C18柱的Gilson Nebula LCMS系統(tǒng)上純化1000μl。從含TFA(0.1％)的5％乙腈水溶液經(jīng)50分鐘線性梯度擴展至80％乙腈(含0.085％TFA)。流速為20mL/min并在214nm處監(jiān)測光吸收。
實施例3合成Fmoc-Gly-His3-Gly-His3-Gly-OMe[TAG4]將2mmol第一氨基酸和4mmol DIPEA溶于10ml干燥的DCM中。將該溶液加入到1.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)中并且將該混合物在渦旋混合器上反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)結(jié)束時，將樹脂與20ml DCM/MeOH/DIPEA反應(yīng)兩次每次3分鐘，用20ml DCM洗滌兩次并用DMF洗滌兩次。隨后用20ml哌啶/DMF(1∶3)處理兩次，持續(xù)3/20分鐘，并用20ml DMF洗滌6次。
將5mmol氨基酸、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分鐘后加入5mmol PyBOP和10mmol DIPEA，并將該溶液澆在樹脂上。在渦旋混合器上60分鐘后，將樹脂用20mlDMF洗滌6次，用20ml哌啶/DMF(1∶3)處理兩次，持續(xù)20/20分鐘，并用20ml DMF洗滌6次。在N-端氨基酸的情況下，樹脂不用哌啶/DMF處理。
結(jié)合最后的氨基酸之后，用20ml DMF洗滌樹脂6次，用20ml DCM洗滌兩次，接著使其與50ml TFE/DCM(2/8)反應(yīng)60分鐘。將樹脂過濾，真空去除溶劑并使用粗肽片段而不再純化。
將粗肽、10mmol Cl-HOBT、10mmol DIEA和20mmol DIC溶于最小量的干燥DCM中。使該溶液反應(yīng)10分鐘，并加入10mmol DIEA和10mmol Gly-Ome溶液。旋渦混合2h之后，加入100ml DCM并用200ml硫酸氫鈉溶液(1-2mol/l)萃取3次，用200ml濃氯化鈉溶液萃取3次并用200ml碳酸氫鈉溶液(1-2mol/l)萃取3次。有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，除去溶劑并使用粗肽而不再純化。
將粗肽溶于50ml TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)中并使其在旋渦混合器上反應(yīng)60分鐘。通過與DCM共蒸發(fā)除去TFA。將粗肽溶于DMSO并在使用Kromasil RP C18柱的Gilson Nebula LCMS系統(tǒng)上純化1000μl。從含TFA(0.1％)的5％乙腈水溶液經(jīng)30分鐘線性梯度擴展至50％乙腈(含0.085％TFA)。流速為20mL/min并在214nm處監(jiān)測吸收。
實施例4合成Fmoc-Gly-5-氨基-1，10-菲咯啉[TAG5]將2ml DIEA、6mmol Cl-HOBt、12mmol DIC加入溶于最小量DMF中的2.56mmolFmoc-Gly-OH中。將該溶液在渦旋混合器上混合5分鐘并加入溶于最小量DMF中的0.5g 5-氨基-1，10-菲咯啉。將該混合物孵育12小時并以5倍體積的乙酸乙酯稀釋。用碳酸氫鈉洗滌該溶液3次。粗產(chǎn)物沉淀，將該沉淀過濾并利用柱色譜或LCMS純化。將該粗肽溶于DMSO并在使用Kromasil RP C18柱的Gilson Nebula LCMS系統(tǒng)上純化1000μl。從含TFA(0.1％)的5％乙腈水溶液經(jīng)50分鐘線性梯度擴展至50％乙腈(含0.085％TFA)。流速為20mL/min并在214nm處監(jiān)測吸收。
實施例5合成(雙-叔丁氧基羰基甲基-氨基)-乙酸[TAG8b]a)合成(雙-叔丁氧基羰基甲基-氨基)乙酸苯甲基酯[TAG8a]將20mmol甘氨酸苯甲基酯對甲苯磺酸鹽、40mmol溴代乙酸叔丁酯和60mmolDIEA溶于35ml干燥的DMF中。將反應(yīng)混合物旋渦混合4天。濾除沉淀鹽并將溶液溶于250ml乙酸乙酯中。用以下溶液萃取有機層2×200ml 1N NaOH、3×1NNaOH/鹽水1∶1。該溶液用Na2SO4干燥，真空蒸餾除去溶劑，粗產(chǎn)物通過快速柱色譜(乙酸乙酯/己烷1∶4)純化。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm 7.42-7.29(m，5H)，5.10(s，2H)，3.60(s，2H)，3.50(s，4H)，1.38(s，18H)；LC-MS(ESI)(M+H)+＝394b)合成(雙-叔丁氧基羰基甲基-氨基)-乙酸[TAG8b]將17.5mmol(雙-叔丁氧基羰基甲基-氨基)-乙酸苯甲基酯溶于75ml THF中，并加入0.70g 10％附著炭上的催化劑鈀。反應(yīng)容器用氫氣沖洗數(shù)次，在氫存在下攪拌反應(yīng)混合物，直至氫消耗停止。經(jīng)硅藻土濾除催化劑并真空除去溶劑。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm，12.2(brs，1H)，3.46(s，2H)，3.44(s，4H)，1.40(s，18H)；LC-MS(ESI)(M+H)+＝304實施例6合成4-(雙-叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)丁酸[TAG10b]a)4-(雙-叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)丁酸苯甲基酯[TAG10a]將24mmol戊二酸單苯甲基酯、30mmol乙二酰氯和兩滴DMF溶于20ml干燥的DCM中?；亓鞣磻?yīng)混合物，直至氣體演變停止。將該溶液與10ml甲苯共蒸發(fā)。粗產(chǎn)物溶于DCM中并逐滴加入到12.0mmol(叔丁氧基羰基甲基-氨基)乙酸叔丁酯和26.4mmol DIEA的0℃的DCM溶液中。0℃下攪拌反應(yīng)混合物1小時，并在室溫下過夜。真空除去溶劑并將殘留物溶于150ml二乙醚中。用以下溶液萃取有機層100ml 1NHCl、100ml半濃的碳酸氫鈉溶液和100ml鹽水。該溶液經(jīng)硫酸鈉干燥并真空除去溶劑。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜(乙酸乙酯/己烷1∶1)純化。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm 7.4-7.2(m，5H)，5.08(s，2H)，4.11(s，2H)，3.91(s，2H)，2.38(t，J＝7.4Hz，2H)，2.28(t，J＝7.3Hz，2H)，1.75(p，J＝7.4Hz，2H)，1.41(s，9H)，1.39(s，9H)；LC-MS(ESI)(M+H)+＝450b)合成4-(雙-叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)丁酸[TAG10b]將2mmol 4-(雙-叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)丁酸苯甲基酯溶于20ml THF中，并加入0.09g 10％附著炭上的催化劑鈀。反應(yīng)容器用氫氣沖洗數(shù)次，并在氫存在下攪拌反應(yīng)混合物，直至氫消耗停止。
經(jīng)硅藻土濾除催化劑并真空除去溶劑。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm 12.1(br s，1H)，4.11(s，2H)，3.91(s，2H)，2.30-2.17(m，4H)，1.68(p，J＝7.2Hz，2H)，1.42(s，9H)，1.39(s，9H)；LC-MS(ESI)(M+Na)+＝382實施例7合成4-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)-丁酸[TAG12b]a)合成4-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)-丁酸甲酯[TAG12a]在氬氣氛中將5mmol 5-氨基-[1，10]-菲咯啉溶于25ml干燥的DMF中。加入6.5mmol DIEA并逐滴加入5.5mmol 4-氯羰基-丁酸甲酯。攪拌1小時之后通過真空蒸餾除去溶劑和過量的堿。粗產(chǎn)物經(jīng)反相柱色譜(Merck Lobar RP18柱，洗脫劑乙腈/碳酸氫銨，5重量％，梯度20％-40％)純化。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm 10.11(s，1H)，9.13(dd，J＝1.6，4.3Hz，1H)，9.03(dd，J＝1.7，4.3Hz，1H)，8.60(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，8.44(dd，J＝1.7，8.2Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.82(dd，J＝4.2，8.4Hz，1H)，7.74(dd，J＝4.3，8.1Hz，1H)，3.63(s，3H)，2.59(t，J＝7.2Hz，2H)，2.46(t，J＝7.4Hz，2H)，1.95(p，J＝7.3Hz，2H)；LC-MS(ESI)(M+H)+＝324b)合成4-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)-丁酸[TAG12b]將1.5mmol 4-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)-丁酸甲酯溶于15ml 1，4-二噁烷和15ml蒸餾水中。加入1.5ml 1N氫氧化鉀溶液并回流該溶液1小時。真空蒸餾除去溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)反相柱色譜(Merck Lobar RP18柱，洗脫劑乙腈/碳酸氫銨，1重量％，梯度10％-20％)純化。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)，以鉀鹽形式ppm 9.11(dd，J＝1.6，4.3Hz，1H)，9.04(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)，8.65(dd，J＝1.5，8.4Hz，1H)，8.41(dd，J＝1.6，8.1Hz，1H)，8.14(s，1H)，7.82(dd，J＝4.4，8.4Hz，1H)，7.74(dd，J＝4.4，8.1Hz，1H)，2.64(t，J＝7.6Hz，2H)，2.36(t，J＝7.2Hz，2H)，2.10(q，J＝7.5Hz，2H))；LC-MS(ESI)(M+H)+＝310此外，含有不同于戊二酸的其它二羧酸衍生物的標簽分子可以類似于本文所述方案而制備。
實施例8合成[5-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)戊酰氨基]-乙酸[TAG15]在氬氣氛中將負載有Fmoc-Gly-OH(0.7mmol/g)的1mmol Wang樹脂懸浮于哌啶/DMF(1∶3)并在微波爐(CEM系統(tǒng)“Discover”)中照射3次持續(xù)30秒。用DMF洗滌樹脂3次并用DCM洗滌3次。將樹脂懸浮于15ml DCM中并加入9mmol DIEA和10mmol己二酰氯。旋渦攪拌該懸浮液30分鐘之后，過濾反應(yīng)混合物并將樹脂用DCM洗滌2次，用DMF洗滌1次。將樹脂懸浮于15ml DMF中并加入3mmol 5-氨基-[1，10]-菲咯啉和5mmol DIEA的20ml DMF溶液。懸浮液旋渦攪拌過夜之后，將樹脂用DMF洗滌6次，通過懸浮于TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)中來從樹脂切割出產(chǎn)物。濾除樹脂并將濾液與氯仿共蒸發(fā)幾次以得到產(chǎn)物。
該過程也可類似應(yīng)用于結(jié)合肽的其它樹脂和二羧酸的其它活化衍生物。
實施例95-氨基-1，10-菲咯啉/2-氯三苯甲基氯化物樹脂在惰性氣體下，將2mmol 5-氨基-[1，10]-菲咯啉懸浮于50ml干燥DMF中。將5g2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)加入所得混合物中并在室溫下孵育該樹脂2小時。濾除樹脂并用DMF洗滌直至除去過量的菲咯啉。為了阻斷樹脂上的未反應(yīng)基團，用10ml DCM/MeOH/DIEA(80∶15∶5)孵育3次持續(xù)10分鐘，隨后用10ml DMF洗滌3次。樹脂可在室溫下貯存在DMF中。為了將Ni2+離子負載到樹脂上，用NiCl2的飽和DMF溶液孵育樹脂30分鐘。用DMF洗滌樹脂直至沒有NiCl2可被發(fā)現(xiàn)。在5次額外的DMF洗滌之后，進行以下過程
4×5′ DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)4×15′DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)1×12h DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)2×5′DMF1×1′異丙醇1×15′異丙醇1×5′DMF1×30′DMF1×1′異丙醇1×15′異丙醇1×5′DMF1×30′DMF1×1′異丙醇1×15′異丙醇1×5′DMF1×30′DMF實施例105-氨基-1，10-菲咯啉/Novasyn TG羧基樹脂將5g Novasyn TG樹脂用50ml干燥DMF平衡30分鐘。加入10mmol DIEA和10mmol HOBt。孵育5分鐘之后加入2g 5-氨基-1，10-菲咯啉和10mmol Pybop以及10mmol DIEA并旋渦混合該混合物過夜。第二天早上，將樹脂每次用50ml DMF洗滌6次。為了將鎳負載在樹脂上，加入10ml氯化鎳飽和DMF溶液并旋渦混合30分鐘。該步驟之后，除去上清液，并用50ml DMF分批洗滌樹脂，直至上清液中無可見顏色。通過以下洗滌程序除去過量吸附的鎳離子
4×5′ DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)4×15′DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)1×12h DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)2×5′DMF1×1′異丙醇1×15′異丙醇1×5′DMF1×30′DMF1×1′異丙醇1×15′異丙醇1×5′DMF1×30′DMF1×1′異丙醇1×15′異丙醇1×5′DMF1×30′DMF實施例11合成1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷/2-氯三苯甲基氯化物樹脂將2.5g 2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)懸浮于40ml干燥DMF中。加入500mg 1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三鹽酸鹽和2ml二異丙基乙胺。室溫下孵育樹脂8小時。過濾樹脂并用DMF洗滌6次。為了阻斷樹脂上的未反應(yīng)基團，用20mlDCM/MeOH/DIEA(80∶15∶5)孵育2次每次30分鐘，隨后用20ml DMF洗滌2次?？梢愿鶕?jù)實施例10完成樹脂的鎳負載。樹脂在DMF保護下貯存于冰箱中。
實施例12將標簽負載至樹脂上(批次實驗)將1ml相應(yīng)的樹脂用DMF(肽合成級)洗滌3次。將1mg標簽溶于1ml DMF中并加入1滴DIEA。將50μl的該溶液用950μl水稀釋并利用HPLC分析。將殘余混合物加入經(jīng)洗滌的樹脂中并孵育30分鐘。為了檢測標簽對樹脂的附著，用950μl水稀釋50μl溶液并用HPLC進行分析。
實施例12a將TAG1負載至Ni-菲咯啉-2Cl-Trt-樹脂上清液的HPLC顯示沒有可檢測的TAG1。
實施例12b將TAG3負載至Ni-菲咯啉-2Cl-Trt-樹脂上清液的HPLC顯示沒有可檢測的TAG3。具有相似保留時間的殘余痕量是未結(jié)合的少量雜質(zhì)。該實施例還顯示出本方法用于從雜質(zhì)中純化產(chǎn)物的潛力。
實施例12c將TAG4負載至Ni-菲咯啉-2Cl-Trt-樹脂上清液的HPLC顯示沒有可檢測的TAG3。
實施例12d將TAG3負載至Ni-菲咯啉-Novasyn-TG-樹脂上清液的HPLC顯示沒有可檢測的TAG3。
實施例13從樹脂洗脫TAG3(批次實驗)將10ml已負載樹脂用20ml混合物1洗滌3次，并將樹脂分成10份。除去上清液并用以下溶液孵育樹脂5分鐘(TAG3_01)6mg谷胱甘肽(氧化型)溶于2ml混合物1(5mmol/l)(TAG3_02)3mg谷胱甘肽(還原型)溶于2ml混合物1(5mmol/l)(TAG3_03)2ml 1N HCl(TAG3_04)2ml 0.1N HCl(TAG3_05)0.68mg咪唑溶于2ml混合物1(5mmol/l)(TAG3_06)1.36mg咪唑溶于2ml混合物1(10mmol/l)(TAG3_07)2.72mg咪唑溶于2ml混合物1(20mmol/l)(TAG3_08)0.82mg N-甲基咪唑溶于2ml混合物1(5mmol/l)(TAG3_09)1.64mg N-甲基咪唑溶于2ml混合物1(10mmol/l)(TAG3_10)3.28mg N-甲基咪唑溶于2ml混合物1(20mmol/l)對于用更高濃度的咪唑和N-甲基咪唑洗脫的實驗，通過使用來自試管(TAG3-07)和(TAG3_10)的樹脂來進行實驗。這些樹脂用濃度逐漸增加的洗脫試劑(100mmol、200mmol、500mmol)孵育，分析上清液并用下一濃度的洗脫試劑孵育樹脂5分鐘。
結(jié)果可利用鹽酸輕易實現(xiàn)標簽的洗脫。濃度100mmol以上的咪唑或N-甲基-咪唑也可有效洗脫。
實施例14從Ni-NTA樹脂上結(jié)合和洗脫TAG3(FPLC實驗)肽TAG3(Fmoc-(His)6-OMe，M＝1191.25g/mol)，HPLC級樹脂Ni-NTA SuperFlow(載量約5μmol/ml)柱Biorad 2.0mlFPLC設(shè)備_kta Pharmaciaa)用N-甲基咪唑洗脫注射1.1mg(0.92μmol)TAG3的0.75ml洗脫劑A溶液洗脫劑A2，2，2-三氟乙醇/H2O/二異丙基乙胺/N-甲基咪唑1∶1∶+1％∶+5mM洗脫劑BTFE/H2O/DIEA/NMI 1∶1∶+1％∶+500mM流速1ml/min程序注射(5mlA)→洗滌(10mlA)→梯度洗脫劑(0％B→100％B 10ml)→保持(5ml B)→再生(8ml A)TAG3定量結(jié)合并在100-125mM N-甲基咪唑濃度下洗脫。這種FPLC程序也可用來確定閾值濃度，在該濃度以上錨定分子受螯合劑有效競爭。閾值濃度以下，錨定分子仍然結(jié)合在樹脂上。在批次程序中，混合物稀釋至閾值濃度點以下將重新固定溶解的錨定分子至樹脂上。
b)用鹽酸洗脫將2.4mg(2.0μmol)TAG3的0.75ml洗脫劑A溶液注射到_kta FPLC機器中。運行以下程序洗脫劑A1TFE/H2O/DIEA/NMI 1∶1∶+1％∶+5mM洗脫劑BTFE/H2O/NMI 1∶1∶+5mM
洗脫劑A2TFE/H2O/HCl 1∶1∶+10mM流速0.5-1ml/min程序注射(2.5ml A1)→洗滌(10ml A1)→梯度除去DIEA(0％B→100％B 10ml)→接著“階段梯度(Step-Gradient)”到洗脫劑A2(10mM HCl20％、40％、60％、70％)TAG3在60％的洗脫劑A2中洗脫。
實施例15用Fmoc-Gly合成環(huán)將TAG3和Fmoc-Gly偶聯(lián)至TG-樹脂上。
將負載有TAG3的1ml TG樹脂用5ml DMF洗滌3次。為了將N端去保護，加入5ml 20％哌啶并孵育樹脂30分鐘。接著將樹脂用DMF洗滌6次，并加入溶于最少量DMF中的1mmol Fmoc-Gly-OH、2mmol DIEA、2mmol HOBt和2mmmol DIC預(yù)活化溶液。60分鐘之后，用每次5ml DMF洗滌樹脂6次并用每次2ml水洗滌6次。為了從樹脂上切割肽，加入1ml 1N HCl并孵育樹脂30分鐘。
結(jié)果切下的肽在Vydac C18質(zhì)譜柱(218MS5415)通過LCMS進行分析。采用5％-95％B的30分鐘梯度和流速1ml/min(A＝水、0.1％TFA；B＝乙腈、0.085％TFA)。
未檢測到離析物?；旌衔镏形ㄒ淮嬖诘碾谋憩F(xiàn)出期望質(zhì)量(M＝1247，M2+＝625)。除了HOBt，沒有檢測到其它明顯的雜質(zhì)。
實施例16在Ni-NTA-樹脂上合成TAG5-G-A-Fmoc在1.7ml Omnifit柱中將2.65mg TAG5結(jié)合至Ni-NTA-樹脂上。將樹脂移入微波反應(yīng)器中并用每次5ml DMF洗滌樹脂6次。棄去上清液并用5ml 25％的哌啶DMF溶液孵育樹脂，同時在Discovery微波爐(CEM GmbH)中暴露于3×30秒每次50W的微波脈沖。將樹脂用DMF洗滌6次。制備溶于最少量溶劑(DMF)的1mM預(yù)期氨基酸(適當保護)的溶液。將2mmol DIEA、2mmol HOBt和2mmol DIC加入該溶液。孵育5分鐘后，將該溶液加入去保護的樹脂中并以每次50W的功率微波處理3×30秒。在連接最后的氨基酸之后，末端fmoc基團沒有除去。用水(pH大于7)洗滌樹脂5次。最后，將2ml 1N HCl加入樹脂。孵育樹脂30分鐘。移除并保存上清液。將上清液直接用于LC/MS分析。收集樹脂用于再循環(huán)利用。LC/MS顯示在唯一可檢測的肽峰上肽具有正確質(zhì)量。非肽雜質(zhì)為HOBt和HOBt-H2O。
實施例17純化IL-2 Immunomer在Ni-NTA上用2，2，2-三氟乙醇/H2O/二異丙基乙胺/N-甲基咪唑來純化IL-2Immunomer(DIM03A)。
肽如實施例19所確定(M＝6237g/mol)，粗產(chǎn)物得自樹脂切割物；樹脂Ni-NTA SuperFlow將溶于5ml洗脫劑A中的76.7mg(12.2μmol)肽分5次注射，見圖3a-c所示。
柱Biorad 2.0ml洗脫劑ATFE/H2O/DIEA/NMI 1∶1∶+1％∶+5mM洗脫劑BTFE/H2O/DIEA/NMI 1∶1∶+1％∶+500mM流速1ml/min程序注射(5mlA)→洗滌(10ml A)→梯度洗脫劑(0％B→100％B 10ml)→保持(5ml B)→再生(8ml A)預(yù)期產(chǎn)物以單峰形式在約125mM NMI中洗脫。用LC-MS進行確認。
實施例18合成后的肽修飾封閉肽中的二硫橋H2N-HHHHGC(Acm)GNGGGC(Trt)GSGN-COOHAcm和Trt是保護半胱氨酸殘基上SH基團的標準保護基團。肽經(jīng)常規(guī)肽合成而合成并在LC-MS系統(tǒng)上預(yù)純化至純度95％以上。
將1ml負載有肽的Ni-NTA樹脂用2ml MeOH洗滌3次。2小時內(nèi)加入50μl碘溶液(0.5mol/l)并將該混合物在室溫下再孵育2小時。將樹脂用MeOH洗滌6次，用水(pH＞7)洗滌3次，隨后用2ml HCl(1N)孵育。濾除樹脂并用LCMS分析溶液。得到單一產(chǎn)物峰，顯示出正確的質(zhì)量。
實施例19使用本文所提供方法的再折疊步驟合成白介素-2 Immunomer待合成物質(zhì)的化學式 X＝D-丙氨酸βAla＝β-丙氨酸其它字母＝標準氨基酸代碼一般策略在2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)上以0.2mmol/g的取代率進行合成。前7個氨基酸連接為片段。隨后的氨基酸的連接通過用10倍過量的氨基酸和作為偶聯(lián)添加劑的PyBOP/HOBT/DIPEA進行單、雙、三重偶聯(lián)來實現(xiàn)。生長中肽鏈的N端去保護是通過用哌啶/DMF(1/3)二次處理來實現(xiàn)。在困難情況下，用DBU/哌啶/DMF(2/2/96)進行第三次處理。所用的偶聯(lián)和去保護循環(huán)數(shù)目示于以下方案中(關(guān)于困難的偶聯(lián)/去保護信息通過用HPLC-MS監(jiān)測每一步延伸來得到)。
RES-XXNNIGN-LCMQLDLLLHELQLQTKKTBGGB-TLTSIISQAFTIWRNCSEVITXXHHHH偶聯(lián) 22221211111111122222222-223333333333333333333333333去保護22222222222222322222222-2233333333333333333333333331，2，3＝偶聯(lián)或去保護循環(huán)數(shù)目X＝D-丙氨酸B＝β-丙氨酸方案1合成第一肽片段將2mmol第一氨基酸和4mmol DIPEA溶于10ml干燥DCM中。將該溶液加入1.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)中并使該混合物在旋渦混合器上反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)結(jié)束時，將樹脂與20ml DCM/MeOH/DIPEA反應(yīng)兩次每次3分鐘，用20ml DCM洗滌兩次并用DMF洗滌兩次。隨后用20ml哌啶/DMF(1∶3)處理兩次，持續(xù)3/20分鐘，并用20mlDMF洗滌6次。氨基酸2-7通過以下步驟連接將5mmol氨基酸、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分鐘后加入5mmolPyBOP和10ml DIPEA，并將該溶液澆在樹脂上。在渦旋混合器上混合60分鐘后，將樹脂用20ml DMF洗滌6次，用20ml哌啶/DMF(1∶3)處理兩次，持續(xù)20/20分鐘，并用20ml DMF洗滌6次。在N-端氨基酸的情況下，樹脂不用哌啶/DMF處理。
方案2切割肽片段結(jié)合最后的氨基酸之后，用20ml DMF洗滌樹脂6次，用20ml DCM洗滌兩次，接著使其與50ml TFE/DCM(2/8)反應(yīng)60分鐘。將樹脂過濾，真空去除溶劑并使用粗肽片段而不再純化。
方案3再結(jié)合肽片段將1mmol片段和2mmol DIPEA溶于50ml干燥DCM中。將該溶液加入5.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)中并使該混合物在旋渦混合器上反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束時，將樹脂與50ml DCM/MeOH/DIPEA反應(yīng)兩次每次3分鐘，用20mlDCM洗滌兩次并用DMF洗滌兩次。
方案4偶聯(lián)氨基酸8-57將干燥的樹脂在50ml哌啶/DMF(1∶3)中溶脹30分鐘，用30ml哌啶/DMF(1∶3)處理20分鐘，用30ml DBU/哌啶/DMF(2/2/96)處理20分鐘并用30ml DMF洗滌6次。將10mmol氨基酸、15mmol HOBT和20mmol DIPEA溶于30ml DMF中。5分鐘后加入10mmol PyBOP和20mmol DIPEA，并將該溶液澆在樹脂上。在渦旋混合器上混合60分鐘后，將樹脂用30ml DMF洗滌2次，并重復偶聯(lián)1次或(困難情況下)2次持續(xù)60分鐘。隨后用30ml DMF洗滌樹脂6次。該樹脂可直接用于偶聯(lián)下一氨基酸或者一在用30ml DCM洗滌2次之后一真空干燥并在-80℃下貯存。
方案5切割和去保護在偶聯(lián)最后的氨基酸之后，通過用30ml哌啶/DMF(1∶3)兩次處理20分鐘和用DBU/哌啶/DMF(2/2/96)處理20分鐘除去N端保護基。用30ml DMF洗滌樹脂6次，用30ml DCM洗滌2次并用50ml TFE/DCM(2/8)處理180分鐘。過濾后，真空除去溶劑并通過在惰性氣氛下用30ml TFA/TIS/EDT/水(94/1/2.5/2.5)處理180分鐘來除去保護基。將該溶液注入300ml冷醚中，將沉淀物溶解于乙腈并用RP-HPLC(Kromasil 100C410μm，250×4.6mm)純化肽，并所收集組分直接用于再折疊過程。
作為替代方案，IL-2Immunomer粗產(chǎn)物可在金屬親和柱上得到有效純化IL-2粗產(chǎn)物，76.7mg(12.2μmol)，溶于約5ml洗脫劑A中，分5次注射(亦見圖3a-c)柱Omnifit 1.7ml洗脫劑ATFE/H2O/DIEA/NMI 1∶1∶+1％∶+5mM洗脫劑BTFE/H2O/DIEA/NMI 1∶1∶+1％∶+500mM流速1ml/min程序注射(5ml A)→洗滌(16.5ml A)→梯度洗脫劑(0％B→100％B 10ml)→保持(5ml B)→再生(8ml A)方案6再折疊步驟精確使用與洗脫組分中相同的溶劑將各洗脫組分稀釋至最終體積20ml。將該純化產(chǎn)物的溶液在燒杯中于輕微攪拌下與10ml Ni-NTA SuperFlow(Qiagen)室溫孵育30分鐘。將Superflow顆粒裝入空的FPLC柱并連接至FPLC機器。使用該機器的色譜程序，于10分鐘內(nèi)交換溶劑。用水形成梯度，然后經(jīng)10分鐘梯度將溶劑改變?yōu)樗?三氟乙酸(1/1)混合物。在24小時時間內(nèi)，該溶劑通過向儲瓶吹氧氣泡而被氧化并使用氧作為瓶內(nèi)氣氛以便封閉二硫橋。氧化過程中，以恒定流速0.1ml/min沿柱流動過夜，同時將洗脫液持續(xù)再循環(huán)至儲瓶中。
在24小時結(jié)束時，用含150mM咪唑的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)或用0.1M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)將再折疊和封閉二硫鍵的最終產(chǎn)物洗脫。
實施例20將(雙-叔丁氧基羰基甲基-氨基)-乙酸[TAG8b]偶聯(lián)至肽的N端根據(jù)如實施例19的方案1的標準方法，在2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)上制備1mmol序列為WETGLRLAPL的肽。
為了將TAG8b偶聯(lián)到肽的N端上，類似地采用偶聯(lián)氨基酸的程序。將5mmolTAG8b、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分鐘后加入5mmolPyBOP和10mmol DIPEA并將該溶液澆注在樹脂上。旋渦混合60分鐘后，將樹脂用20ml DMF洗滌6次，用30ml DCM洗滌2次。
根據(jù)標準程序進行肽的切割和去保護將樹脂用50ml TFE/DCM(2/8)處理180分鐘。過濾后，真空除去溶劑并通過在惰性氣氛中用30ml TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)處理180分鐘來除去保護基團。將該溶液注入300ml冷醚中，將沉淀物溶于乙腈并且用RP-HPLC(Kromasil 100 C410μm，250×4.6mm)純化肽。
在去保護步驟期間，切除標簽Tag的叔丁酯基，從而生成肽Tag8-WETGLRLAPL。
LC-MS(ESI)(M+H)+1331。
實施例21將4-(雙叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)-丁酸[TAG 10b]偶聯(lián)至肽的N端根據(jù)如實施例19的方案1的標準方法，在2-氯三苯甲基氯化物樹脂(200-400目)上制備1mmol序列為GDQYIQQAHRSHI的肽。
為了將Tag10b偶聯(lián)到肽的N端上，類似地采用偶聯(lián)氨基酸的程序。將5mmolTag10b、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分鐘后加入5mmolPyBOP和10mmol DIPEA并將該溶液澆注在樹脂上。旋渦混合60分鐘后，將樹脂用20ml DMF洗滌6次，用30ml DCM洗滌2次。
根據(jù)標準程序進行肽的切割和去保護將樹脂用50ml TFE/DCM(2/8)處理180分鐘。過濾后，真空除去溶劑并通過在惰性氣氛中用30ml TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)處理180分鐘來除去保護基團。將該溶液注入300ml冷醚中，將沉淀物溶于乙腈并且用RP-HPLC(Kromasil 100 C4 10μm，250×4.6mm)純化肽。
在去保護步驟期間，切除標簽Tag的叔丁酯基，從而生成肽Tag 10-GDQYIQQAHRSHI。
LC-MS(ESI)(M+H)+1783。
權(quán)利要求
1.活化固相的用途，所述活化固相包含固相載體、共價結(jié)合至固相載體的金屬螯合配體、配位結(jié)合至所述金屬螯合配體上的金屬離子Mn+，n＝1-3，所述活化固相提供用來使固相肽合成或肽純化的肽錨定部分配位、可逆結(jié)合的配位位點。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述肽是“生長中的肽”并經(jīng)歷肽延伸過程。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中固相載體基于二氧化硅、玻璃或纖維素或選自聚苯乙烯樹脂、三聚氰胺樹脂和聚乙烯醇的聚合物。
4.權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中每個金屬螯合配體含有至少一個氮、氧、磷或硫原子，所述原子能夠建立配位的配體-金屬鍵。
5.權(quán)利要求1-4任一項的用途，其中每個金屬螯合配體含有選自氨基、雜環(huán)氮、羧基、羥基和巰基的至少一個官能團。
6.權(quán)利要求1-5任一項的用途，其中共價結(jié)合至固相載體的每個金屬螯合配體含有選自三苯基膦基團、氨基嘌呤基團優(yōu)選6-氨基嘌呤基團、酞菁基團、1，10-菲咯啉基團優(yōu)選5-氨基-1，10-菲咯啉基團、三聯(lián)吡啶基團優(yōu)選4’-氨基-[2，2’；6’，2”]三聯(lián)吡啶基團、三氮雜環(huán)壬烷基團優(yōu)選[1，4，7]三氮雜環(huán)壬烷基團和四氮雜環(huán)十二烷基團優(yōu)選[1，4，7，10]四氮雜環(huán)十二烷基團的至少一個基團。
7.權(quán)利要求1-6任一項的用途，其中金屬Mn+選自Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+和鑭系金屬離子，Mn+尤其優(yōu)選為Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+。
8.一種方法，其中肽錨定部分配位結(jié)合于活化固相的配位位點，所述活化固相包含固相載體、共價結(jié)合至固相載體的金屬螯合配體、結(jié)合至所述金屬螯合配體上的金屬離子Mn+，n＝1-3，所述肽錨定部分通過加入競爭配體而從所述活化固相上解離。
9.權(quán)利要求8的方法，其中競爭配體包含至少一個能夠螯合金屬離子的基團，優(yōu)選含氮基團，選自咪唑、N-甲基咪唑、氨基嘌呤、菲咯啉、聯(lián)吡啶、三聯(lián)吡啶、三氮雜環(huán)壬烷、四氮雜環(huán)十二烷、亞氨基二乙酸基團、氨三乙酸基團和乙二胺四乙酸基團。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述肽為生長中的肽，通過錨定部分結(jié)合金屬離子，所述金屬離子結(jié)合至與固相載體結(jié)合的金屬螯合配體并經(jīng)歷肽延伸過程。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在Merrifield型順序反應(yīng)方案中將單或寡聚氨基酸加在生長中肽的C-或N-端上。
12.權(quán)利要求8-11任一項的方法，其中肽的錨定部分包含至少一個金屬離子絡(luò)合結(jié)構(gòu)，每個所述結(jié)構(gòu)包含至少一個含氮、氧、磷或硫的基團，所述基團能與活化固相上的金屬離子配位結(jié)合。
13.權(quán)利要求8-12任一項的方法，其中能與活化固相上的金屬離子配位結(jié)合的含氮基團選自氨基、羥基、羧基、巰基、咪唑基、N-甲基咪唑基、氨基嘌呤基團、phenanthrolyl基團、吡啶基團、聯(lián)吡啶基團、三聯(lián)吡啶基團、三氮雜環(huán)壬烷基團、四氮雜環(huán)十二烷基團、亞氨基二乙酸基團、氨三乙酸基團和乙二胺四乙酸基團。
14.權(quán)利要求8-13任一項的方法，其中肽鏈的錨定部分位于肽的C-端和/或位于肽的至少一個氨基酸側(cè)鏈內(nèi)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中位于肽C-端的錨定部分的至少一個氨基酸被一個或多個氨基酸延長，這可以用檢測系統(tǒng)來檢測。
16.權(quán)利要求8-15任一項的方法，其中肽錨定部分在其N-端由提供特定蛋白酶識別位點的氨基酸序列而延長。
17.權(quán)利要求8-16任一項的方法，其中在解離之后，通過稀釋含有競爭配體的Merrifield型順序反應(yīng)方案的反應(yīng)混合物來將肽再結(jié)合至活化固相上。
18.一種用來純化含有錨定部分的肽的方法，其中所述肽任選地受到保護，所述錨定部分配位結(jié)合至活化固相的配位位點，所述活化固相包含固相載體、共價結(jié)合至固相載體的金屬螯合配體、結(jié)合至所述金屬螯合配體上的金屬離子Mn+，n＝1-3，進行漂洗以洗去雜質(zhì)，如殘余保護基團和清除劑或肽合成所不希望的副產(chǎn)物。
19.一種再折疊誤折疊結(jié)構(gòu)和/或使任選地受保護的肽的分子間聚集體解聚的方法，其中肽錨定部分配位、可逆地結(jié)合至活化固相，并重建正確折疊的肽結(jié)構(gòu)，該方法包括以下步驟(a)將肽暴露于至少一種離液劑或變性劑中，和(b)(b)隨后暴露于一系列溶劑中，以逐漸減少離液程度并提供再折疊和重建二級和三級結(jié)構(gòu)的可重復條件。
20.權(quán)利要求19的方法，其中肽的二級和三級結(jié)構(gòu)通過使用合適試劑處理肽而在所述肽的活性側(cè)鏈之間形成共價連接得以維持，包括在肽從活化固相上解離之前形成所述共價連接。
21.權(quán)利要求20的方法，其中共價連接是二硫鍵、酰胺鍵或穩(wěn)定的芳香族或脂肪族腙。
22.權(quán)利要求8、18、19和20的方法，用來合成以下序列的肽HHHH-XX-TIVESCNRWITFAQSIISTLT-βAla-G-G-βAla-TKKTQLQLEHLLLDLQMCLNGINN-XX (I)其中，X＝d-丙氨酸，βAla＝β-丙氨酸，包括在半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵，從而形成 其中X和βAla如上所定義。
23.包含錨定部分的肽，所述錨定部分優(yōu)選由用來使肽配位、可逆地結(jié)合至活化固相表面的非天然氨基酸組成，該錨定部分位于肽的N-或C-端和/或側(cè)鏈中，含有至少一個金屬離子絡(luò)合結(jié)構(gòu)，每個所述結(jié)構(gòu)包含至少一個含氮基團，但有些肽例外，在這些肽中所述金屬離子絡(luò)合結(jié)構(gòu)是2-5個組氨酸殘基的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求23的肽，其中金屬離子絡(luò)合基團，優(yōu)選含氮基團，固定至N-或C-端或至少一個氨基酸的部分側(cè)鏈，并且選自氨基、羥基、羧基、巰基、咪唑基、N-甲基咪唑基、氨基嘌呤基團、phenanthrolyl基團、吡啶基團、聯(lián)吡啶基團、三聯(lián)吡啶基團、三氮雜環(huán)壬烷基團、四氮雜環(huán)十二烷基團或其組合。
25.一種通過使生長中肽鏈非共價結(jié)合至活化固相而固相合成肽的方法，其中各固相的活性成分由具有游離配位位點的金屬螯合物形成，從而通過存在于生長中肽鏈錨定部分處的螯合基團使生長中肽鏈非共價結(jié)合至活化固相上。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，特征在于根據(jù)權(quán)利要求1的活化固相，其中活化固相包含通過金屬離子和金屬螯合配體之間的絡(luò)合物所形成的活性成分，所述配體直接或通過連接分子共價結(jié)合至固相。
27.根據(jù)權(quán)利要求25和/或26的方法，其中肽合成期間重復性合成循環(huán)中完全建立的金屬絡(luò)合物包含固相、金屬螯合配體、金屬離子和存在于單或寡聚氨基酸的N-或C-端處和/或側(cè)鏈中的螯合基團，所述金屬離子插入到金屬螯合配體和肽鏈錨定部分的螯合基團之間，所述螯合基團形成肽鏈錨定部分，所述肽鏈基于重復性合成循環(huán)而以逐步方式增長。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項的方法，其中金屬離子與金屬螯合配體的非共價、配位結(jié)合具有比結(jié)合至螯合基團的力更強的力。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項的方法，其中金屬絡(luò)合物結(jié)構(gòu)組成如下a)共價固定至固相且能夠通過N、O、P和/或S原子螯合金屬離子的金屬螯合配體；b)金屬離子，Me[n+]，n＝1-3，優(yōu)選2，所述金屬離子被金屬螯合配體所絡(luò)合，同時游離配位位點依然保持可用；c)天然地或經(jīng)化學修飾而含有側(cè)鏈或N-端或C-端修飾的單或寡聚天然或非天然氨基酸，所述氨基酸含有螯合基團，因而可以與游離配位位點絡(luò)合，所述游離配位位點出a)和b)和權(quán)利要求1-4所述的在活化固相上的金屬螯合配體與Men+離子的部分飽和絡(luò)合物提供，由此螯合基團可以通過N、O、P和/或S原子螯合金屬離子，并且由此至少一個，優(yōu)選1-3個螯合基團可以存在于一個側(cè)鏈中，從而形成用于結(jié)合生長中肽鏈的穩(wěn)定錨定部分。
30.權(quán)利要求25-29任一項的方法，其中所述固相的特征在于存在選自氨基、雜環(huán)氮、羧基、羥基、硫羥基或其它官能實體的官能化學基團，所述官能化學基團本身已知存在偶聯(lián)反應(yīng)，由此這些官能化學基團和偶聯(lián)反應(yīng)用來共價衍生具有根據(jù)權(quán)利要求25-29的金屬螯合配體的固相。
31.根據(jù)權(quán)利要求25-30任一項的方法，其中金屬螯合配體包含可以化學偶聯(lián)至根據(jù)權(quán)利要求30的固相表面處的官能化學基團的官能團，并且其中相同的金屬螯合配體以及根據(jù)權(quán)利要求29的氨基酸側(cè)鏈的螯合基團包含一個或多個、優(yōu)選1-3個可以絡(luò)合根據(jù)權(quán)利要求5的金屬離子(Men+)的官能團，所述官能團選自氨基、雜環(huán)氮、氮雜基團、羧基、含硫或磷的基團。
32.根據(jù)權(quán)利要求25-31任一項的方法，其中金屬離子(Men+)與固相上的金屬螯合配體絡(luò)合；這些金屬離子選自Mn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+或Zn2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+或鑭系金屬離子。
33.根據(jù)權(quán)利要求25-32任一項的方法，其中順序反應(yīng)用來將其它單或寡聚氨基酸結(jié)合至根據(jù)權(quán)利要求27的完全建立的金屬絡(luò)合物的C-或N-端；在每一循環(huán)中結(jié)合的適當保護的氨基酸衍生物或寡聚片段可從任意天然或非天然氨基酸中自由選擇或組合。
34.權(quán)利要求25-33任一項的方法，其中將競爭螯合劑加入到Merrifield型反應(yīng)方案的偶聯(lián)步驟的試劑混合物中，以便在該步驟中從固相上競爭性解離生長中肽鏈；對于活化固相的游離配位位點，合適的競爭螯合劑具有與單或寡聚氨基酸側(cè)鏈的單個螯合基團大致相同的親和性，所述單個螯合基團用來將生長中肽鏈錨定至固相，競爭螯合劑可溶于偶聯(lián)步驟的試劑混合物中，并且不與偶聯(lián)步驟中試劑混合物的成分反應(yīng)或干擾偶聯(lián)步驟中試劑混合物的成分。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中包含競爭螯合劑的偶聯(lián)步驟反應(yīng)混合物在隨后的洗滌步驟之前稀釋，以便在隨后的步驟如漂洗或洗滌步驟之前，將形成肽鏈錨定部分的單或寡聚氨基酸再結(jié)合至活化固相。
36.根據(jù)權(quán)利要求25-35任一項的方法，其中解離和去保護的肽合成粗產(chǎn)物可以與根據(jù)權(quán)利要求25-32任一項的固相形成金屬絡(luò)合物，所述肽合成粗產(chǎn)物具有單或寡聚氨基酸，在這些氨基酸的側(cè)鏈或N-或C-端基具有根據(jù)權(quán)利要求29的螯合基團，并可以通過以下步驟進一步處理所述肽合成粗產(chǎn)物a)通過在使期望產(chǎn)物再結(jié)合至固相的條件下將粗產(chǎn)物溶液暴露于根據(jù)權(quán)利要求25-32的活化固相，并利用過量溶劑洗去雜質(zhì)如殘余保護基團和清除劑或不希望的副產(chǎn)物，同時選擇性保留絡(luò)合在活化固相上的產(chǎn)物，從而進行純化，并且其進一步純化b)通過將結(jié)合產(chǎn)物暴露于離液劑或變性劑，例如脲、去污劑如十二烷基硫酸鈉、高鹽濃度、巰基乙醇等，由此將結(jié)合產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)樽冃誀顟B(tài)，來消除產(chǎn)物可能的不希望的誤折疊結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物分子的分子間聚集體，其特征在于破壞二級和三級結(jié)構(gòu)，同時保持與固相的結(jié)合。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中將所述純化、結(jié)合和變性產(chǎn)物暴露于一系列溶劑中，該系列溶劑為相應(yīng)產(chǎn)物而設(shè)計和優(yōu)化，以逐漸減少離液程度并產(chǎn)生結(jié)合產(chǎn)物分子再折疊的可重復條件以及可控再現(xiàn)二級和三級結(jié)構(gòu)，同時保持產(chǎn)物分子結(jié)合至固相。
38.權(quán)利要求36和/或37的方法，其中通過使試劑混合物經(jīng)過結(jié)合至固相的再折疊產(chǎn)物而實現(xiàn)氨基酸側(cè)鏈間的共價連接，所述共價連接優(yōu)選封閉來自游離巰基的二硫鍵、形成酰胺鍵或形成穩(wěn)定的芳族或脂肪族腙。
39.權(quán)利要求30的方法，其中所述固相選自二氧化硅、纖維素或選自聚合物，所述聚合物優(yōu)選選自用二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯樹脂、氯三苯甲基樹脂，選自衍生的、優(yōu)選羧化的三聚氰胺顆粒，或選自衍生的、優(yōu)選羧化的聚乙烯醇聚合物載體。
40.根據(jù)權(quán)利要求30和/或39的方法，其中所述樹脂基體包含鐵磁性顆粒并可以應(yīng)用磁性顆粒分離技術(shù)。
41.根據(jù)權(quán)利要求25-33任一項的方法，其中所述單或寡聚氨基酸包含咪唑側(cè)鏈，優(yōu)選為不少于6個組氨酸殘基、2個或更多組氨酸殘基；更優(yōu)選為6-10個組氨酸殘基。
42.根據(jù)權(quán)利要求29和41的方法，其中所用的單或寡聚氨基酸利用提供特異蛋白酶識別位點的短氨基酸序列而在N-端延長。
43.根據(jù)權(quán)利要求29、41和/或42任一項的方法，其中修飾或未修飾(根據(jù)權(quán)利要求41)的單或寡聚氨基酸利用一個或多個氨基酸而在C-端延長，這可以通過檢測系統(tǒng)檢測，例如結(jié)合至生物素化氨基酸可以通過抗生物素蛋白類的相互作用進行檢測。
44.根據(jù)權(quán)利要求34和/或35和/或41-43任一項的方法，其中所述競爭性螯合劑含有結(jié)構(gòu)基團，所述結(jié)構(gòu)基團包含具有用于配位咪唑基、N-甲基咪唑基、亞氨基二乙酸、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、氨基嘌呤、菲咯啉、聯(lián)吡啶、三聯(lián)吡啶、三氮雜環(huán)壬烷或四氮雜環(huán)十二烷衍生基團的電子對的金屬螯合基團。
45.根據(jù)權(quán)利要求25-32任一項的方法，其中螯合配體包含具有用于配位鍵的電子對的結(jié)構(gòu)基團，如三苯膦、6-氨基嘌呤、酞菁。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述配體是5-氨基-1，10-菲咯啉或氨基三聯(lián)吡啶或三氮雜環(huán)壬烷或四氮雜環(huán)十二烷或其衍生物。
47.根據(jù)權(quán)利要求25-46任一項的方法，其中氨基酸側(cè)鏈的螯合基團選自咪唑、氨基、羥基、羧基、硫羥基、氨三乙酸基、亞氨基二乙酸基、菲咯啉基、吡啶基、聯(lián)吡啶基、三聯(lián)吡啶、三氮雜環(huán)壬烷、四氮雜環(huán)十二烷或嘌呤基團或者這些基團的衍生物，所述螯合基團仍然可以形成根據(jù)權(quán)利要求25-32任一項的金屬絡(luò)合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求25-47任一項的方法，其中所述方法是完全自動化的，與合成roboter兼容，并且其中在合成循環(huán)過程中，液相和固相的分離是通過原本已知的方法優(yōu)選通過篩分、基于大小的分離、離心或磁性顆粒分離技術(shù)來實現(xiàn)的。
49.一種設(shè)備，用來根據(jù)權(quán)利要求25-48任一項的方法進行肽的固相合成。
50.錨定部分，用來根據(jù)權(quán)利要求25-49任一項的方法將生長中肽鏈配位錨定至活化固相，優(yōu)選為由天然和/或非天然、優(yōu)選非天然氨基酸組成的單或寡聚肽。
全文摘要
活化固相和與肽結(jié)合的錨定部分在固相肽合成方面的用途，其中錨定部分與活化固相配位、可逆地結(jié)合。還提供競爭性分離所述錨定部分的方法，用來純化和再折疊所述肽。提供具有錨定部分的肽，所述錨定部分用來使所述肽與活化固相配位、可逆地結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，肽和固相之間的連接由金屬螯合物構(gòu)成。固定化肽經(jīng)歷序列延伸(即增長肽)的合成步驟。螯合物的優(yōu)選金屬離子為Cu(2+)，并且樹脂上的優(yōu)選配體是1，10－菲咯啉。
文檔編號C07K14/55GK1795202SQ200480014163
公開日2006年6月28日 申請日期2004年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月23日
發(fā)明者安德烈亞斯·里布卡, 漢斯-格奧爾格·弗蘭克, 弗朗茨-彼得·布拉赫特, 烏多·哈伯爾 申請人:阿普拉根有限責任公司