專利名稱：針對乙型流感病毒多聚酶基因的siRNA序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域和生物信息學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及流行性感冒的預(yù)防與治療。本發(fā)明還涉及核酸技術(shù)領(lǐng)域。具體地說涉及RNA干擾技術(shù)，更具體地涉及具有抑制乙型流感病毒復(fù)制與感染和/或乙型流感病毒基因表達(dá)的小分子干擾核糖核酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流行性感冒簡稱流感，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病，是一種重要的公眾健康問題。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，引起世界性大流行，它在動物中廣泛分布，也能在動物中引起流感流行和造成大量動物死亡。乙型流感病毒常常引起局部暴發(fā)，不引起世界性流感大流行。丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行。
流行性感冒是世界上很猖獗的傳染病，曾多次席卷全球，給人類帶來巨大災(zāi)難。流感病毒感染后容易發(fā)生繼發(fā)性感染，死亡率非常高。由于流感病毒傳播迅速、流行廣泛，抗原易變異，人群的特異性免疫狀況不穩(wěn)定，因此可引起局部地區(qū)流行或世界性大流行。
盡管乙型流感病毒不象甲型流感病毒那樣常引起世界性大流行，但它常常引起局部暴發(fā)，而且流感的流行常由甲型和乙型流感病毒引起，在流感病毒中常出現(xiàn)甲、乙型流感病毒間基因混合顯型現(xiàn)象，因此乙型流感病毒的表面抗原是三聯(lián)流感疫苗的重要組成部分。
流感病毒屬正粘病毒科，是有包膜的單負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒。乙型流感病毒的基因組由8個單獨(dú)的單鏈RNA片段組成，一般認(rèn)為RNA1節(jié)段編碼PB2蛋白；RNA2編碼PB1；RNA3編碼PA；RNA4編碼HA；RNA5編碼NP；RNA6編碼NA和一個NB非結(jié)構(gòu)蛋白；RNA7編碼M1和M2，可能還有M3；RNA8編碼兩個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2。其中，PB1、PB2、PA是三種依賴RNA的RNA多聚酶成分，PB1的功能是識別和結(jié)合由宿主細(xì)胞多聚酶II轉(zhuǎn)錄的帽子結(jié)構(gòu)(7mGpppGPNm)，PB2的功能是負(fù)責(zé)啟動后新生的病毒顆粒RNA合成的延伸，PA的功能至今不完全明了，可能是一種激酶或一種解旋結(jié)構(gòu)的蛋白。
目前，預(yù)防流感的較好措施是接種疫苗，但由于流感病毒編碼表面抗原的基因容易發(fā)生突變或重配，致使表面抗原發(fā)生變異，出現(xiàn)新的抗原，使原有的疫苗不再有效。除疫苗外，也有抗流感病毒的藥物正在積極開發(fā)。至今，國際上抗流感的藥物主要是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，但這些藥物存在副反應(yīng)和耐藥性等問題，所以目前世界上還沒有一種治療流感的有效藥物。鑒于近兩年流感病毒活動頻繁，應(yīng)用現(xiàn)代科技手段發(fā)展方便有效的抑制流感病毒感染的方法就顯得尤為重要。
RNA干擾(RNA interfering，RNAi)技術(shù)是近年來新發(fā)展起來的一種高效的、特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的、轉(zhuǎn)錄后mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá)的序列特異性基因沉默機(jī)制，它也是體內(nèi)基因組抵御外在感染和內(nèi)部轉(zhuǎn)座的一種保護(hù)機(jī)制，廣泛存在于各種生物，如植物、真菌、昆蟲、后生動物和哺乳動物，包括人類。簡言之，該技術(shù)就是當(dāng)把21-23個核苷酸長的雙鏈RNA片段(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞或組織中后，后者會使目的mRNA被切割，從而降解mRNA，阻礙或阻止了由mRNA翻譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的過程。它的作用在基因功能研究領(lǐng)域和各種疾病的治療領(lǐng)域尤其是病毒性疾病的治療領(lǐng)域已顯現(xiàn)出不可估量的價值。通過RNAi技術(shù)，選擇不同的靶位點(diǎn)應(yīng)用siRNA抑制病毒復(fù)制與侵染已在多種病毒中公開(Adelmen et al.，Insect Mol Biol，10265-273(2001)；Gitlin et al.，Nature，418，430 434(2002)；Ge Q et al.，Proc Natl Acad Sci USA，100(5)2718-2723(2003)；Ge Q et al.，Proc Natl Acad Sci USA，101(23)8676-8681(2004)；Hu WY et al.，Curr Biol，121301-1311(2002)；Haasnoot et al.，Biomed Sci，2003，10607-616(2003)；Chen W et al.，J.Virol，78(13)6900-7(2004)；Jia Q et al.，J Virol，773301-3306(2003)；Park WS et al.，Nucleic Acids Res，30(22)4830-4835(2002)；Capodici J et al.，J Immunol，1695196-5201(2002)；Coburn GAet al.，J Virol，769225-9231(2002))。
2002年12月20日，Small RNA & RNAi被Science雜志評為年度十大科技成就之首，Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近20年來，可與人類基因組計劃(human genomics program，HGP)相提并論的最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級活動。人們對小RNA分子的深入研究必將大大推進(jìn)基因功能的研究，更為各種病毒性疾病和腫瘤等疾病的根治，開辟新的治療途徑，具有極其重要的理論和實際意義，它必將對生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
依賴于RNA的多聚酶(PB2、PB1和PA)是乙型流感病毒在感染細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制所必需的。設(shè)計并合成特異性針對編碼聚合酶基因序列全長的多種dsRNA，并將其同時導(dǎo)入患者體內(nèi)，可以選擇性降解聚合酶的mRNA，阻斷其蛋白表達(dá)，使乙型流感病毒在感染細(xì)胞中無法完成復(fù)制過程，從而切斷病原體在體內(nèi)的代謝途徑，有效控制疾病進(jìn)程。由于乙型流感病毒是RNA病毒，而設(shè)計的dsRNA與病毒的vRNA和cRNA都具有序列同源性，因而采用RNA干擾手段，有可能直接引發(fā)病毒vRNA和cRNA的降解，從而在根本上清除感染細(xì)胞中的病毒。
本發(fā)明應(yīng)用RNAi技術(shù)，通過siRNA進(jìn)行乙型流感病毒的抑制研究，為抑制流感病毒的復(fù)制與感染提供新的途徑，也為流行性感冒的預(yù)防與治療提供新的思路。有效的siRNA靶位點(diǎn)不僅可以作為新的化學(xué)藥物靶位點(diǎn)，而且siRNA可以直接作為強(qiáng)有效的藥物用于流行性感冒的預(yù)防與治療，特異性強(qiáng)，不易引起副反應(yīng)，給藥方便、快捷，避免現(xiàn)行疫苗對突變流感病毒和其他動物流感病毒引起的突發(fā)流行性感冒的不能保護(hù)以及化學(xué)藥物的副反應(yīng)。我們認(rèn)為目前研制和開發(fā)治療流行性感冒的dsRNA藥物不但具有實際可操作性而且擁有良好的應(yīng)用前景。
這里引用的所有出版物、專利和專利申請，無論前述或后述，在此都以其完整形式引入作為參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及以下按順序編號的段落中定義的主題1.分離的流感病毒小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其中，所述靶序列為流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA編碼基因上的連續(xù)10-30個(優(yōu)選，15-27個，更優(yōu)選19-23個)核苷酸。
2.如段落1所述的siRNA靶序列，其中，所述靶序列為IDNO1-SEQ ID NO18中任意一條序列。
3.與段落1或2的siRNA靶序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在嚴(yán)緊雜交條件下雜交的多核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列。
4.包含段落1-3任一個的序列的核酸構(gòu)建體。
5.段落1-4任一個所述的siRNA靶序列在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。
6.小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含段落1-3序列編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表達(dá)和/或流感病毒的復(fù)制和/或感染。
7.如段落6所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于一條RNA鏈上，例如在一個單鏈RNA分子包含正義RNA片段和反義RNA片段。
8.如段落7所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸為發(fā)夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。
9.段落6-8任一個所述的核糖核酸，其中，正義RNA片段和反義RNA片段的長度優(yōu)選為8-50個核苷酸，優(yōu)選10-30(更優(yōu)選15-27，最優(yōu)選19-23，如19、20或者21)個。
10.段落6-9任一個所述的核糖核酸，其中，雙鏈RNA的互補(bǔ)區(qū)域至少有10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基對。
11.如段落6-10任一個所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸為具有10-30(優(yōu)選，15-27，更優(yōu)選19-23)對堿基的雙鏈RNA分子，所述雙鏈中至少有10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基互補(bǔ)配對。
12.如段落6-11任一個所述的核糖核酸，其中，正義RNA片段和反義RNA片段的GC含量為35％-75％，例如40-60％、45-55％、48-52％，如約50％。
13.如段落6-12任一個所述的核糖核酸，其中，正義RNA片段和反義RNA片段與已知人類基因和基因表達(dá)片段無顯著的同一性。
14.如段落6-13任一個所述的核糖核酸，其中，所述反義RNA片段包含與段落1或2所述siRNA靶序列有至少10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基互補(bǔ)的序列，正義RNA片段序列與所述反義RNA片段序列有至少10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基互補(bǔ)。
15.如段落6-14任一個所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段與反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)域含18、19、20、或21對互補(bǔ)堿基。
16.如段落6-15任一個所述的核糖核酸，其中，所述反義RNA片段序列與SEQ ID NO1-SEQ ID NO18所示的任意一條序列有至少10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基互補(bǔ)。
17.如段落6-16任一個所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段與反義RNA片段的3’端包含至少兩個脫氧寡核苷酸的末端，一般為脫氧胸苷酸TT。
18.如段落6-17任一個所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸的反義RNA片段序列包含SEQ ID NOX，正義RNA片段序列包含SEQ IDNO(X-18)，X為19-36中的任一整數(shù)。
19.如段落6-18任一個所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段自5’端開始的19個核苷酸序列中的堿基為鳥嘌呤(G)的核苷酸數(shù)量與堿基為胞嘧啶(C)的核苷酸數(shù)量之和占除去3’端的TT以外的19個核苷酸數(shù)量的比例為35％-75％(即G/C比例)，所述反義RNA片段及其一個核苷酸的突變體與已知人類基因和基因表達(dá)片段無同一性。
20.如段落6-19任一個所述的小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其中，用化學(xué)合成方法直接合成或者用質(zhì)粒載體在細(xì)胞或體內(nèi)表達(dá)，或者在體外合成、轉(zhuǎn)錄后用Dicer酶消化的方法獲得。
21.DNA序列的組合，其包括編碼正義RNA片段的第一DNA序列和編碼反義RNA片段的第二DNA序列，所述正義RNA片段包含段落1-3的序列所編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表達(dá)和/或流感病毒的復(fù)制和/或感染。
22.段落21的DNA序列的組合，其中正義RNA片段和反義RNA片段如段落7-20任一個中所定義。
23.段落21的DNA序列的組合，第一DNA序列和第二DNA序列包含在兩種不同的DNA分子中，這兩種不同的DNA分子優(yōu)選分別另外含有與第一DNA序列有效連接的第一啟動子和與第二DNA序列有效連接的第二啟動子。
24.段落21的DNA序列的組合，其中，第一DNA序列和第二DNA序列包含在同一種DNA分子中，優(yōu)選地，第一DNA序列和第二DNA序列包含于所述DNA分子的同一DNA鏈中；更優(yōu)選地，所示正義RNA片段和反義RNA片段表達(dá)為一種RNA分子，還優(yōu)選的是，所述RNA分子能夠折疊，使得其中所含的RNA片段形成雙鏈區(qū)域；所述DNA分子可以另外含有與第一DNA序列和/或者第二DNA序列有效連接的啟動子。
25.包含段落21-24任一個的DNA組合的載體或者載體組合。
26.分離的宿主細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，特別是狗腎傳代(Madindarby canine kidney，MDCK)細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞包含段落21-24任一個的DNA組合或者段落25所述的載體或者載體組合。
27.一種動物模型，其中，所述動物模型包含段落21-24任一個的DNA組合或者段落25所述的載體或者載體組合。
28.如段落27所述的動物模型，其中，所述的動物模型為9-11日齡的雞胚。
29.包含段落6-20任一個的核糖核酸、段落21-24任一個的DNA組合、段落25的載體或者載體組合的組合物，特別是藥物組合物。
30.段落6-20任一個的核糖核酸、段落21-24任一個的DNA組合、段落25的載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中所述藥物用于治療和/或預(yù)防流感病毒引起的流行性感冒或其它相關(guān)疾病。
31.段落6-20任一個的核糖核酸、段落21-24任一個的DNA組合、段落25的載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中，所述藥物用于抑制流感病毒的復(fù)制和/或感染。
32.段落6-20任一個的核糖核酸、段落21-24任一個的DNA組合、段落25的載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中，所述藥物用于抑制流感病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)。
33.抑制流感病毒的復(fù)制和/或感染的方法，包括給予段落29的組合物。
34.抑制宿主細(xì)胞中流感病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，將宿主細(xì)胞與段落29的組合物接觸。
35.以上段落任一個的主題，其中流感病毒是乙型流感病毒，特別是乙型流感病毒株B/Beijing/76/98、B/Beijing/37/99、B/Jiangsu/10/03。
以下結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明。基于這些說明，本發(fā)明的上述方面和其它方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的。
附圖簡述

圖1siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖2針對PB2基因的siRNA的篩選。應(yīng)用針對PB2基因不同靶位點(diǎn)的乙型流感病毒特異siRNA，篩選能敲低PB2-FL融合基因的表達(dá)，即有效抑制MDCK細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶表達(dá)的siRNA。圖示空白對照為不轉(zhuǎn)染siRNA、只轉(zhuǎn)染報告基因(熒光素酶)表達(dá)載體的細(xì)胞，對照siRNA為轉(zhuǎn)染能表達(dá)無關(guān)siRNA的質(zhì)粒及熒光素酶表達(dá)載體的細(xì)胞，其它為轉(zhuǎn)染能表達(dá)針對PB2基因不同靶位點(diǎn)特異siRNA表達(dá)載體及熒光素酶表達(dá)載體的細(xì)胞?？v坐標(biāo)表示以轉(zhuǎn)錄活性內(nèi)對照的海腎熒光素酶為標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲熒光素酶活性。圖中的每一個數(shù)據(jù)表示三個重復(fù)實驗的平均值。
圖3針對PB1基因的siRNA的篩選。應(yīng)用針對PB1基因不同靶位點(diǎn)的乙型流感病毒特異siRNA，篩選能敲低PB1-FL融合基因的表達(dá)，即有效抑制MDCK細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶表達(dá)的siRNA。
圖4針對PA基因的siRNA的篩選。應(yīng)用針對PA基因不同靶位點(diǎn)的乙型流感病毒特異siRNA，篩選能敲低PA-FL融合基因的表達(dá)，即有效抑制MDCK細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶表達(dá)的siRNA。
圖5細(xì)胞中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號、No.16號siRNA在病毒感染后不同時間對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖6細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同量的No.6號siRNA表達(dá)質(zhì)粒對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同量的化學(xué)合成No.6號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖8siRNA對新產(chǎn)生病毒粒子的抑制圖9細(xì)胞中質(zhì)粒表達(dá)各種siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖10細(xì)胞中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/37/99的抑制圖11細(xì)胞中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA對乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的抑制圖12細(xì)胞中siRNA與利巴韋林對乙型流感病毒的抑制效果比較圖13雞胚中質(zhì)粒表達(dá)各種siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖14雞胚中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/37/99的抑制圖15雞胚中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA對乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的抑制圖16雞胚中化學(xué)合成siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制圖17雞胚中siRNA與利巴韋林對乙型流感病毒的抑制效果比較具體實施方式
本發(fā)明人選取乙型流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA編碼基因中高度保守的序列作為siRNA的靶序列，并且以靶序列中的連續(xù)10-30(優(yōu)選，15-27，更優(yōu)選19-23)bp的序列設(shè)計siRNA。細(xì)胞和動物模型攻毒實驗證明，以乙型流感病毒基因組中高度保守的序列作為靶序列，應(yīng)用能與靶序列特定位點(diǎn)上的核苷酸序列互補(bǔ)配對的siRNA，可以阻斷該基因在細(xì)胞和動物模型中的復(fù)制與表達(dá)，從而有效地抑制不同乙型流感病毒毒株在細(xì)胞和動物模型的復(fù)制與感染，以達(dá)到治療流行性感冒的目的。
本發(fā)明的一個目的就是提供一組流感病毒(特別是乙型流感病毒)基因組上的小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列及其應(yīng)用。其中當(dāng)藥物，包括所篩選出的小干擾RNA(siRNA)序列與這些靶序列中的一個或幾個特異性地作用，可以阻斷引起流行性感冒的流感病毒(特別是乙型流感病毒)基因在人體或動物體內(nèi)的復(fù)制或表達(dá)，從而抑制流感病毒的復(fù)制與感染，達(dá)到治療流行性感冒的目的。
本發(fā)明的另一目的就是提供一組用于預(yù)防和治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒的靶向小分子干擾核糖核酸、DNA、其載體、宿主細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。
發(fā)明人相信，本發(fā)明的原理在于特異性siRNA針對病毒基因組保守序列，抑制病毒的mRNA(但本發(fā)明并不受該原理的束縛)。針對流感病毒(特別是乙型流感病毒)多聚酶(PB2、PB1、PA)、病毒的virionRNA(vRNA)和互補(bǔ)RNA(cRNA)，設(shè)計并化學(xué)合成siRNA及制備含特異siRNA編碼DNA的質(zhì)粒，并將此化學(xué)合成siRNA或含特異siRNA編碼DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入選定的靶細(xì)胞進(jìn)行抗流感病毒(特別是乙型流感病毒)的研究。通過特異性抑制病毒的多聚酶的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制途徑，最終為人類和動物提供治療和預(yù)防流感病毒(特別是乙型流感病毒)感染的快速便宜的有效藥物。
本發(fā)明所要解決的問題是針對病毒基因組靶序列提供攻擊流感病毒(特別是乙型流感病毒)的小干擾RNA分子(siRNA)，用于預(yù)防或治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)感染引起的流行性感冒及與其密切相關(guān)的呼吸道疾病。為此本發(fā)明采用權(quán)利要求書中定義的技術(shù)方案。
在一方面，本發(fā)明提供了分離的流感病毒小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其選自(1)流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA編碼基因上的連續(xù)10-30個(優(yōu)選，15-27個，更優(yōu)選19-23個)核苷酸；(2)SEQ ID NO1-SEQ ID NO18中任意一條序列；(3)與(1)或者(2)的序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在嚴(yán)緊雜交條件下雜交的多核苷酸序列；(4)從(1)或者(2)的序列發(fā)生了1-5個(優(yōu)選1-3個，更優(yōu)選1-2個，最優(yōu)選1個)核苷酸插入、替代和/或缺失。
為了序列比較，可以采用Lasergene生物信息軟件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列的最佳比對。或者，為了序列比較，可以利用以下方法進(jìn)行序列的最佳比對Smith和Waterman的局部同一性算法((1982)Add.APL.Math 2482)；Needleman和Wunsch的同一性比對算法((1970)J.Mol.Biol.48443)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)；這些算法的計算機(jī)執(zhí)行程序(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目測。
適合于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的一個優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如本文所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的多核苷酸和肽的序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。
因此，本發(fā)明包括與本文所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少50％序列同一性、優(yōu)選至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。
在其它實施方案中，本發(fā)明指向在中等嚴(yán)緊條件下與本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互補(bǔ)序列能夠雜交的多核苷酸。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中雜交技術(shù)是熟知的。
典型地，“雜交條件”根據(jù)測量雜交時所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5℃(低于探針Tm 5℃)；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5-10℃；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20℃；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20-25℃。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6×SSC＝極低嚴(yán)緊性；3×SSC＝低至中等嚴(yán)緊性；1×SSC＝中等嚴(yán)緊性；0.5×SSC＝高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80％或更多序列同一性的核酸序列。
對于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如，選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，實驗室手冊，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。
為便于說明，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液預(yù)洗；在50-65℃下在5×SSC中雜交過夜；隨后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65℃或65-70℃。
所述靶序列可以是流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA編碼基因、多聚酶PB1、PB2或者PA編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、cDNA、或者其mRNA。所述的靶序列可以是流感病毒(特別是乙型流感病毒)的RNA基因組序列，或病毒粒子RNA序列(virion RNA，vRNA)，或病毒粒子RNA序列的互補(bǔ)RNA序列(complementary RNA，cRNA)。
優(yōu)選地，所述siRNA靶序列為與SEQ ID NO1-SEQ ID NO18中任意一條序列的連續(xù)10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)核苷酸序列相同的序列。更優(yōu)選的是，所述的siRNA靶序列為與SEQ ID NO1-SEQID NO18所示的任意一條序列。
本發(fā)明提供了一系列流感病毒(特別是乙型流感病毒)基因上可以被siRNA或反義核酸序列攻擊的靶序列，因此，凡是可以作用于本靶序列以阻斷病毒基因在感染的人或動物體內(nèi)復(fù)制或表達(dá)的核苷酸片段都是本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。
本發(fā)明還提供上述siRNA靶序列的互補(bǔ)序列。
本發(fā)明還提供包含siRNA靶序列或其互補(bǔ)序列的核酸構(gòu)建體。
本發(fā)明還提供siRNA靶序列在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。所述抗流感病毒(特別是乙型流感病毒)藥物優(yōu)選為治療或預(yù)防流感病毒(特別是乙型流感病毒)所引起的流行性感冒及其它相關(guān)疾病的藥物。
另一方面，本發(fā)明提供小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含本發(fā)明靶序列編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表達(dá)和/或流感病毒的復(fù)制和/或感染。
在本發(fā)明中，術(shù)語“小分子核糖核酸”、“小分子干擾核糖核酸”或“siRNA”、“本發(fā)明核糖核酸”可互換使用，它們都指能夠抑制流感病毒(特別是乙型流感病毒)靶基因表達(dá)、包括正義RNA片段區(qū)域(例如SEQ ID NO1-SEQ ID NO18中任意一條序列)和反義RNA片段區(qū)域(例如SEQ ID NO19-SEQ ID NO36中任意一條序列)的核糖核酸(RNA)。
相關(guān)地，本發(fā)明還提供DNA序列的組合，其包括或者由編碼正義RNA片段的第一DNA序列和編碼反義RNA片段的第二DNA序列組成，所述正義RNA片段包含本發(fā)明靶序列所編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表達(dá)和/或流感病毒的復(fù)制和/或感染。
在本發(fā)明的這方面，所述正義RNA片段和反義RNA片段可以存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于一條RNA鏈上，例如在一個單鏈RNA分子包含正義RNA片段和反義RNA片段。
例如，本發(fā)明的siRNA可以為發(fā)夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。
正義RNA片段和反義RNA片段的長度優(yōu)選為8-50個核苷酸，優(yōu)選10-30(更優(yōu)選15-27，最優(yōu)選19-23，如19、20或者21)個。但也可以更長或者更短。
在正義RNA片段和反義RNA片段形成的雙鏈RNA的互補(bǔ)區(qū)域至少有10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個，如19、20或者21個)堿基對。優(yōu)選地，所述正義RNA片段與反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)域含18、19、20、或21對互補(bǔ)堿基。
在一個實施方案中，本發(fā)明的siRNA為具有10-30(優(yōu)選，15-27，更優(yōu)選19-23)對堿基的雙鏈RNA分子，所述雙鏈中至少有10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基互補(bǔ)配對。
在一個優(yōu)選的實施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段的GC含量為35％-75％，例如40-60％、45-55％、48-52％，如約50％。
在一個優(yōu)選的實施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段與已知人類基因和基因表達(dá)片段無顯著的同一性。顯著的同一性是指至少60％，例如70，80、90％同一性。
優(yōu)選的是，所述正義RNA片段自5’端開始的19個核苷酸序列中的堿基為鳥嘌呤(G)的核苷酸數(shù)量與堿基為胞嘧啶(C)的核苷酸數(shù)量之和占除去3’端的TT以外的19個核苷酸數(shù)量的比例為35％-75％(即G/C比例)，所述反義RNA片段及其一個核苷酸的突變體與已知人類基因和基因表達(dá)片段無顯著同一性。
在一個具體實施方案中，所述反義RNA片段包含與如下所述siRNA靶序列有至少10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基互補(bǔ)的序列(1)流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA編碼基因上的連續(xù)10-30個(優(yōu)選，15-27個，更優(yōu)選19-23個)核苷酸；或者(2)SEQ ID NO1-SEQ ID NO18中任意一條序列；正義RNA片段序列與所述反義RNA片段序列有至少10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基互補(bǔ)。
在另一個具體實施方案中，所述反義RNA片段序列與SEQ ID NO1-SEQ ID NO18所示的任意一條序列有至少10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基互補(bǔ)。
在另一個具體實施方案中，所述正義RNA片段與反義RNA片段的3’端包含至少兩個(例如2、3、4、5個)脫氧寡核苷酸的末端，一般為脫氧胸苷酸TT。
優(yōu)選地，所述反義RNA片段序列包含SEQ ID NO19-SEQ ID NO36所示的任意一條序列或與前述序列有連續(xù)10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基相同的序列。
特別優(yōu)選的是，所述干擾核糖核酸的反義RNA片段序列包含SEQID NOX，正義RNA片段序列包含SEQ ID NO(X-18)，X為19-36中的任一整數(shù)。
在一個優(yōu)選實施方案中，反義RNA片段包含與本發(fā)明靶序列編碼的RNA序列全長互補(bǔ)的RNA序列。
在該實施方案中，優(yōu)選地，在所述正義RNA片段中，在本發(fā)明靶序列編碼的RNA序列3’還含有至少兩個(例如2、3、4、5個)連續(xù)的脫氧胸苷酸作為正義RNA片段的3’末端；而且，在所述反義RNA片段中，在與本發(fā)明靶序列編碼的RNA序列全長互補(bǔ)的RNA序列3’還含有至少兩個(例如2、3、4、5個)連續(xù)的脫氧胸苷酸作為反義RNA片段的3’末端。
在一個具體例子中，正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為21個核苷酸，正義RNA片段和反義RNA片段各自的3’端為兩個連續(xù)的脫氧胸苷酸(TT)，兩個RNA片段除去3’端的TT以外的19個核苷酸上的堿基互補(bǔ)形成雙鏈，但它們3’端的兩個TT卻以單鏈的形式存在。
本發(fā)明的小分子干擾核糖核酸(siRNA)可用化學(xué)合成方法直接合成或者用質(zhì)粒載體在細(xì)胞或體內(nèi)表達(dá)，或者在體外合成、轉(zhuǎn)錄后用Dicer酶消化的方法獲得。
本發(fā)明所述的小干擾RNA可以是化學(xué)合成的雙鏈RNA；也可以是載體或表達(dá)框架表達(dá)的雙鏈RNA，所述載體或表達(dá)框架中可采用例如RNA聚合酶III啟動子和RNA聚合酶III終止子調(diào)控小干擾RNA在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，RNA聚合酶III啟動子包括人源或鼠源的U6啟動子和人H1啟動子等。
本發(fā)明所述的小干擾RNA可以是由作用于一個靶序列的單一小干擾RNA組成，也可以由作用于一個基因的多個靶序列或多個基因上的靶序列的多個小干擾RNA組成；所述的靶序列可以是流感病毒(特別是乙型流感病毒)的RNA基因組序列，或病毒粒子RNA序列(virionRNA，vRNA)，或病毒粒子RNA序列的互補(bǔ)RNA序列(complementaryRNA，cRNA)。具體地，本發(fā)明所述的小干擾RNA可以由序列表中的至少一個序列組成。
本發(fā)明的siRNA可通過本文實施例中公開的方法或者本領(lǐng)域已知的方法篩選。在一個實施方案中，將候選siRNA在病毒感染前和/或病毒感染后導(dǎo)入體外培養(yǎng)細(xì)胞或體內(nèi)，通過病毒滴度降低篩選出能有效防治流感病毒(特別是乙型流感病毒)的小干擾RNA。
在本發(fā)明的DNA序列的組合中，第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在兩種不同的DNA分子中。這兩種不同的DNA分子優(yōu)選分別另外含有與第一DNA序列有效連接的第一啟動子和與第二DNA序列有效連接的第二啟動子。
第一DNA序列和第二DNA序列也可以包含在同一種DNA分子中。優(yōu)選地，第一DNA序列和第二DNA序列包含于所述DNA分子的同一DNA鏈中。更優(yōu)選地，所示有義RNA片段和反義RNA片段表達(dá)為一種RNA分子。還優(yōu)選的是，所述RNA分子能夠折疊，使得其中所含的RNA片段形成雙鏈區(qū)域。同樣，所述DNA分子可以另外含有與第一DNA序列和/或者第二DNA序列有效連接的啟動子。
可用于本發(fā)明中的啟動子可以是天然靶基因的天然啟動子、異源啟動子、組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織特異性啟動子或者發(fā)育調(diào)節(jié)型啟動子。
當(dāng)?shù)谝籇NA序列和第二DNA序列包含在同一種DNA分子中時，所述DNA分子可以另外在編碼有義RNA片段和反義RNA片段的DNA序列之間含有一個接頭。該接頭可以包含一種含有功能基因如選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)盒?；蛘撸鼋宇^可以包含調(diào)節(jié)序列如內(nèi)含子加工信號。
當(dāng)?shù)谝籇NA序列和第二DNA序列包含在同一種DNA分子中時，所述有義RNA片段和反義RNA片段也可以表達(dá)為兩種RNA分子。此時，優(yōu)選地，第一DNA序列與第一啟動子有效連接，而第二DNA序列與第二啟動子有效連接；或者，第一DNA序列和第二DNA序列可以與一種雙向啟動子有效連接。
當(dāng)?shù)谝籇NA序列和第二DNA序列包含在同一種DNA分子中時，在所述DNA分子中第一DNA序列和第二DNA序列可以包含于所述DNA的互補(bǔ)鏈中。
在這方面，所述第一DNA序列和第二DNA序列優(yōu)選可以瞬時轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。但是，在某些實施方式中，所述第一DNA序列和第二DNA序列也可以穩(wěn)定地整合在宿主細(xì)胞的基因組中。
在另一方面，本發(fā)明還提供包含本發(fā)明DNA組合的載體或者載體組合。該載體或者載體組合可以是一個載體或者多個載體，只要它們合在一起包含本發(fā)明的DNA組合即可。例如，本發(fā)明的DNA組合中的第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在同一個載體中。或者，本發(fā)明的DNA組合中的第一DNA序列和第二DNA序列可以包含在不同的載體中。
所述載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒及其他載體形式。表達(dá)載體中的本發(fā)明第一DNA序列和第二DNA序列可以可操作地和表達(dá)控制序列連接，表達(dá)控制序列包括但不限于用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)選的包含一個或多個選擇標(biāo)記。
本發(fā)明還包括上述流感病毒(特別是乙型流感病毒)siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建。siRNA表達(dá)載體可采用本說明書中公開的或者本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建。本發(fā)明所構(gòu)建的流感病毒(特別是乙型流感病毒)siRNA表達(dá)載體經(jīng)PCR、序列測定表明構(gòu)建成功，在體外感染流感病毒(特別是乙型流感病毒)的細(xì)胞模型和體內(nèi)感染流感病毒(特別是乙型流感病毒)的雞胚動物模型中，通過血凝滴度檢測實驗證實表達(dá)載體表達(dá)的siRNA能較為明顯地抑制病毒復(fù)制與感染。
另一方面，本發(fā)明還提供分離的宿主細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，特別是狗腎傳代(Madin darby canine kidney，MDCK)細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞包含本發(fā)明的DNA組合或者載體或者載體組合。所述宿主細(xì)胞可以是用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌，真菌如酵母，昆蟲細(xì)胞如sf9，動物細(xì)胞(尤其是哺乳動物細(xì)胞)如非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、CHO或人類細(xì)胞等。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述哺乳動物細(xì)胞為狗腎傳代(Madin darby canine kidney，MDCK)細(xì)胞。
通過本文的闡述，適當(dāng)?shù)妮d體、宿主細(xì)胞的選擇都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明還提供一種動物模型，其中，所述動物模型包含本發(fā)明的DNA組合或者載體或者載體組合。優(yōu)選的例子是，所述的動物模型為9-11日齡的雞胚。
在另一方面，本發(fā)明還提供包含本發(fā)明siRNA、DNA組合、載體或者載體組合的組合物，特別是藥物組合物。
本發(fā)明提供的小干擾RNA分子(siRNA)能夠特異性地針對流感病毒(特別是乙型流感病毒)，它可能通過細(xì)胞內(nèi)的RISC(RNA-inducedsilencing complex)有效地降解流感病毒(特別是乙型流感病毒)的蛋白信使核糖核酸分子。本發(fā)明siRNA可以直接阻斷病毒基因物質(zhì)的復(fù)制、病毒的繁殖與感染，還可以抑制其和致病密切相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，為治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒及與其密切相關(guān)的呼吸道疾病找到了新的有效的手段。本發(fā)明的抗流感病毒(特別是乙型流感病毒)的siRNA的作用效果顯著，無副作用，將在流感病毒(特別是乙型流感病毒)的防治中起到重要的作用。
因此，在另一方面，本發(fā)明還提供本發(fā)明siRNA、DNA組合、載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中所述藥物用于治療和/或預(yù)防流感病毒引起的流行性感冒或其它相關(guān)疾病。
本發(fā)明還涉及了上述宿主細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒及其它相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為狗腎細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明還提供本發(fā)明siRNA、DNA組合、載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中，所述藥物用于抑制流感病毒的復(fù)制和/或感染。
在另一方面，本發(fā)明還提供本發(fā)明siRNA、DNA組合、載體或者載體組合用于制備藥物的用途，其中，所述藥物用于抑制流感病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)。本發(fā)明還涉及了上述載體在細(xì)胞中抑制流感病毒(特別是乙型流感病毒)多聚酶表達(dá)的應(yīng)用，其中，細(xì)胞中轉(zhuǎn)染上述載體能有效降低多聚酶與螢火蟲熒光素酶融合基因的表達(dá)。
本發(fā)明所述的小干擾RNA能抑制不同流感病毒(特別是乙型流感病毒)毒株在動物細(xì)胞中的復(fù)制與感染。
本發(fā)明所述的小干擾RNA能抑制不同流感病毒(特別是乙型流感病毒)毒株在動物模型如雞胚、小鼠中的復(fù)制與感染。
本發(fā)明選取了流感病毒(特別是乙型流感病毒)基因組中高度保守的區(qū)段作為靶序列，實現(xiàn)了siRNA對不同毒株的復(fù)制與感染的干擾作用，為RNAi技術(shù)用于預(yù)防和治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)對家禽、家畜等的感染提供新的技術(shù)路線。
在另一方面，本發(fā)明還提供抑制流感病毒的復(fù)制和/或感染的方法，包括給予本發(fā)明的組合物。
在另一方面，本發(fā)明還提供抑制宿主細(xì)胞中流感病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，包括將宿主細(xì)胞與本發(fā)明的組合物接觸。
本發(fā)明的組合物可采用本領(lǐng)域已知的或者本文公開的途徑給藥。給藥途徑包括但不局限于下述幾種外用(包括眼、鼻)；吸入(包括氣管內(nèi)、口腔內(nèi)、過皮或皮外的乳化劑或噴霧劑)；口服；注射或點(diǎn)滴(包括靜脈、動脈、皮下腹腔或肌肉內(nèi))；顱內(nèi)給藥(包括鞘膜、腦室內(nèi))。例如，本發(fā)明用于預(yù)防或治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒的小干擾RNA或上述載體可以和脂質(zhì)體混合使用。給藥劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)過常規(guī)試驗來確定。一般來說，siRNA分子的劑量范圍為5ng～200mg/kg體重(優(yōu)選劑量范圍是5μg～5mg/kg)，此劑量可以每天一次或數(shù)次或每周一次或數(shù)次、每月一次或數(shù)次、每年一次或數(shù)次。通?？梢愿鶕?jù)測定所給藥物在體內(nèi)的逗留時間、藥物在體液或組織中的濃度來決定給藥的次數(shù)和頻率。
本發(fā)明用于預(yù)防或治療流感病毒(特別是乙型流感病毒)引起的流行性感冒的小干擾RNA可以通過呼吸道噴霧或滴注使siRNA經(jīng)過肺等呼吸系統(tǒng)組織或器官吸收。
在可適用的本發(fā)明任何方面，優(yōu)選的是，所述流感病毒是乙型流感病毒，特別是乙型流感病毒株B/Beijing/76/98、B/Beijing/37/99、或B/Jiangsu/10/03。
同現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)①本發(fā)明設(shè)計了一系列針對流感病毒(特別是乙型流感病毒)多聚酶PB1、PB2或者PA編碼基因不同靶位點(diǎn)的siRNA。②siRNA是天然存在于植物、真菌和動物細(xì)胞內(nèi)的抗病毒小分子物質(zhì)，它不但對正?；蛘{(diào)控有重要作用，而且是生命體內(nèi)天然的抗病毒感染的基因免疫系統(tǒng)。③大量實驗表明siRNA是通過與其序列互補(bǔ)的RNA結(jié)合并引起RNA鏈的斷裂，從而抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成，因此特異性很高。④許多實驗說明，RNAi存在明顯的高效性，極少量的siRNA就可以引起明顯的基因沉默表型。⑤無明顯毒性和副作用。迄今為止，所有體外和體內(nèi)的研究結(jié)果都表明有效劑量(0.1-10μg/kg)的siRNA對體外培養(yǎng)的細(xì)胞和實驗動物沒有明顯的毒性和副作用，因此siRNA是一類安全的藥物。⑥高抗突變性。流感病毒容易發(fā)生突變使已有疫苗失效，而針對高度保守靶序列的特異siRNA可以避免這些突變，因此siRNA基因藥物具有較高的抗突變性。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于舉例說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中如果未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的病毒學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法和條件，這種技術(shù)和條件在文獻(xiàn)中有完整解釋。參見例如Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)；D.Glover主編DNA CloningA Practical Approach，vol.I & II；N.Gait主編Oligonucleotide Synthesis(1984)；B.Hames & S.Higgins主編Nucleic Acid Hybridization(1985)；B.Hames & S.Higgins主編Transcription and Translation(1984)；R.Freshney主編Animal Cell Culture(1986)；Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)中所述的技術(shù)和條件，或按照制造廠商所建議的條件。
下面實施例中使用了乙型流感病毒株B/Beijing/76/98、B/Beijing/37/99、B/Jiangsu/10/03作為舉例來進(jìn)行試驗。但是，很明顯，本發(fā)明并不局限于這些病毒株，也可以采用其它乙型流感病毒株來進(jìn)行試驗。
實施例實施例一 siRNA靶位點(diǎn)的設(shè)計選取siRNA靶序列遵循以下基本原則是①從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的起始密碼子AUG開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，這19個堿基序列盡量以G開始，且其GC含量在45～55％左右，并避開4個連續(xù)的T或A序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)序列。②靶序列區(qū)域距離翻譯起始點(diǎn)或終止點(diǎn)至少70-100核苷酸。③使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov)，將潛在的靶序列與人的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列或EST同源的序列。
本發(fā)明根據(jù)上述siRNA的設(shè)計原則，在乙型流感病毒(B/Beijing/76/98)多聚酶PB2、PB1、PA蛋白編碼區(qū)(GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號PB2為AY 687394；PB1為AY 687393；PA為AY687392)選取下列位點(diǎn)

表1針對乙型流感病毒多聚酶PB2、PB1、PA蛋白編碼區(qū)的siRNA靶位點(diǎn)序列表1所示的靶位點(diǎn)序列與相同編號的siRNA的正義RNA片段序列相同(除了正義RNA片段3’末端的“TT”外)，其在基因上的位點(diǎn)是從多聚酶PB2、PB1或PA編碼起始密碼子開始編號的，其在序列表中的序號見最右側(cè)一列。本表格所示序列僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例二 siRNA的化學(xué)合成siRNA的合成可委托公開對外開展合成業(yè)務(wù)的商業(yè)公司，比如美國Dharmacon公司和中國上海吉瑪生物制藥公司，具體可通過www.Dharmacon.com和www.genepharma.com獲知，所有的siRNA分子都經(jīng)過2位上脫保護(hù)、脫鹽、純化、和退火形成雙鏈處理，然后溶于DEPC處理的蒸餾水中。其所采用的合成方法均為通用的方法，比如以下文獻(xiàn)公開的方法Scaringe SA，Wincott FE，and Caruthers MH.Novel RNA Synthesis Method Using 5’-Silyl-2’-OrthoesterProtecting Groups.J Am Chem Soc 1998；12011820-11821.
本發(fā)明提供的siRNAs由上海吉瑪生物制藥公司合成。
1.分別合成siRNA的正義鏈和反義鏈(序列見表2，表3)。
2.退火形成雙鏈siRNAs1)將合成的siRNA正義、反義鏈溶于焦磷酸二乙酸(DEPC)處理過的水中。
2)制備退火緩沖液(2×)200mM 乙酸鉀，4mM 乙酸鎂，60mMHepes-KOH(pH7.4)。
3)制備20μM的siRNA貯存液2×退火緩沖液100μlsiRNA正義鏈 XμlsiRNA反義鏈 YμlDEPC處理水 (100-X-Y)μl上述成分混勻，于90℃放置1分鐘，然后于37℃放置1小時。貯存于-20℃。
實施例三 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建用帶有H1啟動子和U6啟動子的載體siBuster vector(瑞典Genordia AB公司產(chǎn)品，詳情見www.genordia.com)，分別連接上述設(shè)計的siRNAs靶位點(diǎn)序列(19個堿基)加三個接頭堿基(共22-mer)的DNA寡核苷酸鏈，形成能表達(dá)siRNAs的質(zhì)粒載體(如圖1所示)。
DNA寡核苷酸鏈為正義DNA片段(對應(yīng)于siRNA正義RNA片段)5’-AAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’反義DNA片段(對應(yīng)于siRNA反義RNA片段)5’-AAAANNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’下劃線的18-mer與正義DNA片段G后的序列互補(bǔ)，這兩條DNA寡核苷酸鏈經(jīng)退火形成雙鏈DNA oligos5’-AAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’正義DNA片段3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA-5’反義DNA片段1)DNA單鏈合成多家DNA合成公司均可合成。
2)DNA單鏈退火成雙鏈退火反應(yīng)體系如下正義DNA片段寡核苷酸(100μM)2μl反義DNA片段寡核苷酸(100μM)2μl10×任何一種限制性內(nèi)切酶緩沖液 2μl水 14μl總量 20μl退火程序為于95℃加熱5min后，移至室溫10min，即完成退火。然后用1×相同限制酶緩沖液稀釋50倍，至終濃度為0.2M，待用。
3)連接將退火后的雙鏈DNA oligos連接入GeneBuster載體，連接反應(yīng)體系為
GeneBuster載體(1ng/μl) 1μl退火的DNA oligos(0.2μM)1μl5×連接酶緩沖液(含ATP) 4μlT4DNA連接酶 1μl水 13μl總量20μl4)轉(zhuǎn)化、鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素(Amp+)抗性篩選，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出含目的基因的陽性克隆，并進(jìn)行DNA序列分析加以確定。
鑒定正確的陽性質(zhì)粒即為可以在細(xì)胞中表達(dá)siRNA的質(zhì)粒。
實施例四 融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建為了分析siRNA對各個靶序列的干擾效果，我們構(gòu)建了一系列報告質(zhì)粒，即將多聚酶組分PB2、PB1、PA三個蛋白的編碼序列分別克隆到一個螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，F(xiàn)L)表達(dá)載體(如pGL3)5’端，構(gòu)成融合基因(如PB2-FL、PB1-FL、PA-FL)，該基因由報告質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)融合的螢火蟲熒光素酶。若靶基因被siRNA干擾則螢火蟲熒光素酶(FL)的表達(dá)量降低，據(jù)此可以判斷siRNA是否特異性干擾靶基因。
實施例五 質(zhì)粒表達(dá)siRNA在MDCK細(xì)胞中抑制PB2、PB1、PA蛋白表達(dá)的鑒定1.方法(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。
①在轉(zhuǎn)染的前一天于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔接種0.5×105個MDCK細(xì)胞(中國國家流感中心)，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜。至轉(zhuǎn)染時細(xì)胞鋪滿孔面積的30-50％。
②PB2、PB1、PA蛋白表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑，按其操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。具體用量為每孔細(xì)胞加入靶基因載體170ng，作為轉(zhuǎn)錄活性內(nèi)對照的海腎熒光素酶(renilla luciferase，RL)表達(dá)載體pRL-TK(Promega公司產(chǎn)品)17ng，siRNA表達(dá)載體0.5μg，Lipofectamine2000 2μl。
③6小時后補(bǔ)加胎牛血清至終濃度為10％。于5％CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)至72小時后檢測。
(2)熒光檢測應(yīng)用Promega公司的雙熒光報告系統(tǒng)(Dual-luciferase ReporterAssay System)，在熒光照度儀TD-20/20 luminometer(TurnurDesigns，USA)上進(jìn)行熒光檢測。
轉(zhuǎn)染后72hr收獲細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測。按照Dual-luciferaseReporter Assay System的操作說明進(jìn)行。具體操作步驟為①棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞兩次，以去除脫落細(xì)胞和殘留的細(xì)胞培養(yǎng)液。
②在每孔中加入100μl 1×裂解緩沖液(Passive LysisBuffer)。
③細(xì)胞培養(yǎng)板置震蕩器上震蕩裂解15min。
④取各細(xì)胞培養(yǎng)孔中的細(xì)胞裂解液20μl，加至熒光照度儀所用的檢測板的各孔中。
⑤檢測板的各樣品孔中加入100μl Luciferse Assay ReagentII，混勻后用熒光照度儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測。
⑥各樣品孔中迅速加入100μl Stop & Glo Reagent，再用熒光照度儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測。
⑦進(jìn)行數(shù)據(jù)計算與分析(按照Promega公司Part#TM040技術(shù)手冊說明進(jìn)行)。
(3)針對多聚酶組分PB2、PB1或PA編碼基因的siRNA的篩選方法。
將siRNA表達(dá)載體、海腎熒光素酶(renilla luciferase，RL)表達(dá)載體(pRL-TK)與螢火蟲熒光素酶融合基因表達(dá)載體(PB2-FL、PB1-FL、PA-FL)共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，72小時后收獲細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測及數(shù)據(jù)計算與分析。實驗結(jié)果分別見圖2，3，4。具體結(jié)果見表2、表3。
2.結(jié)果siRNA的篩選結(jié)果抑制效率＜40％的siRNA

表2
抑制效率＞40％的siRNA


表3表2和表3中(+)表示正義RNA片段；(-)表示反義RNA片段。其中正義RNA片段序列號與表1中相應(yīng)編號靶位點(diǎn)序列的序列號相同，正義RNA片段序列號(Y)為相應(yīng)編號的反義RNA片段序列號(X，X為19-36中任一自然數(shù))減18，即Y＝X-18。表2、表3第三列“/”左側(cè)為正義RNA片段序列號，右側(cè)為反義RNA片段序列號。如編號10的siRNA的正義RNA片段為包含SEQ ID NO10的相應(yīng)序列，反義RNA片段為包含SEQ ID NO28的相應(yīng)序列。
實施例六 細(xì)胞中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號、No.16號siRNA在病毒感染后不同時間對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制將能表達(dá)No.6號、No.12號、No.16號siRNAs的質(zhì)粒(500ng/well)分別轉(zhuǎn)染(如實施例五中用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)培養(yǎng)在24孔板中的MDCK細(xì)胞，于37℃、5％CO2培養(yǎng)6hr后，每孔細(xì)胞經(jīng)Hank’s液沖洗后加入100μl在病毒感染培養(yǎng)液中的乙型流感病毒B/Beijing/76/98(病毒基因工程國家重點(diǎn)實驗室保存株)(病毒感染量為MOI 0.001，其中MOI為感染復(fù)數(shù))，于34℃、5％CO2感染1小時(hr)后加入新鮮的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液(含2μg/ml TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)-胰酶(Trypsin))繼續(xù)于34℃5％CO2培養(yǎng)，在感染后的不同時間收獲細(xì)胞上清進(jìn)行病毒滴度或病毒毒力的測定。
病毒感染培養(yǎng)液為DMEM中含有0.3％牛血清白蛋白，10mM Hepes，100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。
病毒滴度與病毒毒力的測定如下(1)紅細(xì)胞凝集滴度(簡稱血凝滴度)的測定首先在96孔U形板的各孔中加入25μl 0.85％氯化鈉(Nacl)，再于第一孔中加入25μl病毒液，經(jīng)多次吹打充分混勻后吸取25μl液體放入第二孔，依次進(jìn)行稀釋，最后一孔吹打混勻后吸取25μl棄之。然后于每孔中加入25μl 1％雞血紅細(xì)胞懸液，混勻后置室溫30～60min，觀察結(jié)果，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集滴度計算。
(2)病毒毒力的檢測TCID50檢測將病毒進(jìn)行倍比稀釋，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)成單層的MDCK細(xì)胞中，每個稀釋度平行加4個孔，每孔加200μl稀釋液，于34℃孵育1hr后用Hank’s溶液沖洗，然后加入含TPCK-Trypsin(TPCK處理的胰酶)的細(xì)胞維持液。在感染后每24hr補(bǔ)加TPCK-Trypsin，在感染后72hr收獲病毒，凍存于-80℃冰箱過夜，并用雞血紅細(xì)胞測定血凝滴度。
空斑形成單位(PFU)檢測將病毒進(jìn)行10倍比稀釋，接種于含培養(yǎng)成單層的MDCK細(xì)胞的6-孔板中，每個稀釋度兩孔，0.5ml/孔，輕輕晃動使加入的病毒液均勻地鋪在細(xì)胞表面上，于34℃孵育1hr后用Hank’s液沖洗，然后加入第一層覆蓋液，3ml/孔，置34℃孵育72hr后加入第二層覆蓋液，24～72hr取出，計數(shù)空斑。
結(jié)果如圖5顯示，(1)沒有轉(zhuǎn)染siRNAs而只感染病毒的對照細(xì)胞(空白)中，流感病毒滴度隨時間的延長逐漸升高，說明病毒感染細(xì)胞后不斷復(fù)制，病毒產(chǎn)量逐步增加，至感染后72hr達(dá)到最高(HA血凝滴度為1∶128)。(2)針對無關(guān)蛋白的siRNA(對照siRNA)對病毒復(fù)制沒有影響，用實驗證實了siRNA的特異性。(3)在轉(zhuǎn)染了能表達(dá)No.6號、No.12號或No.16號siRNA的質(zhì)粒的細(xì)胞中病毒滴度很低，說明質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號、No.16號siRNA能在MDCK細(xì)胞中有效抑制病毒復(fù)制，而且隨著時間的延長，病毒量沒有明顯增加。由此可見，siRNA可以有效抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，而且抑制效果至少可以持續(xù)4天。
實施例七 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同量的No.6號siRNA表達(dá)質(zhì)粒對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制方法同實施例六。
培養(yǎng)在24孔板的MDCK細(xì)胞中轉(zhuǎn)染(如實施例五中用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)不同量的能表達(dá)No.6號siRNA的質(zhì)粒(如圖6中顯示的量)，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量為MOI 0.001，感染后72hr收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液，測定病毒滴度。結(jié)果如圖6所示。由圖6中的結(jié)果可以明顯地看出，隨著表達(dá)No.6號siRNA的質(zhì)粒的增加，No.6號siRNA對細(xì)胞中流感病毒的抑制效果也越來越明顯。由此可見，質(zhì)粒表達(dá)No.6號siRNA可以強(qiáng)有效地抑制細(xì)胞中的流感病毒B/Beijing/76/98的復(fù)制與感染，而且具有量依賴性。
實施例八 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同量的化學(xué)合成No.6號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制方法同實施例七。
培養(yǎng)在24孔板的MDCK細(xì)胞中轉(zhuǎn)染(如實施例五中用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)不同量的化學(xué)合成No.6號siRNA(如圖7中顯示的量)，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量為MOI 0.001，感染后72hr收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液，測定病毒滴度。結(jié)果如圖7所示。由圖7中的結(jié)果可以明顯地看出，隨著化學(xué)合成No.6號siRNA量的增加，No.6號siRNA對細(xì)胞中流感病毒的抑制效果也越來越明顯。這進(jìn)一步說明，化學(xué)合成No.6號siRNA可以強(qiáng)有效地抑制細(xì)胞中的乙型流感病毒B/Beijing/76/98的復(fù)制與感染，而且具有劑量依賴性。
實施例九 siRNA對新產(chǎn)生病毒粒子的抑制將培養(yǎng)在24孔板的MDCK細(xì)胞先進(jìn)行病毒感染，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量為MOI 0.001，2hr后再轉(zhuǎn)染能表達(dá)No.6號siRNA的質(zhì)粒(500ng/well)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞于34℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)，在感染病毒后72hr收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液進(jìn)行病毒滴度或病毒毒力的測定。結(jié)果如圖8所示。由圖8中的結(jié)果可以看出，隨著時間的延長，沒有轉(zhuǎn)染siRNA的空白對照和轉(zhuǎn)染了無關(guān)siRNA(對照siRNA)的細(xì)胞中流感病毒的量逐漸增加，而轉(zhuǎn)染了能表達(dá)No.6號siRNA的質(zhì)粒的細(xì)胞中流感病毒的量只是略有增加，這說明No.6號siRNAs能有效抑制新病毒粒子的產(chǎn)生。
實施例十 細(xì)胞中質(zhì)粒表達(dá)各種siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制方法同實施例六。
培養(yǎng)在24孔板的MDCK細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染能表達(dá)針對乙型流感病毒多聚酶組分PB2、PB1或PA特異siRNA的質(zhì)粒(500ng/well)，每孔感染B/Beijing/76/98病毒量為MOI 0.001，感染后72hr收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液，測定病毒滴度。結(jié)果如圖9所示。由圖9中的結(jié)果可以明顯地看出，質(zhì)粒表達(dá)的針對乙型流感病毒多聚酶組分PB2、PB1或PA特異siRNA可以有效地抑制細(xì)胞中的流感病毒B/Beijing/76/98的復(fù)制與感染。
實施例十一 細(xì)胞中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/37/99(來自中國國家流感中心)的抑制方法同實施例六。
培養(yǎng)在24孔板的MDCK細(xì)胞中轉(zhuǎn)染能表達(dá)No.6號、No.12號siRNA的質(zhì)粒(500ng/well)，每孔感染B/Beijing/37/99病毒量為MOI0.001，感染后72hr收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液，測定病毒滴度。結(jié)果如圖10所示。由圖10中的結(jié)果可以明顯地看出，質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA可以強(qiáng)有效地抑制細(xì)胞中的流感病毒B/Beijing/37/99的復(fù)制與感染。
實施例十二 細(xì)胞中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA對乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03(病毒基因工程國家重點(diǎn)實驗室保存株)的抑制方法同實施例六。
培養(yǎng)在24孔板的MDCK細(xì)胞中轉(zhuǎn)染能表達(dá)No.6號、No.12號siRNA的質(zhì)粒(500ng/well)，每孔感染B/Beijing/37/99病毒量為MOI 0.01，感染后72hr收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液，測定病毒滴度。結(jié)果如圖11所示。由圖11中的結(jié)果可以明顯地看出，質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA可以強(qiáng)有效地抑制細(xì)胞中的流感病毒B/Jiangsu/10/03的復(fù)制與感染。
實施例十三 細(xì)胞中siRNA與利巴韋林對乙型流感病毒的抑制效果比較方法同實施例六。
培養(yǎng)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的MDCK細(xì)胞，一部分孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)染能表達(dá)No.6號、No.12號siRNA的質(zhì)粒(500ng/well)，6hr后進(jìn)行病毒感染每孔細(xì)胞接種病毒100μl，其中B/Beijing/76/98和B/Beijing/37/99病毒感染量為MOI 0.001、B/Jiangsu/10/03病毒感染量為MOI 0.01；另一部分孔中的細(xì)胞，感染同樣多的病毒后，在培養(yǎng)液中加入利巴韋林(Ribavirin)3.6μg/孔；空白對照為不加任何抑制物、只感染病毒的對照。感染病毒后細(xì)胞于34℃5％CO2培養(yǎng)。病毒感染后72hr收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液，測定病毒滴度。結(jié)果如圖12所示。由圖中結(jié)果可以看出，No.6號、No.12號siRNA和利巴韋林均能抑制細(xì)胞中乙型流感病毒的復(fù)制；利巴韋林對B/Beijing/37/99的抑制效果稍差；當(dāng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染500ng能表達(dá)siRNAs的質(zhì)粒時，對三種乙型流感病毒的抑制效果比3.6μg利巳韋林好。
實施例十四 雞胚中質(zhì)粒表達(dá)各種siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制將500ng能表達(dá)針對乙型流感病毒多聚酶組分PB2、PB1或PA特異siRNA的質(zhì)粒分別用無血清培養(yǎng)基(Opti-MEMI Reduced SerumMedium，Invitrogen公司產(chǎn)品)進(jìn)行稀釋，體積為100μl；然后與B/Beijing/76/98(6500PFU/ml)病毒液100μl或200μl混合，接種10日齡雞胚的尿囊腔。接種66hr后，收獲雞胚尿囊液，進(jìn)行病毒含量測定。結(jié)果如圖13所示。由圖中的結(jié)果可以明顯地看出，質(zhì)粒表達(dá)針對乙型流感病毒多聚酶組分PB2、PB1或PA特異siRNA均可以強(qiáng)有效地抑制雞胚中流感病毒B/Beijing/76/98的復(fù)制與感染。
實施例十五 雞胚中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/37/99的抑制方法同實施例十四。
接種的乙型流感病毒B/Beijing/37/99的毒力為5200PFU/ml。病毒滴度測定結(jié)果如圖14所示。由圖中的結(jié)果可以看出，質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA可以有效地抑制雞胚中流感病毒B/Beijing/37/99的復(fù)制與感染。
實施例十六 雞胚中質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA對乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的抑制方法同實施例十四。
接種的乙型流感病毒B/Jiangsu/10/03的毒力為8500PFU/ml。病毒滴度測定結(jié)果如圖15所示。由圖中的結(jié)果可以看出，質(zhì)粒表達(dá)No.6號、No.12號siRNA可以強(qiáng)有效地抑制雞胚中流感病毒B/Jiangsu/10/03的復(fù)制與感染。
實施例十七 雞胚中化學(xué)合成siRNA對乙型流感病毒B/Beijing/76/98的抑制方法同實施例十四。
將60nmol化學(xué)合成siRNAs用Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrigen公司產(chǎn)品)進(jìn)行稀釋，體積為100μl；然后與B/Beijing/76/98(6500PFU/ml)病毒液100μl或200μl混合，接種10日齡雞胚的尿囊腔。接種66hr后，收獲雞胚尿囊液，進(jìn)行病毒含量測定。結(jié)果如圖16所示。由圖中的結(jié)果可以明顯地看出，化學(xué)合成No.6號、No.10號、No.12號或No.16號siRNA，無論病毒接種量為650PFU/egg還是1300PFU/egg，均可以強(qiáng)有效地抑制雞胚中流感病毒B/Beijing/76/98的復(fù)制與感染。
實施例十八 雞胚中siRNA與利巴韋林對乙型流感病毒的抑制效果比較方法同實施例十四。
將能表達(dá)No.6號、No.12號siRNA的質(zhì)粒(500ng)或利巴韋林3.6μg與病毒B/Beijing/76/98(650pfu/egg)或B/Beijing/37/99(520pfu/egg)或B/Jiangsu/10/03(850pfu/egg)一起接種10日齡雞胚的尿囊腔，接種后66hr收獲雞胚尿囊液，進(jìn)行病毒含量測定。結(jié)果(如圖17所示)發(fā)現(xiàn)，對三種病毒，只接種病毒、不介入siRNA和藥物的雞胚尿囊液(對照)中均可檢測到很高的病毒含量；而同時接種了能表達(dá)No.6號或No.12號siRNA的質(zhì)粒和病毒的雞胚，其尿囊液中的病毒含量很低，說明它們有效地抑制了病毒的復(fù)制；利巴韋林與病毒一起接種雞胚尿囊腔，結(jié)果雞胚尿囊液中的病毒含量比只接種病毒的雞胚尿囊液中病毒量少，但比介入了siRNAs的雞胚尿囊液中的病毒含量高。由此可見，500ng能表達(dá)No.6號或No.12號siRNA的質(zhì)粒在雞胚中產(chǎn)生的siRNAs抑制乙型流感病毒復(fù)制與感染的效果比3.6μg利巴韋林好。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所<120>針對乙型流感病毒多聚酶基因的siRNA序列及其應(yīng)用<130>IDC050122<160>36<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>1gugcugaaga cauaggaac19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>2gugagacuug acaaugcca19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>3gaagcaggaa uaccaagag19<210>4<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>4gacacuagga uguuccaag19<210>5<211>19<212>RNA<213>人工序列
<400>5gucacccaaa gcaagugag19<210>6<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>6guccuaacua uaugcggca19<210>7<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>7gcaacggcac uaaacacaa19<210>8<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>8gguuuccuca uaaagagaa19<210>9<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>9gguuuguauu aguaguuga19<210>10<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>10ggaucagcau gacaguaac19<210>11<211>19
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<210>23<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>23cucacuugcu uugggugac19<210>24<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>24ugccgcauau aguuaggac19<210>25<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>25uuguguuuag ugccguugc19<210>26<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>26uucucuuuau gaggaaacc19<210>27<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>27ucaacuacua auacaaacc19<210>28<211>19<212>RNA<213>人工序列
<400>28guuacuguca ugcugaucc19<210>29<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>29augguaugcu aaacagauc19<210>30<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>30ucauccuuug acauucuuc19<210>31<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>31cucuagaugg acgcagauc19<210>32<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>32gagucucuau uccaugcuc19<210>33<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>33ugaaguucug ugagucugc19<210>34<211>19<212>RNA
權(quán)利要求
1.分離的流感病毒小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其中，所述靶序列為流感病毒多聚酶PB1、PB2或者PA編碼基因上的連續(xù)10-30個(優(yōu)選，15-27個，更優(yōu)選19-23個)核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的siRNA靶序列，其中，所述靶序列為SEQID NO1-SEQ ID NO18中任意一條序列。
3.與權(quán)利要求1或2的siRNA靶序列具有至少70％(例如80、85、90、95、96、97、98、99％)同一性或者在嚴(yán)緊雜交條件下雜交的多核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列。
4.包含權(quán)利要求1-3任一項的序列的核酸構(gòu)建體。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的siRNA靶序列在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。
6.小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含權(quán)利要求1-3序列編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制流感病毒多聚酶基因的表達(dá)和/或流感病毒的復(fù)制和/或感染。
7.如權(quán)利要求6所述的核糖核酸，其中，所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于一條RNA鏈上，例如在一個單鏈RNA分子包含正義RNA片段和反義RNA片段。
8.如權(quán)利要求7所述的核糖核酸，其中，所述核糖核酸為發(fā)夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。
9.權(quán)利要求6-8任一項所述的核苷酸，其中，正義RNA片段和反義RNA片段的長度優(yōu)選為8-50個核苷酸，優(yōu)選10-30(更優(yōu)選15-27，最優(yōu)選19-23，如19、20或者21)個。
10.權(quán)利要求6-9任一項所述的核苷酸，其中，雙鏈RNA的互補(bǔ)區(qū)域至少有10個(優(yōu)選15個，更優(yōu)選18個)堿基對。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組針對乙型流感病毒多聚酶基因的siRNA及其制備方法和應(yīng)用。選取乙型流感病毒多聚酶(PB2、PB1、PA)基因中高度保守的序列作為siRNA的靶序列，并且以靶序列中的連續(xù)10－30(優(yōu)選，15－27，更優(yōu)選19－23)bp的序列設(shè)計siRNA。細(xì)胞和動物模型攻毒實驗證明，以乙型流感病毒基因組中高度保守的序列作為靶序列，應(yīng)用能與靶序列特定位點(diǎn)上的核苷酸序列互補(bǔ)配對的siRNA，可以阻斷該基因在細(xì)胞和動物模型中的復(fù)制與表達(dá)，從而有效地抑制不同乙型流感病毒毒株在細(xì)胞和動物模型的復(fù)制與感染，以達(dá)到治療流行性感冒的目的。
文檔編號C07H21/00GK1837366SQ20051000356
公開日2006年9月27日 申請日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者高永珍, 金奇, 梁子才, 侯云德 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所