一種乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株及其應(yīng)用，其命名為B/Yunnan/2/2005Vca(By)，微生物保藏號(hào)為：CGMCCNO.7009。該毒株能在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，血凝滴度保持在1:512-1:1024，感染性滴度保持在7.0～7.8log10TCID50/ml，經(jīng)鑒定具有Ca、Ts表型和Att特性。該毒株可以作為母本株與流行株遺傳重配，或者采用反向遺傳學(xué)技術(shù)將其6個(gè)內(nèi)部基因與流行株2個(gè)表面蛋白基因進(jìn)行基因重配，獲得含流行株表面抗原的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，可應(yīng)用于制備Vero細(xì)胞流感減毒活疫苗或流感減毒活疫苗，也可用于流感滅活疫苗的生產(chǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株及其應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，并涉及以此適應(yīng)株作為母本毒株與其他流行毒株進(jìn)行重配，從而獲得含有流行株表面抗原的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，以作為制備Veix)細(xì)胞流感減毒活疫苗或流感減毒活疫苗以及流感滅活疫苗的毒種，屬于生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】:
流感病毒(influenza virus)是一種能引起急性呼吸道疾病的病毒，具有高度傳染性，主要經(jīng)空氣飛沫傳播，因此它能在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行，發(fā)病率高并伴有一定的死亡率，是目前人類(lèi)尚不能有效控制的世界性傳染病。
[0003]流感病毒 屬于正粘病毒科，其病毒顆粒呈球形或絲狀，核衣殼呈螺旋對(duì)稱(chēng)，病毒基因組為單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA，有包膜。根據(jù)病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MP)的抗原性，可將流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型和乙型流感病毒的基因含有8個(gè)RNA片段，丙型流感病毒的基因含有7個(gè)片段；甲型流感病毒又可根據(jù)流感病毒血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性不同，再分為若干亞型。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，乙型流感呈局部爆發(fā)，丙型流感主要是以散發(fā)形式出現(xiàn)。其中甲型和乙型流感病毒與人類(lèi)有密切聯(lián)系，甲型流感病毒除感染人外，還可感染飛禽、豬、馬等動(dòng)物。而人在生活中與這些動(dòng)物接觸頻繁，為流感病毒產(chǎn)生變異提供有利條件，變異后的病毒會(huì)導(dǎo)致流感流行，變異程度大則導(dǎo)致大流行。
[0004]乙型流感病毒是流感的主要病原之一，只有一個(gè)亞型，宿主特異性較強(qiáng)，至今只發(fā)現(xiàn)感染人和海豹。1990年就已經(jīng)報(bào)道了世界范圍內(nèi)流行的乙型流感病毒，根據(jù)其抗原特性和HAl區(qū)的核苷酸序列，可以分為兩大譜系，代表的毒株分別為B/ Yamagata/ 16/ 88和B/ Victoria/ 2/ 87 (這兩大譜系分別簡(jiǎn)稱(chēng)為Yamagata系和Victoria系)。同甲型流感病毒一樣，乙型流感病毒也是通過(guò)在HA和NA基因上的點(diǎn)突變和多種氨基酸選擇性突變，特別是血凝素的重鏈區(qū)(HAl)的變異，改變抗原特性來(lái)逃避機(jī)體已有的免疫保護(hù)，從而不斷導(dǎo)致流感的流行。因此乙型流感病毒抗原是三價(jià)流感疫苗的重要組成部分。
[0005]接種流感疫苗是預(yù)防和降低流感嚴(yán)重程度的最有效手段，包括滅活疫苗和減毒活疫苗。1941年雞胚制備的流感滅活疫苗在美國(guó)首次獲得批準(zhǔn)，在全世界得到廣泛應(yīng)用。目前使用的主要是用雞胚制備的滅活的流感三聯(lián)裂解疫苗，包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒毒株。疫苗株的組分是由WHO根據(jù)每年全球流感病毒的變化規(guī)律，推薦的用于下一年度疫苗生產(chǎn)用流感病毒流行株的表面抗原來(lái)確定的。
[0006]流感減毒活疫苗因具備滴鼻途徑接種、提供粘膜免疫和細(xì)胞免疫且免疫保護(hù)更持久的特點(diǎn)，而優(yōu)于滅活疫苗。目前只有美國(guó)和俄羅斯生產(chǎn)流感減毒活疫苗，其疫苗種子批均來(lái)源于雞胚高產(chǎn)的流感病毒冷適應(yīng)株，在美國(guó)為A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)和B/AnnArbor/1/66，在俄羅斯為 A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)和 B/USSR/60/69。
[0007]但是，以雞胚作為培養(yǎng)基質(zhì)存在以下不足之處:⑴潛在污染、可能造成雞傳染病因接種疫苗而波散；(2)連續(xù)傳代常變異，造成疫苗與人群中流行毒株不匹配，使疫苗效力降低；(3)培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)，難于大規(guī)模生產(chǎn)以滿(mǎn)足流感大流行突發(fā)性需求；(4)純化過(guò)程復(fù)雜；(5)易引起過(guò)敏反應(yīng)。尤其是2003年以來(lái)全世界范圍內(nèi)高致病性禽流感的流行，使采用雞胚生產(chǎn)流感病毒疫苗風(fēng)險(xiǎn)性增加。研究出安全有效的疫苗已經(jīng)成為流感疫苗重要研究方向，尤其要應(yīng)對(duì)流感大流行時(shí)不受雞胚來(lái)源限制，世界衛(wèi)生組織建議用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒來(lái)替代雞胚制備流感疫苗。
[0008]現(xiàn)在用于制備流感疫苗的哺乳動(dòng)物細(xì)胞主要是狗腎細(xì)胞(MDCK)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)。雖然MDCK細(xì)胞是培養(yǎng)和分離流感病毒較好的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，但其存在潛在的致瘤性，使得其應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)顧慮重重。非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)是世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)的可用于人用疫苗生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，其遺傳背景較為清楚，無(wú)潛在的致瘤性，安全可靠，且能利用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，短期內(nèi)供給量大。另外，用VeiO細(xì)胞研制的流感疫苗，可以使機(jī)體產(chǎn)生相對(duì)較強(qiáng)的體液免疫效應(yīng)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。目前VeiO細(xì)胞已廣泛用于狂犬、乙腦、脊髓灰質(zhì)炎、腎綜合征出血熱等疫苗的生產(chǎn)。但是，Veix)細(xì)胞并不是流感病毒的敏感培養(yǎng)基質(zhì)，產(chǎn)量較低且多數(shù)病毒不能在Vero細(xì)胞上連續(xù)增殖。我們研究Vero細(xì)胞流感多年，已經(jīng)成功篩選出一株甲型流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株，在此基礎(chǔ)上，如何進(jìn)一步選育出流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，使其能夠在25°C也能大量復(fù)制且連續(xù)高產(chǎn)，成為了 VeiO細(xì)胞流感減毒活疫苗研發(fā)的難題。
[0009]反向遺傳學(xué)，相對(duì)于經(jīng)典遺傳學(xué)而言，是在獲得生物體基因組全部序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)靶基因進(jìn)行必要的加工和修飾，如定點(diǎn)突變、基因插入/缺失及基因置換等，再按組成順序構(gòu)建含生物體必需元件的修飾基因組，讓其裝配出具有生命活性的個(gè)體，研究生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能，以及這些修飾可能對(duì)生物體的表型、性狀有何種影響等方面的內(nèi)容。目前反向遺傳學(xué)已應(yīng)用于流感病毒跨種屬傳播機(jī)制、病毒毒力及其致病性研究和疫苗研發(fā)。應(yīng)用于疫苗研發(fā)，即6+2重配，例如將雞胚高產(chǎn)株的六個(gè)內(nèi)部基因(PB2、PB1、PA、NP、Μ、NS )和當(dāng)前流行毒株的HA和NA加以重配，獲得流行株的雞胚高產(chǎn)株，用以生產(chǎn)疫苗。相對(duì)于傳統(tǒng)流感疫苗研制方法耗時(shí)繁瑣、并且要求足夠的雞胚供應(yīng)，反向遺傳學(xué)可以使疫苗的研制周期縮短、工藝簡(jiǎn)化。因此反向遺傳學(xué)是應(yīng)對(duì)流感大流行的一個(gè)重要手段。
[0010]綜上所述，流感仍是人類(lèi)尚不能有效控制的世界性傳染病，接種流感疫苗是預(yù)防流感主要手段，減毒活疫苗優(yōu)于滅活疫苗。目前使用雞胚作為制備流感疫苗的基質(zhì)，存在很多不足之處，使用Vero細(xì)胞制備流感疫苗成為流感疫苗發(fā)展的重要方向。如何選育出流感病毒VeiO細(xì)胞冷適應(yīng)株，使其不僅在33°C而且在25°C也能大量復(fù)制且連續(xù)高產(chǎn)，成為了Vero細(xì)胞流感減毒活疫苗研發(fā)的難題。
[0011]目前所用的流感疫苗生產(chǎn)毒種都是與雞胚高產(chǎn)株重配或天然的雞配適應(yīng)株，其一般在Vero細(xì)胞上不敏感。國(guó)內(nèi)和國(guó)外有廠(chǎng)家直接將WHO提供的流感疫苗生產(chǎn)毒種接種Vero細(xì)胞產(chǎn)毒量低或產(chǎn)量不穩(wěn)定，制約了利用Vero細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒制備流感疫苗的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的乙型流感病毒Veix)細(xì)胞冷適應(yīng)株，且在Vero細(xì)胞上25°C可連續(xù)傳代并保持穩(wěn)定高產(chǎn)，該乙型流感病毒Veix)細(xì)胞冷適應(yīng)株具有G、7?表型和特性。
[0013]本發(fā)明提供的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，被命名為B/Yunnan/2/2005Vca(B)，其保藏號(hào)為:CGMCC N0.7009，保藏單位為:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為:北京市，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏時(shí)間為:2012年12月19日。
[0014]本發(fā)明的目的之二是提供所述乙型流感病毒VeiO細(xì)胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/2/2005Vca (B)的制備方法。
[0015]本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CGMCC N0.7009的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/2/2005Vca (B)通過(guò)下列方法獲得:
A.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI的血凝滴度達(dá)到1:512的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，33 ± I °C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液；
B.將步驟A收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟A和B，如此連續(xù)傳3代，并維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:512，得傳代乙型流感病毒；
C.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI的步驟B的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，32± 1°C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:256，得傳代乙型流感病毒；
D.在24小時(shí)長(zhǎng)成 致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟C的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，31 ± I°C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:160，得傳代乙型流感病毒；
E.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟D的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，30± I°C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:160，得傳代乙型流感病毒；
F.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟E的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，29± I°C條件下，培養(yǎng)96 - 120小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:160，得傳代乙型流感病毒；
G.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟F的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，28± I°C條件下，培養(yǎng)96-120小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:80，得傳代乙型流感病毒；
H.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟G的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml,pH7.0 — 7.2，27± I°C條件下，培養(yǎng)96-120小時(shí)后，收獲病毒液；
1.將步驟H收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟H和I，如此連續(xù)傳代4代，種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在波動(dòng)于O — 1:80，得傳代乙型流感病毒；
J.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的VeiO細(xì)胞上，接種IMOI步驟I的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，26土 1°C條件下，培養(yǎng)96 — 120小時(shí)后，收獲病毒液；
K.將步驟J收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再次接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟J和K，如此連續(xù)傳代10代，病毒始終保持低水平復(fù)制狀態(tài)，得再傳代乙型流感病毒；
L.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟K的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，25± I°C條件下，培養(yǎng)120-168小時(shí)后，收獲病毒液；
M.將步驟L收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟L和M，如此連續(xù)傳代31代，得血凝滴度在1:512-1:1024的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株。
[0016]所述步驟A的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)為現(xiàn)有病毒，其保藏號(hào)為:CGMCC N0.2931，專(zhuān)利號(hào)為 ZL 2009 I 0094354.6。
[0017]本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CGMCC N0.7009的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/2/2005Vca (B)的基本特征:(a)透射電鏡觀察到所得的流感病毒直徑約為80-120nm,具有囊膜的較為典型的流感病毒形態(tài)；(b)基因序列分析表明在連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中，不易產(chǎn)生流感病毒基因變異；(c)流感病毒在25°C Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，血凝滴度可保持在1:512 ;(d)HI實(shí)驗(yàn)表明病毒的HA抗原可被羊抗或其它動(dòng)物抗B亞型流感病毒高免血清特異性識(shí)別；(e) B/Yunnan/2/2005Vca (B)活病毒經(jīng)自然途徑感染SPF雞后，感染雞無(wú)發(fā)病和死亡。
[0018]本發(fā)明的目的之三是提供保藏號(hào)為CGMCC N0.7009的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/2/2005Vca (B)的應(yīng)用，即以乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株作為母本株與其他流行毒株進(jìn)行重配，從而獲得流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，具體通過(guò)以下兩種方法實(shí)現(xiàn):
第一種方法:用常規(guī)的重配技術(shù)獲得流感病毒流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株:
Al.以1:100-100:1的體積比，將保藏號(hào)為CGMCC N0.7009的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/2/2005Vca (B)與其他亞型流感病毒混合，得混合病毒，具體比例由病毒血凝滴度和不同毒株生長(zhǎng)性而定；
A2.在9-10日齡SPF雞胚上，按每胚接種0.1-0.3ml的量，接種步驟Al的混合病毒，于33±1°C孵育12-48小時(shí)，2-8°C過(guò)夜冷胚，收集雞胚尿囊液，得病毒液；
或者在新鮮的Vero細(xì)胞上，按0.004-0.008ml/cm2Vero細(xì)胞的量，接種步驟Al的混合病毒，置于33±1°C培養(yǎng)48-72小時(shí),得病毒液；
或者在新鮮的MDCK細(xì)胞上，按0.004-0.008ml/cm2MDCK細(xì)胞的量，接種步驟Al的混合病毒，置于33±1°C培養(yǎng)48-72小時(shí),得病毒液；
A3.將步驟A2的病毒液中加入抗B/Yunnan/2/2005Vca (B)的抗血清至抗血清濃度為1-80% (體積比)，具體濃度視抗體效價(jià)為1:10240 - 1:2560而定，并在Vero細(xì)胞上25°C傳代篩選，從而選育出流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株；
第二種方法:用現(xiàn)有的反向遺傳學(xué)技術(shù)重配獲得流感病毒流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)
株:
B1.將保藏號(hào)為CCTCC N0.V201253的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/2/2005Vca (B)的6個(gè)內(nèi)部基因，即PB2、PB1、PA、NP、M、NS，分別克隆于雙向轉(zhuǎn)錄載體pHW2000上或其它雙向轉(zhuǎn)錄載體上，得克隆的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株6個(gè)內(nèi)部基因質(zhì)粒；將流行株的2個(gè)表面蛋白基因HA和NA，也克隆于此雙向轉(zhuǎn)錄載體上，得流行株2個(gè)表面蛋白基因質(zhì)粒；
B2.將步驟BI所得克隆的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株6個(gè)內(nèi)部基因質(zhì)粒與流行株2個(gè)表面蛋白基因質(zhì)粒混合后，共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞297T、CosU Vero或MDCK細(xì)胞上，37± I°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，收獲細(xì)胞液；
B3.在9-10日齡SPF雞胚上，按每胚接種0.1-0.2ml的量，接種步驟B2的收獲細(xì)胞液，25±1°C培養(yǎng)96-120小時(shí)，收獲病毒液，即獲得流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株；
或者在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的MDCK細(xì)胞上，按0.04-0.08ml /cm2MDCK細(xì)胞的量，接種步驟B2的收獲細(xì)胞液，置于25± 1°C培養(yǎng)120-168小時(shí)，收獲病毒液，即獲得流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株；
或者在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，按0.04-0.08ml/cm2Vero細(xì)胞的量，接種步驟B2的收獲細(xì)胞液，置于25± 1°C培養(yǎng)120-168小時(shí)，收獲病毒液，即獲得流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株。
[0019]本發(fā)明的難點(diǎn)在于:
(I)乙型流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株在25°C培養(yǎng)時(shí)也能大量復(fù)制且連續(xù)高產(chǎn)。
[0020](2)對(duì)乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (B)在Vero細(xì)胞上的種毒培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化。
[0021](3)乙型流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株在雞胚25°C培養(yǎng)時(shí)也能大量復(fù)制且連續(xù)高產(chǎn)，同時(shí)具有減毒特征。
[0022](4)如何應(yīng)用乙型流感病毒8八皿1^11/2/2005￥0& (B)與其他病毒株遺傳和反向遺傳學(xué)重配，進(jìn)而獲得Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株進(jìn)行了研究。
[0023]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果:
(O乙流感病毒VeiO細(xì)胞冷適應(yīng)株可以采用微載體發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)VeiO細(xì)胞和流感病毒，制備流感減毒活疫苗和大流行流感疫苗。此法較目前以雞胚作為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)流
感疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn):①可以采用微載體發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)VeiO細(xì)胞和流感病毒，生產(chǎn)工藝易于標(biāo)準(zhǔn)化;?采用標(biāo)準(zhǔn)·化的Vero細(xì)胞，不含外源生物因子污染；@不含易于引起人體過(guò)敏的雞胚蛋白；?避免了流感病毒在雞胚培養(yǎng)后病毒的血凝素抗原易產(chǎn)生變化使疫苗效力降低；?在流感大流行突發(fā)性時(shí)，不受雞胚來(lái)源的影響，能夠生產(chǎn)出足夠的疫苗滿(mǎn)足需求。
[0024](2)本發(fā)明在保藏號(hào)為CGMCC N0.2931的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)基礎(chǔ)上，采用連續(xù)梯度降溫法，連續(xù)傳31代，成功選育出保藏號(hào)為CGMCC N0.7009的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/2/2005Vca (B)，以該毒株為母株與流行株流感病毒重配，獲得Vero細(xì)胞乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)用毒種，大大促進(jìn)了 Vero細(xì)胞流感減毒活疫苗和VeiO細(xì)胞大流行流感疫苗的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為B/Yunnan/2/2005Vca (B)連續(xù)降溫傳代血凝效價(jià)圖。
[0026]圖2為B/Yunnan/2/2005Vca (B)在25°C連續(xù)傳代血凝效價(jià)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。
[0028]實(shí)施例1
保藏號(hào)為CGMCC N0.7009的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/2/2005Vca(B)的制備方法: 1.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI的血凝滴度達(dá)到1:512的保藏號(hào)為CGMCC N0.2931的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)，在維持母液成分為DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度
1.0ug/ml, ρΗ7.2，33 ± I °C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液；
2.將步驟I收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再次接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟I和2，如此連續(xù)傳代3代，并維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:512，得傳代乙型流感病毒；
3.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟2的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml，pH7.2，32 ± I °C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:256，得傳代乙型流感病毒；
4.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟3的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml，pH7.2，31 ± I°C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:160，得傳代乙型流感病毒；
5.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟4的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml，pH7.2，30 ± I °C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:160，得傳代乙型流感病毒；
6.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟5的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml，pH7.2，29 ± I °C條件下，培養(yǎng)120小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:160，得傳代乙型流感病毒；
7.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟6的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml，pH7.2，28 ± I °C條件下，培養(yǎng)120小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:80，得傳代乙型流感病毒；
8.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟7的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml，pH7.2，27± 1°C條件下，培養(yǎng)120小時(shí)后，收獲病毒液；
9.將步驟8收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再次接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟8和9，如此連續(xù)傳代4代，種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在波動(dòng)于0-1:80，得傳代乙型流感病毒；
10.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟9的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.6mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml，pH7.2，26 ± I °C條件下，培養(yǎng)120小時(shí)后，收獲病毒液；
11.將步驟10收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再次接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟10和11，如此連續(xù)傳代10代，病毒始終保持低水平復(fù)制狀態(tài)，得再傳代乙型流感病毒；
12.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟11的再傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為DMEM/F12,青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml,谷氨酰胺溶液0.6mg/ml,牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml,pH7.2，25± I°C條件下，培養(yǎng)步驟20的傳代乙型流感病毒120-168小時(shí)后,收獲病毒液；
13.將步驟12收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再次接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟12和13，如此連續(xù)傳31代。前6代病毒處于較低復(fù)制水平，到第7代時(shí)血凝效價(jià)達(dá)到1:512，第12代達(dá)到1:1024，此后維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:512-1:1024，得保藏號(hào)為CGMCC N0.7009的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，命名為B/Yunnan/2/2005Vca (B)。；
本發(fā)明提供的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Vca (B)的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1 一圖2和表1，證明此毒株具有在VeiO細(xì)胞上25°C培養(yǎng)時(shí)高效穩(wěn)定增殖的特性。
[0029]血凝抑制試驗(yàn)證明，該株流感病毒經(jīng)過(guò)低溫選育后，型別為BY，有BV交叉；無(wú)HlNU H3N2 和 Al 交叉。
[0030]表1，冷適應(yīng)后流感病毒BY血清學(xué)鑒定
【權(quán)利要求】
1.一種乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，命名為B/Yunnan/2/2005Vca (B)，該毒株的微生物保藏號(hào)為:CGMCC N0.7009。
2.如權(quán)利要求1所述乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株在制備流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株在制備流感疫苗中的應(yīng)用。
4.一種乙型流感病毒VeiO細(xì)胞冷適應(yīng)株的制備方法，其特征在于經(jīng)過(guò)以下步驟: A.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI的血凝滴度達(dá)到1:512的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，33 ± I °C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液； B.將步驟A收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟A和B，如此連續(xù)傳3代，并維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:512，得傳代乙型流感病毒； C.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI的步驟B的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，32± I°C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:256，得傳代乙型流感病毒； D.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟C的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，31 ± I°C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:160，得傳代乙型流感病毒； E.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟D的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 - 1.5ug/ml，pH7.0-7.2，30±1°C條件下，培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:160，得傳代乙型流感病毒； F.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟E的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，29± I°C條件下，培養(yǎng)96 - 120小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:160，得傳代乙型流感病毒； G..在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟F的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，28± I°C條件下，培養(yǎng)96-120小時(shí)后，收獲病毒液，其血凝滴度在1:80，得傳代乙型流感病毒； H.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟G的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，27± I°C條件下，培養(yǎng)96-120小時(shí)后，收獲病毒液； I.將步驟H收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟H和I，如此連續(xù)傳代4代，種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在波動(dòng)于O — 1:80，得傳代乙型流感病毒； J.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的VeiO細(xì)胞上，接種IMOI步驟I的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，26土 1°C條件下，培養(yǎng)96 — 120小時(shí)后，收獲病毒液； K.將步驟J收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再次接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟J和K，如此連續(xù)傳代10代，病毒始終保持低水平復(fù)制狀態(tài)，得再傳代乙型流感病毒； L.在24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟K的傳代乙型流感病毒，在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬(wàn)U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml，pH7.0 — 7.2，25± I°C條件下，培養(yǎng)120-168小時(shí)后，收獲病毒液； M.將步驟L收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，接種到24小時(shí)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟L和M，如此連續(xù)傳代31代，得血凝滴度在1:512-1:1024的乙型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟A的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)為現(xiàn)有病毒，其保藏號(hào)為:CGMCC N0.293。
【文檔編號(hào)】C12N7/08GK103740654SQ201410039467
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】廖國(guó)陽(yáng), 李衛(wèi)東, 馬磊, 楊帆, 楊景暉, 周健, 宋紹輝, 蔡瑋, 寸怡娜, 高菁霞, 張新文, 戴宗祥, 姜述德 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所