專利名稱：表皮生長(zhǎng)因子受體靶向短肽與力達(dá)霉素構(gòu)成的抗腫瘤基因工程融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種強(qiáng)化的基因工程重組融合蛋白及其制備方法和在抗腫瘤靶向藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類生命和健康的疾病。其中，消化道癌癥和呼吸道癌癥在我國(guó)發(fā)病率最高，主要有胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、大腸癌等，而且隨著人類生存環(huán)境的日益惡化，這類腫瘤的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。
針對(duì)上述腫瘤，目前臨床采用的治療方案主要有外科手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療、介入放射學(xué)治療、免疫學(xué)治療和導(dǎo)向治療等。所說靶向治療，是利用對(duì)腫瘤有特異性親和力的抗體或化合物；或者利用有物理導(dǎo)向作用的磁性；或者通過腫瘤血管特異性導(dǎo)向的碘油作為載體，與具殺傷腫瘤作用的“彈頭”(放射性核素、化療藥物、毒蛋白等)制成偶聯(lián)物，以達(dá)到較多殺傷腫瘤而較少損害正常組織的目的。單克隆抗體作為“載體”由來已久，但是完整抗體分子量大約為150kDa，對(duì)腫瘤組織的滲透能力有限，導(dǎo)致單抗偶聯(lián)物較難穿過細(xì)胞外間隙到達(dá)實(shí)體瘤的深部。因此，分子小型化已成為單抗靶向藥物發(fā)展的必然趨勢(shì)。
表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)由53個(gè)氨基酸組成，分子量為6045KDa。EGF的生物活性十分廣泛，雖然其名為表皮生長(zhǎng)因子，但后來的研究表明，它對(duì)多種來源的上皮細(xì)胞都有促增殖活性，并與創(chuàng)傷愈合有關(guān)。EGF還可作為腫瘤促進(jìn)因子增強(qiáng)病毒或致癌物的致癌作用。許多轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌TGF-α并表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)形成自泌機(jī)制。EGFR的激活已經(jīng)顯示有助于增強(qiáng)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展的進(jìn)程，包括促進(jìn)增生，血管生成，腫瘤的侵襲/轉(zhuǎn)移，和抑制凋亡。腫瘤細(xì)胞中EGFR的表達(dá)與疾病的發(fā)展、低存活率、低治療效果以及對(duì)細(xì)胞毒、化療藥物耐受的發(fā)展都有關(guān)系。已經(jīng)在許多種腫瘤包括前列腺癌，乳腺癌，胃癌，結(jié)腸癌和子宮癌中觀察到EGFR的高水平表達(dá)。抑制EGFR和EGFR的相關(guān)通路，包括使用抗EGFR胞外配體結(jié)合域的單抗和針對(duì)于EGFR的酪氨酸激酶活性的抑制劑等治療策略已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。酪氨酸激酶抑制劑ZD1839和OSI-774目前正進(jìn)行III期臨床研究。2004年2月12日，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了抗EGFR單抗ErbituxTM(cetuximab，又稱為IMC-C225)用于治療晚期結(jié)腸癌患者。Erbitux是一個(gè)同時(shí)含有人和鼠基因片段的基因工程嵌合抗體，它是以腫瘤細(xì)胞表面的EGFR為靶點(diǎn)而起作用，干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
力達(dá)霉素(lidamycin，LDM，又稱C1027)是從我國(guó)湖北潛江縣土壤分離得到的一株放線菌(Streptomyces globisporu，s菌種保藏號(hào)為CGMCC No.0704)產(chǎn)生的對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈殺傷作用的大分子肽類抗腫瘤抗生素。體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)表明，LDM對(duì)小鼠結(jié)腸癌26，移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲腸癌Hce-8693等多種腫瘤均有顯著療效(中國(guó)抗生素雜志1994，19(2)164-168)。LDM包括兩個(gè)部分一部分為烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)(activeenediyne，AE)，具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，但是不穩(wěn)定；另一部分為110個(gè)氨基酸殘基組成的輔基蛋白(lidaprotein，LDP)，對(duì)發(fā)色團(tuán)的穩(wěn)定性起保護(hù)作用。發(fā)色團(tuán)與輔基蛋白通過非共價(jià)鍵結(jié)合，兩者結(jié)合是特異的，并且經(jīng)過拆分后可以重建(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)2001，23(6)563-567)。力達(dá)霉素具有獨(dú)特的可拆分重建的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，便于DNA重組以及分子強(qiáng)化；另一方面，LDM輔基蛋白LDP分子量只有10.5kDa，當(dāng)LDP與不同來源的生長(zhǎng)因子制備得到的融合蛋白，其分子量?jī)H為15-20kDa，將大大低于目前已知的其它免疫毒素融合蛋白。本發(fā)明構(gòu)建的以力達(dá)霉素為“彈頭”藥物，以EGFR靶向特異性結(jié)合短肽SG為“載體”的高效、小型化的強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE，迄今尚未見有相關(guān)報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤藥物強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE。
本發(fā)明的另一目的在于提供所說強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE制備方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高融和蛋白的效果，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)“載體”和“彈頭”進(jìn)行了研究和選擇，所用的“彈頭”藥物是力達(dá)霉素；選用的EGFR靶向特異性結(jié)合短肽SG是在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，將與EGFR特異結(jié)合的短肽GE7基因序列的上游加入一段大腸桿菌分泌表達(dá)信號(hào)肽基因片段，在此基因片段和短肽片段之間引入一個(gè)酶切位點(diǎn)NcoI。其中所述短肽GE7是依據(jù)配體和受體相互結(jié)合的原理，采用電腦圖象模擬設(shè)計(jì)合成的，它可與表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞特異結(jié)合(《中國(guó)科學(xué)(C輯)》1998，28(6)554-562)。在表達(dá)載體進(jìn)行分泌表達(dá)時(shí)，切除信號(hào)肽后在短肽GE7的N端留下兩個(gè)氨基酸Met和Ala，從而得到短肽SG。該短肽是第一個(gè)用于與力達(dá)霉素融合的EGFR靶向特異性結(jié)合短肽，可以為探索新物種靶點(diǎn)特異性結(jié)合片段應(yīng)用方面作出貢獻(xiàn)。
本發(fā)明所說的強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE是由EGFR靶向結(jié)合的短肽SG、力達(dá)霉素輔基蛋白LDP和羧基端的組氨酸六聚體尾形成的融合蛋白SG-LDP(分子量約為13.9kDa)與活化型烯二炔發(fā)色團(tuán)AE(分子量為843Da)構(gòu)成的，編碼SG-LDP的基因全長(zhǎng)492bp，編碼141個(gè)氨基酸。其中SG基因全長(zhǎng)54bp，編碼18個(gè)氨基酸(在SG基因前有66bp的信號(hào)肽基因序列)；LDP基因全長(zhǎng)330bp，編碼110個(gè)氨基酸；二者之間的柔性肽基因15bp，編碼5個(gè)氨基酸；羧基端的組氨酸六聚體尾基因?yàn)?8bp，編碼6個(gè)氨基酸；SG-LDP基因和羧基端的組氨酸六聚體尾基因之間的XhoI酶切位點(diǎn)基因?yàn)?bp，編碼2個(gè)氨基酸，終止密碼子為3bp。
具體步驟如下A.EGFR靶向結(jié)合的短肽SG與力達(dá)霉素輔基蛋白LDP的融合基因構(gòu)建含EGFR靶向結(jié)合的短肽SG與力達(dá)霉素輔基蛋白LDP融合基因的表達(dá)載體pET30SGLDP的構(gòu)建，是運(yùn)用基因工程技術(shù)，分別克隆得到EGFR靶向結(jié)合的短肽SG基因和力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因，將二者與編碼一段柔性小肽的DNA序列相連構(gòu)建成SG-spacer-LDP形式的融合基因，同時(shí)在SG基因前引入一段信號(hào)肽序列，該信號(hào)肽序列之后引入特異性酶切位點(diǎn)。
B.融合蛋白大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pET30SGLDP的構(gòu)建將融合基因克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30SGLDP。
C.融合蛋白SG-LDP在大腸桿菌pET30SGLDP(保藏編號(hào)CGMCC No.1320)中的誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白SG-LDP在大腸桿菌BL21(DE3)starTM中的誘導(dǎo)表達(dá)包括將pET30SGLDP轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得分泌型活性融合蛋白SG-LDP。
D.融合蛋白SG-LDP的親和層析純化及分離融合蛋白SG-LDP的親和層析純化及其分離制備是通過親和層析純化融合蛋白SG-LDP，再進(jìn)行透析，濃縮，制備功能性融合蛋白。
E.強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE的制備及分離強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE的制備分離，是將純化分離得到的融合蛋白SG-LDP與經(jīng)甲醇提取制備的力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)的活性型烯二炔AE，以分子比為50∶1和強(qiáng)化時(shí)間為12小時(shí)，室溫下進(jìn)行分子強(qiáng)化，獲得強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE。
通過融合蛋白SG-LDP對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的免疫學(xué)活性檢測(cè)以及強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用檢測(cè)結(jié)果表明，強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE在治療腫瘤的應(yīng)用中優(yōu)選治療EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞或Her2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。
EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞包括人肝癌Bel-7402，人口腔鱗狀上皮KB細(xì)胞，人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，子宮頸癌HeLa等細(xì)胞。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果在于，所說強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE穩(wěn)定性好，不易脫落，可以應(yīng)用基因工程手段進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。以EGFR靶向結(jié)合的短肽為載體，分子量小，免疫原性弱，不易引起人體對(duì)外源抗體的免疫反應(yīng)，副作用小，同時(shí)短肽作為靶受體的配基，對(duì)實(shí)體瘤的滲透力強(qiáng)，有助于迅速到達(dá)靶腫瘤細(xì)胞，充分發(fā)揮力達(dá)霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)烈殺傷作用。本發(fā)明的強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE是一種新型高效小型化的靶向藥物，是第一個(gè)將EGFR靶向結(jié)合的短肽SG用于與力達(dá)霉素融合的抗腫瘤靶向藥物，該融合蛋白的腫瘤靶向性好，具有良好的臨床應(yīng)用前景。


圖1重組質(zhì)粒pET-GLDP的限制性內(nèi)切酶分析其中1.DNA Marker DL15000 2.pET-30a(+)3.pET-GLDP 4.pET-30a(+)/NdeI+XhoI5.pET-GLDP/NdeI+XhoI6.PCR擴(kuò)增的GLDPgene7.DNA Marker DL2000圖2重組質(zhì)粒pET-SGLDP的限制性內(nèi)切酶分析其中1.MarkerDL15000+2000 2.PCR擴(kuò)增的SGLDP gene3.pET-30a(+)/NdeI+XhoI 4.pET-30a(+)5.pET-SGLDP/NdeI+XhoI 6.pET-SGLDP圖3表達(dá)載體pET-SGELDP在大腸桿菌BL21(DE3)starTM中誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析其中1.空載體誘導(dǎo)前全菌蛋白組分2.空載體誘導(dǎo)后全菌蛋白組分3.37℃表達(dá)菌株誘導(dǎo)后全菌蛋白組分4.28℃表達(dá)菌株誘導(dǎo)后全菌蛋白組分5.蛋白Marker(分子量分別為97.4kDa，66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14.4kDa)6.空載體誘導(dǎo)前培養(yǎng)基中蛋白組分7.空載體誘導(dǎo)后培養(yǎng)基中蛋白組分8.37℃表達(dá)菌株誘導(dǎo)后培養(yǎng)基中蛋白組分9.28℃表達(dá)菌株誘導(dǎo)后培養(yǎng)基中蛋白組分圖4表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-blot分析其中1.蛋白Marker(分子量分別為97.4kDa，66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14.4kDa)2.誘導(dǎo)前細(xì)胞全菌蛋白組分3.誘導(dǎo)前培養(yǎng)基中蛋白組分4.誘導(dǎo)后細(xì)胞全菌蛋白組分5.誘導(dǎo)后培養(yǎng)基中蛋白組分6.周質(zhì)空間蛋白組分7.可溶蛋白組分8.不可溶蛋白組分圖5金屬螯合層析分離純化融合蛋白SG-LDP的SDS-PAGE分析其中1.蛋白Marker(分子量分別為97.4kDa，66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14.4kDa)2.誘導(dǎo)后培養(yǎng)基中蛋白組分3.硫酸銨沉淀后透析后樣品4.未結(jié)合組分5.第一次洗滌組分6.第二次洗滌組分7.第一次洗脫組分8.第二次洗脫組分9.第三次洗脫組分圖6ASG-LDP對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的免疫結(jié)合活性分析其中◆Bel-7402 ■MCF-7△MCF-7/Her2×KB*Hela ●HT-29圖6BLDP對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的免疫結(jié)合活性分析其中◆Bel-7402 ■MCF-7△MCF-7/Her2×KB*Hela ●HT-29圖7強(qiáng)化融合蛋白對(duì)Bel-7402細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用其中■LDM◆SG-LDP-AE◆圖8ALDM對(duì)MCF-7細(xì)胞體外細(xì)胞毒作用其中■MCF-7◆MCF-7/Her2圖8B強(qiáng)化融合蛋白對(duì)MCF-7/Her2細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用其中■MCF-7◆MCF-7/Her2◆
圖9強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE對(duì)小鼠肝癌H22的生長(zhǎng)抑制作用其中◆對(duì)照 ■SG-LDP-AE 0.2mg/kg△SG-LDP-AE 0.4mg/kg×SG-LDP-AE 0.8mg/kg*LDM 0.05mg/kg ●SG-LDP 1.6mg/kg|MMC 1mg/kg實(shí)施方式以下所舉實(shí)施例，對(duì)于本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的。
實(shí)施例1.含EGFR靶向結(jié)合的短肽SG/力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因的表達(dá)載體pET30SGLDP的構(gòu)建L1上游5’GACAT ATGAAC CCC GTG GTG GGC TAC ATC GGT GAA CGT CCT CAGNde ITAT CGT GAC CTG GGT GGA GGC GGT TCA GCG CCC GCC TTC TCC GTC3’R1下游5’GTTACTC GAGGCC GAA GGT CAG AGC CAC GTG3’Xho IL2上游5’GAATCCACAT ATGAAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTGNde ICTG CTC CTC GCT GCC CAG CCG GCG ATG GCC ATG GCC AAC CCC GTGGTG GGC TAC3’R2下游5’GTTACTC GAGGCC GAA GGT CAG AGC CAC GTG3’Xho I以質(zhì)粒pIJ1027GRGDS(含有LDP基因，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)室可向公眾提供并出具相關(guān)證明)為模板，以引物L(fēng)1和R1(上海生物工程公司合成)按常規(guī)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)約0.4kb的GLDP基因片段。將PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物GLDP進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)染色后用BioDev公司的玻璃奶試劑盒回收GLDP基因片段。將此基因片段用Nde I/XhoI雙酶切用T4DNA連接酶和經(jīng)過Nde I/Xho I雙酶切的質(zhì)粒pET-30a(+)連接得到質(zhì)粒pET30GLDP，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)后挑取單克隆，小量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行Nde I/Xho I雙酶切鑒定(圖1)。將能切下約0.4kb基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3)starTM(Invitrogen公司產(chǎn)品)的感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子并提取轉(zhuǎn)化子。用T7通用引物測(cè)序，結(jié)果表明，該融合基因與預(yù)期相符(上海博雅北京分公司進(jìn)行序列測(cè)定)。
以質(zhì)粒pET30GLDP為模板，以引物L(fēng)2和R2(上海生物工程公司合成)按常規(guī)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，得到長(zhǎng)約0.5kb的SG-LDP基因片段。其余操作同上，得到表達(dá)質(zhì)粒pET30SGLDP，進(jìn)行酶切鑒定(圖2)。將能切下約0.5kb基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3)starTM(Invitrogen公司產(chǎn)品)的感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子并提取轉(zhuǎn)化子。用T7通用引物測(cè)序，結(jié)果表明，該融合基因與預(yù)期相符(上海博雅北京分公司進(jìn)行序列測(cè)定)。SG基因全長(zhǎng)54bp，編碼18個(gè)氨基酸(在SG基因前有66bp的信號(hào)肽基因序列)；LDP基因全長(zhǎng)330bp，編碼110個(gè)氨基酸；二者之間的柔性肽基因15bp，編碼5個(gè)氨基酸；羧基端的組氨酸六聚體尾基因?yàn)?8bp，編碼6個(gè)氨基酸；SG-LDP基因和羧基端的組氨酸六聚體尾基因之間的XhoI酶切位點(diǎn)基因?yàn)?bp，編碼2個(gè)氨基酸。本發(fā)明使用的表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)，在其多克隆位點(diǎn)的3’端融合有一段編碼組氨酸六聚尾(His×6-Tag)的基因序列，經(jīng)翻譯表達(dá)后，His×6-Tag便于融合蛋白的表達(dá)鑒定和分離純化。
實(shí)施例2.融合蛋白SG-LDP在大腸桿菌BL21(DE3)starTM中的誘導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明使用的表達(dá)載體是大腸桿菌表達(dá)體系E.coli BL21(DE3)starTM，為Invitrogen公司產(chǎn)品。以構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)starTM獲得重組轉(zhuǎn)化菌，從LB平板上挑取單克隆菌落接種到含50μg/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日按2-3％接種量轉(zhuǎn)種，37℃，振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600約0.8-1.0，向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.05mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo)8個(gè)小時(shí)。15％的SDS-PAGE分析結(jié)果(圖3)表明，在培養(yǎng)液中經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌約14kDa處有明顯的外源蛋白表達(dá)條帶，表達(dá)量占培養(yǎng)基組分的70％以上，而培養(yǎng)液中未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體則無此帶，細(xì)胞漿中也有少量的外源蛋白的表達(dá)。說明表達(dá)的蛋白主要存在于培養(yǎng)液上清中。在37℃和28℃的誘導(dǎo)溫度下均有外源蛋白的表達(dá)，且在37℃的誘導(dǎo)溫度下表達(dá)量比28℃的誘導(dǎo)溫度下表達(dá)量高。然后分別從全菌蛋白、培養(yǎng)液上清、細(xì)胞周質(zhì)、胞漿中制備樣品，同時(shí)以帶空載體的pET-30a的菌株的樣品和未進(jìn)行誘導(dǎo)的重組表達(dá)菌體樣品作為陰性對(duì)照。進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)(圖4)(半干電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)條件為恒電流0.85mA/cm2，時(shí)間約2小時(shí))。一抗為抗His-Tag單抗(Novagen公司產(chǎn)品)，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Santa Cruz公司產(chǎn)品)，進(jìn)行顯色反應(yīng)(Western Blotting Luminol Reagent為Santa Cruz公司產(chǎn)品)，也證實(shí)在14kDa處有帶his-tag尾的外源蛋白的表達(dá)，并且外源蛋白主要在培養(yǎng)液上清中表達(dá)。將最終挑選出的最優(yōu)表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)化菌株，其中含有能表達(dá)融合蛋白SG-LDP的質(zhì)粒pET30SGLDP，命名為pET30SGLDP，于2005年3月3日送交位于北京的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)1320。
實(shí)施例3.融合蛋白SG-LDP的親和層析純化及其分離制備收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體發(fā)酵液上清，以113g/L的濃度在4℃，緩慢攪拌的條件下加入硫酸銨。4℃靜止放置1小時(shí)，4℃，10000g離心20分鐘，收集上清。將上清在4℃，緩慢攪拌的條件下加入硫酸銨，使其終濃度為390g/L。4℃靜止放置半小時(shí)，4℃，10000g離心20分鐘，收集沉淀。每100ml發(fā)酵液所得沉淀用2ml 1×Ni-NTA Binding Buffer(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole，pH8.0)溶解后用相同溶液透析。
將Ni-NTA His-Bind樹脂(Novagen)裝入層析柱中，用1×Ni-NTA Binding Buffer平衡將透析后的樣品用0.45um的濾膜過濾后緩慢加入層析柱中。收集流出液，流速為10-15ml/小時(shí)；用8倍柱床體積的1×Ni-NTA Binding Buffer洗滌層析柱，收集流出液，流速為20-30ml/小時(shí)；用4倍柱床體積的1×Ni-NTA Elution Buffer(50mM NaH2PO4，300mMNaCl，200mM imidazole，pH8.0)洗脫結(jié)合到層析柱上的目的蛋白，收集流出液，流速為10-15ml/小時(shí)；將各部分流出液各取50ul和50ul 2×上樣緩沖溶液(100mM Tris-HCl，pH6.8，4％SDS，5％2-ME，20％甘油，0.2％溴酚蘭)混合沸水浴5分鐘以變性蛋白，-20℃保存以備電泳分析。進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖5)。收集含目的蛋白的洗脫液，將含目的蛋白的洗脫液用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4pH7.4)溶液透析，再經(jīng)超濾濃縮得到高濃度的目的蛋白。
實(shí)施例4.強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE的制備分離取LDM凍干品(專利申請(qǐng)?zhí)?01215272，公開號(hào)1284566)10mg，加5ml冷甲醇振搖5分鐘，-20℃放置1小時(shí)，中間振搖1次，在0℃，12000rpm/min，離心20分鐘，上清液富含AE，沉降物為肽鏈，重復(fù)提取2次。自然蒸發(fā)濃縮甲醇溶液，上述操作需要在4℃、避光條件下進(jìn)行。取一定體積和濃度的SG-LDP溶于0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，加5倍分子量的AE甲醇溶液(體積比50∶1)，混和振搖，室溫放置12小時(shí)，將混和液以PD-10柱(商業(yè)化的Sephadex G-25柱，Pharmacia產(chǎn)品)層析分離，經(jīng)A280nm紫外監(jiān)測(cè)后棄過量未結(jié)合的AE，收集強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE。
實(shí)施例5.融合蛋白SG-LDP的免疫學(xué)活性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞按照2×104個(gè)/孔的密度鋪96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)4℃預(yù)冷0.05％戊二醛固定15分鐘、1％的BSA封閉后，每孔加入倍比稀釋的融合蛋白，37℃孵育1-2小時(shí)后，先后用抗His抗體為一抗(Novagen公司產(chǎn)品，1∶2000倍稀釋)，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體為二抗(Santa Cruz公司產(chǎn)品，1∶2500倍稀釋)37℃分別孵育半小時(shí)后，每孔加入100μl OPD底物反應(yīng)液(鄰苯二胺∶底物緩沖液∶H2O2＝4mg∶10ml∶15ul)暗處進(jìn)行顯色10分鐘，酶標(biāo)儀測(cè)定492nm處吸光值。結(jié)果表明，靶向融合蛋白SG-LDP和不同的高水平表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞如KB，7402，HeLa，HT-29等都有較強(qiáng)的免疫結(jié)合活性，而力達(dá)霉素輔基蛋白LDP對(duì)上述腫瘤細(xì)胞幾乎沒有免疫結(jié)合活性(圖6A，6B)。
實(shí)施例6.強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的MTT檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，3×103個(gè)/孔鋪于96井板，在37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后吸棄上清，加入以RPMI1640稀釋的不同濃度的藥物，200ul/井，每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)平行井。繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后，每井加入以PBS溶解的MTT(2mg/ml)50ul，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，吸棄上清，加入150ul DMSO，室溫下?lián)u床振搖15分鐘，酶標(biāo)儀上測(cè)定560nm的光吸收值。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)無藥對(duì)照井和無細(xì)胞空白井各3井。按下列公式計(jì)算細(xì)胞的存活率及樣品的IC50值。
結(jié)果表明，SG-LDP-AE對(duì)高表達(dá)EGFR的KB，7402，HeLa，HT-29等腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用，IC50值分別為8.9×10-11M、4.04×10-11M、1.14×10-9M、1.19×10-9M(圖7)，而LDM的IC50分別為3.66×10-11M、6.98×10-12M、1.74×10-10M、1.92×10-10M，和LDM相比，其IC50略高，其原因?yàn)镾G-LDP-AE體外的發(fā)色團(tuán)包裝效率要比天然的LDM的發(fā)色團(tuán)包裝效率差。
對(duì)低表達(dá)EGFR的MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染Her2基因后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒作用，以未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)LDM對(duì)兩株瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用變化不大(圖8A)，其IC50值分別為1.02×10-10(轉(zhuǎn)染前)和6.6×10-11(轉(zhuǎn)染后)；而SG-LDP-AE對(duì)轉(zhuǎn)染Her2基因后的MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用要比未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用強(qiáng)(圖8B)，其IC50值分別為3.42×10-9(轉(zhuǎn)染前)和5.6×10-11(轉(zhuǎn)染后)，提示SG-LDP-AE可能對(duì)高表達(dá)Her2的腫瘤細(xì)胞也具有潛在的協(xié)同作用，而使其對(duì)高表達(dá)Her2的腫瘤細(xì)胞更敏感。
實(shí)施例7.強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE的動(dòng)物試驗(yàn)性治療方案根據(jù)劑量初篩結(jié)果，設(shè)計(jì)動(dòng)物試驗(yàn)治療的給藥方式和劑量。取體重為18-22g的昆明小鼠60只，隨機(jī)分組，每組10只。取小鼠肝癌H22腹水，以生理鹽水稀釋成細(xì)胞數(shù)為7.5×106個(gè)/ml，0.2ml/只，接種于昆明小鼠腋窩皮下。種瘤一天后，對(duì)照組靜脈注射生理鹽水，其余各組分別給予SG-LDP-AE，LDM，SG-LDP，絲裂霉素(MMC)。均為尾靜脈注射，0.2ml/只。實(shí)驗(yàn)期間，每3天測(cè)量一次腫瘤長(zhǎng)徑a和腫瘤短徑b，并記錄動(dòng)物體重。以公式V＝1/2ab2計(jì)算瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算抑制率。如圖9，表1所示。
表1.強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE對(duì)小鼠肝癌H22的生長(zhǎng)抑制作用(實(shí)驗(yàn)第21天)GroupDose No.of miceBody wt.(g) Tumor-size(cm3)Inhibition(mg/kg)Start/end Start/endX±s rate(％)
Control - 10/1040.6398.74±5.40 -LDM 0.0510/1030.4830.98±1.21 88.8**SG-LDP-AE0.8 10/1025.4620.36±0.66 95.8**0.4 10/1029.8291.81±2.05 79.3*SG-LDP 1.6 10/1039.5336.39±3.24 26.9MMC 1 10/1036.1575.82±4.06 33.4*P＜0.05 vs.control；**P＜0.01 vs.control。
試驗(yàn)A第21天的結(jié)果表明(表1)，強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE體內(nèi)有顯著療效，在0.4mg/kg、0.8mg/kg劑量，可明顯抑制H22皮下瘤的生長(zhǎng)，從(圖9)中可以看到，SG-LDP-AE在0.8mg/kg劑量時(shí)療效尤其顯著，其第21天的抑制率達(dá)到95.8％。
序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所<120>表皮生長(zhǎng)因子受體靶向短肽與力達(dá)霉素構(gòu)成的抗腫瘤基因工程融合蛋白<140>
<141>
<160>2<170>
<210>1<211>492<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(1)…(66)<223>
<400>1atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60atggccatgg cgaaccccgt ggtgggctac atcggtgaac gtcctcagta tcgtgacctg120ggtggaggcg gttcagcgcc cgccttctcc gtcagtcccg cctcgggtct gagtgacgga180cagagcgtgt cggtgtcggt cagcggtgcc gccgccggcg agacctacta catcgcccag240tgcgctccgg tcggtggcca ggacgcgtgc aacccggcga ccgcgacgtc cttcaccacg300gacgcgtccg gagcggcgtc gttcagcttc gtcgtgcgca agtcgtacac gggctccacg360cccgaaggca cgccggtcgg cagcgtcgac tgcgccacgg ccgcctgtaa cctcggcgcc420ggcaactccg ggctcgacct cggccacgtg gctctgacct tcggcctcga gcaccaccac480caccaccact ga492<210>2<211>141<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>
<223>
<400>2
atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc45Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leugct gcc cag ccg gcg atg gcc atg gcg aac ccc gtg gtg ggc tac90Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Asn Pro Val Val Gly Tyr1 5atc ggt gaa cgt cct cag tat cgt gac ctg ggt gga ggc ggt tca135Ile Gly Glu Arg Pro Gln Tyr Arg Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser10 15 20gcg ccc gcc ttc tcc gtc agt ccc gcc tcg ggt ctg agt gac gga180Ala Pro Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp Gly25 30 35cag agc gtg tcg gtg tcg gtc agc ggt gcc gcc gcc ggc gag acc225Gln Ser Val Ser Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr40 45 50tac tac atc gcc cag tgc gct ccg gtc ggt ggc cag gac gcg tgc270Tyr Tyr Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys55 60 65aac ccg gcg acc gcg acg tcc ttc acc acg gac gcg tcc gga gcg315Asn Pro Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala70 75 80gcg tcg ttc agc ttc gtc gtg cgc aag tcg tac acg ggc tcc acg360Ala Ser Phe Ser Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr85 90 95ccc gaa ggc acg ccg gtc ggc agc gtc gac tgc gcc acg gcc gcc405Pro Glu Gly Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala100 105 110tgt aac ctc ggc gcc ggc aac tcc ggg ctc gac ctc ggc cac gtg450Cys Asn Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly Leu Asp Leu Gly His Vak115 120 125gct ctg acc ttc ggc ctc gag cac cac cac cac cac cac tga492Ala Leu Thr Phe Gly Leu Glu His His His His His His130 135 140
權(quán)利要求
1.一種強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE，其特征在于它是由與表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR靶向結(jié)合的短肽SG、力達(dá)霉素輔基蛋白LDP和羧基端組氨酸六聚體尾形成的分子量為13.9kDa的融合蛋白SG-LDP以及分子量為843Da的活化型烯二炔發(fā)色團(tuán)AE構(gòu)成的，SG-LDP基因全長(zhǎng)492bp，編碼141個(gè)氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE，其特征在于其中的SG基因全長(zhǎng)54bp，編碼18個(gè)氨基酸，在SG基因前有66bp的信號(hào)肽基因序列；LDP基因全長(zhǎng)330bp，編碼110個(gè)氨基酸；二者之間的柔性肽基因15bp，編碼5個(gè)氨基酸；羧基端的組氨酸六聚體尾基因?yàn)?8bp，編碼6個(gè)氨基酸；SG-LDP基因和羧基端的組氨酸六聚體尾基因之間的XhoI酶切位點(diǎn)基因?yàn)?bp，編碼2個(gè)氨基酸，終止密碼子為3bp。
3.一種制備如權(quán)利要求1所述強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE的方法，其特征在于所說方法主要采用DNA重組和分子強(qiáng)化的技術(shù)路線，具體步驟如下A.EGFR靶向結(jié)合的短肽SG與力達(dá)霉素輔基蛋白LDP的融合基因構(gòu)建；B.融合蛋白大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pET30SGLDP的構(gòu)建；C.融合蛋白SG-LDP在保藏編號(hào)為CGMCC No.1320的大腸桿菌pET30SGLDP中的誘導(dǎo)表達(dá)；D.融合蛋白SG-LDP的親和層析純化及分離；E.強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE的制備及分離。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是步驟A中SG基因前運(yùn)用基因工程技術(shù)引入一段信號(hào)肽序列。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是步驟A中運(yùn)用基因工程技術(shù)分別克隆得到EGFR靶向結(jié)合的短肽SG基因和力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因，將二者與編碼一段柔性小肽的DNA序列相連構(gòu)建成SG-spacer-LDP形式的融合基因，同時(shí)在SG基因前的信號(hào)肽序列后引入特異性酶切位點(diǎn)。
6.如權(quán)利要求3或5所述的制備方法，其特征是步驟B中將所得到的融合基因克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30SGLDP。
7.如權(quán)利要求3或6所述的制備方法，其特征是將pET30SGLDP轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得分泌型活性融合蛋白SG-LDP。
8.如權(quán)利要求3或7所述的制備方法，其特征是通過親和層析純化融合蛋白SG-LDP，再進(jìn)行透析，濃縮，制備功能性融合蛋白。
9.如權(quán)利要求3或8所述的制備方法，其特征是將純化分離得到的融合蛋白SG-LDP與經(jīng)甲醇提取制備的力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)的活性型烯二炔AE，以分子比為50∶1和強(qiáng)化時(shí)間為12小時(shí)，室溫下進(jìn)行分子強(qiáng)化，獲得強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE。
10.強(qiáng)化融合蛋白SG-LDP-AE在制備新型抗腫瘤靶向藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種強(qiáng)化的基因工程融合蛋白SG－LDP－AE，其主要通過融合蛋白的基因工程構(gòu)建和分子強(qiáng)化兩步技術(shù)路線制備而成，所說融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用，在體外能與表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，其對(duì)小鼠移植性肝癌H22有非常顯著的療效，使用可耐受劑量，其抑制率可達(dá)95.8％(p＜0.001)，顯示了靶向藥物的小型化與高效化的特點(diǎn)，可望成為一種用于臨床治療腫瘤的新型靶向藥物。
文檔編號(hào)C07K14/005GK1687119SQ200510056489
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月24日
發(fā)明者陳紅霞, 甄永蘇, 師以康, 尚伯楊 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所