專(zhuān)利名稱(chēng)：逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法。
背景技術(shù)：
柿科(the family Ebenaceae)柿屬植物，全世界總共有240多種，它們主要廣泛地分布于熱帶有亞熱帶地區(qū)，溫帶偶有分布。我國(guó)大約有56種，產(chǎn)于西南部至東南部，北至遼寧(侯寬昭編，中國(guó)種子植物科屬詞典，第二版，北京科技出版社，1984，159)。此發(fā)明所用柿葉，是柿樹(shù)的干燥葉，其味苦、酸、澀，性涼，具有清肺止咳、涼血、降血壓之功效。主要用于咳喘、肺氣腫、各種內(nèi)出血、高血壓等病癥?，F(xiàn)代研究表明，柿葉含有豐富的黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)、樹(shù)脂、維生素C、內(nèi)脂香豆素類(lèi)、揮發(fā)油及熊果酸、齊墩果酸等三萜酸，世界各地的柿葉都含有豐富的熊果酸及其衍生物(Row L.Ramachandra et al，IndianJournal of chemistry，1969，7204-206；Mallavadhani U.V.et al，Biochemical Systematics and Ecology，1998，26941-942；Mallavadhani U.V.et al，Pharmaceutical Biology，2001，39(1)20-24；Mallavadhani U.V.et al，Biochemical Systematics and Ecology，1998，26941-942；陳光等，中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2000，10(4)298-299；陳光等，2005，36(1)26-28)。
柿葉中熊果酸及其衍生物具有廣泛的用途，如用于醫(yī)藥，化妝品等。熊果酸可以抗高血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化等作用(Somova L.I.et al，Journalof Ethnopharmacology，2003，84299-305)，且它對(duì)多種致癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒、誘導(dǎo)分化及抗血管形成作用，其防癌抗癌作用已引起重視，成為現(xiàn)代腫瘤藥研究的新熱點(diǎn)(Chiang Lien-Chai et al，The American Journal of ChineseMedicine，2003，31(1)37-46；夏國(guó)豪等，國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè)，2002，29(6)420-422)，熊果酸也有可能成為抗HIV的潛在藥物(QuéréLuc et al，Biochemicai and Biophysical Research Communications1996，227484-488)。柿葉熊果酸的衍生物也具有消炎(Kusakari Takeshi et al，日本專(zhuān)利，JP 2004010531 A2 20040115)(Maria del Carmen Recio et al，PlantaMedica，1995，619-12.)以及能抑制人體內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞中過(guò)氧化物的產(chǎn)生，使之具有潛在的藥用價(jià)值(Chen Guang et al，Clinica Chimica Acta2002，32011-16)，等等?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道采用柱層析及高效液相色譜的方法分離，但純度不高，回收率很低。高速逆流色譜(High-speed countercurrentchromatography，HSCCC)是近些年發(fā)展起來(lái)的一種連續(xù)的無(wú)需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色說(shuō)分離技術(shù)，它避免了固態(tài)支持體或載體帶來(lái)的各種問(wèn)題如樣品易被吸附、損耗和變性，使用其它液相色譜法進(jìn)行制備量分離時(shí)，其分配效率會(huì)明顯降低，溶劑消耗量大，HSCCC保證較高峰形分辨度，分離量大、樣品無(wú)損失、損失收率高、分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。逆流色譜儀能直接進(jìn)大量粗提樣品或合成混合物，分離結(jié)果能達(dá)到相當(dāng)高的純度，已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域化學(xué)物質(zhì)的制備分離和純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法。
方法的步驟如下1)采用烷烴∶脂肪酯∶脂肪醇∶水的體積比為1-10∶1-20∶1-10∶1-10的溶劑系統(tǒng)；柿葉的提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；2)按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)；3)用上相作固定相，下相作流動(dòng)相或用下相作固定相，上相作流動(dòng)相；用上相作為固定相，充滿整個(gè)逆流色譜儀中的色譜柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為200-2000rmp，以1.0-10.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)進(jìn)行洗脫；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；用下相作為固定相，充滿整個(gè)逆流色譜柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為200-2000rmp，以1.0-10.0mL/min的流速將上相流動(dòng)相從柱子的尾端泵入柱內(nèi)進(jìn)行洗脫；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；4)根據(jù)檢測(cè)器的譜圖或薄層層析檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。
所述的烷烴為正己烷、異己烷、正戊烷、異戊烷、正庚烷、異庚烷、正辛烷、異辛烷或石油醚的一種或幾種的混合物。脂肪酯為乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯或乙酸正丁酯的一種或幾種的混合物。脂肪醇為乙醇或甲醇的一種或兩種的混合物。
熊果酸衍生物為3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸或3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸中任一種或幾種。
泵入柱內(nèi)進(jìn)行洗脫為等梯度洗脫或逐漸改變配比進(jìn)行梯度洗脫。薄層層析檢測(cè)采用正相硅膠薄層層析板，展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮的體積比為4-8∶2-6∶1-3、甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸的體積比為12∶4∶0.5、苯∶酸乙酯∶乙酸的體積比為12∶4∶0.5。逆流色譜儀是分析型、半制備型或制備型。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所用柿葉在我國(guó)分布廣泛，往往被當(dāng)作廢料扔掉或燒掉，因此本發(fā)明柿葉原料易得；所用各種化學(xué)試劑都很常見(jiàn)，容易大批量購(gòu)買(mǎi)；本分離過(guò)程能連續(xù)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，效率高，熊果酸及其衍生物純度大于98％；與柱層析等色譜方法比較，它不用任何固態(tài)的支持物或載體，因此不存在固態(tài)載體所造成的樣品吸附損耗、玷污和變性等問(wèn)題，是一種經(jīng)濟(jì)的從柿葉粗提物中分離制備高純度熊果酸及其衍生物的方法；能直接進(jìn)大量的柿葉粗提物或合成混合物；適合于各種型號(hào)的逆流色譜儀分離制備熊果酸及其衍生物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料，(柿葉的乙酸乙酯提取物的提取方法見(jiàn)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮镃N200410025770.8的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng))；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相作為固定相，充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為450rmp，以5.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶2)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6m，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例2
采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶6∶5∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的二氯甲烷提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在半制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用下相作為固定相，充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為750rmp，以3.0mL/min的流速將上相流動(dòng)相從柱子的尾端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸＝12∶4∶0.5)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝7∶3(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例3采用石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的丙酮提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在分析型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為2000rmp，以1.0mL/min的流速將流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為苯乙酸乙酯∶乙酸＝12∶4∶0.5)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝9∶1(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例4采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝4∶7∶4∶3(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的二氯甲烷提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為500rmp，以5.0mL/min的流速將流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝8∶6∶3)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝7∶3(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例5采用正庚烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶7∶5∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的三氯甲烷提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為550rmp，以5.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝8∶6∶3)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例6采用正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水＝3∶5∶4∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的二氯乙烷提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為400rmp，以5.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶2∶1)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例7采用環(huán)己烷∶乙酸丙酯∶甲醇∶水＝5∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的四氯甲烷提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為450rmp，以5.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶2)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例8采用正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水＝1∶1∶2∶1(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為550rmp，以4.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶2)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝7.8∶2.2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例9
采用正辛烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為450rmp，以3.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶2)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例10采用正己烷∶乙酸丁酯∶甲醇∶水＝3∶7∶4∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用下相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為600rmp，以10.0mL/min的流速將上相流動(dòng)相從柱子的尾端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝5∶3∶2)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例11采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶1∶2∶1(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為550rmp，以5.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝5∶2∶2)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例12采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶1∶1∶1(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為550rmp，以5.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝5∶2∶2)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例13采用正己烷和正庚烷1∶1的混合物、乙酸乙酯、甲醇和乙醇的1∶1混合物、水體積比為3∶6∶4∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用下相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為200rmp，以2.0mL/min的流速將上相流動(dòng)相從柱子的尾端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例14采用異己烷和正辛烷1∶1的混合物、乙酸乙酯和乙酸正丁酯1∶1的混合物、乙醇、水體積比為3∶7∶5∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為550rmp，以5.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例15采用異戊烷和異辛烷1∶1的混合物、乙酸丙酯和乙酸異丙酯1∶1的混合物、乙醇、水體積比為3∶6∶5∶2(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在分析型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用下相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為2000rmp，以5.0mL/min的流速將上相流動(dòng)相從柱子的尾端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例16
采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝10∶20∶9∶6(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在制備型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為200rmp，以2.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
實(shí)施例17采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝10∶19∶10∶10(v/v/v/v)的溶劑系統(tǒng)；柿葉的乙酸乙酯提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；在分析型HSCCC上進(jìn)行分離制備熊果酸及其衍生物。首先按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)。接著，先用上相為固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為2000rmp，以1.0mL/min的流速將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測(cè)器的譜圖及薄層層析方法(展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝4∶3∶1)檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。HPLC檢測(cè)分析條件色譜柱為L(zhǎng)ichrospher100RP-18HPLC柱(150mm×4.6mm，5μm，Merk)，柱溫25℃，洗脫液為甲醇∶磷酸水溶液＝8∶2(v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
權(quán)利要求
1.一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，方法的步驟如下1)采用烷烴∶脂肪酯∶脂肪醇∶水的體積比為1-10∶1-20∶1-10∶1-10的溶劑系統(tǒng)；柿葉的提取物經(jīng)精制、提純和結(jié)晶除去大部分熊果酸后，濾液蒸干所得固體為原料；2)按上述體積比配制溶劑系統(tǒng)置于分液漏斗中，搖勻后，靜置分層，等平衡一段時(shí)間后，將上、下相分開(kāi)；3)用上相作固定相，下相作流動(dòng)相或用下相作固定相，上相作流動(dòng)相；用上相作為固定相，充滿整個(gè)逆流色譜儀中的色譜柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，將下相流動(dòng)相從柱子的首端泵入柱內(nèi)進(jìn)行洗脫，待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；用下相作為固定相，充滿整個(gè)逆流色譜柱子，調(diào)整主機(jī)正轉(zhuǎn)，將上相流動(dòng)相從柱子的尾端泵入柱內(nèi)進(jìn)行洗脫；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；4)根據(jù)檢測(cè)器的譜圖或薄層層析檢測(cè)，經(jīng)重結(jié)晶分別得到熊果酸及其衍生物(3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸和3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述的烷烴為正己烷、異己烷、正戊烷、異戊烷、正庚烷、異庚烷、正辛烷、異辛烷或石油醚的一種或幾種的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述的脂肪酯為乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯或乙酸正丁酯的一種或幾種的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述的脂肪醇為乙醇或甲醇的一種或兩種的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的熊果酸衍生物為3α，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸、3β，19α，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸或3β，24-三羥基烏索-12-烯-28-酸中任一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述的泵入柱內(nèi)進(jìn)行洗脫為等梯度洗脫或逐漸改變配比進(jìn)行梯度洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的薄層層析檢測(cè)采用正相硅膠薄層層析板，展開(kāi)劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮的體積比為4-8∶2-6∶1-3、甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸的體積比為12∶4∶0.5、苯∶酸乙酯∶乙酸的體積比為12∶4∶0.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的逆流色譜儀是分析型、半制備型或制備型。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的主機(jī)轉(zhuǎn)速為200-2000rmp。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法，其特征在于所述的流動(dòng)相的流速為1.0-10.0mL/min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種逆流色譜法從柿葉中分離制備熊果酸及其衍生物的方法。方法步驟為1)配制構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的兩相溶劑系統(tǒng)；2)使逆流色譜儀柱子中充滿固定相；3)使逆流色譜儀的主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)；4)將流動(dòng)相泵入逆流色譜儀柱內(nèi)；5)由進(jìn)樣閥進(jìn)入原料，根據(jù)檢測(cè)器譜圖或薄層層析方法檢測(cè)獲得熊果酸及其衍生物。本方法適用于對(duì)各種途徑獲得的柿葉粗提物提純，適用于用各種型號(hào)的逆流色譜儀分離制備熊果酸、3α，19α，24－三羥基烏索－12－烯－28－酸、3β，19α，24－三羥基烏索－12－烯－28－酸和3β，24－三羥基烏索－12－烯－28－酸，純度可達(dá)到98％以上，能直接進(jìn)大量粗品或合成混合物，能達(dá)到很好的分離效果。
文檔編號(hào)C07J63/00GK1733794SQ20051006048
公開(kāi)日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月25日
發(fā)明者何潮洪, 范杰平 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)