專利名稱：：鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑用于恢復(fù)抗微生物肽的表達(dá)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：.本發(fā)明涉及使用鞘氨醇磷酸膽堿(sphingosylphosphorylcholine，SPC)拮抗劑用于例如在特應(yīng)性皮炎患者的皮膚中恢復(fù)抗微生物肽(AMP)的表達(dá)水平的方法、SPC拮抗劑在制備用于恢復(fù)AMP表達(dá)的藥物中的用途、以及迎過分析候選化合物恢復(fù)AMP的表達(dá)水平的能力篩選SPC拮抗劑的方法。
背景技術(shù)：
：鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)是溶性鞘脂(lysosphingolipid)家族成員，具有下式的N-脫酰鞘磷脂(N-deacylatedsphingomyeline)形式?；瘜W(xué)式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>SPC是通過SMN-脫酰酶從鞘磷脂(sphingomyelin,SM)生成的一種促分裂原(HiguchiKetal.，歷ocAe附./(2000),350,747-756)，并丘已知在C^+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放中發(fā)揮作用，也參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖(Desaietal.,Bzoc/ie肌5!'o//z".^饑Co/wwww.(1991),181,361-366)和凋亡(JeonESetal.,Bfoc/wm歷o//^4cto.(2005)，1734(1);25-33)。特別地，已證明SPC在各種細(xì)胞中影響細(xì)胞重建或細(xì)胞遷移。例如，化、形態(tài)發(fā)生和黑素原生成(Be堪eretal.，戶roc.JVarf.爿caof.5W.￡/,S.A(1995)，92，5885-5889)。最近一些報(bào)道已經(jīng)顯示1)在得自特應(yīng)性皮炎(AD)忠者的角質(zhì)層中SPC的表達(dá)與健康對(duì)照對(duì)象相比顯著增強(qiáng)(ReikoOkamotoetal.，Jowrwa/0/丄z》W及ejea/r/(2003)，44，93-102)，2)在AD患者的表皮中SM脫酰酶的活性異常地高(HiguchiKetal.,B/ocAe肌/(2000)，350747-756)，和3)—些皮膚屏障功能的病變是通過鞘磷脂酶合成酰胺的水平降低導(dǎo)致的(JunkoHaraetal.，/De/vw。to/.(2000)，115,406-413)。然而，迄今為止沒有關(guān)于增強(qiáng)的SPC農(nóng)達(dá)導(dǎo)致皮膚病(例如AD)的機(jī)制的報(bào)道?？刮⑸镫?AMP)是具有預(yù)防--些病原體(例如細(xì)菌、病毒和效-菌)感染的抗微生物活性的小分子量肽(GanzTetal.,C";rQp/"./m/mwo/.(1994)，6，584-589)。已證明AMP誘導(dǎo)血管發(fā)生、傷口愈合和趨化性(IzadpanahAetal"^m.y4cadDerwato/.(2005),52，381-390)，并具有帶正電和擁有親水性和疏水性殘基的結(jié)構(gòu)特征。近來，已經(jīng)確認(rèn)金黃色葡萄球菌(S.在患有AD的患者的炎癥皮膚中的異常生長(zhǎng)是由已知為AMP的人P-防衛(wèi)素(HBD-2)和Cathelicidin(LL-37)的表達(dá)降低導(dǎo)致的，特別地，HBD-2和LL-37在特應(yīng)性損傷中的表達(dá)水平顯著低于在銀屑病損傷中的表達(dá)水平(OngP.Y.etal.，WJ.Med(2002),347,1151-1160)。人防衛(wèi)素可根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征分為a和p防衛(wèi)素。a防衛(wèi)素是富含精氨酸的單體多肽，每種多肽由大約30-35個(gè)氨基酸組成，并且在人體中已經(jīng)鑒別了其6種同種型(HNP-1至4、HI>5和HD>6)。在p-防衛(wèi)素的情形中，每種多肽由大約41-50個(gè)氨基酸組成，并且在人血清中已經(jīng)通過生化手段鑒別了11種同種型(歷oc/;e/m'W7am/A/o/ecw/ar歷o/ogv;Vewj(2006)，1-7)，迄今為止通過人類基因組項(xiàng)目己經(jīng)鑒別了28個(gè)人P-防衛(wèi)素基因和43個(gè)小鼠p-防衛(wèi)素基因(B.C.Schutteetal.,尸raceWwgso/決eiVariowa/i4cacfe/w;yo/S"'e"c&s(2002)，99,2129-2133)。在這些已經(jīng)被報(bào)道在AD患者的皮膚中表達(dá)被抑制的人P-防衛(wèi)素(HBD)中，HBD-1主要在腎臟、女性生殖器官、呼吸器官、胰臟、牙齦、舌和鼓膜的上皮細(xì)胞中表達(dá)；而HBD-2在皮膚、肺、呼吸道、牙齦和鼓膜中表達(dá)，但是在泌尿器官(例如腎臟和膀胱)以及唾液腺「l，完全缺乏(J.Harderetal.,A^/MW(1997)，387,861)。另外，HBD-3在皮膚中表達(dá)，而HBD-4在男性生殖器官和胃中表達(dá)。HBD-1和HBD-3組成型表達(dá)；而大多數(shù)HBD(包括HBD-2和HBD-4)的表達(dá)是誘導(dǎo)型的，僅僅應(yīng)答特定條件例如感染(J.M.Schroderetal.，/wf./fi/oc/;e附.CW/歷o/.(1999)，31,645-651)。在這些誘導(dǎo)型HBD中，已經(jīng)提示HBD-2的表達(dá)被NF-kB通過MEK1/2-ERK1/2信號(hào)途徑上調(diào)(Tsutsumi-IshiiYetal.，/￡ew&c.歷o/.(2002)，71,154-162)，并被TNF-ct、IL-la、IL-卩或LPS增強(qiáng)(KWChaetal.,_/Va//.」cadScf.(2000)，97，3016-3021)，因?yàn)?/5￡>-2基因啟動(dòng)子區(qū)域包含NF-icB結(jié)合位點(diǎn)。另外，己經(jīng)報(bào)道HBD-4的表達(dá)可被微生物(例如肺炎鏈球菌(S./w//wo"/fle))通過PMA-PKC信號(hào)途徑誘導(dǎo)(J.R.Garciaetal.，化S五5J(2001),15,1819-1821)，HBD畫3的表達(dá)水平可應(yīng)答于TNF-a、IL-ip和IFN-"y而提高。因此，本發(fā)明人努力確定特應(yīng)性皮炎的病理學(xué)機(jī)制，并且發(fā)現(xiàn)SPC顯著地降低AMP(特別是HBD-1至-4(屬于人防衛(wèi)素P家族，并且已經(jīng)報(bào)道其表達(dá)在AD患者的皮膚中降低)、Cathelicidin(LL-37)和Dermcidin)的表達(dá)
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于在抗微生物肽(AMP)表達(dá)降低的哺乳動(dòng)物中將AMP的表達(dá)恢復(fù)至有效水平的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)拮抗劑在制各用于恢復(fù)哺乳動(dòng)物屮AMP的表達(dá)的藥物中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種篩選用于恢復(fù)AMP的表達(dá)的候選物的有效方法。技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于在需要恢復(fù)AMP表達(dá)的哺乳動(dòng)物中恢復(fù)AMP的表達(dá)的方法，包括將SPC拮抗劑以治療劑量施用給所述哺乳動(dòng)物的歩驟。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方而，提供了SPC拮抗劑在制備用于在需?；謴?fù)AMP表達(dá)的哺乳動(dòng)物中將AMP的表達(dá)恢復(fù)至正常水平的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另-一個(gè)方而，提供了用于篩選SPC拮抗劑的方法，包括步驟I)用SPC或其衍生物處現(xiàn)對(duì)象以下調(diào)AMP的表達(dá);2)用SPC拮抗劑候選物處現(xiàn)所述對(duì)象并分析在所述對(duì)象中AMP表達(dá)的恢復(fù)水平。當(dāng)與所附附圖聯(lián)系起來時(shí)，本發(fā)明的上述及其他目的和特征從本發(fā)明的如下描述中顯而易見，所述附圖分別示出圖1:RT-PCR分析結(jié)果，顯示HaCaT細(xì)胞中HBD-1至-4、hCAP-18/LL-37和DCD的mRNA表達(dá)水平(組成型或被TNF-a誘導(dǎo))以SPC劑量依賴性方式被抑制；圖2:RT-PCR分析結(jié)果，顯示HaCaT細(xì)胞中HBD-2、HBD-3和DCD的mRNA表達(dá)水平(組成型或被PMA誘導(dǎo))以SPC劑量依賴性方式被抑制；圖3:RT-PCR分析結(jié)果，顯示HaCaT細(xì)胞中HBD-2和HBD-3的mRNA表達(dá)水平(被TNF-a誘導(dǎo)并被SPC抑制)通過給予2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-1，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺恢復(fù)以及圖4:免疫組化測(cè)定結(jié)果，顯示ICR小鼠中HBD-1和HBD-2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(被PMA誘導(dǎo)并被SPC抑制)通過給予2-氨基-2-辛基輕甲基-丙烷-l，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺恢復(fù)至正常水平。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的方法中使用的用于將AMP的表達(dá)恢復(fù)至正常水平的SPC拮抗劑可以是任何一種已知能夠抑制SPC的活性或拮抗SPC下調(diào)AMP表達(dá)的機(jī)制的SPC拮抗劑。SPC拮抗劑的代表性實(shí)例包括與SPC活性位點(diǎn)結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、與SPC活性位點(diǎn)之外的其他位點(diǎn)結(jié)合以使活性位點(diǎn)失活的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、SPC細(xì)胞內(nèi)定位的抑制劑、降解SPC或誘導(dǎo)SPC降解的物質(zhì)、以及SPC誘導(dǎo)的AMP表達(dá)下調(diào)途徑的阻斷劑。在木發(fā)明中，所述SPC拮抗劑可以經(jīng)全身或局部施用給需要恢復(fù)AMP表達(dá)的對(duì)象，例如忠有與AMP表達(dá)降低相關(guān)的病變(例如特應(yīng)性皮炎(AD))的哺乳動(dòng)物，包括人。本發(fā)明的方法中的SPC拮抗劑合適的單次劑量可以根據(jù)各種相關(guān)因素(包括待治療的疾病、施用途徑、患者的年齡和體重、以及患者癥狀的嚴(yán)重性)確定。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種用于篩選可行的SPC拮抗劑的方法，包括步驟I)用SPC或其衍生物處理對(duì)象以下調(diào)AMP的表達(dá);和2)用SPC拮抗劑候選物處理所述對(duì)象并分析所述對(duì)象中AMP表達(dá)的恢復(fù)水平。在本發(fā)明的方法中，所述對(duì)象可以是受試細(xì)胞或哺乳動(dòng)物。所述受試細(xì)胞可以是任何一種表達(dá)AMP或能夠針對(duì)誘導(dǎo)性物質(zhì)應(yīng)答性表達(dá)AMP的已知細(xì)胞，優(yōu)選角質(zhì)形成細(xì)胞；所述哺乳動(dòng)物可以是嚙齒動(dòng)物例如小鼠、大鼠或旱獺，優(yōu)選無毛小鼠。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，在步驟1中，可以將SPC或其衍生物以從大約lnM至大約40mM(從大約0.002°/。(w/w)至大約2%(w/w))的濃度范圍施用給對(duì)象。當(dāng)濃度低于nM時(shí)，無法實(shí)現(xiàn)所希望的對(duì)AMP表達(dá)的抑制當(dāng)濃度高于40mM時(shí)，受試細(xì)胞可能發(fā)生形態(tài)改變，或在哺乳動(dòng)物中可能出現(xiàn)副作用。進(jìn)一步地，當(dāng)AMP顯示誘導(dǎo)型表達(dá)時(shí)，例如在本發(fā)明的方法的分析中使用HBD-2和HBD-4吋，可以進(jìn)一步包括在步驟1的SPC處理之前或同吋用AMP表達(dá)的誘導(dǎo)性物質(zhì)處理對(duì)象。所述AMP表達(dá)的誘導(dǎo)性物質(zhì)可選自由Ca2+、TNF-a、IL-ip、IFN"T和佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)組成的組，優(yōu)選TNF-a和PMA。在步驟2中，可用SPC拮抗劑候選物處理在步驟1中進(jìn)行AMP表達(dá)下調(diào)的對(duì)象，并分析AMP表達(dá)的恢復(fù)水平?？梢允褂靡环N已知用于測(cè)量基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的方法分析AMP的表達(dá)水平。例如，可通過RT-PCR或印跡分析(例如RNA印跡)并使用它們的基因或其片段作為探針分析AMP的基因表達(dá)；可以使用抗AMP的抗體通過進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(R1A)、三明治測(cè)定(sandwichassay)、蛋白質(zhì)印跡、免疫印跡或免疫組化染色法分析AMP的蛋白質(zhì)表達(dá)。SPC顯著降低已有報(bào)道在特應(yīng)性皮炎忠者體內(nèi)被抑制的人|3-防衛(wèi)素(HBD-1、HBD-2、HBD-3和HBD-4)、Cathelicidin(LL-37)和Dermcidin的表達(dá)。因此，SPC拮抗劑可用于預(yù)防和治療與AMP的表達(dá)降低相關(guān)的病變例如特應(yīng)性皮炎，并且可以通過分析AMP基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的恢復(fù)水平而有效地篩選可行的SPC拮抗劑。以下實(shí)施例用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不限制其范圍。進(jìn)一步地，以下給出的固體在固體混合物中的百分比、液體在液體中的百分比、以及固體在液體中的百分比分別是基于wt/wt、vol/vol和wt/vol表示的；并且所有反應(yīng)均在室溫進(jìn)行，除非另外特別說明。參考實(shí)施例AMP的表達(dá)水平的分析在如下實(shí)施例中，通過進(jìn)行多于3次的RT-PCR((94。C，1min;51~60°C，lmin:72。C，2min)50次循環(huán)；引物濃度5pmoI/反應(yīng)，模板含量50ng/反應(yīng))分析受試細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中AMP的mRNA表達(dá)模式，所述RT-PCR使用特異于人防衛(wèi)素家族(HBD-1至-4)、Cathelicidin(hCAP-18/LL-37)、Dermcidin(DCD)的基因的引物，GAPDH作為對(duì)照。所使用的引物序列列于表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通過掃描所得的RT-PCR照片估計(jì)各個(gè)條帶密度并使用student'st檢驗(yàn)檢驗(yàn)估計(jì)的密度值，檢測(cè)AMP的mRNA表達(dá)水平。只有當(dāng)受試組和對(duì)照組的估計(jì)p值小于0.05吋才認(rèn)為受試細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞之間的差異是顯著的。實(shí)施例l:SPC降低AMP表達(dá)的分析(1)受試細(xì)胞中的分析將人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT(Dr.N.E.Fusenig，DuetschesKrebsforschungszentrum，Heidelberg,Germany)以1乂105個(gè)細(xì)胞/孔的量接種于6孔平板，并于37。C和5。/dC02的條件下，在添加了10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(青霉素-鏈霉素，Gibco，USA)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，GibcoBRL)中培養(yǎng)24小時(shí)。將一些培養(yǎng)的細(xì)胞用20ngTNF-a或者40或80nM佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)處理以誘導(dǎo)呈現(xiàn)誘導(dǎo)型表達(dá)的AMP的表達(dá)，同吋加入0、1、10或20pMSPC。一些培養(yǎng)的細(xì)胞不進(jìn)行處理(對(duì)照細(xì)胞)。與參考實(shí)施例的方法一樣，對(duì)受試細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR，以分析其AMP的mRNA表達(dá)水平，作為SPC處理濃度的函數(shù)。結(jié)果示于圖1和2。如圖1和2所示，HBD-1至-4、hCAP-18/LL-37和DCD的mRNA表達(dá)水平在HaCaT細(xì)胞中以SPC劑量依賴性方式被顯著抑制。特別地，HBD-2、HBD-3和DCD的mRNA表達(dá)水平被SPC處理明顯地抑制。(2)受試動(dòng)物中的分析將8周齡大、體重大約為25~30g雄性的ICR小鼠(CharlesRiverLaboratories,MA，USA)用20pl于丙酮中的PMA(2.5pg/nl)對(duì)其耳朵、背部和腹部區(qū)域的皮膚進(jìn)行處理以誘導(dǎo)AMP的表達(dá)，同吋，給這些小鼠中的一部分分別應(yīng)用20^1的0.1%或1%SPC，6小吋之后進(jìn)行同樣的SPC處理。給一些不用PMA處理的小鼠僅應(yīng)用丙酮(對(duì)照組)。24小吋后，從被處理的皮膚以6mm的穿刺(punching)收集組織樣品，每一樣品中包埋在OCT(最佳切割溫度)化合物中并于-20'C冷凍。將每一冷凍組織樣品切成4nm厚的切片，固定在載玻片上，并于室溫與抗-HBD-l或抗-HBD-2抗體(Santacruse，USA)—起溫育超過1小時(shí)。對(duì)每…個(gè)獲得的樣品用Envision試劑盒(DAKO，USA)進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果示于圖4((a)至(d))。如圖4((a)至(d))屮的結(jié)果所示，在ICR小鼠皮膚中HBD畫1和HBD-2的蛋白質(zhì)表達(dá)以SPC劑量依賴性方式顯著降低。實(shí)施例2:通過分析AMP表達(dá)的恢復(fù)水平篩選SPC拮抗劑(1)受試細(xì)胞中的分析將HaCaT細(xì)胞以1"05個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于6孔平板，并于37°C和5%C02的條件下在添加了10%FBS和1%青霉素-鏈霉素(Gibco)的DMEM中培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)的細(xì)胞用20ngTNF-a處理以誘導(dǎo)HBD-2的表達(dá)，同時(shí)加入lO[iMSPC以抑制AMP表達(dá)。之后，每一組用0、0.1、1或10ppm的2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-l，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-1-胺處理。一些培養(yǎng)的細(xì)胞不進(jìn)行處理(對(duì)照細(xì)胞)，或僅用20ngTNF-a或10nMSPC進(jìn)行處理。根據(jù)參考實(shí)施例的方法，對(duì)受試細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR，以確定HBD-2和HBD-3的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果示于圖3。如圖3所示，HBD-2和HBD-3的mRNA表達(dá)在用2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-l，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺處理的受試細(xì)胞中顯著恢復(fù)。因此，這些結(jié)果提示可以通過本發(fā)明的方法容易地檢測(cè)到SPC拮抗劑。(2)受試細(xì)胞中的分析將20nlPMA(2.5pg/nl)應(yīng)用于8周齡大、體重大約為25~30g的毎只雄性ICR小鼠的耳朵、背部和腹部區(qū)域的皮膚以誘導(dǎo)HBD-1和HBD-2的表達(dá)，同吋應(yīng)用2(^1的1°/。SPC以抑制AMP表達(dá)。用20^1的1%2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-1,3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)W-2-烯-l-胺處理這些小鼠中的一部分，6小吋之后進(jìn)行同樣的SPC處現(xiàn)。24小時(shí)后，從被處理的皮膚以6mm的穿刺收集組織樣品，包埋在OCT(最佳切割溫度)化合物中，并于-20'C冷凍。將每一冷凍組織樣品切成4Mm厚的切片，固定在載玻片上，并于室溫用抗-HBD-l或抗-HBD-2抗體(Santacruse，USA)溫育超過1小時(shí)。對(duì)每一樣品用Envision試劑盒(DAKO，USA)進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果示于圖4((d):柳。如圖4((d)至(f))中的結(jié)果所示，在用2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-1，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺處理的受試組中，被SPC抑制的HBD-1和HBD-2的表達(dá)水平恢復(fù)至正常水平。因此，這些結(jié)果提示可以通過本發(fā)明的方法容易地檢測(cè)到SPC拮抗劑。雖然根據(jù)上述特定實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修飾及改變，這些修飾及改變也落入由所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑在制備用于在需要恢復(fù)抗微生物肽的表達(dá)的哺乳動(dòng)物中將抗微生物肽的表達(dá)恢復(fù)至正常水平的藥物中的用途。2.權(quán)利要求^的用途r其中所述"氨醇磷酸ii:堿拮抗劑通過抑制鞘敏醇磷酸膽堿的活性或拮抗鞘氨醇磷酸膽堿下調(diào)抗微生物肽表達(dá)的途徑而恢復(fù)抗微生物肽的表達(dá)。3.權(quán)利耍求2的用途，其中所述鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑選自山與鞘氨醇磷酸膽堿活性位點(diǎn)結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、與鞘氨醇磷酸膽堿活性位點(diǎn)之外的其他位點(diǎn)結(jié)合以使活性位點(diǎn)失活的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、鞘氨醇磷酸膽堿細(xì)胞內(nèi)定位的抑制劑、誘導(dǎo)鞘氨醇磷酸膽堿降解的物質(zhì)、鞘氨醇磷酸膽堿誘導(dǎo)的抗微生物肽表達(dá)下調(diào)途徑的阻斷劑、及其混合物組成的組。4.權(quán)利耍求1的用途，其，l'所述哺乳動(dòng)物患有特應(yīng)性皮炎。5.權(quán)利要求1的用途，其中所述鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑經(jīng)全身或局部施用給所述哺乳動(dòng)物。6.—種用于篩選鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑的方法，包括步驟1)用鞘氨醇磷酸膽堿或其衍生物處理對(duì)象以下調(diào)抗微生物肽的表達(dá)；和2)用鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑候選物處理所述對(duì)象并分析所述對(duì)象中抗微生物肽表達(dá)的恢復(fù)水平。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述對(duì)象是受試細(xì)胞或除人以外的哺乳動(dòng)物。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述受試細(xì)胞表達(dá)抗微生物肽或能夠針對(duì)誘導(dǎo)性物質(zhì)應(yīng)答性表達(dá)抗微生物肽。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述受試細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞。10.權(quán)利要求7的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠或早獺。11.權(quán)利要求6的方法，其中在步驟1中，將鞘氨醇磷酸膽堿或其衍生物以從lnM至40mM的濃度施用給所述對(duì)象。12.權(quán)利要求6的方法，進(jìn)一步包括在步驟1的鞘氨醇磷酸膽堿處理之前或同時(shí)用抗微生物肽表達(dá)的誘導(dǎo)性物質(zhì)處理對(duì)象。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述誘導(dǎo)性物質(zhì)選自由Ca2+、TNF-a、1L-ip、IFN-y、佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)、及其混合物組成的組。14.權(quán)利要求6的方法，其中在步驟2中通過測(cè)定抗微生物肽的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析抗微生物肽表達(dá)的恢復(fù)水平。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗微生物肽的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)水平通過選自由逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、RNA印跡、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、三明治測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡、免疫印跡、免疫組化染色法及其組合組成的組的方法測(cè)定。全文摘要SPC抑制特應(yīng)性皮炎患者體內(nèi)的人β防衛(wèi)素(HBD-1、HBD-2、HBD-3和HBD-4)、Cathelicidin(LL-37)和Dermcidin的表達(dá)，因此，SPC拮抗劑可用于預(yù)防和治療與AMP表達(dá)降低相關(guān)的病變。文檔編號(hào)C07K1/00GK101443347SQ200680054636公開日2009年5月27日申請(qǐng)日期2006年12月8日優(yōu)先權(quán)日2006年5月18日發(fā)明者成基士,成大石,樸鍾喜,李昌勛,趙仙娥,赫金,金亨俊,金光美,金大權(quán),金正鑄申請(qǐng)人:株式會(huì)社Amorepacific