聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于含有抗原或抗體的醫(yī)藥配制品領(lǐng)域，具體是一種聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，具有高度的侵襲性，目前其治療方式包括手術(shù)切除，及輔助性術(shù)后放射及替莫唑胺化學(xué)治療，但生存期通常不足15個月。近年來，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的認(rèn)識和分子生物學(xué)技術(shù)的進步，目前臨床已經(jīng)開始針對細(xì)胞受體、關(guān)鍵基因和調(diào)控分子為靶點的分子靶向治療。而其中的熱點，主要是針對表皮生長因子受體(EGFR)為靶點的治療。EGFR是一跨膜糖蛋白受體，由細(xì)胞外的配體結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)組成，當(dāng)配體于胞外的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合后，受體可發(fā)生同二聚或異二聚作用，激活胞內(nèi)酪氨酸激酶的活性，并進一步激活下游的信號傳導(dǎo)通路。因EGFR的信號傳導(dǎo)機制和腫瘤的惡性表型，正常細(xì)胞凋亡的抑制，血管生成，以及腫瘤的轉(zhuǎn)移均有密切的聯(lián)系，提示它可以作為藥物的治療靶向。目前，全球已經(jīng)有三種針對EGFR的單克隆抗體上市，已經(jīng)取得了明顯的效果。此三種抗體為尼妥珠單抗(Nimotuzumab)，西妥昔單抗(Cetuximab)，帕尼單抗(Panitumumab)。尼妥珠單抗是針對EGFR的人源化IgGl型單克隆抗體藥物，通過與EGFR胞外區(qū)域3A表位結(jié)合，競爭性抑制配體與EGFR的結(jié)合，使受體失去活性，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。但是，治療抗體存在著分子量大、跨血腦屏障效率低、血液中穩(wěn)定性差和循環(huán)時間短等問題。
[0003]原位聚合法是從納米復(fù)合材料中發(fā)展而來的，就是把反應(yīng)單體填充到納米層狀物的層間，讓其在層間發(fā)生聚合反應(yīng)。其反應(yīng)機理是把反應(yīng)性單體與催化劑全部加入分散相中，由于分子間作用力或其他作用，單體可以在芯材附近富集，在催化劑作用下聚合反應(yīng)在分散相芯材上發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明就是為了解決目前膠質(zhì)瘤抗體藥物血藥半衰期短，免疫源性，分子量大，不易透過血腦屏障的問題，所提出的一種聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊及其制備方法和用途。
[0005]本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0006]—種聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊，是由聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿與尼妥珠單抗聚合而成的表面圓滑，粒徑均一，粒徑為30±5nm，表面電荷為2.3 mV，具有腦腫瘤靶向高效投遞作用的納米微囊。
[0007]—種上述聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊的制備方法，包括以下步驟:
a.取0.1-1OOmg尼妥珠單抗溶液； b.按照尼妥珠單抗溶液與含碳碳雙鍵的單體的摩爾比為1:100-1:100000的比例加入含碳碳雙鍵的單體；
C.按照尼妥珠單抗溶液與交聯(lián)劑的摩爾比為1:100-1:10000的比例加入酶可降解的多肽交聯(lián)劑，利用靜電和氫鍵作用，在尼妥珠單抗的周圍富集碳碳雙鍵單體以及交聯(lián)劑；
d.按照尼妥珠單抗溶液與引發(fā)劑的摩爾比為1:100-1:10000的比例加入引發(fā)劑，在4°C，引發(fā)劑的引發(fā)下，通過原位聚合的方法獲得聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊，反應(yīng)時間為0.1-24小時。
[0008]步驟b中所述的含碳碳雙鍵的單體為N-(3_氨基丙基)甲基丙烯酸鹽和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿，兩種單體的摩爾比為0.0001:1-1:10000ο
[0009]步驟c中所述交聯(lián)劑為酶敏感交聯(lián)劑、pH敏感交聯(lián)劑、或氧化還原敏感交聯(lián)劑。
[0010]所述酶敏感交聯(lián)劑為基質(zhì)金屬蛋白酶-2可降解的多肽交聯(lián)劑;pH敏感交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯;氧化還原敏感交聯(lián)劑為含二硫鍵交聯(lián)劑。
[0011]步驟d中所述的引發(fā)劑為過硫酸銨和四甲基乙二胺，兩者的摩爾比為0.01:1-1:100。
[0012]一種上述聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明獲得了如下的有益效果。
[0014]本發(fā)明通過原位聚合法制備了大小均一，表面圓滑，具有腦靶向、酶降解釋放和血液中長循環(huán)功能(血液中半衰期時間為48h)的聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊，極大改善了尼妥珠單抗通過血腦屏障效率低的缺陷，同時實現(xiàn)了尼妥珠單抗的腦腫瘤靶向高效投遞，避免了尼妥珠單抗對正常器官的毒副作用，并利用尼妥珠單抗具有的一定抗腫瘤作用，有效的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，提高了尼妥珠單抗治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的療效。本發(fā)明采用的原位聚合法類似于本體聚合，操作簡單，聚合物純凈，而且反應(yīng)發(fā)生在水相中，又克服了本體聚合散熱困難的問題。本發(fā)明成本較低，操作簡單，穩(wěn)定性好，緩釋效果好，易于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊透射電鏡圖；
圖2是本發(fā)明聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊粒徑分布圖；
圖3是本發(fā)明聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊zeta電位分布圖；
圖4是本發(fā)明聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊對U87膠質(zhì)瘤裸鼠原位模型腦靶向功能的檢測圖；
圖5是本發(fā)明聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊對U87膠質(zhì)瘤裸鼠原位模型治療效果評價圖；
圖6是本發(fā)明聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊對MGC803胃癌裸鼠皮下模型治療效果評價圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0017]實施例1聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠單抗納米微囊的制備及表征取含Img尼妥珠單抗(百泰生物藥業(yè)有限公司)的溶液，加入正電性單體N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸鹽，尼妥珠單抗與N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸鹽的摩爾比是1: 300，再加入
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿，尼妥珠單抗與2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿的摩爾比是1:4000;然后再按尼妥珠單抗與交聯(lián)劑的摩爾比為1:500的比例加入基質(zhì)金屬蛋白酶-2可降解的多肽交聯(lián)劑，靜置10 min，利用靜電和氫鍵作用，在單抗的周圍富集反應(yīng)單體以及酶可降解多肽交聯(lián)劑;然后加入過硫酸銨和四甲基乙二胺，尼妥珠單抗與過硫酸銨、四甲基乙二胺的摩爾比為1:500:1000，在4°C條件下反應(yīng)2h，制備聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿包載的尼妥珠