靶向性凝固因子及其使用方法
【專(zhuān)利摘要】提供了靶向性凝固因子，其包含與至少一個(gè)特異性結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域連接的凝固因子。所公開(kāi)的靶向性凝固因子提高凝固因子的效率，并延長(zhǎng)其作用的持續(xù)時(shí)間，并且如此是用于治療血液學(xué)疾病諸如血友病A的改善。
【專(zhuān)利說(shuō)明】靶向性凝固因子及其使用方法
[0001] 此案是申請(qǐng)日為2009年5月15日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?00980126328. 5、發(fā)明名稱(chēng)為 "靶向性凝固因子及其使用方法"的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本申請(qǐng)要求2008年5月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)流水號(hào)61/053, 932的權(quán)益，通 過(guò)提及而將其內(nèi)容完整收入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本申請(qǐng)涉及具有升高的功效的靶向性凝固因子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療凝固因 子缺乏病癥患者的方法，其通過(guò)將凝固因子選擇性靶向至其作用的生物學(xué)位置，諸如通過(guò) 將凝血因子VIII (FVIII)靶向至紅細(xì)胞和血小板來(lái)進(jìn)行。還提供了藥物組合物，其包含依 照本發(fā)明的靶向性凝固因子。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 生物學(xué)藥物的效率常常受到其在患者中的作用持續(xù)時(shí)間限制，尤其在疾病需要藥 物的持續(xù)調(diào)控時(shí)。因此，藥動(dòng)學(xué)特性的增強(qiáng)對(duì)于治療劑在臨床上的成功通常比藥物效力的 優(yōu)化更重要。一種保護(hù)藥物免于各種清除機(jī)制以延長(zhǎng)半衰期的辦法是添加靶向域，其促進(jìn) 藥物結(jié)合至循環(huán)中的長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)諸如基質(zhì)蛋白或細(xì)胞（諸如血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞）表面。 例如，已經(jīng)顯示了治療性肽或蛋白質(zhì)定位于血細(xì)胞表面通過(guò)阻止正常的清除機(jī)制來(lái)延長(zhǎng)其 循環(huán)半衰期（Chen等，Bloodl05 (10) :3902-3909, 2005)。可以使用極其多種分子作為靶向 域。
[0006] 在另一個(gè)例子中，在連接蝶（tick)抗凝蛋白的Kunitz型蛋白酶抑制劑（KPI)域 與陰離子磷脂、磷脂酰-L-絲氨酸（PS)結(jié)合蛋白、膜聯(lián)蛋白V(ANV)時(shí)，顯示了融合蛋白 (ANV-KPI)比非融合對(duì)應(yīng)物更具活性，而且擁有更高的體內(nèi)抗凝血活性（Chen等，2005)。由 于ANV對(duì)PS和磷脂酰乙醇胺（PE)具有強(qiáng)親和力，假設(shè)融合蛋白ANV-KPI能特異性靶向至血 栓形成（thrombogenesis)位置處存在的富含PS/PE的陰離子膜結(jié)合的凝固酶復(fù)合物。類(lèi)似 地，Dong等報(bào)告了融合血纖蛋白選擇性吸血蝠（Desmodusrotundus)唾液PAa l(dsPAa 1) 與尿激酶（uPA)/抗P-選擇蛋白抗體（HuSZ51)以生成完全功能性的融合蛋白，在體外測(cè)定 法中具有與非融合對(duì)應(yīng)物相似的抗凝血活性。此外，顯示了融合蛋白HuSZ51-dsPAa 1結(jié)合 凝血酶激活的人和犬血小板（Dong等，Thromb. Haemost. 92:956-965, 2004)。
[0007] 已經(jīng)在靶向抗凝血?jiǎng)┲羞M(jìn)行了其它努力以阻止凝塊和降低與血栓性疾病 有關(guān)的死亡率（參見(jiàn)例如 W094/09034)。Stoll 等（Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 27:1206-1212, 2007)表明了新近的開(kāi)發(fā)，其中經(jīng)由抗LIBS單鏈抗體（scFv抗LIBS)將 凝血因子X(jué)a(FXa)抑制劑，即蜱抗凝血肽（TAP)靶向至GPIIb/IIIa(即一種在血小板表面 上豐富表達(dá)的糖蛋白）上的配體誘導(dǎo)的結(jié)合位點(diǎn)。顯示了融合蛋白sCFvauBS-TAP即使在 非靶向性對(duì)應(yīng)物失效（fail)的低濃度也擁有有效的抗凝活性。
[0008] 上述靶向性抗凝血?jiǎng)┦窃O(shè)計(jì)用于靶向特定細(xì)胞的融合蛋白。依照Stoll等，靶向 性抗凝血?jiǎng)?yīng)當(dāng)是具有在與抗體融合時(shí)得到保留的高度有力的凝固抑制活性的小分子。不 討論抗凝血?jiǎng)┳云浒卸ㄎ恢弥械娜诤系鞍椎尼尫拧?br> [0009] 本發(fā)明聚焦于用于治療血液學(xué)疾病諸如血友病的靶向性治療性蛋白質(zhì)。例如，用 FVIII濃縮物或重組FVIII對(duì)血友病A患者的當(dāng)前治療受到這些因子的高成本和其相對(duì)較 短的作用持續(xù)時(shí)間的限制。目前，通過(guò)在需要時(shí)靜脈內(nèi)施用FVIII或者作為一周數(shù)次施用 的預(yù)防性療法來(lái)治療血友病A患者。對(duì)于預(yù)防性處理，一周三次施用FVIII。不幸地，此頻 率對(duì)于許多患者而言是成本昂貴的（cost prohibitive)。由于其在人中的短半衰期，必須 頻繁施用FVIII。盡管其在全長(zhǎng)蛋白質(zhì)上大于300kD的較大大小，F(xiàn)VIII具有僅約11-18(平 均14)小時(shí)的人中半衰期（Gruppo等，Haemophila9:251_260, 2003)。對(duì)于那些能負(fù)擔(dān)得起 所推薦的頻繁劑量給藥的人，然而頻繁地靜脈內(nèi)注射蛋白質(zhì)是非常不方便的。對(duì)于患者而 言會(huì)更方便的是，若可以開(kāi)發(fā)出具有較長(zhǎng)的半衰期，因此需要頻率較少的施用的FVIII產(chǎn) 品。此外，若半衰期得到延長(zhǎng)，則可以降低治療成本，這是因?yàn)槟菢涌尚枰^少的劑量。因 此，想要具有更有效形式的FVIII，其能降低有效劑量或者具有延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間以顯著 改善血友病患者的治療選項(xiàng)。
[0010] 還有，靶向性FVIII的持續(xù)血漿濃度可以通過(guò)降低FVIII的谷至峰水平，如此消除 需要在早期時(shí)間點(diǎn)時(shí)引入超生理學(xué)水平的蛋白質(zhì)，從而降低不利副作用的程度。因此，想要 具有如下的FVIII形式，其具有持續(xù)不變的持續(xù)時(shí)間和比目前銷(xiāo)售的形式更長(zhǎng)的半衰期。
[0011] 目前療法的別的缺點(diǎn)是約25-30%的患者形成抑制FVIII活性的抗體（Saenko 等，Haem〇philia8:1-11，2002)?？贵w形成阻止FVIII作為代替療法使用，迫使這組患者尋 找甚至更昂貴的用高劑量重組凝血因子VIIa(FVIIa)的治療和免疫耐受性療法。因此，較 小免疫原性的FVIII代替產(chǎn)品是想要的。
[0012] 一種為血友病患者改善治療的辦法牽涉基因療法。通過(guò)在血小板中指導(dǎo)FVIII 表達(dá)來(lái)將FVIII異位靶向至血小板在治療血友病A中可以具有治療效果（Shi等，J. Clin. Invest. 116(7):1974-1982, 2006)。
[0013] 本發(fā)明的目標(biāo)是提供靶向性凝固因子，其與非靶向性蛋白質(zhì)相比具有延長(zhǎng)的作用 持續(xù)時(shí)間、更大的功效、更少的副作用、和更小的免疫原性。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是降低與治療性蛋白質(zhì)施用有關(guān)的副作用，其通過(guò)讓蛋白質(zhì) 靶向至期望作用的特定位置，并且由此降低蛋白質(zhì)暴露于可導(dǎo)致不想要副作用的其它潛在 生物學(xué)活性位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0015] 本發(fā)明的進(jìn)一步的目標(biāo)是獲得別的優(yōu)點(diǎn)，其通過(guò)設(shè)計(jì)靶向性治療性凝固因子來(lái)實(shí) 現(xiàn)，其中治療性蛋白質(zhì)在緊鄰其體內(nèi)作用位置處自靶向域釋放?？梢赃_(dá)到高局部濃度的非 融合、激活的蛋白質(zhì)。如此，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的治療功效。
[0016] 本發(fā)明還涉及
[0017] 1. 一種靶向性凝固因子，其包含與至少一個(gè)特異性結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域 連接的凝固因子。
[0018] 2.項(xiàng)1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX。
[0019] 3.項(xiàng)1的靶向性凝固因子，其中所述域是抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
[0020] 4.項(xiàng)1的靶向性凝固因子，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述膜蛋白質(zhì)是GPIIb/ Ilia。
[0021] 5.項(xiàng)4的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽。
[0022] 6.項(xiàng)4的靶向性凝固因子，其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗體的單鏈片 段。
[0023] 7.項(xiàng)1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽，而所述域是與 所述FVIII的B域連接的抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
[0024] 8.項(xiàng)7的靶向性凝固因子，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗 GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段。
[0025] 9. -種藥物組合物，其包含治療有效量的項(xiàng)1的靶向性凝固因子和藥學(xué)可接受賦 形劑或載體。
[0026] 10. -種用于治療血液學(xué)疾病的方法，包括對(duì)有所需要的患者施用有效量的項(xiàng)1 的靶向性凝固因子。
[0027] 11. -種用于將凝固因子靶向至血細(xì)胞表面的方法，包括連接所述凝固因子與至 少一種結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域。
[0028] 12.項(xiàng)11的方法，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX。
[0029] 13.項(xiàng)11的方法，其中所述血細(xì)胞是血小板或紅細(xì)胞。
[0030] 14.項(xiàng)11的方法，其中所述域是抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
[0031] 15.項(xiàng)11的方法，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述膜蛋白質(zhì)是GPIIb/IIIa。
[0032] 16.項(xiàng)15的方法，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽。
[0033] 17.項(xiàng)15的方法，其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段。
[0034] 18.項(xiàng)11的方法，其中所述凝固因子是FVIII，而所述域是與所述FVIII的B域連 接的抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
[0035] 19.項(xiàng)18的方法，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗GPIIb/IIIa 抗體的單鏈片段。
[0036] 20.項(xiàng)11的方法，其中進(jìn)一步從所述血細(xì)胞的表面釋放所述凝固因子。
[0037] 發(fā)明概述
[0038] 依照本發(fā)明的靶向性凝固因子包含與至少一個(gè)特異性結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì) 的域連接的凝固因子。還提供了包含新公開(kāi)的靶向性凝固因子的藥物組合物和使用靶向性 凝固因子來(lái)治療血液學(xué)疾病的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種通過(guò)使用新公開(kāi)的靶向性凝 固因子來(lái)將凝固因子靶向至血細(xì)胞表面以提高用凝固因子治療血液學(xué)疾病的效率的方法。
[0039] 附圖簡(jiǎn)述
[0040] 圖1:全長(zhǎng)？￥111("全長(zhǎng)？￥111)和8域缺失型？￥111(^111-800-了0"）（其中 將靶向域（"TD"）插入B域中，并除去大部分的B域）的示意圖。
[0041] 圖2 :經(jīng)由B域半胱氨酸連接FVIII的經(jīng)修飾的環(huán)肽Integrilin，即"BHRF-1"(A) 和"BHRF-3"⑶的結(jié)構(gòu)。
[0042] 圖3 :BHRF-1和BFRH-3對(duì)固定化GPIIa/IIIb的結(jié)合親和力。
[0043] 圖4 :對(duì)固定化GPIIa/IIIb的BHRF-1-FVIII結(jié)合測(cè)定法。
[0044] 圖5 :與FVIII比較的BHRF-l-FVIII的體外凝固活性。
[0045] 圖6 :BHRF-1-FVIII對(duì)人血小板的體外結(jié)合。
[0046] 圖7 :BHRF-1-FVIII對(duì)小鼠血小板的體外結(jié)合。
[0047] 發(fā)明詳述
[0048] 本發(fā)明涉及將凝固因子靶向至其作用的一個(gè)或多個(gè)位置，諸如血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí) 施方案中，提供了靶向性凝固因子，其經(jīng)由連接所述因子與至少一個(gè)結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋 白質(zhì)的域來(lái)特異性靶向至血細(xì)胞。用于將凝固因子靶向至血細(xì)胞的域可以不限于對(duì)血細(xì)胞 表面上的膜蛋白質(zhì)具有高親和力的抗體片段、抗體、肽、受體配體、碳水化合物、或小分子。 例如，血細(xì)胞是紅細(xì)胞或血小板。
[0049] 如本文中所使用的，"凝固因子"指牽涉凝固級(jí)聯(lián)并主要具有促凝血活性的蛋白 質(zhì)。凝固因子是本領(lǐng)域中公知的，并且包括但不限于凝固因子I、II、V、VI、VII、VIII、IX、 父、乂1、乂11、和乂111，及蛋白5。凝固因子可以從血漿濃縮或者可以重組生成。若重組生成， 凝固因子可以具有與天然結(jié)構(gòu)不同的氨基酸結(jié)構(gòu)，只要維持足夠的促凝血活性，使得變體 是治療有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，凝固因子是功能性FVIII多肽諸如但不限于來(lái)自血漿 的FVIII濃縮物或重組生成的FVIII，或凝血因子IX(FIX)。
[0050] 如本文中所使用的，"功能性FVIII多肽"意為能夠在體內(nèi)或在體外改正例如以血 友病A表征的人FVIII缺乏的功能性多肽或多肽組合。FVIII在自然狀態(tài)中具有多種降解 或加工形式。這些是以蛋白水解方式自前體，即單鏈蛋白質(zhì)衍生的。功能性FVIII多肽包 括此類(lèi)單鏈蛋白質(zhì)，而且還提供了這些各種降解產(chǎn)物，它們具有改正人FVIII缺乏的生物 學(xué)活性?？赡艽嬖诘任蛔儺悺９δ苄訤VIII多肽包括產(chǎn)生FVIII衍生物的所有此類(lèi)等位 變異、糖基化型式、修飾和片段，只要它們含有人FVIII的功能區(qū)段和本質(zhì)的、特征性的人 FVIII功能活性?？梢匀菀椎赝ㄟ^(guò)本文中所描述的直接體外測(cè)試來(lái)鑒定那些擁有必要功能 活性的FVIII衍生物。此外，功能性FVIII多肽能夠在存在凝血因子IXa(FIXa)、鈣、和磷 脂的情況中催化凝血因子X(jué)(FX)轉(zhuǎn)化為FXa，以及改正自血友病A受累個(gè)體衍生的血漿中 的凝固缺陷。從人FVIII氨基酸序列的公開(kāi)序列和關(guān)于其功能區(qū)的公開(kāi)信息看，可以經(jīng)由 對(duì)DNA的限制酶切割或?qū)θ薋VIII蛋白的蛋白水解或其它降解衍生的片段對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù) 人員會(huì)是顯而易見(jiàn)的。功能性FVIII多肽內(nèi)明確包括但不限于全長(zhǎng)人FVIII (例如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2)和B域缺失型凝血因子VIII (例如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4)，而且 具有如W02006/053299中所披露的氨基酸序列。
[0051] FVIII的"促凝血活性"指FVIII在凝固級(jí)聯(lián)中的活性。FVIII自身不引起凝固，但 是在凝固級(jí)聯(lián)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。FVIII在凝固中的作用是要被激活為FVIIIa，其是一 種用于固有 FX 激活的催化性輔因子（Thompson, Semin. Thromb. Hemost. 29:11-22, 2003)。 FVIII是由凝血酶或FXa以蛋白水解方式激活的，所述凝血酶或FXa將其與馮維勒布蘭德 因子（vonWillebrandfactor，vWf)解離，并激活其在級(jí)聯(lián)中的促凝血功能。在其活性形式 中，F(xiàn)VIIIa在血液凝固的固有途徑中發(fā)揮FX激活酶復(fù)合物的輔因子的功能，并且其在血友 病A患者中是降低的或非功能性的。
[0052] "FIX"指凝固因子IX，其又稱(chēng)為人凝固因子IX，或血漿促凝血酶原激酶成分。
[0053] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"靶向性凝固因子"指與至少一個(gè)特異性結(jié)合血細(xì)胞上的 膜蛋白質(zhì)的域偶聯(lián)的凝固因子。靶向性凝固因子應(yīng)當(dāng)有力地結(jié)合血細(xì)胞，例如以小于ΙΟηΜ 的半最大結(jié)合。結(jié)合對(duì)于靶定的血細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是特異性的，例如經(jīng)由結(jié)合靶定細(xì)胞上選擇性 表達(dá)的膜蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。如本文中所使用的，"域"或"靶向域"指對(duì)靶細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)具 有高親和力的模塊。適合于本發(fā)明的域包括但不限于對(duì)血細(xì)胞表面上的膜蛋白質(zhì)具有高親 和力的抗體、抗體片段諸如單鏈抗體（svFv)或FAB片段、抗體模擬物、和肽或小分子。在一 方面，使用單鏈抗體片段或肽，因?yàn)槠渚幋a序列可以與FVIII編碼序列連接，而且可以使用 重組技術(shù)來(lái)生成融合蛋白。
[0054] 可以以化學(xué)法或通過(guò)重組表達(dá)融合蛋白來(lái)將凝固因子與所述域偶聯(lián)?？梢酝ㄟ^(guò)將 凝固因子上存在的化學(xué)模塊與靶向域連接在一起來(lái)實(shí)現(xiàn)化學(xué)連接，包括使用諸如氨基、羧 基、巰基、羥基基團(tuán)、和碳水化合物基團(tuán)等模塊的化學(xué)連接?？梢允褂枚喾N同和異雙功能接 頭，它們具有活化的，或者可以活化以連接附著這些模塊的基團(tuán)。接頭分子上的一些有用的 反應(yīng)基團(tuán)包括馬來(lái)酰亞胺、N-羥基-琥珀酰胺酯和酰肼。可以使用許多不同化學(xué)組成和長(zhǎng) 度的不同間隔物來(lái)分開(kāi)這些反應(yīng)基團(tuán)，包括例如聚乙二醇（PEG)、脂肪族基團(tuán)、亞烴基基團(tuán)、 環(huán)亞烷基基團(tuán)、融合的或連接的芳基基團(tuán)、長(zhǎng)度為1至20個(gè)氨基酸或氨基酸類(lèi)似物的肽和 /或肽基模擬物。例如，可以以如下方式連接所述域與凝固因子，使得在體內(nèi)功能形式的凝 固因子會(huì)自其靶向域釋放或者在凝固因子在身體中的生物學(xué)活性位置處或附近發(fā)生釋放。
[0055] 因而，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了靶向性凝固因子，其中可以切割或降解 將凝固因子附著至用于將凝固因子靶向至血細(xì)胞的域的連接，由此自偶聯(lián)物釋放凝固因 子。
[0056] 可以通過(guò)將靶向域連接至凝固因子上在其激活過(guò)程期間除去的位點(diǎn)，或者通過(guò)使 用以受控方式被血液中的酶降解的接頭來(lái)實(shí)現(xiàn)凝固因子自其偶聯(lián)物形式（即自靶向性凝 固因子）的釋放。例如，可以使用對(duì)一般的血液蛋白酶或水解酶易感的糖聚合物或肽。多種 此類(lèi)技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，而且已經(jīng)用于制備前藥?？梢詫⒔宇^進(jìn)一步工程化改造成在 最需要凝固因子的位置諸如經(jīng)由外傷觸發(fā)的炎癥或血液凝固的位置處特異性切割。例如， 接頭可以對(duì)僅在想要的作用位置處所生成的特定蛋白酶，諸如通過(guò)炎癥過(guò)程釋放或者通過(guò) 血液凝固級(jí)聯(lián)生成的蛋白酶易感。治療性蛋白質(zhì)的此選擇性釋放可以降低副作用的潛力， 并且提高蛋白質(zhì)在其作用位置的效率。
[0057] 依照本發(fā)明，可以靶向血細(xì)胞上的多種膜蛋白質(zhì)。為了特異性且有效地將凝固因 子靶向至血細(xì)胞，然而，優(yōu)選的是，靶定的膜蛋白質(zhì)豐富地存在于血細(xì)胞表面上。例如，發(fā)現(xiàn) 糖蛋白GPIIb/IIIa是血小板表面上最豐富表達(dá)的分子之一。
[0058] 因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由特異性結(jié)合血小板膜蛋白質(zhì)諸如糖蛋白GPIIb/ Ilia的域?qū)⒛桃蜃影邢蛑裂“?。此?lèi)將凝固因子靶向至GPIIb/IIIa的域的例子包括 但不限于含有RGD的肽和模擬物（線性肽、蛇毒肽、和環(huán)肽）諸如含有RGD模擬序列（即高 精氨酸、甘氨酸天冬氨酸）的Integrilin9、非肽RGD模擬物、和抗GPIIb/IIIa抗體。若使 用抗體作為靶向域，則可以使用抗體的單鏈片段，諸如svFv或FAB片段。
[0059] 靶向 FVIII 和 FIX
[0060] 將FVIII和FIX靶向至血細(xì)胞諸如血小板或紅細(xì)胞的表面可以用來(lái)減緩這些凝 固因子的清除。將FVIII靶向至血小板細(xì)胞的表面是特別感興趣的。FVIII是FIX介導(dǎo)的 FX激活中的一種重要的輔因子，所述FIX介導(dǎo)的FX激活主要在凝塊位置處積累的激活的 血小板細(xì)胞表面上發(fā)生。血小板激活觸發(fā)這些凝固因子結(jié)合其表面以形成促進(jìn)FXa生成的 復(fù)合物。血小板具有約9天的平均循環(huán)壽命。比較而言，血漿中的FVIII (大部分結(jié)合馮維 勒布蘭德氏因子）展現(xiàn)出約14小時(shí)的半衰期。如此，F(xiàn)VIII對(duì)血小板的結(jié)合具有極大地延 長(zhǎng)分子的循環(huán)時(shí)間的潛力。經(jīng)由依照本發(fā)明的靶向域?qū)VIII靶向至血小板細(xì)胞表面提高 FVIII作用的效率，而且預(yù)期延長(zhǎng)FVIII的半衰期。
[0061] 在GPIIb/IIIa外，血小板上的其它蛋白質(zhì)也可以充當(dāng)靶向性FVIII的受體，諸如 GPla和膜聯(lián)蛋白V。糖蛋白GPIIb/IIIa是優(yōu)選的，因?yàn)樗茄“灞砻嫔献钬S富表達(dá)的分 子之一。血液中的GPIIb/IIIa濃度估計(jì)為約75nM，這基于其在血小板上的表面密度得到。 這表示超過(guò)治療性應(yīng)用FVIII后達(dá)到的FVIII最大濃度（Cmax約0. 7nM) 100倍。因此，將 FVIII靶向至血小板會(huì)占據(jù)血小板上可用GPIIb/IIIa位點(diǎn)的大約1 %或更小。預(yù)期此低水 平的占據(jù)不會(huì)改變血小板功能，這要求封閉很大分?jǐn)?shù)（即大于50-60%)的GPIIb/IIIa分 子。高濃度的GPIIb/IIIa還會(huì)驅(qū)動(dòng)靶向性FVIII對(duì)血小板表面的平衡結(jié)合。
[0062] 不以任何方式限制本發(fā)明，認(rèn)為將FVIII靶向至GPIIb/IIIa還可以具有如下的益 處，即一些凝固因子可以通過(guò)經(jīng)由血小板的開(kāi)放管內(nèi)系統(tǒng)（open intracanicular system) 胞吞和再循環(huán)GPIIb/IIIa而內(nèi)在化。這種FVIII可以在alpha顆粒中停止（end up)，并在 血小板激活后再釋放，在其為凝固所需要時(shí)提供FVIII源?？梢员Ｗo(hù)靶向至血小板的結(jié)合 的或內(nèi)在化的FVIII免于存在于許多患者中的抑制劑（例如FVIII抗體）。如此，靶向性 FVIII可以為重要的這組患者提供治療選項(xiàng)。
[0063] 對(duì)于促進(jìn)凝固的靶向性FVIII，該分子必須能夠被加工為功能形式（FVIIIa)，并 自其GPIIb/IIIa結(jié)合位點(diǎn)釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，這通過(guò)連接GPIIb/IIIa靶向域與 FVIII的B域來(lái)實(shí)現(xiàn)。在促凝血環(huán)境中通過(guò)凝血酶或FXa介導(dǎo)的蛋白酶解來(lái)除去B域，生成 成熟的FVIIIa分子。如此，激活后，F(xiàn)VIIIa會(huì)自GPIIb/IIIa釋放，而且可用于形成FX激 活復(fù)合物。
[0064] 可以通過(guò)使用本文中所描述的交聯(lián)方法來(lái)共價(jià)結(jié)合靶向域與FVIII上的反應(yīng)基 團(tuán)（包括氨基、巰基、羧基基團(tuán)和羰基基團(tuán)），從而實(shí)現(xiàn)FVIII與靶向域之間的連接。還可以 將靶向域與主要存在于FVIII分子的B域上的碳水化合物偶聯(lián)。例如，用高碘酸鹽輕度氧化 FVIII在碳水化合物鏈上生成醛，其然后能與胺或酰肼起反應(yīng)，接著任選地進(jìn)行還原以形成 更穩(wěn)定的連接。
[0065] 可以經(jīng)由用三（2-羧乙基）膦（TCEP)的輕度還原在重組FVIII的B域上選擇性生 成游離的半胱氨酸，這容許B域與靶向域的特異性連接，所述靶向域與游離的半胱氨酸起 反應(yīng)，諸如含有硫醇、三氟甲燒磺酸基（triflate)、三氟乙基磺酸基（tresylate)、氮丙陡 (aziridine)、環(huán)氧乙燒、S-批陡基、或馬來(lái)酰亞胺模塊的域。此外，可以修飾FVIII以用半 胱氨酸替換氨基酸殘基，從而為附著至靶向域提供特定位置。若使用B域缺失型FVIII，則 可以使用多種B域缺失型FVIII半胱氨酸突變蛋白（諸如那些披露于W02006/053299的） 來(lái)經(jīng)由表面半胱氨酸殘基處的化學(xué)結(jié)合連接FVIII與靶向域?？梢赃M(jìn)行修飾以用半胱氨 酸替換氨基酸殘基的氨基酸殘基的例子包括但不限于81、129、377、378、468、487、491、504、 556、570、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1911、2091、2118、和 2284(氨基酸 殘基以其在全長(zhǎng)FVIII序列中的位置指明）。
[0066] 也可以使用重組技術(shù)將凝固因子與靶向域偶聯(lián)?？梢杂冒現(xiàn)VIII和靶向域的融 合蛋白的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將靶向域插入FVIII的B域中，并刪 除大部分B域，其中僅在羧基和氨基端處留下B域的部分以容許對(duì)B域的生物學(xué)加工，從而 將其自全長(zhǎng)分子刪除。如圖1中所顯示的，規(guī)定B域的剩余部分，其容許在生理學(xué)條件下生 物學(xué)加工并除去B域。
[0067] 宿主細(xì)胞系可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知為可用于生成凝固因子的任何細(xì)胞，對(duì)于 FVIII諸如但不限于CH0細(xì)胞、HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、和HKB11細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞系HEK293 和人Burkitt B細(xì)胞淋巴瘤系2B8的雜合物）。
[0068] 許多域可以以化學(xué)法連接至FVIII，或者與FVIII -起重組表達(dá)，從而將FVIII靶 向至血小板表面上的GPIIb/IIIa。此類(lèi)域的例子包括但不限于針對(duì)GPIIb/IIIa的抗體、靶 向GPIIb/IIIa的RGD肽、肽模擬物、或小分子模擬物?？贵w諸如靶向GPIIb/IIIa的單鏈抗 體（svFv)或FAB片段特別可用作祀向域。
[0069] 已經(jīng)顯示了可以在不喪失FVIII功能的情況中除去FVIII的B域。另外，還已 經(jīng)顯示了各種B域截短形式的FVIII和B域與其它蛋白質(zhì)域的融合物可以產(chǎn)生功能活 性FVIII。在一方面，本發(fā)明牽涉可以進(jìn)行工程化改造以插入、替換、或部分替換FVIII的 B域而不阻斷分子產(chǎn)生活性FVIII的正常加工的靶向域。例如，使用重組DNA技術(shù)，可以 生成FVIII分子，其中將單鏈抗體片段融合至FVIII B域的C端?；蛘?，也可以使用svFv 片段來(lái)替換整個(gè)或部分的FVIII B域。這可以經(jīng)由在B域編碼序列后以符合讀碼框方式 插入編碼svFv片段的DNA序列，或者替換一些或整個(gè)B域編碼序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。此策略會(huì)保 存FVIII的正常蛋白水解激活所要求的凝血酶切割位點(diǎn)。多種有效定位至血小板的針 對(duì) GPIIb/IIIa 的抗體是已知的（參見(jiàn)例如 Schwarz 等，Circ. Res. 99(1) :25-33, 2006 ; Jacobin 等，Clin. Immunol. 108(3):199-210, 2003 ;Christopoulos 等，Blood Coagul. Fibrinolysis4 (5) : 729-37, 1993 ;及 Chung 等，F(xiàn)ASEB J. 18 (2) : 361-363, 2004)。
[0070] 同樣地，含有RGD或RGD模擬物的肽也是對(duì)于靶向FVIII有用的配體，因?yàn)樵S多此 類(lèi)肽已經(jīng)描述為具有對(duì)GPIIb/IIIa的高結(jié)合親和力。這些包括線性肽、蛇毒肽、和環(huán)肽。也 可以使用非肽RGD模擬物。與抗體片段類(lèi)似，可以以化學(xué)法將RGD肽與FVIII偶聯(lián)?；蛘?， 可以使用重組DNA技術(shù)將RGD序列插入B域編碼序列中或者用于完全或部分替換FVIII的 B域編碼序列并表達(dá)。
[0071] 可以使用類(lèi)似的方法來(lái)制備靶向性FIX。例如，可以將靶向域連接至FIX分子的激 活域（氨基酸殘基191-226或145-180,這取決于偏愛(ài)，即+/-信號(hào)序列），其在將FIX激活 為FIXa中以蛋白水解方式除去。域可以使用與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)諸如激活域中的巰基、胺、 和羧基基團(tuán)反應(yīng)性的交聯(lián)劑來(lái)化學(xué)連接，或者經(jīng)由碳水化合物鏈來(lái)連接，如上文針對(duì)FVIII 所討論的。也可以使用重組技術(shù)（其中將靶向域的氨基酸序列插入FIX激活肽中），或者替 換激活肽序列的一部分來(lái)生成融合分子。插入的靶向域序列可以編碼單鏈抗體，或者其它 血小板結(jié)合肽序列，諸如R⑶結(jié)合肽。
[0072] 藥物組合物和用途
[0073] 本發(fā)明還涉及包含治療有效量的本發(fā)明的靶向性凝固因子和藥學(xué)可接受賦形劑 或載體的藥物組合物。"藥學(xué)可接受賦形劑或載體"是可以添加至活性成分以幫助配制或 穩(wěn)定制劑，而且不對(duì)患者引起顯著不利毒物學(xué)效果的物質(zhì)。此類(lèi)賦形劑或載體的例子是本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括水、糖諸如麥芽糖或蔗糖、清蛋白、鹽等。其它賦形劑或載體記載 于例如 Remington, s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.，Easton, Pa.，第 20 版，2000)。此類(lèi)組合物會(huì)含有有效量的靶向性凝固因子以及合適量的賦形劑或載體以制備 適合于對(duì)有所需要的患者有效施用的藥學(xué)可接受組合物。
[0074] 例如，可以以可隨出血事件的嚴(yán)重性而變化的劑量對(duì)罹患血友病A的受試者胃腸 內(nèi)施用偶聯(lián)物。靜脈內(nèi)施用的平均劑量范圍為對(duì)于手術(shù)前適應(yīng)癥為每千克40個(gè)單位、對(duì)于 微小出血為每千克15至20個(gè)單位、和對(duì)于維持劑量為8小時(shí)期間里施用的每千克20至40 個(gè)單位。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于治療血液學(xué)疾病的方法，包括對(duì)有所需 要的患者施用治療有效量的上述靶向性凝固因子。
[0076] 如本文中所使用的，"治療有效量"指在血流或靶組織中提供想要水平的靶向性因 子（或自靶向性形式釋放的相應(yīng)的非偶聯(lián)因子）所需要的靶向性凝固因子量。精確量會(huì)取 決于許多因素，包括但不限于治療性組合物的成分和物理特征、預(yù)期的患者群體、個(gè)體患者 考慮因素等，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定。
[0077] 如本文中所使用的，"患者"指接受醫(yī)學(xué)護(hù)理和/或治療的人或動(dòng)物個(gè)體。
[0078] 本文中所描述的多肽、材料、組合物、和方法意圖是本發(fā)明的代表性例子，并且要 理解的是，本發(fā)明的范圍不受例子范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，本發(fā)明可以用所公 開(kāi)多肽、材料、組合物和方法的變型實(shí)施，并且認(rèn)為此類(lèi)變型在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0079] 呈現(xiàn)以下實(shí)施例來(lái)例示本文中所描述的發(fā)明，但是不應(yīng)以任何方式解釋為限制本 發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
[0080] 為了本發(fā)明可以得到更好的理解，列出了以下實(shí)施例。這些實(shí)施例僅出于例示目 的，并且不要以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過(guò)提及而完整收錄本文中所提及的 所有出版物。
[0081] 實(shí)施例1 :對(duì)GPIIb/IIIa結(jié)合具有高親和力的經(jīng)修飾的RGD肽
[0082] 已經(jīng)描述了環(huán)肽有力地且選擇性地結(jié)合GPIIb/IIIa。使用一種此類(lèi)肽，即 Integrilin作為祀向域以與FVIII連接，因?yàn)橐呀?jīng)顯示了 Integrilin能選擇性結(jié)合 GPIIb/IIIa。通過(guò)在馬來(lái)酰亞胺模塊中添加能選擇性與蛋白質(zhì)中游離的半胱氨酸殘基 偶聯(lián)的短PEG接頭末端來(lái)修飾Integri 1 in。經(jīng)修飾的Integri 1 in稱(chēng)作僅具有接頭的 BHRF-1 (圖2A)，和具有接頭和熒光素（FITC)的BHRF-3(圖2B)。如圖3中所顯示的，經(jīng)修 飾的Integrilin保留對(duì)GPIIb/IIIa的親和力，因?yàn)樗鼈冇辛Φ刈钄嘌w蛋白原（Fbn)結(jié) 合固定化的GPIIa/IIIb。
[0083] 使用固相結(jié)合測(cè)定法來(lái)測(cè)量肽對(duì)GPIIb-IIIa的結(jié)合，其中測(cè)量測(cè)試化合物競(jìng)爭(zhēng) 血纖蛋白原結(jié)合。如下實(shí)施測(cè)定法。以O(shè).mL/孔χ2μ g/mL(緩沖液A(20mMTrispH7. 5、0. 15M NaCl、和 ImM 各種 MgCl2、CaCl2、和 MnCl2)中稀釋的）將純化的 GPIIb-IIIa(Innovative Research, Novi, MI)包被至96孔Immulon-B板上。于4°C溫育過(guò)夜后，用緩沖液B(50mM Tris ρΗ7· 5、0· lMNaCl、和各 lmMMgCl2、CaCl2、和MnCl2)中的 3. 5%BSA將平板于 30°C封閉 1 小時(shí)。 用緩沖液B清洗3次后，將稀釋的肽或蛋白質(zhì)溶液與0. 1 % BSA/緩沖液B中的3. 5nM生物素 化的血纖蛋白原組合，并添加至孔，于30°C溫育2小時(shí)。清洗（3次，緩沖液B)后，于30°C添 加1:4000鏈霉抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶（HRP) (Pierce Chemical Co.，Rockford, IL) 達(dá)1小時(shí)。最終的清洗步驟（3次，緩沖液B)后，用Ultra TMB(3, 3'，5, 5' -四苯基聯(lián)苯 胺）（Pierce Chemical Co.，Rockford, IL)將平板顯影5分鐘，用等體積的2M硫酸停止。于 450nm讀取平板吸光度，并使用4參數(shù)Logistic擬合來(lái)測(cè)定IC5(I值。
[0084] 然后，經(jīng)由位于FVIII的B域中的半胱氨酸（Cys)殘基來(lái)將經(jīng)修飾的Integrilin 肽（BHRF1)與 FVIII 偶聯(lián)。
[0085] 實(shí)施例2 :偶聯(lián)GPIIb/IIIa結(jié)合肽與FVIII
[0086] 全長(zhǎng)FVIII的多肽序列是本領(lǐng)域中已知的（參見(jiàn)例如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、 和如W02006/053299中所披露的）。
[0087] FVIII的濃縮和游離巰基基團(tuán)的脫帽
[0088] 可以在蛋白質(zhì)表達(dá)過(guò)程中通過(guò)培養(yǎng)基中存在的半胱氨酸來(lái)為位于重組FVIII的B 域中的Cys殘基加帽，但是它容易如下通過(guò)還原劑諸如TCEP的處理來(lái)除去。將FVIII (20mL) 融化，并在于2000x g (約3153rpm)在低溫（cold)中旋轉(zhuǎn)25分鐘的兩個(gè)Amicon? -15筒 (Millipore，Billerica，MA)中濃縮。2. 8mL保留物的濃度是約0. 8-0. 9mg/mL，其通過(guò)使用 NanoDrop? 分光光度計(jì)（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)的 A280 得到。然后使 用10mL Zeba脫鹽筒來(lái)交換緩沖液，所述10mL Zeba脫鹽筒用50mM Tris、150mM NaCl、2. 5mM CaCl2和lOOppm Tween? -80(聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯）預(yù)平衡。獲得具有0. 88mg/ mL濃度的2. 8mL蛋白質(zhì)溶液。然后將TCEP添加至終濃度0. 68mM，并于4°C將混合物溫和地 顛轉(zhuǎn)約3小時(shí)。通過(guò)兩次連續(xù)的Zeba筒旋轉(zhuǎn)來(lái)除去TCEP，并容許FVIII再次氧化至少30 分鐘，之后添加肽。除去TCEP后，F(xiàn)VIII濃度測(cè)量為0· 768mg/mL( "KG-R"）。
[0089] R⑶靶向肽的偶聯(lián)
[0090] 為 了將經(jīng)修飾的 Integrilin 肽 BHRF-1 偶聯(lián)至 FVIII，將 0· 294mg 肽（M. W. 1225) 添加至48yL干的二甲亞砜（DMS0)以制備5mM儲(chǔ)備溶液。然后將此儲(chǔ)備溶液（34.4UL) 添加至2. 8mLKG-R。80分鐘后，通過(guò)添加等摩爾量的半胱氨酸來(lái)淬滅反應(yīng)。然后針對(duì)起始 Tris緩沖液（2升）廣泛透析反應(yīng)混合物。BHRF-1-FVIII的終濃度是0. 74mg/mL，而產(chǎn)量是 2mg。也使用類(lèi)似的方法來(lái)制備BHRF-3-FVIII。
[0091] 如圖3中所顯示的，經(jīng)修飾的Integrilin肽，S卩BHRF-1和BHRF-3保留對(duì)GPIIb/ Ilia的親和力，因?yàn)樗鼈冇辛Φ刈钄嘌w蛋白原（Fbn)結(jié)合固定化的GPIIa/IIIb。與 BHRF-1偶聯(lián)的FVIII (FVIII-BHRF-1)顯示在抑制血纖蛋白原結(jié)合固定化的GPIIb/IIIa上 的高效力（IC5Q = 0· 043+/-0. 05nM(N = 3))。這甚至比親本BHRF-1肽更有力。表1中顯 示了結(jié)果。
[0092] 表 1
[0093]
【權(quán)利要求】
1. 一種靶向性凝固因子，其包含與至少一個(gè)特異性結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域連接 的凝固因子。
2. 權(quán)利要求1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX;和/ 或其中所述域是抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子；和/或其中所述血細(xì)胞是血小板，而所 述膜蛋白質(zhì)是GPIIb/IIIa ;和或其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽；和/或其中所述 域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段。
3. 權(quán)利要求1的靶向性凝固因子，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽，而所述域是 與所述FVIII的B域連接的抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
4. 權(quán)利要求3的靶向性凝固因子，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗 GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段。
5. -種藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求1的靶向性凝固因子和藥學(xué)可接受 賦形劑或載體。
6. -種用于治療血液學(xué)疾病的方法，包括對(duì)有所需要的患者施用有效量的權(quán)利要求1 的靶向性凝固因子。
7. -種用于將凝固因子靶向至血細(xì)胞表面的方法，包括連接所述凝固因子與至少一種 結(jié)合血細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)的域。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX ;和/或其中所述 血細(xì)胞是血小板或紅細(xì)胞；和/或其中所述域是抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子；和/或 其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述膜蛋白質(zhì)是GPIIb/IIIa ;和/或其中所述凝固因子是功 能性FVIII多肽；和/或其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗體的單鏈片段，和/或其 中進(jìn)一步從所述血細(xì)胞的表面釋放所述凝固因子。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述凝固因子是FVIII，而所述域是與所述FVIII的B域連 接的抗體片段、肽、肽模擬物、或小分子。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述血細(xì)胞是血小板，而所述域是R⑶肽或抗GPIIb/IIIa 抗體的單鏈片段。
【文檔編號(hào)】C07K14/755GK104045716SQ201410228025
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2008年5月16日
【發(fā)明者】理查德.費(fèi)爾德曼, 吉-揚(yáng).金, 蔣海英, 柯克.麥克萊恩, 潘峻亮, 格倫.皮爾斯, 伍國(guó)鴻, 趙曉燕 申請(qǐng)人:拜耳醫(yī)藥保健有限公司