專利名稱：源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG5及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病理學(xué)、農(nóng)藥學(xué)和微生物基因工程領(lǐng)域，提供了一個來源于稻瘟病菌的、在營養(yǎng)生長、孢子產(chǎn)生、附著胞形成與致病性中起重要作用的新基因mgATG5的啟動子與編碼區(qū)的核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。本發(fā)明提供的核苷酸序列和氨基酸序列可以作為靶標應(yīng)用于抗真菌藥劑的篩選與設(shè)計中，也可以利用該核苷酸序列的某一區(qū)段作為探針或利用該蛋白制備的抗體應(yīng)用于稻瘟病菌及其他真菌的與該序列具有一定同源性的基因的克隆中。
背景技術(shù)：
由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病是世界性的一種水稻上的毀滅性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失在10～30％之間。我國幾乎每年都有稻瘟病菌的流行爆發(fā)。最近的2005年，四川省和重慶市遭受到10年來最嚴重的稻瘟病，四川省共有20個市、127個縣的230萬畝稻田發(fā)生稻瘟病，重慶市共有100多萬畝稻田發(fā)生稻瘟病菌；這次稻瘟病流行迅速、危害程度重、發(fā)病水稻品種多、對水稻產(chǎn)量影響嚴重。除了水稻外，稻瘟病菌也能侵染其它50多種禾本科植物，也對小米(Eleusine coracana)、大麥(Hordeum vulgare)、小麥(Triticum aestivum)等重要農(nóng)作物造成嚴重的危害。稻瘟病菌也是一種研究植物病原真菌-寄主植物相互作用的模式生物，具有許多病原真菌共有的植物致病侵染循環(huán)，包括孢子產(chǎn)生、萌發(fā)、附著胞形成、侵染栓形成、侵入菌絲生長等致病過程；許多發(fā)達國家正在進行研究其致病分子機制，期望通過此類研究設(shè)計出新型農(nóng)藥篩選的藥靶，從而開發(fā)、設(shè)計新型抗真菌藥物。
稻瘟病菌的生活史包括有性階段和無性階段。有性階段由2個不同交配型的菌株交配后產(chǎn)生子囊和子囊孢子。稻瘟病菌的交配型由交配基因MAT1-1和MAT1-2控制。無性階段為營養(yǎng)菌絲分化產(chǎn)生分生孢子梗和梨形分生孢子。在自然界，稻瘟病菌主要通過無性階段完成生活史，而分生孢子是植物的主要侵入源。
稻瘟病菌無性孢子落到水稻葉片表面后，侵染過程開始。當孢子與水相遇后，孢子頂端分隔內(nèi)的粘膠釋放出來，使孢子緊緊粘附在水稻葉片表面。水稻葉片表面具有一層蠟質(zhì)角質(zhì)膜，該膜具有很大的疏水性，而粘膠使孢子粘附在這一疏水的排斥性表面。粘附后2小時內(nèi)，孢子萌發(fā)并產(chǎn)生芽管。芽管通常從孢子的一個頂端細胞伸出并生長。芽管頂端也分泌一種粘膠物質(zhì)，使芽管緊緊粘附在植物葉片表面，防止被水滴沖走。4小時內(nèi)，芽管生長停止，頂端鉤狀體形成并膨大形成附著胞?；|(zhì)的硬度是芽管分化的一個重要因子，如稻瘟病菌孢子僅在硬的固體表面形成附著胞，而不能在液體表面或軟基質(zhì)表面形成附著胞。而基質(zhì)疏水表面也通過類似于水稻葉片表面的蠟質(zhì)的作用激發(fā)附著胞的形成。在孢子萌發(fā)后不久，產(chǎn)生芽管的細胞進行一次有絲分裂。一個細胞核留在孢子內(nèi)，而另一個細胞核通過芽管移動，與孢子和芽管的細胞質(zhì)內(nèi)容物一起轉(zhuǎn)移到形成中的附著胞。這些細胞質(zhì)內(nèi)容物包括儲存在正在發(fā)育的附著胞中央大液泡的脂滴。然后，在附著胞和芽管之間形成隔膜。隨著附著胞成熟，附著胞細胞壁出現(xiàn)黑色素沉積，最終形成黑色素層。黑色素層允許水分子自由通過，但溶解于水的物質(zhì)不能自由通過，從而讓附著胞建立并維持一個很大的細胞內(nèi)膨壓。附著胞的黑色素化過程完成后，附著胞產(chǎn)生一根狹小的菌絲--侵染栓。侵染栓對水稻葉片的穿透由于附著胞產(chǎn)生巨大的膨壓而得以完成。膨壓只要稍微降低就會阻止附著胞在人工表面或水稻葉片表面穿透。測量結(jié)果表明附著胞膨壓達到8.0Mpa，相當于40倍汽車輪胎的壓力。附著胞黑色素層的作用在于限制了細胞壁的滲透性，有利于細胞內(nèi)滲透物質(zhì)的積累和膨壓的產(chǎn)生。甘油是一種可溶性物質(zhì)，產(chǎn)生的滲透勢足以使附著胞產(chǎn)生巨大的膨壓。在膨壓產(chǎn)生過程中，甘油在細胞內(nèi)累積濃度超過3M。
侵入后，侵染栓分化成侵染菌絲，迅速在水稻葉片內(nèi)生長并侵染其它細胞。侵入72小時后，病原菌生物量已經(jīng)達到感染葉片的10％。5～7天后，分生孢子梗上分化出大量新的分生孢子，并從病斑釋放出來。這些新形成的孢子被潮濕的空氣帶到鄰近的植物開始新的侵染過程。在冬天，稻瘟病菌以菌絲和分生孢子形式在稻草和稻谷上越冬，完成侵染循環(huán)。
稻瘟病菌的致病過程是一個復(fù)雜的分子過程。目前已經(jīng)克隆了許多與稻瘟病菌致病性相關(guān)的基因，如MPG1、CPKA、PMK1、MAGB、PLS1、SMO1、PDE1、MPS1、PTH11、CBP1、ICL1、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1。其中多數(shù)與附著胞形成有關(guān)，如PMK1、MAGB、MAC1等；部分參與黑色素的形成和積累(ALB1、RSY1、BUF1等)以及甘油合成相關(guān)(ICL1等)；少數(shù)與稻瘟病菌的穿透相關(guān)(MPS1、PLS1、PDE1等)。稻瘟病菌芽管分泌的一種疏水蛋白，由MPG1基因編碼，參與菌絲和水稻葉表的互作，為形成正常的附著胞所必須(Talbot，1999)。MAGB基因編碼的異源三聚G蛋白的α亞單位和MAC1編碼的cAMP環(huán)化酶也是形成附著胞所必需的(Liu and Dean，1997；Choiand Dean，1997；Kulkarni and Dean，2004)。CPKA基因編碼的cAMP依賴性蛋白激酶A的催化亞單位PKA-c是附著胞穿透所必須的(Mitchell & Hamer，1995；Xu et al，1997)，而正在分化的芽管中的PKA活性對于形成正常的附著胞也非常關(guān)鍵(Adachi & Hamer1998)。同樣，有絲分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)基因PMK1是附著胞形成所需的(Xu & Hamer 1996)。黑色素合成系列基因也證明是附著胞穿透所不可缺少的(Chumley and Valent，1990；Motoyama等，1998)。在各種突變子庫中也發(fā)現(xiàn)了一些突變子缺失致病性，如編碼一種與ATP運輸體(ATP-bindingcassette transporters)相關(guān)的蛋白的ABC1基因(Urban等，1999)、編碼P-型ATP酶的PDE1基因(Balhadere等，1999，2001)和編碼tetraspannin樣蛋白的PLS1基因(Clergeot等，2001)。盡管如此，稻瘟病菌的分子致病機制還是不清楚。
鑒定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是與侵入過程相關(guān)的基因，可以為設(shè)計、篩選抗真菌藥物提供有用的靶標位點。目前已經(jīng)在包括稻瘟病菌在內(nèi)的一些真菌中證明了一些藥物的靶點，如三環(huán)唑是一種很重要的稻瘟病菌殺菌劑，其作用是抑制黑色素的合成，靶點是稻瘟病菌的三羥萘還原酶；多肽殺菌劑sorphen A的作用靶點是青霉的的脫甲基酶(CYP51)。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定、克隆新的在稻瘟病菌的致病過程中具有重要功能的致病性基因，可以為設(shè)計、篩選新的抗真菌藥物提供有用的藥物靶點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的、對稻瘟病菌等真菌的菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生、分生孢子發(fā)芽、附著孢形成和侵染栓形成以及致病性有重要影響的基因mgATG5及其用途。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG5，該基因的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO1。
本發(fā)明同時提供了上述基因mgATG5編碼的cDNA序列，該cDNA序列具有SEQ IDNO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明同時提供了上述基因mgATG5編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
本發(fā)明同時提供了上述基因mgATG5的啟動子，該啟動子具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了利用上述基因mgATG5的表達作為靶標，在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了利用上述蛋白質(zhì)的表達與修飾作為靶標，在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了結(jié)合利用上述蛋白質(zhì)以及啟動子作為靶標，在設(shè)計和篩選抗真菌藥物的中應(yīng)用。
本發(fā)明的基因mgATG5及該基因編碼的蛋白質(zhì)序列，以其全長核苷酸為探針，通過雜交分離源于其它病原真菌的具有相同功能的基因；或以序列設(shè)計引物，通過PCR分離源于其它病原真菌的具有相同功能的基因；或以其編碼的蛋白質(zhì)，雜交分離源于其它病原真菌的具有相同功能的蛋白。上述真菌包括禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麥穎枯病菌(Stagonospora nodorum)。
本發(fā)明所稱的抗真菌藥物包括抗稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麥穎枯病菌(Stagonospora nodorum)的藥物。
本發(fā)明利用基因敲除和基因互補證明了稻瘟病菌中一個對稻瘟病菌附著胞的穿透過程以及致病力具有關(guān)鍵性作用的基因mgATG5。該基因的啟動子、編碼蛋白的表達和修飾可以作為新農(nóng)藥設(shè)計和篩選的藥物靶點。
本發(fā)明的基因mgATG5是通過cDNA差減文庫從稻瘟病菌中克隆的。具體過程包括通過篩選稻瘟病菌cDNA的SSH差減文庫獲得在菌絲或附著孢中差異表達的EST序列。通過RT-PCR驗證目的基因在稻瘟病菌菌絲、孢子、附著孢中的存在情況。通過高保真長距離PCR從稻瘟病菌基因組DNA中獲得目的基因。通過PCR或以該基因的EST序列為探針從稻瘟病菌cDNA文庫驗證和分離目的基因的完整的cDNA。目的基因的功能驗證和注釋通過目的基因的敲除和互補恢復(fù)來完成。目的基因在稻瘟病菌內(nèi)的作用位點通過目的基因與報告基因GFP的融合蛋白在細胞的位置來確定。基因啟動子的測定是將啟動子與報告基因GFP連接，通過觀察GFP在啟動子指導(dǎo)下在稻瘟病菌的各個發(fā)育階段的表達來進行的。
本發(fā)明所涉及的稻瘟病菌SSH差減文庫是指利用SSH技術(shù)(Suppression subtractivehybridization，SSH)構(gòu)建的、含有若干獨立克隆的稻瘟病菌cDNA文庫。
本發(fā)明所涉及的RT-PCR分析是指根據(jù)cDNA序列設(shè)計引物，對基因缺失突變子和互補恢復(fù)突變子的mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA進行PCR擴增，分別驗證基因缺失突變子和基因互補恢復(fù)突變子中基因缺失和恢復(fù)后的轉(zhuǎn)錄本等情況。
本發(fā)明所涉及的目的基因克隆是指根據(jù)SSH文庫中獲得的EST序列，以此設(shè)計探針從cDNA文庫中篩選cDNA克隆，對獲得的cDNA克隆進行測序；并利用cDNA序列比對基因組數(shù)據(jù)庫中DNA序列，以此設(shè)計引物從稻瘟病菌基因組DNA擴增獲得基因的DNA序列，克隆到T載體中，進行測序；根據(jù)獲得的DNA序列利用程序分析其轉(zhuǎn)錄序列，并以此設(shè)計引物從稻瘟病菌cDNA文庫中擴增獲得基因的cDNA序列，連接到T載體中，進行測序分析。
本發(fā)明所涉及的Shouthern雜交分析是指利用基因側(cè)翼的DNA序列作為探針，對所獲得的基因敲除轉(zhuǎn)化子和基因恢復(fù)轉(zhuǎn)化子分別進行Southern雜交，以分析基因敲除轉(zhuǎn)化子的基因缺失情況和敲除載體的插入拷貝數(shù)，以及分析基因互補恢復(fù)轉(zhuǎn)化子基因插入拷貝數(shù)等情況。
本發(fā)明所涉及的目的基因的功能確定是通過mgATG5的敲除和恢復(fù)進行的。具體的mgATG5基因的敲除過程包括敲除載體的構(gòu)建，將敲除載體轉(zhuǎn)入稻瘟病菌，得到基因敲除突變子；mgATG5的基因敲除突變子的互補恢復(fù)過程包括互補載體的構(gòu)建，互補載體導(dǎo)入基因敲除突變子菌株，得到基因恢復(fù)的轉(zhuǎn)化子。基因敲除載體的構(gòu)建是指將待敲除基因的兩側(cè)翼的一段DNA片段各自連接到含潮霉素抗性基因載體的潮霉素抗性基因的兩側(cè)。基因互補載體的構(gòu)建是指將含有目標基因的全長的DNA片段與帶有一個不同于潮霉素抗性基因的篩選標記(本發(fā)明中是草胺磷抗性基因)的載體連接。在本發(fā)明中將外源載體導(dǎo)入稻瘟病菌的優(yōu)選方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，實驗者也可以根據(jù)自己的情況選用其它方法如ATMA法、基因槍法等。本發(fā)明中，基因敲除載體所導(dǎo)入的稻瘟病菌菌株是野生型菌株Guy11，實驗者也可以選用其它稻瘟病菌野生型菌株，基因缺失使突變子的表型發(fā)生不同于原來野生型的變化，對水稻等植物的致病性喪失。本發(fā)明中，基因互補載體所導(dǎo)入的菌株是本發(fā)明所得到的基因缺失突變子，互補載體在該基因缺失突變子基因組中的異位整合使該突變子的表型恢復(fù)正常。
本發(fā)明所提供的mgATG5的cDNA克隆過程包括從SSH差減文庫中篩選含有目標基因mgATG5的cDNA克隆，獲得其EST序列，利用其EST序列從稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫中獲得相對應(yīng)的一段DNA序列，在根據(jù)其序列設(shè)計引物從稻瘟病菌基因組DNA中擴增到目標基因的DNA片段，測序獲得其DNA序列，利用GenScan(http//genes.mit.edu/genscan.html)進行啟動子、編碼區(qū)和加尾點的預(yù)測。根據(jù)預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計引物，并通過PCR從稻瘟病菌cDNA文庫中擴增獲得，其序列如SEQ IDNO2所示。
本發(fā)明還提供了mgATG5編碼的蛋白質(zhì)，其具有如SEQ ID NO3所示氨基酸序列或與SEQ IDNO2所示的序列具有42％以上的序列一致性的并具有相似功能的氨基酸序列。該蛋白可以源于稻瘟病菌，也可以源于其它病原真菌。本發(fā)明提供了禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麥穎枯病菌(Stagonosporanodorum)的中具有與mgATG5蛋白具有42％以上氨基酸序列一致性的同源蛋白的氨基酸序列。
本發(fā)明所涉及的基因因為同源重組造成的基因缺失突變導(dǎo)致稻瘟病菌產(chǎn)孢量下降、孢子萌發(fā)和附著胞形成延遲、附著胞膨壓降低和侵入栓形成率降低，并且在感病水稻品種上的致病力缺失。因此，本發(fā)明最重要的用途是應(yīng)用上述成果，設(shè)計和篩選能夠破壞該基因的表達、剪切及其編碼蛋白的表達的化合物，或設(shè)計和篩選能對該蛋白的氨基酸序列進行修飾的化合物，從而開發(fā)出新的抗真菌藥物。此外，本發(fā)明的用途還包括利用該基因的DNA或cDNA序列作為探針在其它真菌中分離與該基因具有一定序列同源性的序列。
以上述所克隆基因編碼蛋白的表達、修飾為靶標，設(shè)計、篩選新型抗真菌藥物，或者以具有如SEQ ID No3所示序列或與SEQ ID No3具有42％以上序列一致性的并具有相似功能的蛋白中任一區(qū)域的氨基酸序列設(shè)計多肽，并制備抗體用于檢測在化合物處理狀況下蛋白的表達，均屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
以上述所克隆基因的啟動子為靶標，設(shè)計和篩選新型抗真菌藥物，也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
因此，本發(fā)明具有以下優(yōu)點1、附著胞是稻瘟病菌侵入寄主植物的重要結(jié)構(gòu)，附著胞膨壓是稻瘟病菌穿透寄主植物表皮角質(zhì)層的主要機械力量，mgATG5基因參與稻瘟病菌附著胞膨壓的產(chǎn)生，mgATG5基因與稻瘟病菌的致病性密切相關(guān)，mgATG5失活或缺失，導(dǎo)致稻瘟病菌附著胞膨壓下降，致病性喪失。因此mgATG5基因在稻瘟病菌致病過程中作用重大。
2、稻瘟病菌借助分生孢子在水稻等植物葉片之間傳播，分生孢子是稻瘟病菌致病循環(huán)中的一個環(huán)節(jié)，消滅分生孢子從而切斷致病循環(huán)是防止病菌流行的一個有效措施。mgATG5參與稻瘟病菌分生孢子的形成過程，mgATG5失活或缺失，導(dǎo)致稻瘟病菌分生孢子形成率顯著下降(約為野生型的4.5％)，可以有效抑制稻瘟病的流行和爆發(fā)。因此mgATG5基因在稻瘟病菌致病過程中作用重大。
3、mgATG5為開發(fā)新的抗真菌藥物提供了特異的藥物作用靶標，針對mgATG5作為藥物開發(fā)的靶標藥靶，通過對大量化合物進行篩選，可以找到能夠與藥靶起作用的物質(zhì)，這些物質(zhì)可以被用做阻止真菌侵染。由于藥靶的特異性，篩選到的抗真菌藥物一般對于動物和植物的毒性較小。


圖1是野生型菌株Guy11與mgATG5基因缺失突變子ΔATG5及mgATG5互補轉(zhuǎn)化子ATG5-HB1在水稻感病品種CO39上的致病性比較圖。Guy11為野生型菌株，ΔATG5為mgATG5基因缺失突變子，ATG5-HB1為mgATG5基因互補恢復(fù)轉(zhuǎn)化子，明膠為0.2％(w/v)的明膠對照溶液。噴霧接種的孢子濃度為1×105/ml，接種后7天拍照。
圖2是野生型菌株Guy11與mgATG5基因缺失突變子ΔATG5及mgATG5互補轉(zhuǎn)化子HB24在大麥表皮上侵入栓形成比較圖。Guy11為野生型菌株，ΔATG5為mgATG5基因缺失突變子；24h、48h、72h、96h為接種后拍照時間。離體點接種的孢子濃度為1×105/ml。
圖3是基因敲除載體構(gòu)建示意圖。
圖4是基因互補載體構(gòu)建示意圖。
圖5是基因敲除位置和過程示意圖。
圖6是野生型菌株Guy11與mgATG5基因缺失突變子ΔATG5及mgATG5互補突變子ATG5-HB1形成的附著胞膨壓(附著胞塌陷率)大小比較圖，為孢子接種24h后附著胞在不同甘油濃度溶液(1M、2M、3M和4M)中的細胞塌陷率。
圖7是野生型菌株Guy11與mgATG5基因缺失突變子ΔATG5及mgATG5互補突變子ATG5-HB1的分生孢子形成率比較圖。稻瘟病菌菌株在CM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)11天后，用直徑為0.7CM的打孔器打取菌絲片，統(tǒng)計孢子的數(shù)量；單位為×104個孢子/片。
圖8是野生型菌株Guy11與mgATG5基因缺失突變子ΔATG5及mgATG5互補轉(zhuǎn)化子ATG5-HB1的孢子萌發(fā)率(％)比較圖。
圖9是野生型菌株Guy11與mgATG5基因缺失突變子ΔATG5及mgATG5互補轉(zhuǎn)化子ATG5-HB1的附著孢形成率(％)比較圖。
圖10是野生型菌株Guy11與mgATG5基因缺失突變子ΔATG5及mgATG5互補轉(zhuǎn)化子ATG5-HB1在MM培養(yǎng)基、缺氮培養(yǎng)基、缺炭培養(yǎng)基上的生長速度比較圖。MM為MM培養(yǎng)基，MM-N為缺氮培養(yǎng)基，MM-C為缺炭培養(yǎng)基；測定的菌落直徑為生長12天時的菌落直徑。
圖11是mgATG5基因編碼蛋白的細胞質(zhì)定位圖。mgATG5-GFP融合蛋白分布于細胞質(zhì)中，在某些位置呈點狀分布，左側(cè)為明視場下拍攝，右側(cè)為暗視場下拍攝。左上(A)為普通光鏡下的孢子照片，右上(B)為熒光顯微鏡下的孢子照片，左中(C)為普通光鏡下的菌絲照片，右中(D)為熒光顯微鏡下的菌絲照片，左下(E)為普通光鏡下的附著胞照片，右下(F)為熒光顯微鏡下的附著胞照片。
圖12是野生型菌株Guy11與mgATG5基因缺失突變子ΔATG5及mgATG5互補轉(zhuǎn)化子ATG5-HB1形成的孢子中的糖原顆粒比較圖(電鏡照片)。上圖(A)為野生型菌株Guy11，中圖(B)為mgATG5基因缺失突變子ΔATG5，下圖(C)為mgATG5互補轉(zhuǎn)化子ATG5-HB1。
圖13是野生型菌株Guy11與mgATG5基因缺失突變子ΔATG5在缺氮培養(yǎng)基中自噬泡形成的比較圖。上圖為野生型菌株Guy11菌株自噬泡形成的照片，中圖為mgATG5基因缺失突變子菌株自噬泡形成的照片，下圖為mgATG5互補轉(zhuǎn)化子ATG5-HB1自噬泡形成的照片。
圖14是幾種病原真菌中ATG5蛋白的序列比較圖(Phylip tree，NJ)。圖示說明mgATG5、fgATG5、ssATG5、snATG5分別為來自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麥穎枯病菌(Stagonospora nodorum)的ATG5蛋白。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。
實施例1與稻瘟病菌致病性相關(guān)的基因的克隆1、SSH文庫篩選稻瘟病菌附著胞cDNA與產(chǎn)孢菌絲cDNA差減后獲得的差減cDNA，克隆到T載體，測序獲得cDNA序列，將獲得的序列與稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫比較，確定獲得的差異表達基因，并用RT-PCR驗證差異表達特異性。
2、mgATG5 cDNA的克隆取保存在-20℃的稻瘟病菌Guy11菌株的附著胞cDNA文庫，根據(jù)預(yù)測的基因cDNA序列設(shè)計合成PCR引物，擴增包含整個基因編碼區(qū)在內(nèi)的基因cDNA片段，克隆到T載體，測序獲得mgATG5 cDNA的序列，其序列如SEQ ID2所示。
3、mgATG5基因組DNA的克隆取保存在-20℃的稻瘟病菌Guy11菌株的基因組DNA，根據(jù)預(yù)測的基因DNA序列設(shè)計合成PCR引物，擴增包含整個全長基因的DNA片段，克隆到T載體，測序獲得mgATG5基因組DNA的序列，其序列如SEQ ID1所示。
實施例2mgATG5基因缺失突變子的獲得和鑒定1、基因敲除載體的構(gòu)建將mgATG5基因上游和下游的長約500～2000bp的DNA片段分別插入到含有潮霉素抗性基因的載體中潮霉素抗性基因的兩側(cè)，如圖3和圖5所示。具體如下采用高保真PCR的方法分別從稻瘟病菌DNA基因組中擴增mgATG5基因上游和下游的長約500～2000bp的DNA片段，先連接到T載體上；然后上游DNA片段用限制性內(nèi)切酶XhoI和SalI從T載體上切下，插入到含有潮霉素抗性基因的pBShph1載體的同樣酶切位點上；接著下游DNA片段也從T載體上用限制性內(nèi)切酶SpeI和XbaI從T載體上切下，插入到上述已經(jīng)插入上游DNA片段的pBShph1載體的SpeI和XbaI位點上，即獲得mgATG5基因敲除載體。含有潮霉素抗性基因的pBShph1載體的構(gòu)建過程先采用高保真PCR的方法從pCB1003質(zhì)粒中擴增到潮霉素抗性基因(HPH或HygBr)，連接到T載體上；然后用限制性內(nèi)切酶HindIII和SalI切下，并插入到pBS質(zhì)粒的同樣酶切位點中，即獲得pBShph1載體。
2、稻瘟病菌原生質(zhì)載體的制備和DNA轉(zhuǎn)化稻瘟病菌菌株先在CM平板上生長6天左右。切取兩個直徑約3cm的菌落，置于150mL CM液體培養(yǎng)基中，用搗碎器將其搗碎；然后均勻分裝到兩瓶200mL CM液體培養(yǎng)基中，28℃，125rpm，培養(yǎng)48小時。四層紗布過濾收集菌絲，用無菌水沖洗兩遍，將水分壓干。菌絲在酶解液(Glucanex，酶液濃度7.5mg/mL，0.7M NaCl溶液)酶解2-3hr中30℃，80rpm。取出酶解液，三層濾紙過濾，0.7M NaCL洗滌，除去殘渣，濾液收集到50mL的離心管中。4℃，3000rpm，離心10min。用10-20mL STC(1.2M Sorbitol，10mM Tris-HCL PH7.5，20mM CaCL2)懸浮沉淀。4℃，3000rpm，離心10min；重復(fù)兩次。取適量的STC懸浮沉淀，使終濃度為0.5～1.0×108個/mL。每個50ml離心管分裝150μl原生質(zhì)體，加入2μg線性化DNA，室溫下放置25min。逐滴加入1mL PTC(60％PEG4000，10mM Tris-HCL PH7.5，20mMCaCL2)，混勻，室溫放置25min。緩慢加入5mL OCM液體培養(yǎng)基(CM液體培養(yǎng)基中加入1.2M Sorbitol/1M Sucrose)，輕輕搖勻，置于28℃，100rpm，搖過夜。每管過夜培養(yǎng)的原生質(zhì)體中加入含有200μg/mL潮霉素的固體OCM Top培養(yǎng)基(CM液體培養(yǎng)基中加入20％Sucrose，瓊脂粉1g)，混勻，倒入已鋪有OCM Bottom培養(yǎng)基(CM液體培養(yǎng)基中加入20％Sucrose，瓊脂粉1.5g)的平板，每管鋪三個平板。黑暗，28℃，培養(yǎng)約一周左右，挑取轉(zhuǎn)化子，接種到含有200μg/mL潮霉素的固體CM上。
3、mgATG5基因缺失突變子的鑒定提取具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子DNA，用PCR、Southern雜交等方法驗證轉(zhuǎn)化子。
實施例3、mgATG5基因缺失突變子的互補恢復(fù)將mgATG5基因的全長DNA序列連接到帶有草胺磷抗性基因的載體中，如圖4所示。具體為采用高保真長片段PCR方法(LD PCR)從稻瘟病菌基因組DNA中擴增得到含有mgATG5基因全長編碼區(qū)、啟動子區(qū)域和終止區(qū)區(qū)域的DNA片段，先插入到pCR-XL-TOPO載體中，然后再用限制性內(nèi)切酶NotI和MluI從TOPO載體中切下該DNA片段，插入到含有草胺磷抗性基因的pBARKS1載體的NotI和MluI位點，即構(gòu)建成mgATG5基因的互補恢復(fù)載體——pBAR-ATG5載體。在進行DNA的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化前，pBARATG5載體在用限制性內(nèi)切酶NotI酶切線性化。
然后按照實施例2的方法，將線性化的此mgATG5基因的互補載體轉(zhuǎn)化mgATG5基因缺失菌株原生質(zhì)體。挑取具有草胺磷抗性的轉(zhuǎn)化子接種到含有草胺磷的固體CM上。提取具有草胺磷抗性的轉(zhuǎn)化子DNA和RNA，用RT-PCR、Southern雜交等方法驗證轉(zhuǎn)化子。
通過以下方法比較了基因恢復(fù)后表型的變化狀況在完全培養(yǎng)基上比較了mgATG5基因突變子和互補恢復(fù)轉(zhuǎn)化子(即互補突變子或互補轉(zhuǎn)化子)的產(chǎn)孢量變化(見圖7)；比較了mgATG5基因突變子和互補恢復(fù)轉(zhuǎn)化子孢子的萌發(fā)變化(見圖8)；比較了mgATG5基因突變子和互補恢復(fù)轉(zhuǎn)化子的附著孢形成率的變化(見圖9)；比較了mgATG5基因突變子和互補恢復(fù)轉(zhuǎn)化子形成的附著孢的膨壓變化(見圖6)；比較了mgATG5基因突變子和互補恢復(fù)轉(zhuǎn)化子形成的菌絲自噬泡形成情況(見圖13)；比較了mgATG5基因突變子和互補恢復(fù)轉(zhuǎn)化子形成的孢子的糖原含量變化(見圖12)；在MM培養(yǎng)基、缺氮培養(yǎng)基、缺碳培養(yǎng)基上比較mgATG5基因突變子和互補恢復(fù)轉(zhuǎn)化子的生長變化(見圖10)；互補轉(zhuǎn)化子致病性的恢復(fù)見圖1。
實施例4mgATG5基因缺失突變子和互補突變子的致病性測定1、噴霧接種大麥或水稻CO39種子種于花缽泥土中，培養(yǎng)8天(大麥)或14天(3～4葉期的水稻CO39植株)。從培養(yǎng)12天的CM平板上洗取稻瘟病菌野生型菌株、突變子和互補轉(zhuǎn)變子的孢子，孢子濃度用0.2％(wt/v)的明膠稀釋至1×105/ml。用微型的油漆噴霧器將孢子懸浮液噴霧接種到植株葉片表面。同時，以0.2％的明膠作為陰性對照噴霧接種。接種植物放在一個潮濕箱子內(nèi)，于25℃黑暗環(huán)境中保濕培養(yǎng)24小時(大麥)或48小時(水稻)。然后接種植物放入人工氣候箱(25℃，80％以上濕度，12小時光照周期)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)至第4天(大麥)或第7天、第14天(水稻)，使植物病癥充分顯示。拍照記錄植物葉片的稻瘟病癥狀，并根據(jù)Bonman等(1986)報道的方法記錄和評價植物的病癥嚴重程度。同時，從每株受試植物中挑選一片受感染最嚴重的葉片，記錄葉片上5cm長的一段區(qū)域內(nèi)的稻瘟病菌病斑。結(jié)果見圖1。
2、離體接種大麥種子種于花缽泥土中，培養(yǎng)7～10天。從培養(yǎng)12天的CM平板上洗取稻瘟病菌野生型菌株、突變子和互補轉(zhuǎn)變子的孢子，稀釋至孢子濃度為5×104/ml或1×105/ml。孢子液20μl一滴點接種于離體大麥葉片上表面。在人工氣候箱內(nèi)保濕光照培養(yǎng)(光照/黑暗，12h∶12h)，25℃。分別在培養(yǎng)24h，48h，72h和96h后，取出部分葉片觀察。先觀察病斑形成情況，并拍照記錄。然后剪取部分病斑放入甲醇溶液中固定并脫去葉綠素。病斑葉片在甲醇溶液中固定24小時(室溫)后，移入乳酚油固定透明液(乳酚油∶95％乙醇＝1∶2)室溫固定1小時。乳酚油配方為乳酸20ml、苯酚20ml、20％甘油40ml、蒸餾水20ml。病斑葉片再用苔酚藍/苯胺藍(0.01％苔酚藍/0.06％苯胺藍，乳酚油)染色5～10分鐘。染色葉片在乳酚油中脫色。在顯微鏡下觀察病斑發(fā)展情況，統(tǒng)計24h和48h的附著胞穿透率、以及侵入菌絲的生長和次生孢子的產(chǎn)生情況，并拍照記錄。結(jié)果見圖2。
實施例5mgATG5的亞細胞定位將GFP基因的完整編碼區(qū)序列連接到不帶終止密碼子的mgATG5基因編碼區(qū)的下游，構(gòu)建成融合基因并連接到帶有潮霉素抗性基因的載體中。按照實施例2的方法，將線性化的此載體轉(zhuǎn)化野生型Guy11菌株原生質(zhì)體。挑取具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下觀察mgATG5-GFP融合蛋白在稻瘟病菌細胞中的分布。結(jié)果表明mgATG5定位于細胞質(zhì)中，在有些細胞器中數(shù)量比較大。結(jié)果見圖11。
實施例6mgATG5啟動子的界定和表達分析將GFP基因的完整編碼區(qū)序列連接到mgATG5基因編碼區(qū)上游(不含編碼區(qū)序列)的一段DNA序列后，構(gòu)建成融合基因并連接到帶有潮霉素抗性基因的載體中。按照實施例2的方法，將線性化的此載體轉(zhuǎn)化野生型Guy11菌株原生質(zhì)體。挑取具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下觀察mgATG5啟動子指導(dǎo)下的GFP蛋白在稻瘟病菌不同發(fā)育階段的表達情況。mgATG5啟動子序列見SEQ ID NO4所示。
實施例7真菌ATG5蛋白的生物信息學(xué)分析為了明確ATG5蛋白在其他病原真菌中是否保守，針對下列病原真菌禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麥穎枯病菌(Stagonospora nodorum)，將mgATG5蛋白的氨基酸序列對這些真菌的蛋白序列進行Blastp檢索，獲得上述病原真菌的同源蛋白的氨基酸序列，其序列分別如SEQ ID 5、6和7所示，并將這些蛋白分別命名為fgATG5、ssATG5和snATG5。序列分析表明上述真菌的ATG5蛋白在氨基酸序列上與mgATG5蛋白的一致性分別達到59％，54％和42％。利用clustalw程序(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)繪制的上述真菌的ATG5蛋白的同源性關(guān)系圖(Phylip tree)見圖14。
實施例8利用mgATG5蛋白的表達或修飾作為靶標，篩選抗真菌的藥物。
把稻瘟病菌在液體完全培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，收集菌絲后分成若干小份，每一份中加入待篩選的化合物或候選藥物繼續(xù)在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)小時，然后在缺氮培養(yǎng)基中(同時也加入待篩選的化合物或候選藥物)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2小時左右，取菌絲在相差顯微鏡下觀察菌絲的自噬泡形成狀況(圖13)，或者菌絲利用常規(guī)電鏡制片方法制成超薄切片后在電子顯微鏡下觀察自噬泡的形成狀況。如果mgATG5蛋白發(fā)生被候選藥物修飾事件而失去活性，則菌絲不形成自噬泡。獲得的化合物再利用實施例4的方法，測定野生型稻瘟病菌在這種化合物存在的條件下對水稻的致病性有沒有減弱，進一步確定化合物的抗真菌效果。
實施例9利用mgATG5的表達作為靶標，篩選抗真菌的藥物。
把稻瘟病菌在液體完全培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，收集菌絲后分成若干小份，每一份中加入待篩選的化合物或候選藥物繼續(xù)在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)小時，然后在缺氮培養(yǎng)基中(同時也加入待篩選的化合物或候選藥物)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2小時左右，提取菌絲的RNA，采用實時定量PCR的方法檢測mgATG5的表達狀況。如果mgATG5的表達被候選藥物抑制，則菌絲細胞內(nèi)沒有mgATG5的轉(zhuǎn)錄本或mgATG5的轉(zhuǎn)錄本顯著減少。獲得的化合物再利用實施例4的方法，測定野生型稻瘟病菌在這種化合物存在的條件下對水稻的致病性有沒有減弱，進一步確定化合物的抗真菌效果。
實施例10利用mgATG5的啟動子作為靶標，篩選抗真菌的藥物。
把mgATG5的啟動子與熒光蛋白GFP構(gòu)建成融合蛋白載體，或把mgATG5的啟動子與熒光蛋白GFP以及mgATG5蛋白一起構(gòu)建成融合蛋白載體，通過實施例2的方法轉(zhuǎn)入到稻瘟病菌中，然后把在mgATG5的啟動子調(diào)控下的GFP表達的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化子菌株在液體完全培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，收集菌絲后分成若干小份，每一份中加入待篩選的化合物或候選藥物繼續(xù)在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)小時至數(shù)天，取菌絲在熒光顯微鏡下觀察菌絲的GFP的綠色熒光表達情況。如果mgATG5的啟動子的被化合物抑制而失去活性，則GFP蛋白不表達從而菌絲失去綠色熒光。獲得的化合物再利用實施例4的方法，測定野生型稻瘟病菌在這種化合物存在的條件下對水稻的致病性有沒有減弱，進一步確定化合物的抗真菌效果。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
序列表SEQ ID NO1CTCTAGGGGG TTGCAGTGCG TTCGTCACGC GTAAGGCTTC CTCGGCCAGT AAGATGGTGT 60GCTGGGGGGA CTTTTCTTTC TGACCTGGAA TCACTCACTG CTGGTTGCTT GCCAAGCTTG 120CTTGCTCGGA AAGGGGTTAA TACAAAACCA GCTAGAAAAA AAAAAAGATC TACAAATGGT 180GCATGTCTCA TCGCGGGAAC GTGAATGGTT CGTTTTGCTG GCTGTAGTCT GTACCTCTAA 240TTTCTTTTTT TTTCTTTTTT CCCCGGTGGC TTTTTGGATT CCCTCACTGC AAAAAAGAGA 300TGGAAGCGAG TGCAACCTGA TAGTGGCTAC ATGCCAACCT AGCTAGCTAT ACATCCTTTT 360ACAGCCTGGG CCATTTGAAT TCGGCGGGCA AGCGGGGTTA ATGGTACTCT CTCTGGTTTT 420TGGTAGTGGT TCCCTGGTTT GCGGAGGTGA AATGGCAGCT GTCATCCCAA ACATACGGAG 480TAAACTGATC ACAGCAAAGT GAGAAGGGGG GATGTGATCC GGATCACGGC AATGAGCTAG 540TCCCTACCTA CAGGCAGTGC CTGCCTACCA ATAGCTCGTA CAGAAAATCC CTGCCCCTCT 600CTCTGTTGTG TCTCCGAGTT GCTTTTCTCG TCCTCTCTCC AAACCCCGCA TCGAAAAAGT 660AAAGCCCGAT GCTCACCCAC CCCTGTCTGC AGGTTCCCCA TCGCCAAGTT ATCTTGTGTC 720TCTTGAGCTG CAAAAGCAAC CCATTGAAGC AACCATCAAC AGCGCCGATT AAATTTGATA 780TCGACAAGGT AAAAAAGGAT AAGAACAACA AGAAGAAAAA GAGATCAGAA AAAAAAGGAA 840ATCGCCCAAA GTTTTACGGT TCCCTCAGCT TTCAAGACGG TCGCGCCATT GTGAAAACGG 900TGGCACGGCT TCACGACTTA ACGGCTTGAA CGGGTAACCG CACCCAGGAG GGTCGGCTGG 960ATAATTGATT CTCGGCCGGT CCAGAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA GGCTGCCTAG 1020AGTAACATTT GAACTACCTA CGAATAATCG GCGGGGTACT GCATAGGTAG TACAATAGTC 1080GGGAGATATT TAGTCTTTTT GGGTTGGTTT CATTTTCGTT ACCTTTTTTT TTACACCCCA 1140CGTGCAGCTC GTCGTTTTCG TCCCCTAAAA AAAACGCGAC CCGGTTCTTG GGCCGTTTCT 1200TCGAGACCAG GAAAAAGAGA GACAAGGGTG TGTGGGGGGA AAACCACAAC CGACGAGAAG 1260GCATTCGGCA GATCGCTATC TCCCTACGGA TAATCCAAAT AAGAGAAATC GTGATCGGGG 1320AACCCGGATA TTTCAAACTC ACCGCTTCTG ACTGAACACA CCCTACTGTA TCTTGTTGTT 1380GCCGTCAGAA TTACCGTTTA CGTTTGCAGA CAACCGTCAC TGCTACCACC CGACAGGGGG 1440TCGCATGGGT GTTTAAATGG CTTCGCCGCG CCGATCAGAA GCCGACCTCG CCAGCCCGGC 1500ACGCGGGCCG GGTTCGGGCC CGCCATCCCC ACCTCATCCC GGTCCCGACT CGGCAAGGCC 1560ACTATCAAGA ATCACGTCGG CGGCAGCGTC ACCACCACCA CCGGGACAAC GAACCGCGGA 1620ACCACCCACA ACCATCTCTA TCCCCCGCAC CCTCTGGCGC CTCAGCATCC CTTTGTACAT 1680CACTCACCCC TCCCTCCCCA ACACACCCTT CATAACCTCC CTCCCGCGCG TATCCTACCT 1740GTCTCTTCTT CTCCCCCGGA TCCGCGCCTT CCTGCCCCCA TCCATCCCAG CCCCGACCAG 1800CTTCCACCAC GAAGGGATCG CGCTGCGCGC CCTGCCGCTC GGCCTGCTCG TCGACCTGTA 1860CCAGCCCACG CTGCCGTGGC GCCTGACGGT CGACCAAGGG GACGACTGGC ACGTGGGCGA 1920CACCTTCCTC AACGGCGTCA AGGAGGCCGA CTTTGTGCGC AACGGACACG CCAAGCAGAT 1980TATGGGCATG AGCAAGGCCG ACACCACGGC GCTGTGGAAC GCCGTCCGCG ACGCAGACTA 2040CCCGGCTTGG GCCCGCATCA ACGCCCGTCT GCTCAACCCT AGCACCCCGA TCAAGCACGT 2100GCCCCTGCGC ATCTACATCC CCAGCAGCGG TGGTGGTGGC GCCGGGGGAG CAACGCCCGC 2160CGGGTCTTTT AGGGTCATGC AGACCCTCGT TCCACCCCGG ACGGCAAACC GTGAGTAAAC 2220CATCAGCCTC GACTTGCTTT TTGCCGCCAT TCAACTCTTT AAAGTTTTTT TTTTTTTTTT 2280TTTTTTTTTG AGAGCACGGA ACCGAGCCTG ACGTGTCGCT GACTTGGTTT GCTTCCACAG 2340GTATTCCGCA GACTCTCGGC CCAACACTAC GTGACTTGCT CCCTGTCTTG TTCCCGAGCA 2400GCAGAGATCC CGTACTGGCC AACGTGGTGC TTCACGGCGC TCCCGTGCCA TTCTCGGCCC 2460
CGCTAGAGGG CTTGATGCGC GAGGCCGCCT ATCCAGACGG CTGGCTTTGT TTAACCGTCG 2520TGCCATTATG ATTTTTTGAC AGGGGCAAAA ACAGTAGTCT TGAGCTCAAG GGCTAAAAAC 2580TTGACCGTTG TTTCCCTCCA ACTAGAACTA GATGGTGATT TGAGCGACGT TCGATTTCAC 2640GTGCATTGAA TTTGGTTTCA CAATTCTTGG AGCTGAAAAG ATGCAAGGAT GGCCTTTGAT 2700GTTTATTGCC TCACAAAGAG ATTCAAGAGA CCAAAAAAGA ACAACATGTC TTATCCAACA 2760AAGTACTTCA AGATCAAATA TGATCCACCC TCAACCAGCC ATCTATATAT GCAACATGTA 2820CTTGCAACGG ACCTGTCCGC CGCGCAGCTA TCACTTCGTA CCACCTCGCA ATAAAAAAAG 2880AAAAAGGAAT ATACCATCAT TAGAGTATGC GTGTATAACA TAACTCAGAA AGTGAAAAGA 2940AAATCAAAGA AAAAGCCGAC CTAGTAAATG GGTATGTATG CAGGTACGCT TCATCCAAGA 3000AGATAAACAA AGAATACAAA ACGTCGCTGA GCATGATACT TGTTGCCTTT GCCATAAAAC 3060AGCTTCATCC ACATGAGGGG CCGTCATTAT CTTGTCAAGT CGGAAAGGAA AAGAACATGA 3120AACAAGTATG ATCTTAAATG CAAGCAAGAT GCCAGCCAGA AAAAAAGGGA GAAGCTGATC 3180CTAATCCAGA AGAAAATACG AGGGTGTTTA AATGGCAAAA TATTAGCGAG ATAATTATGT 3240GGTAGAGCTC AACTGCAATC CTTTGCAGCG CGAGCTTTCC CAAGTAATTA AATGCAGCGA 3300GCCCTCTGTC GCCACGGCAA ATCAGGCCAT GTCGGGTCCG GTCTTGAACA TTCGCCAAAC 3360TTGCTTTTCG GGCGAGCCCT GTCAACATGA CACAGCAGGT AGAATCTGAA GGGAAGCGAG 3420GCTTAGCAGG AGCGTACTGC AACAGCCTGT TTCTTGCTAG CAGAGAACCT TGATGGTGTG 3480GTGAATGCGA GTTCCGCTTT CCTGGGAGCA CTTTCATCGA GGTACCTGAA CATCCACTGC 3540TCCGTTGGGT GTTGGATGGG GCGGCTGATG AGGATGAGGA GAGTAAGAGA ACGGCGGT3598SEQ ID NO2AGGGGGTCGC ATGGGTGTTT AAATGGCTTC GCCGCGCCGA TCAGAAGCCG ACCTCGCCAG 60CCCGGCACGC GGGCCGGGTT CGGGCCCGCC ATCCCCACCT CATCCCGGTC CCGACTCGGC 120AAGGCCACTA TCAAGAATCA CGTCGGCGGC AGCGTCACCA CCACCACCGG GACAACGAAC 180CGCGGAACCA CCCACAACCA TCTCTATCCC CCGCACCCTC TGGCGCCTCA GCATCCCTTT 240GTACATCACT CACCCCTCCC TCCCCAACAC ACCCTTCATA ACCTCCCTCC CGCGCGTATC 300CTACCTGTCT CTTCTTCTCC CCCGGATCCG CGCCTTCCTG CCCCCATCCA TCCCAGCCCC 360GACCAGCTTC CACCACGAAG GGATCGCGCT GCGCGCCCTG CCGCTCGGCC TGCTCGTCGA 420CCTGTACCAG CCCACGCTGC CGTGGCGCCT GACGGTCGAC CAAGGGGACG ACTGGCGCGT 480GGGCGACACC TTCCTCAACG GCGTCAAGGA GGCCGACTTT GTGCGCAACG GACACGCCAA 540GCAGATTATG GGCATGAGCA AGGCCGACAC CACGGCGCTG TGAAACGCCG TCCGCGACGC 600AGACTACCCG GCTTGGGCCC GCATCAACGC CCGTCTGCTC AACCCTAGCA CCCCGATCAA 660GCACGTGCCC CTGCGCATCT ACATCCCCAG CAGCGGTGGT GGTGGCGCCG GGGGAGCAAC 720GCCCGCCGGG TCTTTTAGGG TCATGCAGAC CCTCGTTCCA CCCCGGACGG CAAACCGTAT 780TCCGCAGACT CTCGGCCCAA CACTACGTGG CTTGCTCCCT GTCTTGTTCC CGAGCAGCAG 840AGATCCCGTA CTGGCCAACG TGGTGCTTCA CGGCGCTCCC GTGCCATTCT CGGCCCCGCT 900AGAGGGCTTG ATGCGCGAGG CCGCCTATCC AGACGGCTGG CTTTGTTTAA CCGTCGTGCC 960ATTATGATTT TTTGACAGGG GCAAAAACAG TAGTCTTGAG CTCAAGGGCT AAAAACTTGA 1020CCGTTGTTTC CCTCCAACTA GAACTAGATG GTGATTTGAG CGACGTTCGA TTTCACGTGC 1080ATTGAATCTG GTTTCACAAT TCTTGGAGCT GAAAAGATGC AAGGATGGCC TTTGATGTTT 1140ATTGCCTCAC AAAGAGATTC AAGAGACCA1169
SEQ ID NO3Met Ala Ser Pro Arg Arg Ser Glu Ala Asp Leu Ala Ser Pro Ala1 5 10 15Arg Gly Pro Gly Ser Gly Pro Pro Ser Pro Pro His Pro Gly Pro20 25 30Asp Ser Ala Arg Pro Leu Ser Arg Ile Thr Ser Ala Ala Ala Ser35 40 45Pro Pro Pro Pro Gly Gln Arg Thr Ala Glu Pro Pro Thr Thr Ile50 55 60Ser Ile Pro Arg Thr Leu Trp Arg Leu Ser Ile Pro Leu Tyr Ile65 70 75Thr His Pro Ser Leu Pro Asn Thr Pro Phe Ile Thr Ser Leu Pro80 85 90Arg Val Ser Tyr Leu Ser Leu Leu Leu Pro Arg Ile Arg Ala Phe95 100 105Leu Pro Pro Ser Ile Pro Ala Pro Thr Ser Phe His His Glu Gly110 115 120Ile Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Gly Leu Leu Val Asp Leu Tyr125 130 135Gln Pro Thr Leu Pro Trp Arg Leu Thr Val Asp Gln Gly Asp Asp140 145 150Trp His Val Gly Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Lys Glu Ala Asp155 160 165Phe Val Arg Asn Gly His Ala Lys Gln Ile Met Gly Met Ser Lys170 175 180Ala Asp Thr Thr Ala Leu Trp Asn Ala Val Arg Asp Ala Asp Tyr185 190 195Pro Ala Trp Ala Arg Ile Asn Ala Arg Leu Leu Asn Pro Ser Thr200 205 210Pro Ile Lys His Val Pro Leu Arg Ile Tyr Ile Pro Ser Ser Gly215 220 225Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Pro Ala Gly Ser Phe Arg Val230 235 240Met Gln Thr Leu Val Pro Pro Arg Thr Ala Asn Arg Ile Pro Gln245 250 255Thr Leu Gly Pro Thr Leu Arg Asp Leu Leu Pro Val Leu Phe Pro260 265 270Ser Ser Arg Asp Pro Val Leu Ala Asn Val Val Leu His Gly Ala275 280 285Pro Val Pro Phe Ser Ala Pro Leu Glu Gly Leu Met Arg Glu Ala290 295 300Ala Tyr Pro Asp Gly Trp Leu Cys Leu Thr Val Val Pro Leu305 310
SEQ ID NO4CTCTAGGGGG TTGCAGTGCG TTCGTCACGC GTAAGGCTTC CTCGGCCAGT AAGATGGTGT 60GCTGGGGGGA CTTTTCTTTC TGACCTGGAA TCACTCACTG CTGGTTGCTT GCCAAGCTTG 120CTTGCTCGGA AAGGGGTTAA TACAAAACCA GCTAGAAAAA AAAAAAGATC TACAAATGGT 180GCATGTCTCA TCGCGGGAAC GTGAATGGTT CGTTTTGCTG GCTGTAGTCT GTACCTCTAA 240TTTCTTTTTT TTTCTTTTTT CCCCGGTGGC TTTTTGGATT CCCTCACTGC AAAAAAGAGA 300TGGAAGCGAG TGCAACCTGA TAGTGGCTAC ATGCCAACCT AGCTAGCTAT ACATCCTTTT 360ACAGCCTGGG CCATTTGAAT TCGGCGGGCA AGCGGGGTTA ATGGTACTCT CTCTGGTTTT 420TGGTAGTGGT TCCCTGGTTT GCGGAGGTGA AATGGCAGCT GTCATCCCAA ACATACGGAG 480TAAACTGATC ACAGCAAAGT GAGAAGGGGG GATGTGATCC GGATCACGGC AATGAGCTAG 540TCCCTACCTA CAGGCAGTGC CTGCCTACCA ATAGCTCGTA CAGAAAATCC CTGCCCCTCT 600CTCTGTTGTG TCTCCGAGTT GCTTTTCTCG TCCTCTCTCC AAACCCCGCA TCGAAAAAGT 660AAAGCCCGAT GCTCACCCAC CCCTGTCTGC AGGTTCCCCA TCGCCAAGTT ATCTTGTGTC 720TCTTGAGCTG CAAAAGCAAC CCATTGAAGC AACCATCAAC AGCGCCGATT AAATTTGATA 780TCGACAAGGT AAAAAAGGAT AAGAACAACA AGAAGAAAAA GAGATCAGAA AAAAAAGGAA 840ATCGCCCAAA GTTTTACGGT TCCCTCAGCT TTCAAGACGG TCGCGCCATT GTGAAAACGG 900TGGCACGGCT TCACGACTTA ACGGCTTGAA CGGGTAACCG CACCCAGGAG GGTCGGCTGG 960ATAATTGATT CTCGGCCGGT CCAGAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA GGCTGCCTAG 1020AGTAACATTT GAACTACCTA CGAATAATCG GCGGGGTACT GCATAGGTAG TACAATAGTC 1080GGGAGATATT TAGTCTTTTT GGGTTGGTTT CATTTTCGTT ACCTTTTTTT TTACACCCCA 1140CGTGCAGCTC GTCGTTTTCG TCCCCTAAAA AAAACGCGAC CCGGTTCTTG GGCCGTTTCT 1200TCGAGACCAG GAAAAAGAGA GACAAGGGTG TGTGGGGGGA AAACCACAAC CGACGAGAAG 1260GCATTCGGCA GATCGCTATC TCCCTACGGA TAATCCAAAT AAGAGAAATC GTGATCGGGG 4320AACCCGGATA TTTCAAACTC ACCGCTTCTG ACTGAACACA CCCTACTGTA TCTTGTTGTT 1380GCCGTCAGAA TTACCGTTTA CGTTTGCAGA CAACCGTCAC TGCTACCACC CGACAGGGGG 1440TCGCATGGGT GTTTAA 1456SEQ ID NO5＞fgATG5 Fusarium graminearum 禾谷鐮刀菌Met Ser Ser Pro Ile Pro Gln Ala Leu Trp Ser Ala Gln Ile Pro1 5 10 15Leu His Ile Thr His Pro Ala Ser Pro Thr Thr Pro Phe Ile Thr20 25 30Ser Ile Pro Arg Phe Ser Tyr Leu Ala Leu Leu Ile Pro Arg Leu35 40 45Ser Thr Phe Phe Asn Ser Pro Cys Ser Ser Phe His Phe Glu Asp50 55 60Val Gln Leu Arg Asn Leu Ala Val Gly Leu Leu Val Asp Leu Tyr65 70 75Gln Pro Ala Leu Pro Trp Lys Leu Thr Val Asn Asp Gly Val Gly80 85 90Trp Asp Ile Ala Asp Thr Phe Leu Asn Cys Val Lys Glu Ala Asp95 100 105
Phe Val Arg Asn Gly Asn Ala Asn Gln Ile Met Lys Met Ser Lys110 115 120Glu Asn Thr Thr Gln Leu Trp Asn Ala Val Ile Asp Asn Asp His125 130 135Pro Ser Phe Asn Arg Ile Asn Ser His Leu Leu Asn Ala Pro Thr140 145 150Ala Leu Lys His Val Pro Ile Arg Ile Tyr Val Pro Thr Ser Gly155 160 165Pro Asp Ser Ser Ala Thr His Pro Glu His Ala Thr Phe Lys Val170 175 180Ile Gln Ser Leu Met Ala Ala Thr Ser Ser Asp Arg Arg Pro Lys185 190 195Leu Leu Gly Gln Ala Leu Lys Glu Val Leu Pro Gly Leu Phe Pro200 205 210Ser Ser Arg Asp Pro Ile Leu Ala Lys Val Val Met His Gly Ala215 220 225Gly Val Pro Phe Asp Ala Pro Leu Glu Asp Leu Met Arg Glu Ala230 235 240Ala Tyr Pro Asp Gly Trp Leu Cys Leu Val Val Ile Val Leu245 250SEQ ID NO6＞ssATG5 Sclerotinia sclerotiorum 油菜菌核病菌Met Gln Ser Leu Ile Trp Ala Ser Ala Ile Pro Leu Tyr Ile Thr1 5 10 15His Ser Ser Ser Thr Ile Pro Tyr Leu Ile Asn Val Pro Arg Val20 25 30Ser Tyr Leu Ala Leu Leu Phe Pro Arg Leu Thr Ser Phe Phe Gly35 40 45Glu Asn Val Ser Ser Phe Ser Tyr Glu Gly Ile Leu Leu Lys Asn50 55 60Leu Pro Val Gly Leu Leu Cys Asp Leu Tyr Gln Pro Glu Leu Pro65 70 75Trp Arg Ile Glu Leu Gly Asp Gly Pro Leu Phe Asp Ile His Asp80 85 90Thr Phe Ile Asn Ser Val Lys Glu Ala Asp Phe Met Arg Asn Gly95 100 105Asn Ala Lys Gly Ile Met Ser Met Ser Lys Glu His Ser Thr Gln110 115 120Leu Trp Asn Ser Val Gln Asp Asn Asp Phe Ser Thr Tyr His Lys125 130 135Ile Ser Thr Ile Leu Leu Asn Pro Ala Thr Ala Leu Lys His Ile140 145 150
Pro Leu Arg Ile Tyr Leu Pro Ser Ser Ser Thr Pro Ser Ser Thr155 160 165Pro His Pro Gly Ser Ser Gly Ser Ser Lys Ala Pro Ser Thr Ala170 175 180Ser Pro Pro Ser Pro Leu Phe Thr Phe Lys Thr Ile Gln Thr Leu185 190 195Ile Gln Pro Gln Thr Thr Ser Arg Glu Pro Gln Thr Leu Gly Gly200 205 210Ala Leu Asn Ser Val Leu Pro Thr Leu Phe Pro Ser Lys Arg Asp215 220 225Ala Ile Leu Ala Glu Val Ile Leu His Gly Ala Thr Val Pro Phe230 235 240Lys Ala Val Leu Glu Asp Leu Met Arg Glu Ala Ser Tyr Ala Asp245 250 255Gly Trp Leu Asn Val Cys Val Val Met Leu Asn260 265SEQ ID NO7＞snATG5 Stagonospora nodorum 小麥穎枯病菌Met Ser Ser Arg Glu Val Thr Ser Arg Leu Arg Glu Lys Val Trp1 5 10 15Asn Gly Ser Val Pro Leu Glu Ile Arg Leu His Lys Gly Asp Cys20 25 30Arg Thr Tyr Asp Asp Ser Asp Ala Tyr Leu Ile Gln Phe Pro Arg35 40 45Leu Ser Tyr Leu Ala Leu Leu Ile His Lys Leu His Ala Phe Phe50 55 60Ala Pro Ser Leu Ile Tyr Pro Asp Ile His Pro Ser Asp Leu Trp65 70 75Phe Ser Tyr Glu Gly Val Pro Leu Lys Trp His Tyr Pro Leu Gly80 85 90Leu Leu Tyr Asp Leu Tyr Ser Gly Ala Glu Pro Tyr His Pro Ser95 100 105Asp Ser Pro Pro Pro Ser Pro Thr Thr Pro Ser Lys Gln Asp Ser110 115 120Lys Gln Pro Leu Pro Trp Arg Leu Thr Leu His Thr Ser Ala Tyr125 130 135Pro Thr Thr Gln Leu Ile Pro Leu Asp Asn Asn Asn Leu Gln Ile140 145 150His Asp Leu Phe Ile His Ser Val Lys Glu Ala Asp Tyr Leu Arg155 160 165Thr Gly Thr Gly Lys Thr Val Met Phe Leu Ser Gln Ala Asp Ser170 175 180
Thr Gln Leu Trp Asp Ala Val Val Lys His Asp Phe Ala Leu Phe185 190 195Asn Pro Ile Asn Gln Lys Leu Leu Asn Pro Gln Gly Val Asn Leu200 205 210Arg His Leu Pro Val Arg Leu Tyr Leu Pro His Ala Gly Val Asp215 220 225Glu Glu Asp Arg Gly Met Gly Ser Val Arg Val Val Gln Ser Leu230 235 240Val Lys Val Glu Val Gly Ser Arg Gln Pro Gln Thr Ile Gly Thr245 250 255Ala Leu Asn Gln Ile Leu Pro Thr Leu Phe Pro Ser Arg Arg Ser260 265 270Ala Leu Leu Ala Gln Ala Val Leu His Gly Ala Val Val Pro Leu275 280 285Gly Ala Ser Val Glu Glu Leu Ile Arg Ser Val Ala Tyr Leu Asp290 295 300Gly Trp Leu His Ile Ala Ile Val Met Met Gly305 310
權(quán)利要求
1.一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG5，其特征是該基因的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的基因mgATG5編碼的cDNA序列，其特征是所述cDNA序列具有SEQID NO2所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的基因mgATG5編碼的蛋白質(zhì)，其特征是所述蛋白質(zhì)具有SEQ IDNO3所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的基因mgATG5的啟動子，其特征是所述啟動子具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
5.利用如權(quán)利要求1所述的基因mgATG5的表達作為靶標，在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
6.利用如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的表達和修飾作為靶標，在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
7.結(jié)合利用如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)以及如權(quán)利要求4所述的啟動子作為靶標，在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG5，其核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO1。基因mgATG5編碼的cDNA序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列?；騧gATG5編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。基因mgATG5的啟動子具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。分別利用基因mgATG5的表達作為靶標、利用上述蛋白質(zhì)的表達和修飾作為靶標、結(jié)合利用上述蛋白質(zhì)以及啟動子作為靶標，在設(shè)計和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/37GK101050463SQ20071006758
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月16日
發(fā)明者劉小紅, 盧建平, 馮曉曉, 林福呈, 章初龍 申請人:浙江大學(xué)