專利名稱：真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物基因工程和植物保護領域中真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
梨孢菌(Magnaporthe，grisea)是子囊菌亞門的真菌，能侵染水稻、小麥、大麥、粟以及其它多種禾本科植物，導致瘟病。尤其是該菌侵染水稻引起的稻瘟病在世界各個栽培稻區(qū)每年均有發(fā)生，危害廣泛、嚴重。一般情況下，稻瘟病地危害可使水稻減產(chǎn)5-10％，重病田可導致水稻絕收。稻瘟病在我國曾多次流行，也是我國水稻的主要病害之一。1993年，稻瘟病在我國發(fā)生大流行，在全面防治的情況下仍然減產(chǎn)上百億斤。梨孢菌還可侵染鈍葉草、狗牙草、假儉草等屬的草坪草，造成大面積枯死，是草坪草常見病害。
梨孢菌的分生孢子呈梨形，由三個細胞組成。一般3至5個分生孢子以合軸的方式從一個分生孢子梗的頂端產(chǎn)生。分生孢子釋放后，在分生孢子梗上留下屈膝狀的疤痕。梨孢菌對植物的侵染起始于分生孢子的形成，其過程包括分生孢子附著到植物葉片上后，經(jīng)過萌發(fā)，附著胞形成與成熟，附著胞內膨脹壓的產(chǎn)生與累積，侵染釘產(chǎn)生與植物表皮的直接穿透，植物細胞內侵染性菌絲的形成、分支，侵染性菌絲在植物細胞間和組織間的擴展與定植等幾個步驟。梨孢菌侵染感病寄主時，侵染性菌絲在植物組織間的擴展形成直徑2-3毫米以上的灰色或灰褐色病斑，這些病斑中的侵染菌絲穿透植物組織向空中分化形成分生孢子梗，進一步形成分生孢子。分生孢子在風、雨的沖刷下釋放、附著，引起植物的再侵染。梨孢菌從分生孢子附著到分生孢子再產(chǎn)生的周期一般所需時間為3-5天；在植物的生長季節(jié)，如果條件適宜，能夠多次侵染，造成危害。因此，梨孢菌的分生孢子是主要的初侵染源和再侵染源，在病害侵染循環(huán)中不可缺少。稻瘟病的嚴重度與梨孢菌形成分生孢子的多少直接相關，所以，人們常通過監(jiān)測空氣中分生孢子量來預測預報病害將要發(fā)生的情況。研究梨孢菌分生孢子形成和形態(tài)建成的分子遺傳不僅對于揭示梨孢菌致病性的分子機制具有重要的理論意義，而且對于指導稻瘟病的防治具有重要應用價值。
目前在梨孢菌分生孢子形成及變異方面的報道比較少，即使有報道一般也都沒有關于基因克隆與分子機理的內容。
1989年Hamer等報道了Smo-突變體(Hamer，J.E.，Valent，B.，and Chumley，F(xiàn).G.，Mutations at the SMO genetic locus affect the shape of diversecell types in the rice blast fungus，Genetics，1989(122)351-361.)是有關梨孢菌分生孢子形態(tài)變異方面較早的報道。這個突變體是他們在運用Teflon膜來篩選和獲得在附著胞形成上有缺陷的梨孢菌突變體的過程中獲得的，這一類型的突變體不能形成正常形態(tài)的分生孢子和子囊，但是能形成正常形態(tài)的子囊孢子(盡管有一些Smo-的子囊孢子不能萌發(fā))。Smo-突變并不影響菌株正常的營養(yǎng)生長、形成分生孢子、減數(shù)分裂以及對寄主植物的侵染。
1993年Shi和Leung報道他們用電穿孔法處理70-15菌株，從可存活的菌中分離到Con1-突變體(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis and rapidmapping of a sporulation mutation in Magnaporthe grisea，MPMI，Vol.7，No.1，1993，pp.113-120.)，這種突變體與野生型形成分生孢子的形式不同，在每一個分生孢子梗上，只產(chǎn)生一個端生的伸長的三個細胞的分生孢子。Con1-突變體在培養(yǎng)基上的生長和分生孢子的形成分別只有野生型的73％和2.3％，在載玻片或洋蔥表皮上不能形成正常的附著胞，并且在原來感病的水稻品種上沒有致病性。兩年后，Shi和leung報道他們運用REMI獲得了一系列的與分生孢子形成有關的突變體Con2--Con7-(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis of sporulationin Magnaporthe grisea by chemical and insertional mutagenesis，MPMI，Vol.8，No.6，1995，pp.949-959.)。CON1-7(包括1993報道的CON1)分別控制著產(chǎn)生氣生菌絲、分生孢子梗、形成分生孢子、形成形態(tài)正常分生孢子等一系列過程。
突變體con5-and con6-完全喪失了分生孢子形成能力，con1-、con2-、con4-和con7-作用于con5-和con6-的下游影響產(chǎn)孢能力和分生孢子的發(fā)育，con4-和con7-產(chǎn)孢量減少約35％。con1-和con7-不能形成附著胞，因而喪失了對水稻的致病性，con2-和con4-附著胞形成率明顯減少，因而致病性明顯減弱。通過它們之間的遺傳關系分析表明，Con1和Con2連鎖，Con5和Con6連鎖，并且有Con5＞Con6＞Con7和Con2＞Con1的上位關系。
1998年，Lau等報道他們通過REMI獲得了一種形成分生孢子的形式變異的梨孢菌突變體，他們把它稱為ACR1-(Lau，G.W.，and Hamer，J.E.AcropetalAgenetic locus required for conidiophore architecture and pathogenicity inthe rice blast fungus，F(xiàn)ungal Genetics and Biology，1998(24)228-239.)。梨孢菌正常從一個分生孢子梗的頂端產(chǎn)生三至五個分生孢子，與此合軸方式不同，ACR1-的分生孢子以成串的方式著生于一個分生孢子梗上，這些分生孢子的頂端細胞不能產(chǎn)生頂端孢子粘液(STM)，因此不能粘附到疏水性的表面。ACR1-的分生孢子產(chǎn)生附著胞的能力也大大減小，能萌發(fā)產(chǎn)生芽管的分生孢子中只有5％能形成附著胞，因此致病力也大大減弱。Lau等也克隆了相應的基因，其開放閱讀框包括編碼633個氨基酸的轉錄區(qū)域，3′端包括長的大約1.3kb的非編碼區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)，這個包含633個氨基酸開放閱讀框大約2kb，包括多個短的ORFs，與目前數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白都缺少同源性。
以上研究報道表明梨孢菌分生孢子的形成及其形態(tài)構建是一個很復雜的事件，包括許多與之有關的遺傳基因。克隆這些基因，解明它們的分子功能和在梨孢菌分生孢子的形成和形態(tài)建成中的作用，從而研究它們對梨孢菌致病性的影響，將有助于搞清楚梨孢菌致病性的分子機制，并有可能從中發(fā)現(xiàn)可以作為殺菌劑靶標的蛋白及其基因與啟動子，為開發(fā)稻瘟病以及其它植物瘟病的有效化學控制途徑奠定理論和技術基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白，名稱為MgCOM1，來源于梨孢菌，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質
1)序列表中的SEQ ID №3；
2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與真菌分生孢子形狀及致病性相關的蛋白質。
序列表中的序列3由774個氨基酸殘基組成。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
MgCOM1的編碼基因(MgCOM1)也屬于本發(fā)明的保護范圍。
MgCOM1的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；
3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中的序列1由4276個堿基組成，包括三個外顯子和兩個內含子，自序列1的5′端第786位至956位堿基為第一外顯子，自序列1的5′端第957位至1222位堿基為第一內含子，自序列1的5′端第1223位至1485位堿基為第二外顯子，自序列1的5′端第1486位至1556位堿基為第二內含子，自序列1的5′端第1557位至3447位堿基為第三外顯子；其編碼區(qū)位于序列1的5′端第786位至3447位堿基之間。自序列1的5′端第1位至785位堿基為啟動子序列。
MgCOM1的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；
2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；
3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中的序列2由2591個堿基組成，其編碼序列為自序列1的5′端第101位至2425位堿基。
所述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
含有MgCOM1基因的表達載體，細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增MgCOM1基因中任一片段的引物也在本發(fā)明的保護范圍之內。
實驗證明MgCOM1基因的突變導致梨孢菌產(chǎn)生細長的分生孢子，形成侵染釘和侵染性菌絲的能力減弱，并且在親和性水稻品種上的致病力減弱。篩選能夠破壞掉該基因表達、剪切及其產(chǎn)物的表達、修飾與定位的藥物，是本發(fā)明的一個重要用途。MgCOM1的核苷酸序列和MgCOM1的氨基酸序列可以作為靶位點應用于抗真菌藥劑(特別是抗梨孢菌藥劑)的篩選和設計中，也可以以該核苷酸序列的某一區(qū)段作為探針在梨孢菌中再分離該序列，也可以用于篩選、分離其它真菌的與該基因具有一定序列同源性的序列。
本發(fā)明證明梨孢菌MgCOM1的變異可使分生孢子由梨型變成細長型，并導致致病力顯著減弱。因此，可利用該分生孢子的形態(tài)變異與致病性變異的相關性篩選殺菌劑。


圖1為野生菌株70-15與三個MgCom1的插入突變體的分生孢子形態(tài)比較
圖2A為野生菌株70-15與MgCom1的插入突變體X54在洋蔥表皮上分生孢子的萌發(fā)率比較
圖2B為野生菌株70-15與MgCom1的插入突變體X54在洋蔥表皮上附著胞的形成率比較
圖2C為野生菌株70-15與MgCom1的插入突變體X54在洋蔥表皮上侵染釘?shù)男纬陕时容^
圖2D為野生菌株70-15與MgCom1的插入突變體X54在洋蔥表皮上侵染性菌絲的形成率比較
圖3為野生菌株70-15與三個MgCom1的插入突變體X54、H3035和H3587在親和性水稻CO39葉片上形成病斑比較
圖4A為互補載體pKNS的示意圖
圖4B為基因置換載體pPSH的示意圖
圖5為互補轉化體CX54與野生菌株70-15的分生孢子形態(tài)比較
圖6A為互補轉化體CX54與野生菌株70-15和MgCom1的插入突變體X54在洋蔥表皮上分生孢子的萌發(fā)率比較
圖6B為互補轉化體CX54與野生菌株70-15和MgCom1的插入突變體X54在洋蔥表皮上附著胞的形成率比較
圖6C為互補轉化體CX54與野生菌株70-15和MgCom1的插入突變體X54在洋蔥表皮上侵染釘?shù)男纬陕时容^
圖6D為互補轉化體CX54與野生菌株70-15和MgCom1的插入突變體X54在洋蔥表皮上侵染性菌絲的形成率比較
圖7為野生菌株70-15和三個MgCom1的插入突變體X54、H3035、H3587和相應的互補轉化體CX54、CH3035、CH3587對親和性的水稻品種CO39的致病性比較
圖8為基因置換轉化體K204與野生菌株70-15的分生孢子形態(tài)比較
圖9A為野生菌株70-15與基因置換轉化體K204在洋蔥表皮上侵染釘形成率的比較
圖9B為野生菌株70-15與基因置換轉化體K204在洋蔥表皮上侵染性菌絲形成率的比較
圖10為野生菌株70-15與基因置換轉化體K204在洋蔥表皮上接種后24小時時形成侵染釘和侵染性菌絲的差異
圖11為野生菌株70-15與突變體X54，H3035，H3587及基因置換轉化體K204對親和性的水稻品種CO39的致病性比較
圖12Aa為互補載體pKNSP1.8的結構示意圖
圖12Ab為用pKNSP1.8轉化基因置換轉化體K204后得到的轉化體的分生孢子形態(tài)
圖12Ba為互補載體pKNSP1.0的結構示意圖
圖12Bb為用pKNSP1.0轉化基因置換轉化體K204后得到的轉化體的分生孢子形態(tài)
圖12Ca為互補載體pKNSP0.8的結構示意圖
圖12Cb為用pKNSP0.8轉化基因置換轉化體K204后得到的轉化體的分生孢子形態(tài)
具體實施例方式
為了更好的理解本發(fā)明，以下通過實施例予以進一步地說明，但并非對本發(fā)明的限制。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白MgCOM1及其編碼基因的獲得
一、突變體的篩選與鑒定
1、梨孢菌菌株70-15的REMI轉化體庫的構建
通過堿裂解法大量提取pUCATPH(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Tagged mutant s at the Toxl locus of Cochliobolusheterostrophus by restriction enzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA911264-12653)的質粒DNA，分別用限制性內切酶HindIII、KpnI、SacI和SmaI酶切將其線性化，按REMI轉化的方法(Shi Z.，Christian D.，& LeungH.，Enhanced transformation in Magnaporthe grisea by restriction enzymemediated integration of plasmid DNA.Phytopathology，1995，85329-333.)轉化野生型的梨孢菌菌株70-15。每個轉化體系中加入2微克線性化的質粒和相應的限制性內切酶，其中KpnI、HindIII、SacI和SmaI分別采用30U、45U、30U和15U。具體的步驟見實施例二的第二部分梨孢菌的轉化。
2、分生孢子的制備
將梨孢菌菌株70-15的各REMI轉化體的菌絲充分打斷，均勻地涂布到西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基(每升含150ml西紅柿汁、30-50克燕麥片煮沸30分鐘過濾取濾液、20克瓊脂)平板上，26℃-28℃培養(yǎng)，當肉眼可見新生菌絲長出培養(yǎng)基表面時，用棉簽輕輕將菌絲洗下，并用水沖洗干凈，蓋上單層紗布，于26℃-28℃光照培養(yǎng)48小時，在培養(yǎng)基表面即可見大量的梨孢菌孢子。
3、分生孢子形態(tài)變異突變體的篩選
在放大倍數(shù)為10×40的顯微鏡下觀察梨孢菌菌株成熟分生孢子的形態(tài)，每個菌株分別測量50個成熟分生孢子的長和寬。結果共獲得三個類似形狀變異的突變體X54，H3035，H3587。這三個突變體的分生孢子比野生型的梨孢菌70-15的分生孢子在形狀上要長而且窄(圖1，A為70-15，B為X54，C為H3035，D為H3587)。三個突變體與野生型菌在分生孢子的長度和寬度上的差異比較如表1。
表1.三個突變體與野生型菌的分生孢子的長度和寬度
注差異顯著性均為B的兩組之間在5％的顯著范圍內沒有差異，差異顯著性為A和B的兩組之間在5％的顯著范圍內差異顯著。
4、致病性的測定
采用步驟2所述的方法培養(yǎng)梨孢菌的分生孢子，孢子洗下后用雙層擦鏡紙過濾于50毫升的離心管中，4000轉/分室溫離心5分鐘收集孢子，然后懸浮于0.25‰(體積比)的吐溫20中。調整分生孢子濃度到每毫升5×104個孢子，均勻地噴霧接種于五葉一心期的親和性水稻品種CO39幼苗的葉片正面。用同樣的方法制備分生孢子的懸浮液，調整分生孢子濃度到每毫升5×105個孢子，均勻地噴霧接種于新鮮的洋蔥內表皮的正面。分別在接種后2小時，6小時，12小時，24小時，36小時，48小時和72小時于顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)，附著胞、侵染釘及侵染性菌絲的形成等過程，并計算分生孢子的萌發(fā)率和附著胞、侵染釘及侵染性菌絲的形成率。
結果表明在洋蔥表皮上三個突變體形成侵染釘和侵染性菌絲的比率比野生型的低，其中野生型70-15和突變體X54在洋蔥表皮上形成侵染釘和侵染性菌絲的比率如圖2A-圖2D和表2所示。
表2.70-15和X54在接種洋蔥表皮后24、36和48小時形成侵染釘和侵染性菌絲的比率
在親和性水稻品種CO39葉片上，三個突變體的致病力也比野生型的低，其中，三個突變體與野生型菌株在CO39葉片上形成擴展性病斑和褐斑的數(shù)的比較結果如表3所示；野生菌株70-15與三個突變體X54、H3035和H3587在親和性水稻CO39葉片上形成病斑如圖3所示，圖中A為70-15，B為X54，C為H3035，D為H3587。
表3.三個突變體與野生型菌株在CO39葉片上形成擴展性病斑和褐斑的數(shù)的比較
二、突變體表型變化與插入標記共分離分析
用遺傳雜交的方法對突變體中插入標記潮霉素抗性基因與突變表型的共分離進行分析，將此三個突變體分別與一個不具有突變表型和潮霉素抗性，并且交配型相反的梨孢菌菌株GUY11進行雜交，分析其子囊孢子后代的分生孢子形狀及潮霉素抗性情況，具體方法如下
將上述突變體X54、H3035和H3587分別與不具有潮霉素抗性，分生孢子形態(tài)正常的梨孢菌菌株Guy11在西紅柿燕麥片培養(yǎng)基上進行對峙培養(yǎng)。首先于25℃培養(yǎng)至菌落邊緣即將接到一起，然后將其移至20℃光照培養(yǎng)，約20天左右在菌落的交界處形成黑色突起的子囊殼。挑取成熟的子囊殼，于無菌水中輕輕擠破，釋放殼內的子囊，將子囊懸浮液涂在水瓊脂平板上，24小時后挑取子囊內子囊孢子萌發(fā)的單根菌絲于西紅柿燕麥片培養(yǎng)基上培養(yǎng)。統(tǒng)計這些子囊孢子后代的潮霉素抗性和分生孢子形態(tài)。結果如表4所示，表明在測定的子囊孢子后代中，分生孢子形狀突變的后代都具有潮霉素抗性，說明這三個突變體的分生孢子形狀突變的表型與插入標記潮霉素抗性基因是共分離的。在突變體X54與Guy11的雜交后代中，抗潮霉素的后代全是突變表型，而突變體H3035和H3587與Guy11的雜交后代中，抗潮霉素的后代有些是突變表型的，有些則是野生型表型的，說明在突變體X54中插入標記潮霉素抗性基因只插入在基因組的一個位點，而在突變體H3035和H3587中插入標記潮霉素抗性基因可能插入在基因組的兩個或兩個以上不同的位點。
表4.Guy11與三個突變體雜交后代的潮霉素抗性和分生孢子形態(tài)
三、與梨孢菌分生孢子形狀有關的MgCOM1基因的克隆
1.質粒拯救及基因組TAC文庫的篩選
分別通過對三個突變體中插入質粒的拯救，獲得了相應的插入位點側端的基因組序列，并確定了三個突變體中質粒的插入位置。具體方法如下選取插入質粒pUCATPH(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Tagged mutants at the Toxl locus of Cochliobolus heterostrophusby restriction enzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA911264-12653)中pUC18部分沒有酶切位點的限制性內切酶完全消解突變體的基因組，突變體X54和H3587選用限制性內切酶BamHI消解，突變體H3035選用限制性內切酶EcoRV消解。乙醇沉淀精制后用T4DNA連接酶進行自連接，轉化大腸桿菌的感受態(tài)細胞JM109。提取轉化體的質粒，并進行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質粒中除含有pUCATPH中pUC18部分的序列外，還含有部分插入位點側端的基因組的序列。對鑒定正確的質粒進行測序然后到數(shù)據(jù)庫中檢索，分析插入位點附近的基因的范圍和可能的外顯子。結果表明在突變體X54中，質粒插入在一個限制型內切酶SmaI的酶切位點處，對應于SEQ ID NO.1中的第174位；在突變體H3035和H3587中，質粒插入在一個限制型內切酶HindIII的酶切位點處，對應于SEQ ID NO.1的第2120位和SEQ ID NO.2中的第1098位。將獲得的側端序列與國際稻瘟菌基因組協(xié)會的官方網(wǎng)站(http//www.riceblast.org/)已公布的梨孢菌的基因組數(shù)據(jù)庫比較，這兩個插入位點都位于第I號染色體的contig2.217。以這兩個位點之間的一段1392bp的DNA片斷(序列4)為探針，篩選梨孢菌70-15的基因組TAC文庫(其平均克隆片段大小為50kb，共覆蓋全基因組的16-18倍，該基因組TAC文庫按照文獻魏士平等(Construction and Evaluation of a TAC Library of Magnaporthe grisea，植物病理學報，2003，3357-62)描述的方法構建)，獲得四個陽性克隆，它們都包括MgCOM1的基因組基因(SEQ ID NO.1所示的第1位到第4276位的核苷酸序列)。
質粒拯救過程中涉及到的限制性內切酶和T4DNA連接酶由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，參照使用說明書使用。
2、RT-PCR和5’RACE獲得MgCOM1的cDNA基因
按照步驟一中2所提到的制備分生孢子的方法收集產(chǎn)孢時間為24小時的梨孢菌菌株70-15的分生孢子，異硫氰酸胍(GT)法抽取總RNA，消解其中的DNA，然后以poly(T)為引物用SuperscriptIITM的反轉錄酶進行反轉錄，得到分生孢子總cDNA的第一條鏈。利用英國Exeter大學的建立的植物病原真菌的EST數(shù)據(jù)庫(http//cogeme.ex.ac.uk/)，從3’非翻譯區(qū)和兩個不同外顯子中設計如下兩對RT-PCR引物609’5’-CTTTTGCCATAACTCTGAGC-3’和down64285’-GGTGCCCTGACAGTAGTTTCC-3’；20695’-ACACCACTTGCTAAGAAGTTC-3’和prepoly35’-CACCTGGTATAGGAGATCCG-3’，擴增基因的3’端cDNA序列。將擴增得到的cDNA片段連接到T-載體上后測序，利用測序得到的5’端的序列設計5’RACE引物包括基因特異性反轉錄引物RT primer5’-CTCATCTTCGTC-3’，和如下兩對PCR引物A15’-TTCGGATCGGTAACGTAGAGG-3’和S15’-CAACCCGACGATGCCAATA-3’；A25’-CTGTGTTGCCGCCGTAGAGGA-3’和S25’-CAAGAAGCCCAAGTACATGCC-3’，擴增基因5’端的cDNA序列。5’RACE的實驗方法參照寶生物工程(大連)有限公司的5’Full RACE Core Set。同樣將所獲得的cDNA片段連接到T-載體上后測序，并拼接分別測得的基因的3’端和5’端的cDNA序列。結果表明MgCOM1的cDNA基因具有SEQ ID NO.2所示的第1位到第2591位的堿基對。其編碼序列為自SEQ ID NO.2的第101位到第2425位堿基，編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列的蛋白質MgCOM1。將MgCOM1與NCBI的蛋白質數(shù)據(jù)庫進行比較，該蛋白質屬于一種新的蛋白質，它與所有已知的蛋白質的相似性都很低，只與赤霉菌的一個假定蛋白(登錄號為EAA67862.1)有36％的一致性，與粗糙脈胞霉的一個預測蛋白(登錄號為EAA35776.1)有33％的一致性。
將序列1的基因組基因的核苷酸序列與序列2的cDNA序列進行比較，結果表明MgCOM1的基因組基因中包含兩個內含子，這兩個內含子的剪切都符合“GT-AG”原則，自序列1的5′端第786位至956位堿基為第一外顯子，自序列1的5′端第957位至1222位堿基為第一內含子，自序列1的5′端第1223位至1485位堿基為第二外顯子，自序列1的5′端第1486位至1556位堿基為第二內含子，自序列1的5′端第1557位至3447位堿基為第三外顯子；其編碼區(qū)位于序列1的5′端第786位至3447位堿基之間。
實施例2、MgCOM1及其編碼基因功能的確認
包括互補實驗和基因置換實驗。在這部分內容中包括互補載體和基因置換載體的構建以及將上述兩類載體導入梨孢菌中，得到梨孢菌的重組轉化體。互補載體的構建是指將包含預測的MgCOM1的全長的基因組基因(梨孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)的DNA片斷與一個帶有新霉素抗性基因的載體相連，在這里新霉素抗性基因并不是對本發(fā)明的限制，其他能導致抗生素抗性的基因，即潮霉素抗性基因之外的導致真菌抗性的基因都可以達到同樣的效果?；パa載體所導入的梨孢菌受體菌株是三個突變體為梨孢菌X54、H3035和H3587?；蛑脫Q載體的構建是指將包括預測的MgCOM1的全長的基因組基因(梨孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)連入一個載體中，然后用潮霉素抗性基因替換掉MgCOM1的基因組基因的大部分?；蛑脫Q載體所導入的梨孢菌菌株是野生型梨孢菌70-15，基因置換載體通過基因兩側的側翼序列與野生型菌株基因組的相應序列發(fā)生同源重組，從而將基因組中相應位點MgCOM1的基因組基因部分序列與潮霉素基因置換。
一、互補載體和敲除載體的構建
1.基因的預測
首先將三個突變體X54、H3035和H3587中質粒插入位點所在的contig2.217的序列用軟件GENESCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)進行預測，結合國際稻瘟菌基因組協(xié)會的官方網(wǎng)站(http//www.riceblast.org/)中對梨孢菌基因組中基因的預測，三個突變體X54、H3035和H3587中質粒的插入位點都包括在負鏈上同一個預測的MgCOM1的基因組基因(梨孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)中。盡管GENESCAN中三種預測模式(Arabidopsis、Maize和Vertebrate)和國際稻瘟菌基因組協(xié)會的官方網(wǎng)站中對這個基因的定位和外顯子-內含子結構不一致，但是contig2.217中兩個限制性內切酶SphI位點(從contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)之間的序列都能包含這幾種模式對這個基因所預測的范圍，而且除了這個基因外不再包括別的基因。
2.互補載體的構建
首先合成帶有限制性內切酶XbaI識別序列的引物從克隆質粒載體pS65T-C1(gi1019893)中擴增出新霉素磷酸轉移酶基因連入pBlueScriptKS(+)的限制性內切酶切位點XbaI間，得到的質粒載體命名為KN。然后從實施例1中步驟三的1中所得到的陽性克隆中用限制性內切酶SphI切下包含有預測的MgCOM1的基因組基因(梨孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)的DNA片斷，末端補平后與限制性內切酶EcoRV酶切的KN連接，得到包含有預測的MgCOM1的基因組基因(梨孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)和選擇標記新霉素磷酸轉移酶基因的互補載體pKNS(圖4A)。構建過程中涉及到的限制性內切酶和連接酶，末端補平酶由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，參照使用說明書使用。
3.敲除載體(基因置換載體)的構建。
參照GENESCAN中三種預測模式(Arabidopsis、Maize和Vertebrate)和國際稻瘟菌基因組協(xié)會的官方網(wǎng)站中所預測的MgCOM1的基因組基因的外顯子-內含子的結構，兩個限制性內切酶XhoI和ApaI位點(從contig2.217的第6332位的核苷酸至第13228位的核苷酸)之間的序列能包括MgCOM1的基因組基因的大部分(包括序列1的1-2847位，和基因組中這段序列上游的約4049bp的序列)而不包括任何別的基因。一方面從實施例1中步驟三的1中所得到的陽性克隆中用限制性內切酶SphI切下包含有預測的MgCOM1的基因組基因(梨孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)的DNA片斷，與同樣限制性內切酶SphI酶切的pUC18連接，命名為PS2；另一方面用限制性內切酶XbaI從質粒載體pUCATPH中切下潮霉素磷酸轉移酶基因與同樣限制性內切酶切的pGEM7zf(+)連接，得到的質粒載體命名為p7h6；然后用限制性內切酶XhoI和ApaI從質粒p7h6中切下潮霉素磷酸轉移酶基因與同樣酶切的PS2連接，得到基因置換載體pPSH(圖4B)，這樣質粒載體pKNS中的預測的MgCOM1的基因組基因(梨孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)的XhoI和ApaI位點之間的序列就被潮霉素磷酸轉移酶基因所代替，在潮霉素磷酸轉移酶基因的兩側分別留下1958bp和1657bp的MgCOM1的基因組基因的側端序列。
二、梨孢菌的轉化。
梨孢菌的轉化首選REMI的方法。REMI的原意為限制性內切酶介導的整合，采用不破壞載體內基因的限制性內切酶將載體線性化，在限制性內切酶的介導下轉化梨孢菌的原生質體，被轉化的質粒隨機的整合到基因組中相應的限制性內切酶的切點處。在本發(fā)明中，梨孢菌的轉化中省略了限制性內切酶的應用，轉化效率會比添加限制性內切酶的方法低，但不影響被轉化質粒整合到基因組中。原生質體的制備和轉化方法如下
1.原生質體的制備
500毫升三角瓶裝入150毫升液體CM培養(yǎng)基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸鈣0.1％，磷酸二氫鉀0.02％，硫酸鎂0.025％，氯化鈉0.015％)，分別接入梨孢菌70-15、X54、H3035和H3587的1×106個分生孢子，在26-28℃、100轉/分條件下?lián)u培30-32小時，三層滅菌擦鏡紙過濾收集菌絲體，菌絲體用0.7M氯化鈉溶液洗滌后轉移至滅菌的50毫升離心管中，每1克菌絲加入1毫升的酶滲透液(含20毫克/毫升崩潰酶，用0.7M氯化鈉配制)，26-28℃、100轉/分條件下酶解3-4小時后，用0.7M氯化鈉洗滌菌絲體，經(jīng)三層滅菌擦鏡紙過濾，收集原生質體，4,000轉/分離心15分鐘，先用25毫升STC(1.2M山梨醇，10mM Tris-Cl，pH 7.5，50mM氯化鈣)洗滌原生質體一次，然后分別用10毫升STC洗2次，離心沉淀后用STC將原生質體濃度調至0.5-1×108個/毫升。
2.梨孢菌轉化
分別將梨孢菌70-15、X54、H3035和H3587原生質體分裝于滅菌的50毫升離心管中，每管150微升，分別加入等體積的線性化的載體(約2微克，梨孢菌70-15的離心管中加入用限制性內切酶SmaI線性化的基因置換載體pPSH，梨孢菌X54、H3035和H3587的離心管中分別加用限制性內切酶NotI線性化的互補載體pKNS)和STC混合液，冰上放置20分鐘，然后逐滴緩慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mM Tris-pH 7.5，50mM氯化鈣)，冰上靜止20分鐘，加入25毫升/管冰冷的STC，緩慢混勻，4,000轉/分、4℃離心15分鐘，去上清，然后每管加入3毫升的LR培養(yǎng)基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室溫靜置培養(yǎng)12-13小時后，轉入培養(yǎng)皿，加入12毫升冷卻至50℃的SR(LR+1.6％瓊脂)，混勻，待其凝固吹干后，上面鋪一層12毫升的0.7％上層瓊脂(冷卻至50℃，含400微克/毫升的G418(互補實驗)或300微克/毫升的潮霉素(美國Roche公司生產(chǎn)，基因置換試驗)。28℃培養(yǎng)4-6天，將出現(xiàn)的轉化體(梨孢菌三個突變體X54、H3035和H3587的互補轉化體分別為CX54、CH3035和CH3587；梨孢菌70-15的基因置換轉化體K204)轉至固體CM培養(yǎng)基(0.6％酵母提取物，0.3％酶水解干酪素，0.3％酸水解干酪素，1％的蔗糖，1.6％瓊脂)(含400微克/毫升的G418(互補實驗)或250微克/毫升的潮霉素(基因置換試驗)上，二次篩選后將單個菌落轉入燕麥片番茄培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并進行單孢分離。
互補實驗的結果表明互補載體在梨孢菌三個突變體X54、H3035和H3587基因組中的異位整合使這三個突變體的分生孢子的形狀恢復野生形態(tài)。三個突變體的互補轉化體CX54、CH3035和CH3587的分生孢子的長度和寬度與野生型菌70-15的比較如表5所示。突變體X54的互補轉化體CX54和野生型菌70-15的分生孢子形態(tài)如圖5所示，圖中標尺為5微米。
表5.互補轉化體與野生型菌70-15的分生孢子的長度和寬度
注差異顯著性均為A的兩組之間在5％的顯著范圍內沒有差異。
互補載體在三個突變體基因組中的異位整合使這三個突變體的致病力也恢復到野生型的水平，包括在洋蔥表皮上的侵染釘和侵染性菌絲的形成率，以及在親和性水稻品種CO39葉片上形成病斑的數(shù)。其中，突變體X54和相應的互補轉化體CX54在接種后24小時、36小時和48小時在洋蔥表皮上形成侵染釘和侵染性菌絲的比率及與野生型菌的比較如表6和圖6A-圖6D所示；野生菌株70-15和三個MgCom1插入突變體X54、H3035、H3587和相應的互補轉化體CX54、CH3035、CH3587在親和性水稻品種CO39葉片上形成病斑的數(shù)如圖7所示。圖7中，A為70-15，B為X54，C為H3035，D為H3587，E為CX54，F(xiàn)為CH3035，G為CH3587。
表6.70-15，X54和CX54在洋蔥表皮上形成侵染釘和侵染性菌絲的比率
基因置換試驗的結果表明MgCOM1的部分基因組基因序列與潮霉素基因序列的置換導致轉化體K204所產(chǎn)生的分生孢子的形狀具有與本發(fā)明中的三個突變體X54、H3035和H3587一樣的變異?；蛑脫Q轉化體K204的分生孢子的長度和寬度及與野生型菌70-15、突變體X54、H3035、H3587的比較結果如表7所示。其中，基因置換轉化體K204與野生菌株70-15的分生孢子形態(tài)比較如圖8所示，圖中，A為70-15，B為K204，標尺為25微米。MgCOM1的部分基因組基因序列與潮霉素基因序列的置換也導致轉化體的致病力減弱，包括在洋蔥表皮上的侵染釘和侵染性菌絲的形成率，以及在親和性水稻品種CO39葉片上形成病斑的數(shù)。其中，基因置換轉化體K204與野生型菌70-15在洋蔥表皮上接種后24小時、36小時和48小時形成侵染釘和侵染性菌絲的比率如表8和圖9A和圖9B所示。野生菌株70-15與基因置換轉化體K204在洋蔥表皮上接種后24小時時形成侵染釘和侵染性菌絲的差異如圖10所示，圖中A為70-15，B為K204，標尺為30微米?；蛑脫Q轉化體K204與野生型菌70-15在CO39葉片上形成擴展性病斑和褐斑的數(shù)量如表9所示。野生菌株70-15與突變體X54，H3035，H3587及基因置換轉化體K204對親和性的水稻品種CO39的致病性比較如圖11所示，圖中A為70-15、B為X54、C為H3035、D為H3587、E為K204。
表7.轉化體K204與野生型菌70-15、突變體X54、H3035和H3587的分生孢
子的長度和寬度比較
注差異顯著性均為B的兩組之間在5％的顯著范圍內沒有差異，差異顯著性為A和B的兩組之間在5％的顯著范圍內差異顯著。
表8.基因置換轉化體K204與野生型菌70-15在接種后24小時、36小時和48小
時形成侵染釘和侵染性菌絲的比率
表9.基因置換轉化體K204與野生型菌70-15在CO39葉片上形成擴展性病斑和褐
斑的數(shù)量
實施例3、啟動子區(qū)域的確定
一、啟動子區(qū)域的確定
通過將序列2的MgCOM1的cDNA基因序列和預測的MgCOM1基因組基因的全長(梨孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)進行比較，后者包括基因起始密碼子前約6.4kb的序列，而這段序列中基因起始密碼子前約2kb的序列中沒有預測到保守的啟動子序列和順式作用元件(http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan/)。因此通過尋找能夠互補基因置換轉化體的最短的序列來確定啟動子序列。在該實施例中，共構建了包括基因起始密碼子之前1814bp，983bp和785bp等三種不同長度的序列作為啟動子序列和MgCOM1基因相連的互補載體。
本實施例中首先構建了兩個限制性內切酶PstI位點之間5299bp的片斷(從contig2.217的第4912位的核苷酸至第10211位的核苷酸)和新霉素磷酸轉移酶標記相連的互補載體pKNSP1.8(圖12Aa，從互補載體pKNS中用PstI切下5299bp的片斷與同樣酶切的KN連接得到)，這個載體包括MgCOM1的基因組基因起始密碼子前1814bp的啟動子序列和終止密碼子后829bp的終止序列。用pKNSP1.8轉化基因置換轉化體K204，結果表明所得的轉化體的分生孢子形態(tài)(圖12Ab)和致病力能夠恢復到野生型的水平。
本實施例在互補載體pKNSP1.8的基礎上，選用限制性內切酶切逐步缺失掉831bp(HindIII和EcoRI酶切pKNSP1.8回收919bp的包含啟動子部分，與EcoRI和PstI酶切pKNSP1.8回收3553bp的MgCOM1基因部分，共同連入HindIII和PstI酶切的KN連接)和1029bp(KpnI酶切pKNSP1.8，除要缺失掉的PstI和KpnI之間1029bp的部分外，回收其他的部分連接)，分別得到包括MgCOM1的基因組基因起始密碼子前983bp和785bp的啟動子序列的互補載體pKNSP1.0(圖12Ba)和pKNSP0.8(圖12Ca)。用這兩個載體分別轉化基因置換轉化體K204，結果表明這兩個載體轉化所得到的轉化體的分生孢子形態(tài)(圖12Bb和圖12Cb)和致病力都能夠恢復到野生型的水平。證明能夠正常啟動MgCOM1的基因組基因的啟動子至少應包括從翻譯起始密碼子上游的785bp的序列，即如SEQ ID NO.1所示的第1位到第785位的核苷酸序列。
二、兩種不同長度啟動子序列所啟動的基因在梨孢菌侵然過程中不同發(fā)育階段的表達
首先合成分別帶有限制性內切酶EcoRI識別序列的引物從克隆質粒載體phGFP-S65T(gi1289374)中擴增出綠色熒光蛋白基因(GFP)連入pBlueScriptKS(+)的限制性內切酶切位點EcoRI間，得到的質粒載體命名為KSG。合成分別帶有限制性內切酶HindIII和EcoRV酶切位點的引物從pKNSP1.8中擴增983bp的啟動子部分連至KSG的HindIII和EcoRV酶切位點間，得到包含有983bp啟動子和GFP基因的載體pNpSal；合成分別帶有限制性內切酶KpnI和EcoRV酶切位點的引物從pKNSP1.8中擴增的785bp啟動子序列部分連至KSG的KpnI和EcoRV酶切位點間，得到包含有785bp啟動子和GFP基因的載體pKPG；將pNpSal和pKPG分別轉化野生型菌株70-15，結果表明pNpSal和pKPG分別轉化野生型菌株70-15得到的轉化體在分生孢子，芽管，附著胞及侵染性菌絲中都有不同強度GFP的表達。
序列表
<160>1
<210>1
<211>4276
<212>DNA
<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)
<400>1
ggtacccggc cggaacgcct ggcccctgca actcaccaac tccgccctcc actgacgttc60
ccactccatt tctcgtgcct ctttcgttgc tcgctccacc cacccatcca ttctttgcct120
gcgtgcgtgt cggggcgatc ccaggtgcat cttccgtacg acctctttcg ccccgggttt180
gctttgtact gcctttgctc tgcttgctca tcactgcttg cgagtgagtg tggtgtctgt240
acgccctctt tggaaacaac tgttggatca cttcttgctc cgtccttctt ttttcccggc300
cattgttctt tggatctgcc aatttacttg ttacctcatc actgaactgg caaccccctg360
ttcctctcgt ttctttgctt tactctaccc gctctgcatc ctgctcccag ttattcggtt420
ttctttggac cgacattaac actttccctt tcgatatcga ccgcctcctt agctcgccag480
gaacctccag aagatctatc ggcatacaat gaggtgaaga gtgctgcacc acggaaggat540
actggcagca ttgaaagcct gaagaacgtc tgtcggcttc ggccgcccgc caccctcggc600
tggtctgaca actgacgtcc tcttaccccc tttactctct tgacgaaacc aacaacaacc660
cattcttttt cgactaatgc caatcgacct gaccacgacc gaccacgata acgagccagc720
ggaattctcg ttgtgaattg aactcggacg aaaagcaaga cggccgagcc gagttgccca780
tcaagatgtc tctcgtcatt ccggcagggg gtctggagct ggagacgtcg gtcgacaaga840
tgaccagtct cccgctccag gcttttgcca taaccctgag cgatgacatg cttgaggacc900
tgatagacag cttccaaaat ggccaggaga tcgagttgtc cctggggcag tcaccggtag960
gtttattttg gatcgaaccc caatagtgat gcctctttgg aggtaccttg ctgtttgcct1020
ttgcccatca attgcctgga tacaatcaga ataattcttg tgattgtgaa caatagcttt1080
agaagaaaag ctggtctctg tgcgctcccg caacctgctt ggcgaagata gcatttagcc1140
ctaaatctcg accatgcatg aaccataact cacctatccg tcaacttacg atccactgac1200
actattctgt tcgtatctca aggctttcct ctacggcggc aacacagcac ccatcactcg1260
aatccccgag aatttctcct acgacctcta cgttaccgat ccgaactcgc ccgaaacggc1320
tagccttgca cccaacccga cgatgccaat attcaagaaa caacacctca acttggtcaa1380
gaagcccaag tacatgccaa agggcttcat tgacgaagat gaggccccgg agctgggagc1440
tttagagatc atcgagaacc cggaaaagtc tcagacgtcc tcacagtatg cattctgtgt1500
ccaactgacc tttttaccca gtggtcaggt aactaacggt agagctcact ttaaaggtcc1560
aagagctctt cacttcaacc tcagtctgcg ctgaacaaga agccgaagtc tgcgacggcc1620
gggaagaaga cggcggctag taatgcgata accatgtcca cacaggctcg ctcgcgtccg1680
acaagcccgg caatcagcgc cgttggctct cctcttcccg agtcgtcgat cgaatcttcg1740
caccagcaaa tcgtgaagga ggctaaagaa ctacgcgcac cgctcatcca cgccctcgct1800
gttcgggaga tgacatatga cgaactctgg gagaagtggg gcaagggtga tgatgacgag1860
tcgaggcggg agttccgtaa tattctgagc aaggtcgccg agcaggtcaa gaactctaac1920
aagtacatga tgaagaagaa ccactggaag gagttggatg tctggaatca caattacgac1980
tcggattcgg accgccaaac cgccatcgac aatgctgtgc ggcactttga caagatgcga2040
attggtgcct cggagccaga gtggcagaag ctgttgccgt ttgacgaccg tggaaagggc2100
aagtgtctga gcaagcttca agcttcgtta gccaggggcc cgaaaggact cactgttcac2160
gttcagaatg cagacgatac gagcggagct ggttcgccag acacggacaa ccgctctatc2220
agcgggtcgc agcccatgtc caggtcgagc tcacaaaaca agccaaagaa ggcagtcgaa2280
aagaaaccag ctgtttcagc accgaaaaag ccgaccgctc ccaaggtttc tccctccaag2340
cccgccgcca agccggcagc caagacagga gccagaggtc cgctatcaaa agaaatcatc2400
accgattctg acgaatccag tgacgagatc ccgctttcgc agacaaagaa cgtggtcaaa2460
aaacaagcgg cacctgcggt gagggctccc aagcctccaa tatctgcacc agtttcgggt2520
ccttcgtccc ttcccaagaa gcccccgcca cctgcggcac gcgagccagc caagccgcag2580
atcacagcaa agccgccggt gaagagacca cgcgaggagg aggacagcag ttccagctcg2640
ggcacaccac ttgctaagaa gttcaaggtc aaggagccag tgagggcacc aaaagagccc2700
atcagggcac cgaaagaacc tatcagggcg ccaaaggaaa ctactgtcag ggcacccaag2760
gaggtcatcc gtgcgccacg agagacgaag ccgaccaagg aacccaaggc tgcgcctttg2820
cctgtcagca agccccgtcc cgcagactcg agtcagagca cgtcgaggac cggaagctcg2880
aatatatcgt tcaaccggtc gaagaacaca tcgcctgcca agtcttcgcc tcttgcatca2940
tcgcccccaa ccaatgcttc cgatatcgat ccggctgagg aggccatgat tgctaatgcc3000
aatcgcaaac gcaaggctga cgcatactac aacgactcat cgtcgaccac tagcagcagc3060
agcagcaacg tacaaacttc gggcaagaac tcgattaaaa agcgcaccca cgacgatgac3120
gtgagcgtga gcagaagagg cgctggtagc aagcttcctc cggatgttgt agccaaagca3180
cgccgcttca aagaggcgta ctcggattac gagcgactgc actatgagct ttcgggaatg3240
aacaaccccg aggagagcaa gctcaatgag ctcatgaaca tgcaccgcag gttggaaaag3300
atgaagaagg agatatactc gaccacaggt gctacttaca atggggaccg tgaccgtgct3360
cacaagtctg gagagcagaa gcggagtagc gccgtggcca gcagccgccg cgagcgcgac3420
gagtacaacg actatggccg gcattgagat ttgaggaggc gatcaaagtt gagcgatact3480
gcgccgataa tattattctt ggcagcgatt cgctccttcg catctcgaac ctgttgctga3540
aacaagtcga ttgactcggt gtgcttctgc tcccaagact cggatcgcaa aggcggatct3600
cctataccag gtggccgatg tgtcttgatt atttcccgag aagtgttctt tttttaacac3660
aactttgttt tgcttttcaa tgatcgttat actgcatatt tctcaagttt taccccggag3720
tgctccacag aagcaactct tgcacatctc attccatcat tttatggcgc accttggttc3780
tggagttcat gggcggcata taacaaatga cagcatcttt tgtcttgatg gaaaatggtc3840
ttttggatta actactcccc ttgtcctctc tttcctttgc attaatcata tacaaacacc3900
tggggagcat atcatgatcc tttatcgttt actcttcggg acaggcaggg gcatttgaaa3960
ttaagcgata ccacaccagg atatacttgg tatttcagtc ccactaggag aactgaatgg4020
cggagggggt cgaaaacagg actggaaaga ttgtgaggga tgacgatagg ggtttcaaag4080
gttgctacta tgcttaacta gttgacagtt tgaatcagct acctgacgtt ttggttcctt4140
tgcttgcatt tgactcaagg actcttgttg gttttcatgt agtctttttt tcaacgtctc4200
tagcaggttt agagcaaggg ttcatttagc taccgaattg aacacagaaa gttaagctca4260
cgaccgcgaa ctgcag4276
<210>2
<211>2591
<212>DNA
<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)
<220>
<221>CDS
<222>(101)..(2425)
<400>2
gacctgacca cgaccgacca cgataacgag ccagcggaat tctcgttgtg aattgaactc60
ggacgaaaag caagacggcc gagccgagtt gcccatcaag atgtctctcg tcattccggc120
agggggtctg gagctggaga cgtcggtcga caagatgacc agtctcccgc tccaggcttt180
tgccataacc ctgagcgatg acatgcttga ggacctgata gacagcttcc aaaatggcca240
ggagatcgag ttgtccctgg ggcagtcacc ggctttcctc tacggcggca acacagcacc300
catcactcga atccccgaga atttctccta cgacctctac gttaccgatc cgaactcgcc360
cgaaacggct agccttgcac ccaacccgac gatgccaata ttcaagaaac aacacctcaa420
cttggtcaag aagcccaagt acatgccaaa gggcttcatt gacgaagatg aggccccgga480
gctgggagct ttagagatca tcgagaaccc ggaaaagtct cagacgtcct cacagtccaa540
gagctcttca cttcaacctc agtctgcgct gaacaagaag ccgaagtctg cgacggccgg600
gaagaagacg gcggctagta atgcgataac catgtccaca caggctcgct cgcgtccgac660
aagcccggca atcagcgccg ttggctctcc tcttcccgag tcgtcgatcg aatcttcgca720
ccagcaaatc gtgaaggagg ctaaagaact acgcgcaccg ctcatccacg ccctcgctgt780
tcgggagatg acatatgacg aactctggga gaagtggggc aagggtgatg atgacgagtc840
gaggcgggag ttccgtaata ttctgagcaa ggtcgccgag caggtcaaga actctaacaa900
gtacatgatg aagaagaacc actggaagga gttggatgtc tggaatcaca attacgactc960
ggattcggac cgccaaaccg ccatcgacaa tgctgtgcgg cactttgaca agatgcgaat1020
tggtgcctcg gagccagagt ggcagaagct gttgccgttt gacgaccgtg gaaagggcaa1080
gtgtctgagc aagcttcaag cttcgttagc caggggcccg aaaggactca ctgttcacgt1140
tcagaatgca gacgatacga gcggagctgg ttcgccagac acggacaacc gctctatcag1200
cgggtcgcag cccatgtcca ggtcgagctc acaaaacaag ccaaagaagg cagtcgaaaa1260
gaaaccagct gtttcagcac cgaaaaagcc gaccgctccc aaggtttctc cctccaagcc1320
cgccgccaag ccggcagcca agacaggagc cagaggtccg ctatcaaaag aaatcatcac1380
cgattctgac gaatccagtg acgagatccc gctttcgcag acaaagaacg tggtcaaaaa1440
acaagcggca cctgcggtga gggctcccaa gcctccaata tctgcaccag tttcgggtcc1500
ttcgtccctt cccaagaagc ccccgccacc tgcggcacgc gagccagcca agccgcagat1560
cacagcaaag ccgccggtga agagaccacg cgaggaggag gacagcagtt ccagctcggg1620
cacaccactt gctaagaagt tcaaggtcaa ggagccagtg agggcaccaa aagagcccat1680
cagggcaccg aaagaaccta tcagggcgcc aaaggaaact actgtcaggg cacccaagga1740
ggtcatccgt gcgccacgag agacgaagcc gaccaaggaa cccaaggctg cgcctttgcc1800
tgtcagcaag ccccgtcccg cagactcgag tcagagcacg tcgaggaccg gaagctcgaa1860
tatatcgttc aaccggtcga agaacacatc gcctgccaag tcttcgcctc ttgcatcatc1920
gcccccaacc aatgcttccg atatcgatcc ggctgaggag gccatgattg ctaatgccaa1980
tcgcaaacgc aaggctgacg catactacaa cgactcatcg tcgaccacta gcagcagcag2040
cagcaacgta caaacttcgg gcaagaactc gattaaaaag cgcacccacg acgatgacgt2100
gagcgtgagc agaagaggcg ctggtagcaa gcttcctccg gatgttgtag ccaaagcacg2160
ccgcttcaaa gaggcgtact cggattacga gcgactgcac tatgagcttt cgggaatgaa2220
caaccccgag gagagcaagc tcaatgagct catgaacatg caccgcaggt tggaaaagat2280
gaagaaggag atatactcga ccacaggtgc tacttacaat ggggaccgtg accgtgctca2340
caagtctgga gagcagaagc ggagtagcgc cgtggccagc agccgccgcg agcgcgacga2400
gtacaacgac tatggccggc attgagattt gaggaggcga tcaaagttga gcgatactgc2460
gccgataata ttattcttgg cagcgattcg ctccttcgca tctcgaacct gttgctgaaa2520
caagtcgatt gactcggtgt gcttctgctc ccaagactcg gatcgcaaag gcggatctcc2580
tataccaggt g 2591
<210>3
<211>774
<212>PRT
<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)
<400>3
Met Ser Leu Val Ile Pro Ala Gly Gly Leu Glu Leu Glu Thr Ser Val
1 5 10 15
Asp Lys Met Thr Ser Leu Pro Leu Gln Ala Phe Ala Ile Thr Leu Ser
20 25 30
Asp Asp Met Leu Glu Asp Leu Ile Asp Ser Phe Gln Asn Gly Gln Glu
35 40 45
Ile Glu Leu Ser Leu Gly Gln Ser Pro Ala Phe Leu Tyr Gly Gly Asn
50 55 60
Thr Ala Pro Ile Thr Arg Ile Pro Glu Asn Phe Ser Tyr Asp Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Asp Pro Asn Ser Pro Glu Thr Ala Ser Leu Ala Pro Asn Pro
85 90 95
Thr Met Pro Ile Phe Lys Lys Gln His Leu Asn Leu Val Lys Lys Pro
100 105 110
Lys Tyr Met Pro Lys Gly Phe Ile Asp Glu Asp Glu Ala Pro Glu Leu
115 120 125
Gly Ala Leu Glu Ile Ile Glu Asn Pro Glu Lys Ser Gln Thr Ser Ser
130 135 140
Gln Ser Lys Ser Ser Ser Leu Gln Pro Gln Ser Ala Leu Asn Lys Lys
145 150 155 160
Pro Lys Ser Ala Thr Ala Gly Lys Lys Thr Ala Ala Ser Asn Ala Ile
165 170 175
Thr Met Ser Thr Gln Ala Arg Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ala Ile Ser
180 185 190
Ala Val Gly Ser Pro Leu Pro Glu Ser Ser Ile Glu Ser Ser His Gln
195 200 205
Gln Ile Val Lys Glu Ala Lys Glu Leu Arg Ala Pro Leu Ile His Ala
210 215 220
Leu Ala Val Arg Glu Met Thr Tyr Asp Glu Leu Trp Glu Lys Trp Gly
225 230 235 240
Lys Gly Asp Asp Asp Glu Ser Arg Arg Glu Phe Arg Asn Ile Leu Ser
245 250 255
Lys Val Ala Glu Gln Val Lys Asn Ser Asn Lys Tyr Met Met Lys Lys
260 265 270
Asn His Trp Lys Glu Leu Asp Val Trp Asn His Asn Tyr Asp Ser Asp
275 280 285
Ser Asp Arg Gln Thr Ala Ile Asp Asn Ala Val Arg His Phe Asp Lys
290 295 300
Met Arg Ile Gly Ala Ser Glu Pro Glu Trp Gln Lys Leu Leu Pro Phe
305 310 315 320
Asp Asp Arg Gly Lys Gly Lys Cys Leu Ser Lys Leu Gln Ala Ser Leu
325 330 335
Ala Arg Gly Pro Lys Gly Leu Thr Val His Val Gln Asn Ala Asp Asp
340 345 350
Thr Ser Gly Ala Gly Ser Pro Asp Thr Asp Asn Arg Ser Ile Ser Gly
355 360 365
Ser Gln Pro Met Ser Arg Ser Ser Ser Gln Asn Lys Pro Lys Lys Ala
370 375 380
Val Glu Lys Lys Pro Ala Val Ser Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ala Pro
385 390 395 400
Lys Val Ser Pro Ser Lys Pro Ala Ala Lys Pro Ala Ala Lys Thr Gly
405 410 415
Ala Arg Gly Pro Leu Ser Lys Glu Ile Ile Thr Asp Ser Asp Glu Ser
420 425 430
Ser Asp Glu Ile Pro Leu Ser Gln Thr Lys Asn Val Val Lys Lys Gln
435 440 445
Ala Ala Pro Ala Val Arg Ala Pro Lys Pro Pro Ile Ser Ala Pro Val
450 455 460
Ser Gly Pro Ser Ser Leu Pro Lys Lys Pro Pro Pro Pro Ala Ala Arg
465 470 475 480
Glu Pro Ala Lys Pro Gln Ile Thr Ala Lys Pro Pro Val Lys Arg Pro
485 490 495
Arg Glu Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ser Ser Gly Thr Pro Leu Ala Lys
500 505 510
Lys Phe Lys Val Lys Glu Pro Val Arg Ala Pro Lys Glu Pro Ile Arg
515 520 525
Ala Pro Lys Glu Pro Ile Arg Ala Pro Lys Glu Thr Thr Val Arg Ala
530 535 540
Pro Lys Glu Val Ile Arg Ala Pro Arg Glu Thr Lys Pro Thr Lys Glu
545 550 555 560
Pro Lys Ala Ala Pro Leu Pro Val Ser Lys Pro Arg Pro Ala Asp Ser
565 570 575
Ser Gln Ser Thr Ser Arg Thr Gly Ser Ser Asn Ile Ser Phe Asn Arg
580 585 590
Ser Lys Asn Thr Ser Pro Ala Lys Ser Ser Pro Leu Ala Ser Ser Pro
595 600 605
Pro Thr Asn Ala Ser Asp Ile Asp Pro Ala Glu Glu Ala Met Ile Ala
610 615 620
Asn Ala Asn Arg Lys Arg Lys Ala Asp Ala Tyr Tyr Asn Asp Ser Ser
625 630 635 640
Ser Thr Thr Ser Ser Ser Ser Ser Asn Val Gln Thr Ser Gly Lys Asn
645 650 655
Ser Ile Lys Lys Arg Thr His Asp Asp Asp Val Ser Val Ser Arg Arg
660 665 670
Gly Ala Gly Ser Lys Leu Pro Pro Asp Val Val Ala Lys Ala Arg Arg
675 680 685
Phe Lys Glu Ala Tyr Ser Asp Tyr Glu Arg Leu His Tyr Glu Leu Ser
690 695 700
Gly Met Asn Asn Pro Glu Glu Ser Lys Leu Asn Glu Leu Met Asn Met
705 710 715 720
His Arg Arg Leu Glu Lys Met Lys Lys Glu Ile Tyr Ser Thr Thr Gly
725 730 735
Ala Thr Tyr Asn Gly Asp Arg Asp Arg Ala His Lys Ser Gly Glu Gln
740 745 750
Lys Arg Ser Ser Ala Val Ala Ser Ser Arg Arg Glu Arg Asp Glu Tyr
755 760 765
Asn Asp Tyr Gly Arg His
770
<210>4
<211>1392
<212>DNA
<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)
<400>4
gaattctcgt tgtgaattga actcggacga aaagcaagac ggccgagccg agttgcccat60
caagatgtct ctcgtcattc cggcaggggg tctggagctg gagacgtcgg tcgacaagat120
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agagctcttc acttcaacct cagtctgcgc tgaacaagaa gccgaagtct gcgacggccg900
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ttcgggagat gacatatgac gaactctggg agaagtgggg caagggtgat gatgacgagt1140
cgaggcggga gttccgtaat attctgagca aggtcgccga gcaggtcaag aactctaaca1200
agtacatgat gaagaagaac cactggaagg agttggatgt ctggaatcac aattacgact1260
cggattcgga ccgccaaacc gccatcgaca atgctgtgcg gcactttgac aagatgcgaa1320
ttggtgcctc ggagccagag tggcagaagc tgttgccgtt tgacgaccgt ggaaagggca1380
agtgtctgag ca139權利要求
1、真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質
1)序列表中的SEQ ID №3；
2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與真菌分生孢子形狀及致病性相關的蛋白質。
2、權利要求1所述的真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白的編碼基因。
3、根據(jù)權利要求2所述的基因，其特征在于所述真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白的基因組基因，具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；
3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
4、根據(jù)權利要求3所述的基因，其特征在于所述真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白的基因組基因的編碼區(qū)位于自序列1的5′端第786位至3447位堿基之間。
5、根據(jù)權利要求2所述的基因，其特征在于所述真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；
2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；
3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
6、根據(jù)權利要求5所述的基因，其特征在于所述真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白的cDNA基因的編碼序列為自序列2的5′端第101位至2425位堿基。
7、含有權利要求1所述的真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白的編碼基因的表達載體，細胞系和宿主菌。
8、真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白的編碼基因的啟動子，具有自序列1的5′端第1位至785位堿基的核苷酸序列。
9、權利要求1所述的真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白及其編碼基因在篩選抗真菌藥劑中的應用。
10、根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于所述抗真菌藥劑為抗梨孢菌藥劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明的真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與真菌分生孢子形狀及致病性相關的蛋白質。真菌分生孢子形狀與致病性相關蛋白的氨基酸序列和其編碼基因的核苷酸序列可以作為靶位點應用于抗真菌藥劑的篩選和設計中，也可以以該核苷酸序列的某一區(qū)段作為探針在梨孢菌中再分離該序列，也可以用于篩選、分離其它真菌的與該基因具有一定序列同源性的序列。
文檔編號C07K14/37GK1699411SQ20051007492
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月6日 優(yōu)先權日2005年6月6日
發(fā)明者彭友良, 魏士平, 趙曉燕 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學