專利名稱：抗內(nèi)毒素Fab’的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物的制備方法，具體地說，本發(fā)明是一種抗內(nèi)毒素 Fab，的制備方法。
技術(shù)背景目前，內(nèi)毒素是G-菌生長時(shí)或死亡時(shí)裂解釋放出來的細(xì)胞壁脂 多醣成分。燒傷后，尤其是大面積嚴(yán)重的燒傷早期由于腸粘膜通透性 增加、燒傷創(chuàng)面細(xì)菌的感染，大量內(nèi)毒素入血，加重機(jī)體感染并導(dǎo)致 腸粘膜的損害，往往會(huì)爆發(fā)內(nèi)毒素血癥，造成SIRS，MODS，甚至于 死亡的后果。內(nèi)毒素進(jìn)入人體后可直接對細(xì)胞的生物膜產(chǎn)生毒性，但 更為重要的是通過單核一巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用使機(jī)體產(chǎn)生 多種炎性介質(zhì)，從而影響細(xì)胞的代謝，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡，進(jìn)而影響 臟器功能和屏障功能的完整性。至今，對內(nèi)毒素血癥的治療仍然沒有 較為有效措施，主要措施為使用抗生素，抗生素的應(yīng)用雖然能夠有效 控制細(xì)菌感染，但是卻由于加速了細(xì)菌的裂解和死亡反而增加了內(nèi)毒 素血癥的危險(xiǎn)系數(shù)；器官支持和重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)，以及抗炎性細(xì)胞因子 (炎癥介質(zhì))抗體或炎性細(xì)胞因子受體拮抗劑等技術(shù)和新藥的使用也 沒有明顯降低內(nèi)毒素血癥患者的病死率。IgY即蛋黃中的免疫球蛋白(yolkimmunoglobulins)，是母禽血清 中的IgY經(jīng)受體介導(dǎo)(receptor—mediuted)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)(activetransport)到 卵黃中富積形成的。IgY最基本的但又最重要的生物學(xué)功能是中和病 毒、抑殺細(xì)菌或中和毒素等抗病防御作用。據(jù)研究者認(rèn)為，IgY因其 制造相對容易、療效可靠、價(jià)格適宜而被預(yù)測是21世紀(jì)最有前途的
生物藥品。但是，目前所采用的制備方法，酶解效率和利用率都還比較低， 資源沒有得到充分利用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明克服了上述缺點(diǎn)，提出了抗內(nèi)毒素Fab'的制備方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是該抗內(nèi)毒素Fab'的制備方法是從免疫產(chǎn)蛋雞分離蛋黃，制備 IgY，酶切IgY制備Fab'后進(jìn)行鹽析，提純Fab'，本發(fā)明的改進(jìn)在 于酶切IgY制備Fab，時(shí)，調(diào)節(jié)抗內(nèi)毒素IgY與胃蛋白酶的混合水 溶液的pH值為3.5 4.0;提純Fab，時(shí)加入明礬。在酶切IgY制備Fab，時(shí)，調(diào)節(jié)溶液的pH值為3.5 4.0，可以提 高酶解效率和利用率，提高了目的物產(chǎn)量，節(jié)約了生產(chǎn)原料和能源。 傳統(tǒng)方法pH值一般為4.2。傳統(tǒng)方法徹底酶切IgY需要3h，本發(fā)明 只需要1.5h，顯著節(jié)約了消化時(shí)間，提高了酶切效率。傳統(tǒng)方法Fab'的產(chǎn)率為1.04mg/ml蛋黃液，本發(fā)明的產(chǎn)率為 4.2mg/ml蛋黃液，相當(dāng)于提高了每單位體積蛋黃液的利用率，提高了 單位體積蛋黃液的產(chǎn)出率。所述明礬的加入量為每1克抗內(nèi)毒素IgY加入0.2 0.5克明礬。 傳統(tǒng)方法中沒有使用明礬，加入明礬后，可以更好地去除熱源，去渣， 除菌，為后續(xù)除菌減少障礙，節(jié)約了相關(guān)資源。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所得的抗內(nèi)毒素Fab'具有產(chǎn)量高、效價(jià)好、 理化性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(一) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25周齡羅曼母雞(二) 主要儀器冷凍低溫高速離心機(jī)HITACHI CR21F 日本pH計(jì) TOLEDO 320Metter德國臺(tái)式離心機(jī) TGL-16G 上海本實(shí)施例按以下步驟順序進(jìn)行1. 免疫1.1取150Eu內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解在30ml去熱源生理鹽水中，充 分振蕩溶解后配制成5Eu/ml的內(nèi)毒素溶液，然后取3ml與等體積的 完全福氏佐劑混合乳化，配制成免疫抗原，備用；1.2動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)一周后開始免疫，采用雙翅膀皮下與雙大腿肌 肉相結(jié)合的方案進(jìn)行注射免疫，每個(gè)注射點(diǎn)各注射0.25ml，每兩周加 強(qiáng)免疫一次(加強(qiáng)免疫時(shí)將完全弗氏佐劑替換為不完全弗氏佐劑)，首 次免疫后2周開始收集雞蛋于4"C保存。2. 抗內(nèi)毒素IgY的分離與純化從LPS免疫產(chǎn)蛋雞中分離蛋黃，按照蛋黃液與蒸餾水1: 9的體 積比例溶解蛋黃液，調(diào)節(jié)pH值至5.0，《C保存12小時(shí)。在4°C， 10000 轉(zhuǎn)/分，離心25分鐘，得水溶成分(Water solve fract，簡稱為"WSF")。 在WSF中加18wt。/。的硫酸鈉，溶解，室溫放置l小時(shí)，然后在常溫 下離心分離15分鐘，速率10000轉(zhuǎn)/分，取沉淀。以原始蛋黃液體積 PBS (O.OIM， pH7.4)溶解上述沉淀，獲得沉淀與PBS的混合物。 然后加入14wty。的硫酸鈉溶解，室溫放置1小時(shí)，常溫下10000轉(zhuǎn)/ 分離心15分鐘，取其沉淀。即得到抗內(nèi)毒素IgY，透析，過濾，凍 干后保存?zhèn)溆谩?.胃蛋白酶酶切制備抗內(nèi)毒素Fab'3.1消化酶切IgY制備Fab，時(shí)，按照抗內(nèi)毒素IgY與蒸餾水 質(zhì)量比例l: 25混合溶解，然后向該溶液中加入胃蛋白酶混合溶解， 其中胃蛋白酶與IgY的質(zhì)量比為1: 20，調(diào)節(jié)溶液pH值為3.5。加入 甲苯，甲苯的加入量為0.3%,即每100ml溶液加入甲苯0.3ml， 30 "C水浴反應(yīng)1.5小時(shí)。3.2第一次沉淀向消化產(chǎn)物中加入終濃度為15wt。/。的硫酸銨， 在pH5.0值且溫度為57。C加熱30分鐘，然后迅速降溫至45°C以下。 在4。C下離心分離15分鐘，速率10000轉(zhuǎn)/分，取上清液。3.3第二次沉淀調(diào)節(jié)第一次沉淀所得的上清液的pH值至7.2， 加入終濃度為20wt。/。的硫酸銨。在4。C下離心分離15分鐘，速率8000 轉(zhuǎn)/分，取其沉淀。3.4吸附用蒸餾水溶解沉淀(蛋白含量小于2wt。/。)，其中蒸餾 水的量為步驟3.1中所述蒸餾水的量，然后加入明礬，每l克抗內(nèi)毒 素IgY加入0.25克明礬。調(diào)節(jié)pH值7.8，在4'C下離心分離15分鐘， 速率8000轉(zhuǎn)/分，取其上清液。3.5純化向所得的上清液中加入38wty。硫酸銨，在4"C下離心 分離15分鐘，速率8000轉(zhuǎn)/分，取其沉淀，過濾除菌即得。以上對本發(fā)明所提供的抗內(nèi)毒素Fab'的制備方法進(jìn)行了詳細(xì)介 紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述， 以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同 時(shí)，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方 式及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解
為對本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.一種抗內(nèi)毒素Fab’的制備方法，從免疫產(chǎn)蛋雞分離蛋黃，制備IgY，酶切IgY制備Fab’后進(jìn)行鹽析，提純Fab’，其特征在于酶切IgY制備Fab’時(shí)，調(diào)節(jié)抗內(nèi)毒素IgY與胃蛋白酶的混合水溶液的pH值為3.5～4.0；提純Fab’時(shí)加入明礬。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗內(nèi)毒素Fab'的制備方法，其特征在 于所述的pH值為3.5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗內(nèi)毒素Fab'的制備方法，其特征在 于所述明礬的加入量為每1克抗內(nèi)毒素IgY加入0.2 0.5克明礬。
4. 權(quán)利要求l所述的抗內(nèi)毒素Fab'的制備方法，其特征在于 所述明礬的的加入量為每1克抗內(nèi)毒素IgY加入0.25克明礬。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗內(nèi)毒素Fab’的制備方法。該抗內(nèi)毒素Fab’的制備方法是從免疫產(chǎn)蛋雞分離蛋黃，制備IgY，然后酶切IgY制備Fab’并提純Fab’；在酶切IgY制備Fab’時(shí)，調(diào)節(jié)抗內(nèi)毒素IgY與胃蛋白酶的混合水溶液的pH值為3.5～4.0；酶切IgY制備Fab’后進(jìn)行鹽析，然后再提純Fab’；提純Fab’時(shí)加入明礬。所得的抗內(nèi)毒素Fab’具有產(chǎn)量高、效價(jià)好、理化性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101125887SQ20071014016
公開日2008年2月20日 申請日期2007年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月8日
發(fā)明者史政榮, 穎 莊, 張雅萍, 強(qiáng) 李, 馬思遠(yuǎn) 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院