專利名稱：細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒，更加具體地說，涉及好氣性產(chǎn)芽孢細(xì)菌的特異性寡核苷酸固定在基板上的細(xì)菌檢測器具、使用該細(xì)菌檢測器具的極其準(zhǔn)確且操作性強的細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
以往，在食品產(chǎn)業(yè)中，為了提高制造食品的安全性，已研究開發(fā)出各種衛(wèi)生管理方面的技術(shù)。特別是近年來，食品的安全性受到嚴(yán)格監(jiān)管，對提高技術(shù)方面的關(guān)心也在提高。
在食品制造現(xiàn)場實施衛(wèi)生管理時，必需進行微生物管理，因此，必須對微生物進行檢測、鑒定。而微生物的檢測、鑒定需要專業(yè)知識和技術(shù)，所以通常將此委托于各種專業(yè)機構(gòu)和部門。接受委托的機構(gòu)等根據(jù)生理性質(zhì)和生物化學(xué)性質(zhì)以及基因分析的分類對微生物進行檢測、鑒定。
在食品微生物管理中最重要的是及時為食品制造現(xiàn)場提供準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，但是，現(xiàn)在普遍使用的檢測方法、分類鑒定方法，微生物的鑒定需要多日，例如微生物的鑒定幾乎需要大約數(shù)日～1周時間。因此，急待開發(fā)出能夠在食品制造現(xiàn)場實施的快速且準(zhǔn)確的微生物檢測方法。
其中，已知芽孢桿菌屬(Bacillus)等好氣性產(chǎn)芽孢細(xì)菌在土壤、水、空氣等自然界中分布廣泛，并且有害性細(xì)菌很多。例如，在芽孢桿菌屬中，已知引起食物中毒的炭疽桿菌(Bacillus anthracis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等對人類具有病原性。
作為對細(xì)菌分類鑒定的方法，已知有基于生理性質(zhì)和生物化學(xué)性質(zhì)的方法，基于醌組成、菌體脂肪酸組成、細(xì)胞壁成分等的方法，基于DNA的G+C含量的方法，基于DNA同源性的方法，使用DNA探針的方法，以及分析16S核糖體RNA基因的堿基序列的方法等。特別是近年來，一般是將基于16S核糖體RNA基因的堿基序列的系統(tǒng)分類得到的組(簇)作為指標(biāo)，對細(xì)菌進行分類、鑒別。
作為鑒定屬于好氣性產(chǎn)芽孢細(xì)菌的細(xì)菌的技術(shù)，已知例如日本國特開平9-94100號公報(
公開日1997年4月8日專利文獻1)及Shida，O et al.，Proposal for Two New Genera，Brevibacillus gen.nov.and Aneurinibacillusgen.nov.，International Journal of Systematic Bacteriology，939-946(1996)(非專利文獻1)中公開的方法。在該技術(shù)中，將具有屬于短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等好氣性產(chǎn)芽孢細(xì)菌細(xì)菌的16S核糖體RNA基因中存在的特異性堿基序列的DNA作為引物，將從被鑒定細(xì)菌中得到的染色體DNA作為模板應(yīng)用于PCR法，將特定DNA的擴增作為指標(biāo)在被鑒定細(xì)菌的屬水平上進行鑒定。
作為利用16S核糖體RNA基因的芽孢桿菌屬細(xì)菌的分類技術(shù)，已知有Goto，K et al.，Application of the partial 16S rDNA sequence as an index forrapid identification of species in the genus Bacillus，The Journal ofGeneral and Applied Microbiology，46，1-8(2000)(非專利文獻2)中公開的方法。在16S核糖體RNA基因的5’端約275bp區(qū)域被稱為高變區(qū)(HV region)，該區(qū)是種特異性區(qū)域，所以該技術(shù)通過分析該區(qū)域的堿基序列能夠?qū)ρ挎邨U菌屬細(xì)菌進行分類。

發(fā)明內(nèi)容
上述各種技術(shù)難于在食品制造現(xiàn)場快速且簡便地鑒定微生物，因此，期待開發(fā)出特別是能夠在要求快速性檢測的食品產(chǎn)業(yè)中的產(chǎn)品出貨前快速性檢測等中使用的技術(shù)。
具體來說，首先上述專利文獻1和非專利文獻1公開的方法，本來就不是用于食品產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品出廠前的檢測等的技術(shù)，其主要是用于鑒定細(xì)菌的技術(shù)。因此，該方法雖然能夠確保用PCR法檢測帶來的快速性，但因為其是屬特異性方法，所以需要根據(jù)各屬而采用引物，操作煩雜。
此外，非專利文獻2所述的方法，其迅速性及簡便性還不夠。
迅速且簡便的微生物鑒定方法，不僅能夠在食品制造現(xiàn)場利用，而且還能夠用于醫(yī)藥品等的制造、醫(yī)院、或研究機構(gòu)等，所以期望開發(fā)出這種技術(shù)。但是，這樣的技術(shù)還不為人所知。
鑒于上述問題，本發(fā)明的目的是提供不僅能夠在屬水平、而且能夠在種水平鑒定好氣性產(chǎn)芽孢細(xì)菌，并且能夠快速且簡便地鑒定的技術(shù)。
本發(fā)明者為了解決上述課題進行了精心研究，結(jié)果在清涼飲料(refreshingbeverage)等食品的代表性污染細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中，發(fā)現(xiàn)特定屬或特定種的特異性序列，并且發(fā)現(xiàn)使用根據(jù)該堿基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板上的器具，通過與來自被檢樣品的核酸的雜交，能夠快速且準(zhǔn)確地檢測、鑒定目標(biāo)細(xì)菌，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明包括下述發(fā)明。
(1)細(xì)菌檢測器具，其特征在于，從含有檢測對象細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的序列號1～40、43～56或57(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57)所示的堿基序列的寡核苷酸組中選擇的1個或多個寡核苷酸固定在基板上，通過該寡核苷酸和來自被檢樣品的核酸的雜交，檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌。
(2)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號1、2或3所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(3)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號4所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(4)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號5所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(5)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號6所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(6)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于土芽孢桿菌屬(Geobacillus)細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號7所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(7)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號3或8所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(8)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號9、10或11所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(9)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號12、13或14所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(10)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillussporothermodurans的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號15、43或44所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(11)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號16、17或18所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(12)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號19所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(13)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號20或55所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(14)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號21～25中任一序列號所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(15)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號26所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(16)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號27所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(17)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillus benzoevorans菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號29或30所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(18)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號31所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
(19)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號32或33所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(20)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號34、35或36所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(21)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號28或37所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(22)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Paenibacillus validus的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號38、39或40所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(23)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有史氏芽孢桿菌(Bacillussmithii)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號45或46所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(24)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Alicyclobacillusacidiphilus的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號47、48或49所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(25)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Alicyclobacillushesperidum的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號50或51所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(26)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillus fumarioli的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號52或53所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(27)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillus acidogenesis的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號54所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(28)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillus sonorensis的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號56或57所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
(29)如上述(1)所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有序列號1～40、43～56或57所示的堿基序列的全部寡核苷酸固定在基板上。
(30)如上述(1)～(29)中任一項所述的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，上述被檢樣品中的細(xì)菌是從下述(a)～(f)中任一項所述的細(xì)菌組成的群組中選擇的至少1種細(xì)菌(a)屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的細(xì)菌；(b)屬于短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)的細(xì)菌；(c)屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)的細(xì)菌；(d)屬于硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)的細(xì)菌；(e)屬于土芽孢桿菌屬(Geobacillus)的細(xì)菌；和(f)屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的細(xì)菌。
(31)如上述(1)～(30)中任一項所述的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，上述基板上具有碳二亞胺基或異氰酸酯基，該碳二亞胺基或異氰酸酯基和上述寡核苷酸或寡核苷酸末端連接的接頭反應(yīng)形成共價鍵。
(32)細(xì)菌檢測方法，用于檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌，其包括如下步驟制備被檢樣品中細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟；以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟；使用上述(1)～(31)中任一項所述的細(xì)菌檢測器具，使固定在基板上的寡核苷酸和上述標(biāo)記探針發(fā)生雜交的雜交步驟；檢測雜交信號的信號檢測步驟。
(33)細(xì)菌檢測方法，用于檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌，其包括如下步驟
制備被檢樣品中細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟；以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟；使用含有序列號1～40及43～57中任一序列號所示的堿基序列的寡核苷酸，使該寡核苷酸和上述標(biāo)記探針發(fā)生雜交的雜交步驟；檢測雜交信號的信號檢測步驟。
(34)上述(32)或(33)所述的細(xì)菌檢測方法，其特征在于，所述被檢樣品是食品。
(35)如上述(34)所述的細(xì)菌檢測方法，其特征在于，所述食品是飲料。
(36)如上述(35)所述的細(xì)菌檢測方法，其特征在于，所述飲料是清涼飲料。
(37)細(xì)菌檢測試劑盒，其用于實施上述(32)～(36)中任一項所述的細(xì)菌檢測方法。
(38)細(xì)菌檢測試劑盒，其用于實施上述(32)～(36)中任一項所述的細(xì)菌檢測方法，其特征在于，所述試劑盒包括上述雜交步驟及信號檢測步驟中使用的試劑。
(39)如上述(38)所述的細(xì)菌檢測試劑盒，其還包括上述探針制備步驟及/或上述核酸制備步驟中使用的試劑。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)俚奶禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板上，通過該寡核苷酸和來自被檢樣品的核酸的雜交，能夠檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌。所以，根據(jù)本發(fā)明即可產(chǎn)生能夠準(zhǔn)確且簡便地檢測、鑒定細(xì)菌的效果。
此外，如果在基板上固定根據(jù)多數(shù)細(xì)菌種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸，即可產(chǎn)生能夠進行全面檢測的效果。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測試劑盒，因為其包括上述細(xì)菌檢測器具及必要的試劑，所以產(chǎn)生操作性高、能夠更加簡便地檢測鑒定細(xì)菌的效果。
具體實施例方式
下面，對本發(fā)明的一種實施方式進行說明，但本發(fā)明并不限于該實施方式。
(1)本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具用于檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌，根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)俚奶禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板上，通過該寡核苷酸和來自被檢樣品的核酸的雜交，檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌。
關(guān)于本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具使用基板的材質(zhì)，只要其能夠使寡核苷酸穩(wěn)定固定即可，例如可以為聚碳酸酯或塑料等合成樹脂、玻璃等，但不限于這些材質(zhì)?；宓男螤顩]有特別限定，但可優(yōu)選使用如板狀、薄膜狀等基板。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具基板上固定的寡核苷酸是根據(jù)檢測對象細(xì)菌所屬的種或?qū)俚奶禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸。通過該寡核苷酸和來自被檢樣品的核酸之間發(fā)生雜交，能夠檢測出被檢樣品中含有的屬于目標(biāo)種或?qū)俚募?xì)菌。此外，對于根據(jù)上述檢測對象細(xì)菌所屬種或?qū)俚奶禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸，以下恰當(dāng)?shù)胤Q其為“捕獲寡核苷酸(capture oligonucleotide)”。
盡管上述特異性堿基序列只要從檢測對象細(xì)菌的基因組堿基序列中選取屬或種的特異性堿基序列即可，但優(yōu)選從檢測對象細(xì)菌的核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中選取。其中，已知細(xì)菌的16S核糖體RNA基因具有很多屬或種特異性堿基序列，所以特別優(yōu)選從16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的DNA序列中選取屬或種特異性堿基序列。核糖體RNA基因的堿基序列，可以從GenBank、EMBL、DDBJ等數(shù)據(jù)庫等中得到。
捕獲寡核苷酸根據(jù)上述屬或種特異性堿基序列設(shè)計即可，因此，其可以為上述屬或種特異性堿基序列本身，而且只要能夠與從檢測對象細(xì)菌中制備的核酸發(fā)生特異性雜交，也可包含變異，變異的位置沒有特別限定。
捕獲寡核苷酸的長度(堿基數(shù))沒有特別限定，如果過短則難于對雜交進行檢測，如果過長則發(fā)生非特異性雜交。本發(fā)明者對捕獲寡核苷酸的最適合長度進行反復(fù)研究，確定標(biāo)準(zhǔn)長度為12～24個堿基，更優(yōu)選為13～22個堿基，但并不限于此。本發(fā)明者確認(rèn)，堿基長度主要取決于序列特性(特異性堿基序列的含有率、以及該堿基序列的重復(fù))，結(jié)合性良好的序列即使是鏈短，也可發(fā)生特異性雜交。
當(dāng)捕獲寡核苷酸具有妨礙其與來自被檢樣品的核酸發(fā)生雜交的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、環(huán)狀結(jié)構(gòu)或除此之外的立體結(jié)構(gòu)時，通過將構(gòu)成捕獲寡核苷酸的1個或1個以上的核苷酸置換為肌苷或與任何核苷酸不配對的核酸，能夠解除其立體結(jié)構(gòu)。
捕獲寡核苷酸的合成方法沒有特別限定，根據(jù)公知的方法(例如Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)中描述的方法等)合成即可。一般可以用市售的DNA合成儀進行化學(xué)合成。
在本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具中，不僅將根據(jù)上述檢測對象細(xì)菌所屬的種或?qū)俚奶禺愋詨A基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板上，在此基礎(chǔ)上優(yōu)選將所謂的對照捕獲寡核苷酸固定在基板上。對照捕獲寡核苷酸包括陽性對照捕獲寡核苷酸及陰性對照捕獲寡核苷酸。陽性對照捕獲寡核苷酸用于判定下述探針制備步驟中擴增反應(yīng)是否正確地進行、雜交是否正確地進行。陰性對照捕獲寡核苷酸用于確認(rèn)未發(fā)生非特異性雜交，即未發(fā)生假陽性雜交。本發(fā)明也包括這些陽性對照捕獲寡核苷酸及陰性對照捕獲寡核苷酸固定在基板上的細(xì)菌檢測器具。
陽性對照捕獲寡核苷酸，只要根據(jù)從檢測對象細(xì)菌中制備的探針?biāo)膲A基序列設(shè)計即可。此外，使用同一細(xì)菌檢測器具要同時檢測多數(shù)檢測對象細(xì)菌時，可以對各檢測對象細(xì)菌設(shè)計陽性對照捕獲寡核苷酸，或者也可以根據(jù)從多數(shù)檢測對象細(xì)菌中制備的探針中的相同堿基序列設(shè)計。從檢測對象細(xì)菌中制備的所有探針中沒有相同堿基序列時，也可分為數(shù)組分別設(shè)計陽性對照捕獲寡核苷酸。
或者設(shè)計引物序列相同、與目標(biāo)細(xì)菌序列不同的人工序列，也可以使該序列的一部分作為陽性對照捕獲寡核苷酸。以上述人工序列為模板制備探針(在本說明書中稱這種探針為對照探針)，并添加從被檢樣品中制備的探針，能夠驗證下述探針制備步驟中擴增反應(yīng)是否順利進行和雜交是否順利進行。
陰性對照捕獲寡核苷酸，優(yōu)選設(shè)計為在陽性對照捕獲寡核苷酸的堿基序列中，具有在1個堿基以上且低于該序列具有的堿基數(shù)的20％的范圍內(nèi)含有人工置換堿基的堿基序列。進行堿基置換的堿基數(shù)，取決于與雜交條件之間的關(guān)系，選擇來自檢測對象細(xì)菌的探針不發(fā)生雜交的堿基數(shù)即可。
檢測對象細(xì)菌沒有特別限定，適當(dāng)選擇欲從被檢樣品中檢測的目標(biāo)細(xì)菌即可。例如可以為混入食品中有可能污染該食品的細(xì)菌。其中優(yōu)選有可能混入、污染飲料的細(xì)菌，特別優(yōu)選有可能混入、污染清涼飲料的細(xì)菌為檢測對象細(xì)菌。食品中混入有害細(xì)菌已成為食物中毒等公共衛(wèi)生方面的非常大的問題，并且也成為食品渾濁、異味發(fā)生、風(fēng)味劣化等質(zhì)量劣化的原因，因此，急待開發(fā)出快速且準(zhǔn)確地檢測、鑒定這些有害細(xì)菌的方法。
作為上述檢測對象細(xì)菌，例如可以為屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的細(xì)菌，更加具體地說，可以為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、Bacillus sporothermodurans、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、Bacillusbenzoevorans、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)、史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)、Bacillus fumarioli、Bacillus acidogenesis、Bacillus sonorensis等。
除上述細(xì)菌外，還可以為屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)的細(xì)菌，更加具體地說，可以為酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus cycloheptanicus、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus acidiphilus等。
除上述細(xì)菌外，還可以為屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的細(xì)菌，更加具體地說，可以為Paenibacillus validus、Paenibacillus illinoisensis、蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)等。
除上述細(xì)菌外，還可以為屬于硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)的細(xì)菌，更加具體地說，可以為Aneurinibacillus aneurinolyticus等。
除上述細(xì)菌外，還可以為屬于土芽孢桿菌屬(Geobacillus)的細(xì)菌，更加具體地說，可以為嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)等。
除上述細(xì)菌外，還可以為屬于短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)的細(xì)菌，更加具體地說，可以為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)、土壤短芽孢桿菌(Brevibacillus agri)、側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)等。但是檢測對象細(xì)菌并不限于上述細(xì)菌。
作為用于檢測、鑒定上述細(xì)菌的捕獲寡核苷酸，可以為根據(jù)屬于下述菌屬細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的各屬特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，所述菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)。
根據(jù)屬于上述芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的同屬特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號1、2或3所示的堿基序列的寡核苷酸。
AGATGGGCCCGCGGCGCATT(序列號1)GACCCGCGGCGCATT(序列號2)GGGCAACCTGCCTGTAAGAC(序列號3)根據(jù)屬于上述短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)細(xì)菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的同屬特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號4所示的堿基序列的寡核苷酸。
ACATAGGGAAACTTATGCTAA(序列號4)根據(jù)屬于上述脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)細(xì)菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的同屬特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號5所示的堿基序列的寡核苷酸。
GAGGAGCCCGCGGCGCATT(序列號5)根據(jù)屬于上述硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)細(xì)菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的同屬特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號6所示的堿基序列的寡核苷酸。
GAAGAACCGCCGGGA(序列號6)根據(jù)屬于土芽孢桿菌屬(Geobacillus)細(xì)菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的同屬特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號7所示的堿基序列的寡核苷酸。
ACACCGAAGACCGCATGGTC(序列號7)根據(jù)屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)細(xì)菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的同屬特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號3或8所示的堿基序列的寡核苷酸。
GGGCAACCTGCCTGTAAGAC(序列號3)
GACGGTACCTGAGAAGAA(序列號8)除上述之外，捕獲寡核苷酸還可以為根據(jù)下述細(xì)菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的各細(xì)菌種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸，所述細(xì)菌為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、Bacillussporothermodurans、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、Bacillus benzoevorans、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)、史氏芽孢桿菌(Bacillussmithii)、Bacillus fumarioli、Bacillus acidogenesis、Bacillus sonorensis、酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus acidiphilus、Paenibacillus validus。
根據(jù)上述蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號9、10或11所示的堿基序列的寡核苷酸。
GATTAAGAGCTTGCTCTTATGAA(序列號9)CCGCATGGTTCGAAAT(序列號10)GCTAGTTGAATAAGCTGGC(序列號11)根據(jù)上述凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號12、13或14所示的堿基序列的寡核苷酸。
TCGTGCGGACCTTTTAAAAG(序列號12)CCGCATGGAGGAAAAAG(序列號13)GCCGGGGAAGAACAAG(序列號14)根據(jù)上述Bacillus sporothermodurans菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號15、43或44所示的堿基序列的寡核苷酸。
CTCCGCATGGAGAGAGATT(序列號15)AAGAGCTTGCTTTTGATCAG(序列號43)
CTTCGCATGAAGGAGAATTG(序列號44)根據(jù)上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號16、17或18所示的堿基序列的寡核苷酸。
GCATGGTTCAAACATAAAAG(序列號16)GGCTACCACTTACA(序列號17)GAGCTTGCTCCCTGATGTTA(序列號18)根據(jù)上述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號19所示的堿基序列的寡核苷酸。
TGCTCCCTTAGGTCAGCGGC(序列號19)根據(jù)上述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號20或55所示的堿基序列的寡核苷酸。
GGATGAAAGACGGTTT(序列號20)CCGGATAGTTCCTTGAACCG(序列號55)根據(jù)上述遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號21～25中任一序列號所示的堿基序列的寡核苷酸。
GAATGGATGGGAGCTTG(序列號21)AGCTTGCTCCCAGAAG(序列號22)TTCTCCTGGAGAAAGGTT(序列號23)AGCTTGCTCCCAGAAGTT(序列號24)CTGGAGAAAGGTTGAAAGAC(序列號25)根據(jù)上述堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號26所示的堿基序列的寡核苷酸。
GAGGAAAAGCTGAAAGATGG(序列號26)根據(jù)上述環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號27所示的堿基序列的寡核苷酸。
GAGCGGACTTTAAAAGCTTG(序列號27)根據(jù)上述Bacillus benzoevorans菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號29或30所示的堿基序列的寡核苷酸。
GAGCGGACTTAAAAAGCTTG(序列號29)GAGCGGACTTTTGGGAG(序列號30)根據(jù)上述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號31所示的堿基序列的寡核苷酸。
TAGGATCTTCTCCTTCATGGG(序列號31)根據(jù)上述球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號32或33所示的堿基序列的寡核苷酸。
TCGGCTGTCGCTATAGGATG(序列號32)AAGTACAGTAGTAACTGGCT(序列號33)根據(jù)上述酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號34、35或36所示的堿基序列的寡核苷酸。
TTTCAGACTGGAATAACACT(序列號34)AATACACGGGTAGGCATCTA(序列號35)GGAAAGCTCCTTGTGA(序列號36)根據(jù)上述酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號28或37所示的堿基序列的寡核苷酸。
TTGGGCCGCTGAGAGAG(序列號28)CGCCCGCGAGGAGGCATCTT(序列號37)根據(jù)上述Paenibacillus validus菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號38、39或40所示的堿基序列的寡核苷酸。
GGGGCAACCTGTGGCTTAC(序列號38)GCTAAGACCGGATAGCTGGT(序列號39)CGCCTCGGAGAGTAA(序列號40)根據(jù)上述史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號45或46所示的堿基序列的寡核苷酸。
AGCTTGCTTTTTGAAAGTTA(序列號45)GATAATATCTTCCTTCGC(序列號46)根據(jù)上述Alicyclobacillus acidiphilus的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號47、48或49所示的堿基序列的寡核苷酸。
GTTCAAGGGAAGGCA(序列號47)CCGTTGAGGAAAGTTGC(序列號48)ATGCAACACTGATAGAG(序列號49)根據(jù)上述Alicyclobacillus hesperidum的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號50或51所示的堿基序列的寡核苷酸。
GGTCACGAGGAGGCA(序列號50)GCATCTTCTTGTGAGGA(序列號51)根據(jù)上述Bacillus fumarioli的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號52或53所示的堿基序列的寡核苷酸。
TTGCCCCTTGAGATTAG(序列號52)TCATCCTTTCCTTCGC(序列號53)根據(jù)上述Bacillus acidogenesis的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號54所示的堿基序列的寡核苷酸。
CTTCTTCCTCCGCATGG(序列號54)根據(jù)上述Bacillus sonorensis的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中同種特異性序列設(shè)計的寡核苷酸的具體例子，可以為含有下述序列號56或57所示的堿基序列的寡核苷酸。
AGCGAACCGACGGGA(序列號56)TCCCTTAGGTTAGCGGC(序列號57)此外，上述捕獲寡核苷酸并不限于含有上述序列號1～40及43～57中所示的任一種堿基序列的寡核苷酸。
對于本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具的基板上固定的捕獲寡核苷酸，只要能夠與從對象細(xì)菌中制備的探針發(fā)生雜交，對其沒有特別限定。因此，作為含有上述序列號1～40及43～57中所示的任一種堿基序列的寡核苷酸，可以為僅含有序列號1～40及43～57中所示的任一種堿基序列的寡核苷酸，也可以為含有序列號1～40及43～57中所示的任一種堿基序列以外的序列的寡核苷酸。作為含有序列號1～40及43～57中所示的任一種堿基序列以外的序列的捕獲寡核苷酸，可以為具有下述堿基序列的寡核苷酸，所述堿基序列為基于各16S核糖體RNA基因的堿基序列從序列號1～40及43～57所示的各堿基序列的5’端或3’端、或其兩側(cè)延伸的堿基序列。這種寡核苷酸固定在基板上的細(xì)菌檢測器具也屬于本發(fā)明。
1個基板上固定的捕獲寡核苷酸至少有1種即可，沒有特別限定。一般檢測樣品中混入的細(xì)菌時，用1個基板可以全部檢測出被檢樣品中可能檢測到的細(xì)菌，從操作的簡便性和檢測的快速性來看可謂優(yōu)選。因此，本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具也特別優(yōu)選在1個基板上固定多數(shù)目標(biāo)細(xì)菌種或?qū)賹?yīng)的捕獲寡核苷酸的所謂微陣列型器具。
寡核苷酸在基板上的固定方法沒有特別限定，可以適當(dāng)選擇并使用公知的方法。例如可以利用物理吸附、電結(jié)合或分子共價鍵等一般雜交法中所使用的方法。本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，優(yōu)選使用表面具有碳二亞胺基或異氰酸酯基的基材(美國專利US5,908,746、日本國特開平8-23975號)進行固定。
將寡核苷酸點樣時，如果寡核苷酸的點樣量太少，無法充分確保寡核苷酸和探針之間的反應(yīng)性，因而難于判定。此外，高密度點樣存在技術(shù)方面的問題，同時成本較高，而使用探針的熒光標(biāo)記、化學(xué)顯色等檢測雜交信號時也需要更加精密昂貴的檢測裝置(如掃描儀)。因此，優(yōu)選寡核苷酸以直徑10～1000μm的尺寸固定在基板表面。寡核苷酸在基板上的點樣方法沒有特別限定，例如可使用點樣機將寡核苷酸溶液點樣在基板上。因此寡核苷酸溶液通?？牲c成大致圓形。
(2)本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法用于檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌，其包括制備被檢樣品中細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟、以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟、根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)俚奶禺愋孕蛄性O(shè)計的寡核苷酸與上述標(biāo)記探針發(fā)生雜交的雜交步驟、檢測雜交信號的信號檢測步驟。本檢測方法的雜交步驟中優(yōu)選使用上述本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具。通過使用該細(xì)菌檢測器具，能夠簡便、快速且準(zhǔn)確地進行全面檢測、鑒定。此外，本檢測方法的被檢樣品優(yōu)選食品，更優(yōu)選飲料，特別優(yōu)選清涼飲料。下面將對各步驟分別詳細(xì)說明。
其為制備被檢樣品中細(xì)菌的核酸的步驟。從被檢樣品中制備核酸的制備方法，可以適當(dāng)選擇并使用公知的核酸制備方法。例如制備DNA時，可以根據(jù)R.F.Wang介紹的方法進行提取(Molecular and Cellular Probes(2000)14，1-5)。該方法為標(biāo)準(zhǔn)制備方法，但還有多種替代方法，可以采用其中的任一種方法。此外，也可以使用市售的試劑盒。
其為將上述核酸制備步驟中制備的核酸作為模板制備標(biāo)記探針的步驟。例如可以使用用以擴增含有捕獲寡核苷酸及陽性對照捕獲性核苷酸的堿基序列的區(qū)域而設(shè)計的引物，通過核酸擴增來制作探針。作為核酸擴增的方法，例如可以為通過PCR擴增DNA的方法，或通過體外轉(zhuǎn)錄法(in vitro transcription)擴增RNA的方法，但并不限于這些方法。
例如通過PCR制備標(biāo)記探針時，設(shè)計PCR使用的引物以使探針擴增含有與捕獲寡核苷酸及陽性對照捕獲寡核苷酸互補的堿基序列的區(qū)域。此外，只要能夠雜交，探針可以比捕獲寡核苷酸或陽性對照捕獲寡核苷酸長，也可比其短。為了得到標(biāo)記探針，可預(yù)先標(biāo)記PCR使用的引物。此外也可通過預(yù)先標(biāo)記PCR的底物(脫氧核苷酸三磷酸)得到標(biāo)記探針?；蛘咭部稍赑CR結(jié)束后標(biāo)記探針。標(biāo)記物質(zhì)沒有特別限定，例如可以使用熒光物質(zhì)、半抗原、放射性物質(zhì)等與通常雜交使用的探針相同的標(biāo)記物質(zhì)。具體來說，熒光物質(zhì)可以為異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明(Rodamine)、藻紅素(phycoerythrin)(PE)、德州紅(TexasRed)、花色素(cyanin)類熒光染料等，半抗原的具體實例包括生物素(BIOTIN)、地高辛(Digoxigenin)(Dig)、二硝基苯酚(DNP)、熒光素(fluorescein)等。
雜交步驟是根據(jù)對象細(xì)菌所屬的種或?qū)俚奶禺愋孕蛄性O(shè)計的寡核苷酸和上述標(biāo)記探針發(fā)生雜交的步驟。雜交可以在固定有上述寡核苷酸的薄膜等上進行，但優(yōu)選使用本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具。通過使用該細(xì)菌檢測器具，可以簡便、快速且準(zhǔn)確地進行全面檢測、鑒定。雜交步驟中使用的方法沒有特別限定，可以適當(dāng)選擇并使用公知的核酸雜交方法。下面所示的是一例具體雜交方法。
在含有例如為SSC(Standard Saline Citrate)的鹽溶液、例如為十二烷基硫酸鈉(SDS)或牛血清白蛋白(BSA)的阻斷溶液及促進融合反應(yīng)的添加劑的融合液中，加入標(biāo)記探針。當(dāng)探針為雙鏈時，通過加熱等進行變性。在基板上加數(shù)微升標(biāo)記探針液后，進行數(shù)小時的加熱操作(通常37℃～50℃)，使基板上固定的寡核苷酸和標(biāo)記探針之間發(fā)生雜交。然后在基板上加入5×SSC或3M四甲基氯化銨進行加熱(通常37℃～50℃)，使沒有形成特異性雜交體的標(biāo)記探針從基板上除去，只有特異性雜交體選擇性地留在基板上。
信號檢測步驟是判定上述雜交步驟中是否發(fā)生雜交的步驟，通常與上述雜交步驟連續(xù)進行。
信號檢測步驟使用的方法，取決于上述探針制備步驟所制備的探針中導(dǎo)入的標(biāo)記物質(zhì)。即、檢測雜交體時要使用在探針中導(dǎo)入的熒光物質(zhì)、半抗原等標(biāo)記物質(zhì)。因此，適當(dāng)選擇并使用公知的用以檢測使用的探針中所導(dǎo)入的標(biāo)記物質(zhì)的方法即可。
例如使用半抗原時，在基板上加入含有識別半抗原的蛋白質(zhì)或與其結(jié)合的蛋白質(zhì)的結(jié)合物和堿性磷酸酯酶或辣根過氧化物酶等的結(jié)合物(酶結(jié)合物)的溶液，室溫下使反應(yīng)進行數(shù)十分鐘。
為使雜交體可視化，僅存在半抗原和酶結(jié)合物結(jié)合體的情況下，添加形成不溶化合物的化合物。該不溶化合物的生成通過酶反應(yīng)得到擴增并可視化。作為添加的化合物，當(dāng)酶結(jié)合物中的酶是堿性磷酸酯酶時，使用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-對甲苯胺鹽)；當(dāng)酶是辣根過氧化物酶時，使用TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯二胺)等。
通過觀察捕獲寡核苷酸固定位置的雜交體色素沉淀或熒光發(fā)射等雜交信號，判定被檢樣品中含有的細(xì)菌種類。即、檢測到雜交信號時，表明被檢樣品中含有該信號位置點樣的寡核苷酸相對應(yīng)的細(xì)菌。此外，如果在陽性對照捕獲寡核苷酸的位置發(fā)現(xiàn)信號，可以確認(rèn)本試驗正常進行；如在陰性對照捕獲寡核苷酸的位置未發(fā)現(xiàn)信號，可以確認(rèn)雜交條件適當(dāng)。
(3)本發(fā)明的細(xì)菌檢測試劑盒本發(fā)明的細(xì)菌檢測試劑盒是用于實施上述本發(fā)明的細(xì)菌檢測方法的試劑盒。因此，只要能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的細(xì)菌檢測方法，試劑盒內(nèi)包括的組成沒有特別限定。
本細(xì)菌檢測試劑盒，優(yōu)選包括本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具，形成包括該細(xì)菌檢測器具的試劑盒，可以簡便、快速且準(zhǔn)確地進行全面檢測、鑒定。此外，本細(xì)菌檢測試劑盒中優(yōu)選包括上述雜交步驟及信號檢測步驟中使用的試劑。作為上述雜交步驟使用的試劑，例如可以為SSC(Standard Saline Citrate)等鹽溶液、十二烷基硫酸鈉(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)等阻斷溶液及用以促進融合反應(yīng)的添加劑等。
作為信號檢測步驟中使用的試劑，例如可以為識別半抗原的蛋白質(zhì)和酶的結(jié)合物(酶結(jié)合物)、NBT、BCIP、TMB等顯色底物等。
上述雜交步驟和信號檢測步驟中使用的試劑，并不限于所述試劑，可以根據(jù)目的選擇適當(dāng)試劑作為試劑盒的組成。
本細(xì)菌檢測試劑盒中，優(yōu)選包括上述探針制備步驟中使用的試劑，并且還優(yōu)選包括上述核酸制備步驟中使用的試劑。作為探針制備步驟中使用的試劑，例如可以為PCR用緩沖液、耐熱性DNA合成酶、脫氧三磷酸核苷混合液等。作為核酸制備步驟中使用的試劑，可以為溶菌用緩沖液、DNA回收柱、DNA提取用緩沖液等。但并不限于這些試劑，可以根據(jù)目的選擇適當(dāng)試劑作為試劑盒的組成。
通過使用本發(fā)明的試劑盒(包括本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具及各步驟使用的試劑)，受領(lǐng)被檢樣品后約6小時即可檢測、鑒定出被檢樣品中含有的細(xì)菌。
(4)本發(fā)明的用途本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒的用途沒有特別限定，可用在所有需要判定細(xì)菌的用途中。具體來說，如優(yōu)選應(yīng)用于細(xì)菌污染對質(zhì)量造成大的影響的各種工業(yè)制品的制造過程中，從該工業(yè)制品、其制造環(huán)境等中分離出的細(xì)菌需要快速且準(zhǔn)確地檢測、鑒定的情況。
作為判定對象的被判定細(xì)菌的來源的上述工業(yè)制品，代表性例子可以是食品、醫(yī)藥品、試劑、非處方藥、一次性醫(yī)療器具等，沒有特別限定。本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用在上述例舉的工業(yè)制品中的食品中。作為食品，更加具體地說，可以為飲料(清涼飲料、酒精飲料、濃縮還原果汁、天然果汁、果汁飲料、咖啡飲料)、面包、和洋式點心(包括冷凍點心)、成品菜食品、乳制品、谷類食品、豆腐、油炸豆腐類、面類、盒飯類、調(diào)味料、小麥粉及食肉等農(nóng)產(chǎn)加工品、營養(yǎng)補助食品(supplement等)、長期保存食品(罐頭、冷凍食品、蒸煮袋食品等)等，沒有特別限定。
本發(fā)明特別優(yōu)選應(yīng)用于上述例舉食品中的清涼飲料。清涼飲料可以為麥茶、烏龍茶、綠茶、焙煎茶等茶類，沒有特別限定。
本發(fā)明并不限定于上述各實施方式，在權(quán)利要求項所示的范圍內(nèi)可以進行各種變更，將不同實施方式中公開的技術(shù)手段適當(dāng)組合得到的實施方式也包括在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
實施例[寡核苷酸的合成]根據(jù)規(guī)定方法，使用寡核苷酸合成儀(Perkin-elmer Applied biosystems公司制)合成寡核苷酸，經(jīng)脫保護后進行干燥。該寡核苷酸干燥體用10mMTris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA緩沖液溶解，制成100pmol/μL的寡核苷酸溶液。本實施例中使用的全部寡核苷酸均由該方法合成。
合成的寡核苷酸的堿基序列用序列號1～57表示，其中序列號1～40及43～57表示捕獲寡核苷酸，序列號41、42表示引物。對于捕獲寡核苷酸，使用上述合成儀使5’末端結(jié)合氨基，然而對于引物則是使5’末端結(jié)合生物素。
在10μL的5’末端具有氨基的寡核苷酸溶液中混合10μL微點樣溶液(TeleChem International Inc.制)，分注于微量滴定板(Greiner LaboratoryInc制)上。在點樣機的預(yù)定位置設(shè)置碳化二亞胺樹脂處理的載玻片Carbostation(日清紡織株式會社制、注冊商標(biāo))后，使點樣機工作。
點樣結(jié)束后，將載玻片置于熱水的蒸汽中數(shù)秒時間，然后用600mJ紫外線照射。再次在蒸汽中暴露數(shù)秒時間，然后將載玻片置于加熱板上除去水分。
將載玻片放入含有3％BSA(牛血清白蛋白)的100mM Tris-HCl(pH7.5)·100mM NaCl·0.1％Triton X-100中室溫下浸漬30分鐘，進行阻斷。然后用10mMTris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA緩沖液清洗。
室溫下干燥載玻片，使用前一直以干燥狀態(tài)保存于冷暗處。
作為檢體使用的細(xì)菌，使用屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、Bacillussporothermodurans、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、Bacillus benzoevorans、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)、史氏芽孢桿菌(Bacillussmithii)、Bacillus fumarioli、Bacillus acidogenesis及Bacillussonorensis。
此外，將屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)的酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、Alicyclobacillus acidiphilus及Alicyclobacillus hesperidum作為檢體使用。
此外，將屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的Paenibacillus validus、Paenibacillus illinoisensis、蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)作為檢體使用。
此外，將屬于硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)的Aneurinibacillusaneurinolyticus作為檢體使用。
此外，將屬于土芽孢桿菌屬(Geobacillus)的嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)作為檢體使用。
此外，將屬于短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)的短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)作為檢體使用。
另一方面，作為對照檢體，使用大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、頭葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)。
利用在最適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)上述各細(xì)菌的菌液，使用Genomic DNAPurif.Kit(EdgeBioSystems制、Cat.No.#85171)分別制備各細(xì)菌的基因組DNA。
以得到的各細(xì)菌的DNA為模板通過PCR制備核酸探針。PCR反應(yīng)液的組成為，Taq聚合酶2.5單位、生物素化引物(序列號41和42)各50pmol、10×反應(yīng)用緩沖液5μL、dNTP各10nmol、模板DNA 100ng，加入滅菌蒸餾水使總量為50μL。使用熱循環(huán)器，95℃保持3分鐘后，95℃30秒、57℃30秒、72℃1分鐘的反應(yīng)循環(huán)40次，72℃保持5分鐘結(jié)束反應(yīng)。
將4μL上述核酸探針溶液和16μL ArrayIt Unihyb HybridizationSolution(TeleChem International Inc.制、注冊商標(biāo))加在一起并混合，95℃加熱處理1分鐘后在冰中浸漬1分鐘。取該核酸探針溶液的全量，加在固定有捕獲寡核苷酸的基板上，在其上面放置蓋玻片。將其放入保濕箱，在設(shè)定37℃的恒濕器中靜置120分鐘。取出基板，快速浸入室溫下的2×SSC溶液(2×SSC0.033M NaCl、0.033M枸櫞酸鈉)中并除去蓋玻片，在保持溫度37℃的2×SSC中浸漬5分鐘。
從2×SSC中取出基板，放入離心機(Beckman公司制)內(nèi)，以2000rpm離心1分鐘，接著使用VECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR公司制)，制作卵白素-生物素化過氧化物酶結(jié)合體，在基板上滴1.4mL，室溫靜置30分鐘。
然后在PBS(10mM磷酸鈉(pH7.5)、0.9％氯化鈉)中清洗。使用TMB substratekit for peroxidase(VECTOR公司制)制備顯色溶液，在基板上滴1.4mL室溫靜置30分鐘。用蒸餾水清洗基板停止顯色反應(yīng)。
使用愛普生公司制造的掃描儀GT-8700F及其透射單元，用600dpi掃描已發(fā)生雜交的區(qū)域，用目視來確認(rèn)掃描圖像有無顯色。
作為各檢體使用的21種細(xì)菌的結(jié)果如表1～21所示。
各表中“+”表示確認(rèn)有顯色的點，“-”表示確認(rèn)沒有顯色的點。
表1表示枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的結(jié)果。
表1被檢細(xì)菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)


根據(jù)表1，確認(rèn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號2、3)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號16、17、18)的合計5處顯色。
表2表示凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)的結(jié)果。
表2被檢細(xì)菌凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)


根據(jù)表2，確認(rèn)凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1、3)和凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號12、13、14)的合計5處顯色。
表3表示球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)的結(jié)果表3被檢細(xì)菌球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)


根據(jù)表3，確認(rèn)球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1)和球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號32、33)的合計3處顯色。
表4表示短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的結(jié)果表4被檢細(xì)菌短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)


根據(jù)表4，確認(rèn)短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號3)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號20、55)的合計3處顯色。
表5表示Bacillus sporothermodurans菌的結(jié)果表5被檢細(xì)菌Bacillus sporothermodurans


根據(jù)表5，Bacillus sporothermodurans在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號3)和Bacillus sporothermodurans檢測用捕獲寡核苷酸(序列號15、43)的合計3處顯色。
表6表示巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的結(jié)果。
表6被檢細(xì)菌巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)


根據(jù)表6，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1、3)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號31)的合計3處顯色。
表7表示遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)的結(jié)果。
表7被檢細(xì)菌遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)


根據(jù)表7，確認(rèn)遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1、3)和遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號21、22、23、24、25)的合計7處顯色。
表8表示堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)的結(jié)果。
表8被檢細(xì)菌堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)


根據(jù)表8，確認(rèn)堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1，3)和堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號26)的合計3處顯色。
表9表示環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)的結(jié)果表9被檢細(xì)菌環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)


根據(jù)表9，確認(rèn)環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1、3)和環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號27)的合計3處顯色。
表10表示Bacillus benzoevorans的結(jié)果。
表10被檢細(xì)菌Bacillus benzoevorans


根據(jù)表10，確認(rèn)Bacillus benzoevorans在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1、3)和Bacillus benzoevorans檢測用捕獲寡核苷酸(序列號30)的合計3處顯色。
表11表示地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的結(jié)果。
表11被檢細(xì)菌地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)


根據(jù)表11，確認(rèn)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號2、3)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號19)的合計3處顯色。
表12表示酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)的結(jié)果。
表12被檢細(xì)菌酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)


根據(jù)表12，確認(rèn)酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)在脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號5)和酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號34、35、36)的合計4處顯色。
表13表示酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的結(jié)果。
表13被檢細(xì)菌酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)


根據(jù)表13，確認(rèn)酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)在脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號5)和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號28、37)的合計3處顯色。
表14表示Aneurinibacillus aneurinolyticus的結(jié)果。
表14被檢細(xì)菌Aneurinibacillus aneurinolyticus


根據(jù)表14，確認(rèn)Aneurinibacillus aneurinolyticus菌在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號3)和硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號6)的合計2處顯色。
表15表示嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)的結(jié)果。
表15被檢細(xì)菌嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)


根據(jù)表15，確認(rèn)嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1)和土芽孢桿菌屬(Geobacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號7)的合計2處顯色。
表16表示Paenibacillus validus菌的結(jié)果。
表16被檢細(xì)菌Paenibacillus validus


根據(jù)表16，確認(rèn)Paenibacillus validus菌在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號3)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號8)、以及Paenibacillus validus菌檢測用捕獲寡核苷酸(序列號38、39、40)的合計5處顯色。
表17表示蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的結(jié)果。
表17被檢細(xì)菌蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)


根據(jù)表17，確認(rèn)蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)在蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號9、10、11)的合計3處顯色。
表18表示Paenibacillus illinoisensis的結(jié)果。
表18被檢細(xì)菌Paenibacillus illinosensis


根據(jù)表18，確認(rèn)Paenibacillus illinoisensis菌在類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號8)的1處顯色。
表19表示蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)的結(jié)果。
表19被檢細(xì)菌蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)


根據(jù)表19，確認(rèn)蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)在類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號8)的1處顯色。
表20表示多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)的結(jié)果。
表20被檢細(xì)菌多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)


根據(jù)表20，確認(rèn)多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)在類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號8)的1處顯色。
表21表示短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)的結(jié)果。
表21被檢細(xì)菌短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)


根據(jù)表21，確認(rèn)短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)在短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號4)的1處顯色。
表22表示史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)的結(jié)果。
表22被檢細(xì)菌史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)


根據(jù)表22，確認(rèn)史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1和3)和史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號45及46)的合計4處顯色。
表23表示Alicyclobacillus acidiphilus的結(jié)果。
表23被檢細(xì)菌Alicyclobacillus acidiphilus


根據(jù)表23，確認(rèn)Alicyclobacillus acidiphilus在脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號5)和Alicyclobacillusacidiphilus檢測用捕獲寡核苷酸(序列號47～49)的合計4處顯色。
表24表示Alicyclobacillus hesperidum的結(jié)果。
表24被檢細(xì)菌Alicyclobacillus hesperidum


根據(jù)表24，確認(rèn)Alicyclobacillus hesperidum在脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號5)和Alicyclobacillushesperidum檢測用捕獲寡核苷酸(序列號50和51)的合計3處顯色。
表25表示Bacillus fumarioli的結(jié)果。
表25被檢細(xì)菌Bacillus fumarioli


根據(jù)表25，確認(rèn)Bacillus fumarioli在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1和3)和Bacillus fumarioli檢測用捕獲寡核苷酸(序列號52和53)的合計4處顯色。
表26表示Bacillus acidogenesis的結(jié)果。
表26被檢細(xì)菌Bacillus acidogenesis


根據(jù)表26，確認(rèn)Bacillus acidogenesis在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1～3)和Bacillus acidogenesis檢測用捕獲寡核苷酸(序列號54)的合計4處顯色。
表27表示Bacillus sonorensis的結(jié)果。
表27被檢細(xì)菌Bacillus sonorensis


根據(jù)表27，確認(rèn)Bacillus sonorensis在芽孢桿菌屬(Bacillus)檢測用捕獲寡核苷酸(序列號1～3)和Bacillus sonorensis檢測用捕獲寡核苷酸(序列號56和57)的合計5處顯色。
此外，對照菌大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、頭葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)對所有的捕獲寡核苷酸沒有顯色(數(shù)據(jù)省略)。
根據(jù)上述結(jié)果可以確認(rèn)，本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具(基板)能夠特異性檢測芽孢桿菌屬(Bacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，并且能夠?qū)ο率黾?xì)菌進行種特異性鑒定，所述細(xì)菌為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、Paenibacillus validus菌、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)、Alicyclobacillus acidoterestris、Alicyclobacillus acidocardarius、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、Bacillus benzoevorans、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)、Bacillusfumarioli、Bacillus acidogenesis、Bacillus sonorensis、Alicyclobacillusacidiphilus、Alicyclobacillus hesperidum等。
本發(fā)明提供采用簡便操作即可快速、準(zhǔn)確地判定被檢樣品中混入的細(xì)菌的細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒，因此，本發(fā)明能夠在食品制造業(yè)、飲食產(chǎn)業(yè)、藥品產(chǎn)業(yè)等中的衛(wèi)生管理、過程管理、質(zhì)量管理方面應(yīng)用。
序列表<110>三得利株式會社(Suntory Limited)日清紡織株式會社(Nisshihbo Industries Inc.)<120>細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒(A target bacteria detection instrument，atarget bacteria detection method and a target bacteria detection kit)<130>PCT05-0065<150>JP2004-228669<151>2004-08-04<160>57<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<212>芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)<400>1agatgggccc gcggcgcatt 20<210>2<211>15<212>DNA<213>芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)
<400>2gacccgcggc gcatt 15<210>3<211>20<212>DNA<213>芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)<400>3gggcaacctg cctgtaagac 20<210>4<211>21<212>DNA<213>短芽孢桿菌屬(Brevibacillus sp.)<400>4acatagggaa acttatgcta a21<210>5<211>19<212>DNA<213>脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus sp.)<400>5gaggagcccg cggcgcatt 19
<210>6<211>15<212>DNA<213>硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus sp.)<400>6gaagaaccgc cggga 15<210>7<211>20<212>DNA<213>土芽孢桿菌屬(Geobacillus sp.)<400>7acaccgaaga ccgcatggtc 20<210>8<211>18<212>DNA<213>類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)<400>8gacggtacct gagaagaa18<210>9<211>23<212>DNA<213>蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)
<400>9gattaagagc ttgctcttat gaa 23<210>10<211>16<212>DNA<213>蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)<400>10ccgcatggtt cgaaat 16<210>11<211>19<212>DNA<213>蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)<400>11gctagttgaa taagctggc 19<210>12<211>20<212>DNA<213>凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)<400>12tcgtgcggac cttttaaaag 20
<210>13<211>17<212>DNA<213>凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)<400>13ccgcatggag gaaaaag 17<210>14<211>16<212>DNA<213>凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)<400>14gccggggaag aacaag 16<210>15<211>19<212>DNA<213>Bacillus sporothermodurans<400>15ctccgcatgg agagagatt 19<210>16<211>20<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>16
gcatggttca aacataaaag 20<210>17<211>14<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>17ggctaccact taca14<210>18<211>20<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>18gagcttgctc cctgatgtta 20<210>19<211>20<212>DNA<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<400>19tgctccctta ggtcagcggc 20<210>20<211>16<212>DNA
<213>短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)<400>20ggatgaaaga cggttt 16<210>21<211>17<212>DNA<213>遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)<400>21gaatggatgg gagcttg 17<210>22<211>16<212>DNA<213>遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)<400>22agcttgctcc cagaag 16<210>23<211>18<212>DNA<213>遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)<400>23
ttctcctgga gaaaggtt18<210>24<211>18<212>DNA<213>遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)<400>24agcttgctcc cagaagtt18<210>25<211>20<212>DNA<213>遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)<400>25ctggagaaag gttgaaagac 20<210>26<211>20<212>DNA<213>堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)<400>26gaggaaaagc tgaaagatgg 20<210>27<211>20
<212>DNA<213>環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)<400>27gagcggactt taaaagcttg 20<210>28<211>17<212>DNA<213>酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)<400>28ttgggccgct gagagag 17<210>29<211>20<212>DNA<213>Bacillus benzoevorans<400>29gagcggactt aaaaagcttg 20<210>30<211>17<212>DNA<213>Bacillus benzoevorans<400>30
gagcggactt ttgggag 17<210>31<211>21<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)<400>31taggatcttc tccttcatgg g21<210>32<211>20<212>DNA<213>球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)<400>32tcggctgtcg ctataggatg 20<210>33<211>20<212>DNA<213>球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)<400>33aagtacagta gtaactggct 20<210>34<211>20
<212>DNA<213>酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)<400>34tttcagactg gaataacact 20<210>35<211>20<212>DNA<213>酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)<400>35aatacacggg taggcatcta 20<210>36<211>16<212>DNA<213>酸土環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)<400>36ggaaagctcc ttgtga 16<210>37<211>20<212>DNA<213>酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)<400>37
cgcccgcgag gaggcatctt 20<210>38<211>19<212>DNA<213>Paenibacillus validus<400>38ggggcaacct gtggcttac 19<210>39<211>20<212>DNA<213>Paenibacillus validus<400>39gctaagaccg gatagctggt 20<210>40<211>15<212>DNA<213>Paenibacillus validus<400>40cgcctcggag agtaa 15<210>41<211>19
<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列描述人工合成DNA序列(Description of Artificial SequenceArtificiallySynthesized DNA Sequence)<400>41gagtttgatc ctggctcag 19<210>42<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列描述人工合成DNA序列(Description of Artificial SequenceArtificiallySynthesized DNA Sequence)<400>42gtattaccgc ggctgctg18<210>43<211>20<212>DNA<213>Bacillus sporothermodurance<400>43
aagagcttgc ttttgatcag 20<210>44<211>20<212>DNA<213>Bacillus sporothermodurance<400>44cttcgcatga aggagaattg 20<210>45<211>20<212>DNA<213>史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)<400>45agcttgcttt ttgaaagtta 20<210>46<211>18<212>DNA<213>史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)<400>46gataatatct tccttcgc18<210>47<211>15<212>DNA
<213>Alicyclobacillus acidiphilus<400>47gttcaaggga aggca 15<210>48<211>17<212>DNA<213>Alicyclobacillus acidiphilus<400>48ccgttgagga aagttgc 17<210>49<211>17<212>DNA<213>Alicyclobacillus acidiphilus<400>49atgcaacact gatagag 17<210>50<211>15<212>DNA<213>Alicyclobacillus hesperidum<400>50ggtcacgagg aggca 15
<210>51<211>17<212>DNA<213>Alicyclobacillus hesperidum<400>51gcatcttctt gtgagga 17<210>52<211>17<212>DNA<213>Bacillus fumarioli<400>52ttgccccttg agattag 17<210>53<211>16<212>DNA<213>Bacillus fumarioli<400>53tcatcctttc cttcgc 16<210>54<211>17<212>DNA
<213>Bacillus acidogenesis<400>54cttcttcctc cgcatgg 17<210>55<211>20<212>DNA<213>短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)<400>55ccggatagtt ccttgaaccg 20<210>56<211>15<212>DNA<213>Bacillus sonorensis<400>56agcgaaccga cggga 15<210>57<211>17<212>DNA<213>Bacillus sonorensis<400>57tcccttaggt tagcggc 1權(quán)利要求
1.細(xì)菌檢測器具，其中，從寡核苷酸組中選擇的1個以上的寡核苷酸固定在基板上，通過該寡核苷酸和來自被檢樣品的核酸的雜交，檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌，其中所述寡核苷酸組含有檢測對象細(xì)菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號1～40、43～56或57所示的堿基序列。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號1、2或3所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于短芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號4所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號5所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于硫胺素芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號6所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于土芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號7所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
7.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有屬于類芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號3或8所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
8.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有蠟樣芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號9、10或11所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
9.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有凝結(jié)芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號12、13或14所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
10.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillussporothermodurans的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號15、43或44所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
11.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有枯草芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號16、17或18所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
12.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有地衣芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號19所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
13.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有短小芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號20或55所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
14.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有遲緩芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中的序列號21～25中任一序列號所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
15.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有堅強芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號26所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
16.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有環(huán)狀芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號27所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
17.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillus benzoevorans的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號29或30所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
18.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有巨大芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號31所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板上。
19.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有球形芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號32或33所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
20.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有酸土環(huán)脂芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號34、35或36所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
21.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號28或37所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
22.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Paenibacillus validus的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號38、39或40所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
23.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有史氏芽孢桿菌16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號45或46所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
24.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Alicyclobacillusacidiphilus的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號47、48或49所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
25.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Alicyclobacillushesperidum的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號50或51所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
26.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillus fumarioli的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號52或53所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
27.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillus acidogenesis的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號54所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
28.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有Bacillus sonorensis的16S核糖體RNA基因?qū)?yīng)的堿基序列中序列號56或57所示的堿基序列的寡核苷酸中的至少1個固定在基板上。
29.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測器具，其中，含有序列號1～40、43～56或57所示的堿基序列的全部寡核苷酸固定在基板上。
30.如權(quán)利要求1～29中任一項所述的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，上述被檢樣品中的細(xì)菌是從下述(a)～(f)中任一項所述的細(xì)菌組成的群組中選擇的至少1種的細(xì)菌(a)屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌；(b)屬于短芽孢桿菌屬的細(xì)菌；(c)屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的細(xì)菌；(d)屬于硫胺素芽孢桿菌屬的細(xì)菌；(e)屬于土芽孢桿菌屬的細(xì)菌；和(f)屬于類芽孢桿菌屬的細(xì)菌。
31.如權(quán)利要求1～30中任一項所述的細(xì)菌檢測器具，其特征在于，上述基板上具有碳二亞胺基或異氰酸酯基，通過該碳二亞胺基或異氰酸酯基和上述寡核苷酸或寡核苷酸末端連接的接頭反應(yīng)形成共價鍵。
32.細(xì)菌檢測方法，用于檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌，其包括如下步驟制備被檢樣品中細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟；以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟；使用權(quán)利要求1～31中任一項所述的細(xì)菌檢測器具，使固定在基板上的寡核苷酸和上述標(biāo)記探針發(fā)生雜交的雜交步驟；和檢測雜交信號的信號檢測步驟。
33.細(xì)菌檢測方法，用于檢測、鑒定被檢樣品中的細(xì)菌，其包括如下步驟制備被檢樣品中細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟；以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟；使用含有序列號1～40及43～57中任一序列號所示的堿基序列的寡核苷酸，使該寡核苷酸和上述標(biāo)記探針發(fā)生雜交的雜交步驟；和檢測雜交信號的信號檢測步驟。
34.如權(quán)利要求32或33所述的細(xì)菌檢測方法，其中所述被檢樣品是食品。
35.如權(quán)利要求34所述的細(xì)菌檢測方法，其中所述食品是飲料。
36.如權(quán)利要求35所述的細(xì)菌檢測方法，其中所述飲料是清涼飲料。
37.細(xì)菌檢測試劑盒，其用于實施權(quán)利要求32～36中任一項所述的細(xì)菌檢測方法。
38.細(xì)菌檢測試劑盒，其用于實施權(quán)利要求32～36中任一項所述的細(xì)菌檢測方法，其包括所述雜交步驟及信號檢測步驟中使用的試劑。
39.如權(quán)利要求38所述的細(xì)菌檢測試劑盒，其還包括所述探針制備步驟及/或所述核酸制備步驟中使用的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供采用簡便操作即可快速、準(zhǔn)確地判定被檢樣品中混入的細(xì)菌、特別是好氣性產(chǎn)芽孢細(xì)菌的細(xì)菌檢測器具、細(xì)菌檢測方法及細(xì)菌檢測試劑盒。本發(fā)明的細(xì)菌檢測器具是根據(jù)對象好氣性產(chǎn)芽孢細(xì)菌所屬的屬或種的特異性堿基序列設(shè)計的寡核苷酸固定在基板上的微陣列型器具。根據(jù)從被檢樣品中制備的探針和上述基板上固定的寡核苷酸是否發(fā)生雜交，能夠簡便、快速且準(zhǔn)確地檢測、鑒定被檢樣品中的好氣性產(chǎn)芽孢細(xì)菌。
文檔編號C12Q1/04GK1993482SQ200580026458
公開日2007年7月4日 申請日期2005年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月4日
發(fā)明者山中實喜子, 守屋彰悟, 小佐野薰, 桶川高史 申請人:三得利株式會社, 日清紡織株式會社