專利名稱：：傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的數(shù)量眾多、種類豐富，這些細(xì)菌是豆醬傳統(tǒng)發(fā)酵的關(guān)鍵，直接影響豆醬的發(fā)酵速度和產(chǎn)品風(fēng)味，甚至決定了發(fā)酵的成敗。以往對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)多以形態(tài)鑒定結(jié)果為主，而豆醬中不可培養(yǎng)的微生物以及數(shù)量極少的微生物則往往無法被檢測(cè)出來，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，采用PCR-DGGE技術(shù)已能夠?qū)h(huán)境樣品中不可培養(yǎng)的微生物以及數(shù)量極少的微生物檢測(cè)出來。但是傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬組成復(fù)雜，除微生物細(xì)胞外還含有大量的有機(jī)物質(zhì)(脂類、蛋白質(zhì)和糖類)和無機(jī)鹽，造成PCR-DGGE檢測(cè)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬過程中微生物DNA抽提困難、雜質(zhì)去除困難;如結(jié)合現(xiàn)有的總基因組DNA直接提取法，則殘存的雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重地抑制PCR擴(kuò)增，致使DNA后續(xù)分析錯(cuò)誤；如結(jié)合現(xiàn)有的總基因組DNA間接提取法，則容易造成微生物種類和數(shù)量的丟失。所以，目前的PCR-DGGE技術(shù)仍無法準(zhǔn)確的檢測(cè)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中的細(xì)菌。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前的PCR-DGGE技術(shù)無法準(zhǔn)確的檢測(cè)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的問題，而提供的一種傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行一、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組DNA提取a、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理用50mL、pH值為7.0、濃度為O.lmol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮10g傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品，然后加入玻璃珠用振蕩器振蕩5min，再在200r/min的條件下離心5min，收集上清液，離心沉淀則用pH值為7.0、濃度為O.lmol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮、離心并重復(fù)3次，其中每次離心轉(zhuǎn)速為200r/min、離心時(shí)間為5min，之后匯集離心上清液以9000r/min的轉(zhuǎn)速離心12min，收集離心沉淀，將離心沉淀用50mL、pH值為7.0、濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮后在9000r/min的條件下離心12min并重復(fù)3次，再將離心沉淀用8mL、pH值為7.0、濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮，并用移液器吹打后置于振蕩器上振蕩23min，即得到傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理液；b、抽提傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組(1)取lmL傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理液在12000r/min條件下離心1min，棄去上清液；(2)向b(l)離心沉淀加中加入180pL的裂解緩沖液和20pL蛋白酶K,振蕩懸??；(3)將b(2)獲得的懸浮液在55"條件下孵育15min后加入20pL的RNaseA室溫孵育2分鐘，然后加入10pL、濃度為10%(體積)的十二垸基硫酸，并立即渦旋5s，再加200nL的結(jié)合緩沖液立即渦旋5s，之后在70。C條件下孵育10min，得到細(xì)胞裂解液；(4)將200pL無水乙醇加入b(3)獲得的細(xì)胞裂解液中渦旋混合5s，然后將全部渦旋混合液加入離心吸附柱中以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液，再加入500pL清洗緩沖液，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，并棄去流出液，再加入500jiL清洗緩沖液，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，并棄去流出液，之后加入500pL洗滌緩沖液，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液后，再加入500pL洗滌緩沖液，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液后再以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，去除流出液；(5)將離心吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新離心管中并在離心吸附柱中央加入200pL溴化乙錠，然后置于室溫環(huán)境中靜置1min，再以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，再用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫DNA，收集洗脫液，即得到傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組DNA;二、PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增引物為F338GC和R518，引物F338GC的序列為5'畫ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，，弓|物R518的序列為5，醫(yī)ATTACCGCGGCTGCTGG-3，；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50pL，由5.0pL10xTaqBuffer、4.0pL濃度為2.5mmol/L的dNTPMixture、5.0(xL濃度為lpmol/L的引物F338GC、5.0jiL濃度為lpmol/L的引物R518、5.0pL濃度為25mmol/L的MgCl2、1.0(iL濃度為5U/joL的Taq、5.0^iL的Template和余量的雙蒸水組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序預(yù)變性95。C5min;變性95。C30s，退火55。Clmin,延伸72。C40s，35個(gè)循環(huán)；72°C7min;三、細(xì)菌PCR-DGGE:其中DGGE膠體為濃度是8.0%(體積)的丙烯酰胺凝膠，凝膠變性梯度范圍為40%70%，電泳電壓為150V，電泳時(shí)間為9h、每隔lh點(diǎn)樣一次；即完成傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)；其中步驟三中凝膠變性梯度范圍100°/。為7mol/L尿素、40%(體積分?jǐn)?shù))甲酰胺。本發(fā)明方法在徹底清除傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物細(xì)胞之外其它成分的同時(shí)，盡可能的避免了微生物種類和數(shù)量的流失，而且整個(gè)檢測(cè)過程中不改變DNA的含量，減小了最終分析偏差，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用本發(fā)明方法可以準(zhǔn)確的檢測(cè)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中的細(xì)菌，而且還可以對(duì)發(fā)酵過程中的豆醬進(jìn)行檢測(cè)，時(shí)時(shí)了解豆醬中的微生物群落結(jié)果，為科學(xué)研究發(fā)酵豆醬奠定了基礎(chǔ)。圖1是具體實(shí)施方式五步驟三變性梯度凝膠制備示意圖；圖2是具體實(shí)施方式五細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)1中凝膠變性梯度范圍為20%50%的檢測(cè)結(jié)果圖；圖3是具體實(shí)施方式五細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)1中凝膠變性梯度范圍為30%60%的檢測(cè)結(jié)果圖；圖4是具體實(shí)施方式五細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)1中凝膠變性梯度范圍為40%70%的檢測(cè)結(jié)果圖；圖5是具體實(shí)施方式五細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)2中第一組檢測(cè)結(jié)果圖；圖6是具體實(shí)施方式五細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)2中第二組檢測(cè)結(jié)果圖；圖7是具體實(shí)施方式五細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)2中第三組檢測(cè)結(jié)果圖；圖8是具體實(shí)施方式五細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)3中選用丙烯酰胺濃度為6.0%(體積)的DGGE膠銀染后檢測(cè)結(jié)果圖；圖9是具體實(shí)施方式五細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)3中選用丙烯酰胺濃度為8.0%(體積)的DGGE膠銀染后檢測(cè)結(jié)果圖；圖10是具體實(shí)施方式五細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)4不同電泳時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行一、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組DNA提取a、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理用50mL、pH值為7.0、濃度為O.lmol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮10g傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品，然后加入玻璃珠用振蕩器振蕩5min，再在200r/min的條件下離心5min，收集上清液，離心沉淀則用pH值為7.0、濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮、離心并重復(fù)3次，其中每次離心轉(zhuǎn)速為200r/min、離心時(shí)間為5min，之后匯集離心上清液以9000r/min的轉(zhuǎn)速離心12min，收集離心沉淀，將離心沉淀用50mL、pH值為7.0、濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮后在9000r/min的條件下離心12min并重復(fù)3次，再將離心沉淀用8mL、pH值為7.0、濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮，并用移液器吹打后置于振蕩器上振蕩23min，即得到傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理液；b、抽提傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組-(1)取lmL傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理液在12000r/min條件下離心1min，棄去上清液；(2)向b(l)離心沉淀加中加入180pL的裂解緩沖液(LysisBuffer2)和20(xL蛋白酶K，振蕩懸??；(3)將b(2)獲得的懸浮液在55。C條件下孵育15min后加入20^L的RNaseA室溫孵育2分鐘，然后加入l(niL、濃度為10%(體積)的十二垸基硫酸，并立即渦旋5s，再加200pL的結(jié)合緩沖液(BindingBuffer2)立即渦旋5s，之后在7(TC條件下孵育10min，得到細(xì)胞裂解液；(4)將200pL無水乙醇加入b(3)獲得的細(xì)胞裂解液中渦旋混合5s，然后將全部渦旋混合液加入離心吸附柱中以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液，再加入50(HiL清洗緩沖液(CleanBuffer),以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，并棄去流出液，再加入50(HiL清洗緩沖液，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，并棄去流出液，之后加入500pL洗滌緩沖液(WashBufferl)，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液后，再加入500pL洗滌緩沖液，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液后再以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，去除流出液；(5)將離心吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新離心管中并在離心吸附柱中央加入200pL溴化乙錠，然后置于室溫環(huán)境中靜置1min，再以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min,再用洗脫緩沖液(ElutionBuffer)進(jìn)行洗脫DNA，收集洗脫液，即得到傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組DNA;二、PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增引物為F338GC和R518，引物F338GC的序列為5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，，弓|物R518的序歹U為5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3';PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如表1所示表1PCR反應(yīng)體系加入體積終濃度10xTaqBuffer(Mg2+Free)5攀2.5mmol/LdNTPMixture4攀各0.2mmol/|jL引物F338GC(lpmol/L)5.0jxLO.lpinol/pL引物R518(lpmol/L)0.1|xmol/nL25mmol/LMgCl25攀0.2mmol/(jLTaq(5U4iL)l單0.5U批Template5攀雙蒸水Upto50nLPCR擴(kuò)增反應(yīng)程序預(yù)變性95。C5min;變性95"C30s，退火55。Clmin，延伸72。C40s，35個(gè)循環(huán)；72°C7min;三、細(xì)菌PCR-DGGE:其中DGGE膠體為濃度是8.0。/。(體積)的丙烯酰胺凝膠，凝膠變性梯度范圍為40%70%，電泳電壓為150V，電泳時(shí)間為9h、每隔lh點(diǎn)樣一次；即完成傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)；其中步驟三中凝膠變性梯度范圍100%為7mol/L尿素、40%(體積分?jǐn)?shù))甲酰胺。本實(shí)施方式在去除傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物細(xì)胞之外其它成分的同時(shí)，盡可能的避免了微生物種類和數(shù)量的流失，而且整個(gè)檢測(cè)過程中不改變DNA的含量，減小了最終分析偏差，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)施方式步驟一a中預(yù)處理好的樣品分裝于體積為2mL的EP管中，置于-2(TC環(huán)境中凍存。本實(shí)施方式步驟二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可置于4'C環(huán)境中保存。本實(shí)施方式方法對(duì)DNA的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，提高了抽提率及DNA產(chǎn)物的純度，在徹底清除傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物細(xì)胞之外其它成分的同時(shí)，盡可能的避免了微生物種類和數(shù)量的流失，而且整個(gè)檢測(cè)過程中不改變DNA的含量，減小了最終分析偏差，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)施方式步驟三中采用美國(guó)CBS公司生產(chǎn)的2401DGGE電泳裝置進(jìn)行細(xì)菌PCR-DGGE。本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑和酶等均容易購得，若無注明則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實(shí)施方式步驟一b中使用的裂解緩沖液、清洗緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液、RNaseA、蛋白酶K和離心吸附柱都選自北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasypureGenomicDNAExtractionKit。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是步驟三中每次點(diǎn)樣量為5.0pL，由2.5pL步驟二獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2.5中性上樣液混合組成。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。本實(shí)施方式步驟三中直接用步驟二獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，無需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。具體實(shí)施方式三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二的不同點(diǎn)是中性上樣液10mL由2g蔗糖、IOOjiL濃度為lmol/L、pH值為7.8的Tris-HCl、20pL濃度為0.5mol/L、pH值為8.0的EDTA、10mg溴酚藍(lán)和余量的去離子水組成。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。本實(shí)施方式中性上樣液置于4'C環(huán)境中保存。具體實(shí)施方式四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一、二或三的不同點(diǎn)是用上海華舜生物工程有限公司DNA膠回收試劑盒(GelExtractionMiniKit)回收步驟二獲得的PCR產(chǎn)物檢測(cè)16SrDNA的V3區(qū)擴(kuò)增結(jié)果。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一、二或三相同。取0.5pLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2.5jiL6xloadingbuffer混合均勻，以DL2000為Marker,于濃度為1%(體積)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。將PCR擴(kuò)增結(jié)果置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，有約230bp的熒光條帶出現(xiàn)說明16SrDNA的V3區(qū)擴(kuò)增成功，若沒有約230bp的熒光條帶出現(xiàn)說明16SrDNA的V3區(qū)擴(kuò)增失敗。具體實(shí)施方式五結(jié)合圖1說明本實(shí)施方式，本實(shí)施方式傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行一、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組DNA提取a、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理用50mL、pH值為7.0、濃度為O.lmol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮10g傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品，然后加入玻璃珠用振蕩器振蕩5min，再在200r/min的條件下離心5min，收集上清液，離心沉淀則用pH值為7.0、濃度為O.lmol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮、離心并重復(fù)3次，其中每次離心轉(zhuǎn)速為200r/min、離心時(shí)間為5min，之后匯集離心上清液以9000r/min的轉(zhuǎn)速離心12min，收集離心沉淀，將離心沉淀用50mL、pH值為7.0、濃度為O.lmol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮后在卯00r/min的條件下離心12min并重復(fù)3次，再將離心沉淀用8mL、pH值為7.0、濃度為O.lmol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮，并用移液器吹打后置于振蕩器上振蕩23min，即得到傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理液；b、抽提傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組(1)取lmL傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理液在12000r/min條件下離心1min，棄去上清液；(2)向b(l)離心沉淀加中加入180|xL的裂解緩沖液和20pL蛋白酶K，振蕩懸浮；(3)將b(2)獲得的懸浮液在55'C條件下孵育15min后加入20pL的RNaseA室溫孵育2分鐘，然后加入10nL、濃度為10%(體積)的十二烷基硫酸，并立即渦旋5s，再加20(HiL的結(jié)合緩沖液立即渦旋5s，之后在70。C條件下孵育10min，得到細(xì)胞裂解液；(4)將200|iL無水乙醇加入b(3)獲得的細(xì)胞裂解液中渦旋混合5s，然后將全部渦旋混合液加入離心吸附柱中以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液，再加入500|iL清洗緩沖液，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，并棄去流出液，再加入500jiL清洗緩沖液，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，并棄去流出液，之后加入500pL洗滌緩沖液，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液后，再加入500pL洗滌緩沖液，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液后再以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，去除流出液；(5)將離心吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新離心管中并在離心吸附柱中央加入200pL溴化乙錠，然后置于室溫環(huán)境中靜置1min，再以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，再用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫DNA，收集洗脫液，即得到傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組DNA;二、PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增引物為F338GC和R518，弓|物F338GC的序列為5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，，弓|物R518的序列為5，-ATTACCGCGGCTGCTGG國(guó)3，；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如表1所示表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序預(yù)變性95t:5min;變性95。C30s，退火55'Clmin，延伸72。C40s，35個(gè)循環(huán)；72°C7min;三、細(xì)菌PCR-DGGE:(1)膠外套墊圈的安裝A、將玻璃板垂直放置在桌面上膠條的凹口中，使玻璃板底邊與封口膠條的凹口嵌合；B、當(dāng)用封口條圍繞玻璃板的兩個(gè)底角進(jìn)行封口時(shí)，要確定封條的凹口與玻璃板平衡，當(dāng)封條固定在玻璃板兩個(gè)底角后，開始玻璃板兩邊的封口；C、將有封條的玻璃板水平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，保持封口向上，然后將兩條隔離條沿著封條內(nèi)邊緣插進(jìn)去，使每條隔離條的邊角貼緊玻璃板的底部；D、將玻璃板的底邊放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，從底部邊緣慢慢放開，確定邊緣封條已經(jīng)封好后，用2#夾子A2沿底部進(jìn)行固定；E、將底部已夾好2^夾子A2的玻璃板垂直放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，確定的底部?jī)蓚€(gè)2#夾子A2完全固定好水平性，然后用2#夾子A2對(duì)稱夾玻璃板的兩邊，確定在板之間的封條是平衡的；(2)制膠過程a、將GM-40梯度灌膠器放置在已抬高的磁力攪拌器上，并將一個(gè)小型的磁力攪拌子放置靠近出口的灌膠器右筒C-2里，調(diào)節(jié)灌膠閥V-2與玻璃板頂部的垂直距離為12cm;b、將高濃度變性液灌進(jìn)梯度灌膠器右筒C-2內(nèi)，并打開內(nèi)部閥V-l趕走閥中氣泡，讓大約lmL的高濃度變性液回流到梯度灌膠器左筒C-l內(nèi)，用吸管將左筒C-1內(nèi)lmL高濃度變性液吸回右筒C-2內(nèi)，并用吸水紙將殘留在左筒C-1內(nèi)的殘余液體吸干；c、將低濃度變性液灌進(jìn)梯度灌膠器左筒C-1內(nèi)；d、打開磁力攪拌器；e、用膠帶固定出口管的針頭于玻璃板的凹口處；f、先打開內(nèi)部閥V-l,然后打開外部閥V-2，讓混合的變性液自動(dòng)流出，并將外部閥V-2開關(guān)調(diào)制最大；g、0.75mm厚度隔條的膠體積約23mL，如膠體不足以添充滿玻璃板的整個(gè)空間，可以用0%變性劑[濃度是8.0%(體積)的丙烯酰胺凝膠]來補(bǔ)充；h、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要插入16孔的梳子，將膠置于在室溫聚合過夜或置于45。C烘箱中聚合40min;(3)膠板電泳前的準(zhǔn)備a、將20x電泳緩沖液稀釋成lxTAE電泳緩沖液，倒入DGGE裝置中；b、用蒸餾水沖洗玻璃板上殘余的未聚合的丙烯酰胺及變性劑；c、小心拔出梳子，拔開膠板底部的封條，并快速將膠板上的2#夾子A2全部移走后放到膠板盒上正確的位置，用1#夾子將膠板固定在膠盒上；d、將膠板盒浸入預(yù)熱至6(TC的電泳緩沖液箱里，將循環(huán)的流通管與電泳槽連接好，用lxTAE電泳緩沖液沖洗上樣孔，并加滿電泳槽的上槽，打開熱循環(huán)攪拌器進(jìn)行Buffer循環(huán)；(4)變性梯度凝膠電泳a、50V恒壓預(yù)電泳約30min;b、調(diào)整上樣樣品濃度，2.5pL步驟二獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2.5中性上樣液(10mL中性上樣液由2g蔗糖、lOO^L濃度為lmol/L、pH值為7.8的Tris-HCl、20pL濃度為0.5mol/L、pH值為8.0的EDTA、10mg溴酚藍(lán)和余量的去離子水組成)混合，點(diǎn)樣；C、連接黑色電源線到膠盒上；d、蓋好蓋子，打開電源開關(guān)，150V恒壓電泳；e、電泳時(shí)間為9h、每隔lh點(diǎn)樣一次；(5)銀染檢測(cè)a、電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，將連接管和電泳線斷開，拿出膠板盒，將膠板盒上的玻璃板取出；b、將玻璃板分離楔伸進(jìn)兩塊玻璃板的縫隙，將兩塊玻璃板分開；C、固定凝膠將凝膠浸沒入塑料盤內(nèi)固定液中，充分震蕩直至樣品中染料完全消失，整個(gè)過程約15min;d、洗膠將去凝膠浸沒在去離子水中振蕩洗膠3次，每次2min;e、凝膠染色瀝凈凝膠上的去離子水后把凝膠移至銀染溶液中充分搖動(dòng)20min;f、凝膠顯影在500mL預(yù)冷的顯影液中加入1.5mL甲醛和200pL硫代硫酸鈉溶液，混勻；從染色液中取出的凝膠放入裝有去離子水的盤中浸洗510s，然后立刻將凝膠取出迅速瀝干，再將凝膠轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的顯影液中充分振蕩，顯影時(shí)間為35min;g、固定凝膠在顯影液中直接加入等體積的固定液，停止顯影反應(yīng)，-h、在去離水中浸洗凝膠兩次，每次2min;i、封膠，掃描照相在干凈玻璃板上鋪上已經(jīng)浸濕的玻璃紙，用玻璃棒趕走氣泡；將丙三醇均勻覆蓋到玻璃紙上，并將凝膠輕輕置于玻璃紙上，鋪平;在凝膠上再均勻覆蓋一層丙三醇；用浸濕玻璃紙平鋪到凝膠上，趕走氣泡；用夾子夾好玻璃板，室溫避光風(fēng)干；待凝膠干燥后，小心地將其從玻璃板上取下，掃描照相；即完成傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)。本實(shí)施方式步驟三中采用美國(guó)CBS公司生產(chǎn)的2401DGGE電泳裝置進(jìn)行細(xì)菌PCR-DGGE;步驟三中所用的玻璃板用洗衣粉刷洗后用自來水沖凈，再用去離子水沖洗、自然風(fēng)干。本實(shí)施方式步驟三中DGGE膠體為濃度是8.0。/c)(體積)的丙烯酰胺凝膠，凝膠變性梯度范圍為40%70%(高濃度變性液為70%,低濃度變性液為40%)，步驟三中凝膠變性梯度范圍100Q/。為7mol/L尿素、40%(體積分?jǐn)?shù))甲酰胺。本實(shí)施方式所采用的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品采集于齊齊哈爾市拜泉縣，傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品分醬醅發(fā)酵階段和稀態(tài)發(fā)酵階段兩階段采集醬醅發(fā)酵階段每隔7天取樣1次，共采集12次，稀態(tài)發(fā)酵階段每隔14天取樣1次，共采集5次。采用本實(shí)施方式方法兩階段共檢測(cè)出細(xì)菌18種[其中包括嗜水氣單胞菌(々ramo"os/y^ra/M")、魏斯氏菌(恥/^e〃ac/6"W")、木糖葡萄球菌(Sto//^/ococcwsxy/osws)、短乳桿菌(Z^ctoZac/〃ws6rev/50，中間氣單胞菌(Jerawowaswe<i/fl)、腐生葡萄球菌(Sto//z^y/ococcw51sa/ra//zj^z'cws)、乳明串珠菌(丄ewco"ostocAac^s)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、枯草芽孢桿菌(5""7/wsswte7&)、模仿葡萄球菌(S鄉(xiāng)/^/ococcwss/騰Ams)、堅(jiān)硬芽孢桿菌(&c飾syr羅s)、嗜鹽四聯(lián)球菌(re加ge"ococc船to/o;M—,6種不可培養(yǎng)的細(xì)菌(w"c"/加w^e"&)]，且多組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。對(duì)于相同的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品，采用形態(tài)鑒定法兩階段只確定出10種細(xì)菌(為嗜水氣單胞菌、魏斯氏菌、木糖葡萄球菌、短乳桿菌，乳明串珠菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、枯草芽孢桿菌、模仿葡萄球菌、堅(jiān)硬芽胞桿菌和嗜鹽四聯(lián)球菌)；采用現(xiàn)有PCR-DGGE檢測(cè)法與總基因組DNA直接提取法結(jié)合兩階段共檢出8種細(xì)菌，而且與形態(tài)鑒定法(及本實(shí)施方式方法)對(duì)照發(fā)現(xiàn)有2種鑒定結(jié)果明顯錯(cuò)誤；采用現(xiàn)有PCR-DGGE檢測(cè)法與總基因組DNA間接提取法結(jié)合兩階段共只檢出7種細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本實(shí)施方式檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確。說明本實(shí)施方式方法可有效的去除樣品中的雜質(zhì)、減小對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，而且避免了微生物種類和數(shù)量的大量流失，確保了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。細(xì)菌PCR-DGGE條件對(duì)比試驗(yàn)(除對(duì)比實(shí)驗(yàn)條件外其它條件與本實(shí)施方式方法相同)對(duì)比試驗(yàn)1、凝膠變性梯度范圍為20%50%的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，DGGE條帶均有堆積現(xiàn)象，條帶分離效果不好；凝膠變性梯度范圍為30%60%的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，DGGE條帶無堆積現(xiàn)象，條帶分離效果較好，但是電泳時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)條帶逸出凝膠的現(xiàn)象，造成信息丟失；凝膠變性梯度范圍為40%70%的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，DGGE條帶無堆積現(xiàn)象，條帶分離效果較好，并能夠避免條帶逸出的現(xiàn)象。對(duì)比試驗(yàn)2、一般認(rèn)為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后檢測(cè)效果更好。第一組直接用步驟二獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行步驟三檢測(cè)(本實(shí)施方式)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示；第二組用經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行步驟三檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示；第三組用DNA膠回收試劑盒回收的凝膠進(jìn)行步驟三檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。第一組和第二組電泳效果無明顯差別，條帶都比較清晰，且條帶分離程度好；所以選用本實(shí)施方式可以在不降低檢測(cè)效果的情況下更好的節(jié)約成本；而第三組電泳條帶分離程度不好，模糊不清。對(duì)比試驗(yàn)3、選用丙烯酰胺濃度為6.0%(體積)的DGGE膠軟，在銀染過程中易斷裂，斷裂的DGGE膠不適于銀染分析(如圖8所示)；選用丙烯酰胺濃度為10%(體積)的DGGE膠較硬，在其灌制過程中易聚合，不易制備；選用丙烯酰胺濃度為8.0%(體積)的DGGE膠軟硬適中，在銀染過程中不易斷裂，且容易灌制，條帶分離效果好(如圖9所示)。對(duì)比試驗(yàn)4、不同電泳時(shí)間(每隔lh點(diǎn)樣一次)的檢測(cè)結(jié)果如圖IO所示，電泳8h、7h、6h、5h、4h的DGGE條帶分離效果均不好，且條帶不清晰，而電泳10h的DGGE條帶分離效果較好，但出現(xiàn)了二次堆積現(xiàn)象；只有電泳9h的DGGE條帶的分離效果相對(duì)較好。序列表<110>黑龍江大學(xué)<120>傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)的PCR擴(kuò)增上游引物F338GC。<400>1actcctacgggaggcagcag20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)的PCR擴(kuò)增下游引物R518。<400>2attaccgcggctgctgg1權(quán)利要求1、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行一、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組DNA提取a、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理用50mL、pH值為7.0、濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮10g傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品，然后加入玻璃珠用振蕩器振蕩5min，再在200r/min的條件下離心5min，收集上清液，離心沉淀則用pH值為7.0、濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮、離心并重復(fù)3次，其中每次離心轉(zhuǎn)速為200r/min、離心時(shí)間為5min，之后匯集離心上清液以9000r/min的轉(zhuǎn)速離心12min，收集離心沉淀，將離心沉淀用50mL、pH值為7.0、濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮后在9000r/min的條件下離心12min并重復(fù)3次，再將離心沉淀用8mL、pH值為7.0、濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮，并用移液器吹打后置于振蕩器上振蕩2～3min，即得到傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理液；b、抽提傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組(1)取1mL傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品預(yù)處理液在12000r/min條件下離心1min，棄去上清液；(2)向b(1)離心沉淀加中加入180μL的裂解緩沖液和20μL蛋白酶K，振蕩懸?。?3)將b(2)獲得的懸浮液在55℃條件下孵育15min后加入20μL的RNaseA室溫孵育2分鐘，然后加入10μL、濃度為10％(體積)的十二烷基硫酸，并立即渦旋5s，再加200μL的結(jié)合緩沖液立即渦旋5s，之后在70℃條件下孵育10min，得到細(xì)胞裂解液；(4)將200μL無水乙醇加入b(3)獲得的細(xì)胞裂解液中渦旋混合5s，然后將全部渦旋混合液加入離心吸附柱中以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液，再加入500μL清洗緩沖液，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，并棄去流出液，再加入500μL清洗緩沖液，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，并棄去流出液，之后加入500μL洗滌緩沖液，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液后，再加入500μL洗滌緩沖液，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，棄去流出液后再以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，去除流出液；(5)將離心吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新離心管中并在離心吸附柱中央加入200μL溴化乙錠，然后置于室溫環(huán)境中靜置1min，再以12000r/min的轉(zhuǎn)速離4心2min，再用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫DNA，收集洗脫液，即得到傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組DNA；二、PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增引物為F338GC和R518，引物F338GC的序列為5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，引物R518的序列為5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50μL，由5.0μL10×TaqBuffer、4.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTPMixture、5.0μL濃度為1pmol/L的引物F338GC、5.0μL濃度為1pmol/L的引物R518、5.0μL濃度為25mmol/L的MgCl2、1.0μL濃度為5U/μL的Taq、5.0μL的Template和余量的雙蒸水組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序預(yù)變性95℃5min；變性95℃30s，退火55℃1min，延伸72℃40s，35個(gè)循環(huán)；72℃7min；三、細(xì)菌PCR-DGGE其中DGGE膠體為濃度是8.0％(體積)的丙烯酰胺凝膠，凝膠變性梯度范圍為40％～70％，電泳電壓為150V，電泳時(shí)間為9h、每隔1h點(diǎn)樣一次；即完成傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)；其中步驟三中凝膠變性梯度范圍100％為7mol/L尿素、40％(體積分?jǐn)?shù))甲酰胺。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于步驟三中每次點(diǎn)樣量為5.0pL，由2.5mL步驟二獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2.5pL中性上樣液混合組成。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于中性上樣液10mL由2g蔗糖、IOOjiL濃度為lmol/L、pH值為7.8的Tris-HCl、20pL濃度為0.5mol/L、pH值為8.0的EDTA、10mg溴酚藍(lán)和余量的去離子水組成。全文摘要傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法，它涉及一種豆醬中細(xì)菌的檢測(cè)方法。它解決了目前的PCR-DGGE技術(shù)無法準(zhǔn)確的檢測(cè)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的問題。檢測(cè)方法一、傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品細(xì)菌總基因組DNA提??；二、PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的V3區(qū)；三、細(xì)菌PCR-DGGE。本發(fā)明方法在徹底清除傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物細(xì)胞之外其它成分的同時(shí)，盡可能的避免了微生物種類和數(shù)量的流失，而且整個(gè)檢測(cè)過程中不改變DNA的含量，減小了最終分析偏差，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101619355SQ200910072449公開日2010年1月6日申請(qǐng)日期2009年7月2日優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日發(fā)明者凌宏志,剛宋,平文祥,葛菁萍,蔡柏巖,丹趙,麗陳,高冬妮申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)