專利名稱：在供體收獲過程期間保護胰島細(xì)胞使之免于凋亡的新方法
在供體收獲過程期間保護胰島細(xì)胞使之免于凋亡的新方法相關(guān)申請
本申請要求2007年3月20日提交的美國申請60/783,414的優(yōu)先權(quán)，該美國申請的全部內(nèi)容結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
朗格罕氏島是胰內(nèi)含有產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞的多細(xì)胞實體(multi-cellular entity )。通常人含有大約一百萬個朗格罕氏島，這些島含有胰內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的大約百分之二至三。胰含有朗格罕氏島，所述朗格罕氏島容納產(chǎn)胰島素的P細(xì)胞。(3細(xì)胞監(jiān)控血液中的葡萄糖水平，并釋放精確測量的量的胰島素以均衡葡萄糖峰。當(dāng)超過9 0 %的(3細(xì)胞受損時，就發(fā)展成為I型和II型糖尿病。
胰島與結(jié)締基質(zhì)和剩余的外分泌組織的分開或分離是有利的并且對于實驗室實驗和移植的目的是有益的。對于I型糖尿病的治療，胰島移植是最有希望且生理侵害限度最低的手術(shù)。移植胰島而非全部胰組織具有容易移植及涉及消化酶的分泌的供體組織的胰外分泌功能的；肖除的明顯益處。從胰外分泌組織釋放胰島是影響胰島移植的起始且重要的步驟。胰島分離中的重要的目的是為移植提供足夠數(shù)目的有生活力的功能性(viable functional)且有效的胰島。
"埃德蒙頓方案(Edmonton Protocol)"將健康的胰島移植到糖尿病患者體內(nèi)。使用埃德蒙頓方案的胰島移植在下述文獻中敘述Shapiro,Ryan, 和 Lakey, Clinical Islet Transplantation_State of the Art,Transplantation Proceedings, 33, pp. 3502-3503 (2001); Ryan等人，ClinicalOutcomes and Insulin Secretion After Islet Transplantation With theEdmonton Protocol, Diabetes, Vol. 50, April 2001, pp. 710-719;和Ryan等人，Continued Insulin Reserve Provides Long-Term Glycemic Control,Diabetes, Vol. 51, July 2002, pp. 2148- 2157。 一旦在肝中，所述細(xì)月包就發(fā)展血液供給并開始產(chǎn)生胰島素。依賴于所用方法，埃德蒙頓方案可包括7-10個步驟。第一步驟包括向供體胰送遞特定的酶(liberase),其消化所述胰組織，但不消化胰島。消化步驟接下來的是，從胰其它細(xì)胞中分離胰島的幾個連續(xù)步驟。所述分離的胰島被移植到肝的主血管(稱為門靜脈)中。當(dāng)被損壞時，肝能夠自我再生，構(gòu)造新的血管和支持組織。因此，當(dāng)胰島被移植到肝中時，相信新血管生成以支持胰島。所述細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素通過這些周圍血管被吸收到血流中并分布到全身以控制血液中的葡萄糖水平。
總而言之，埃德蒙頓方案的步驟產(chǎn)生了 一個危及胰島生活力
(viability)的有力的方法，其中的胰島具有脆弱的、三維的結(jié)構(gòu)并需要大量的氧以維持生長和生活力。在此方法中，由于氧送遞的非最佳條件，胰島可被損害或破壞，從而影響從給定供體胰回收的健康胰島的得率。而且，胰島移植被供體的可用性嚴(yán)重地限制了；通常，在僅僅一個患者中，要求兩個胰以獲得胰島素的獨立性。
胰島移植與無類固醇的非致糖尿病的免疫抑制療法一起已經(jīng)被用于治療I型糖尿病患者。然而，這樣的治療可導(dǎo)致增加的高脂血癥和高血壓的風(fēng)險，且長期的研究證明胰島生活力被損傷。
因此，需要在收獲過程期間保護胰島細(xì)胞免于凋亡的方法。本發(fā)明滿足了這種需要。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供用于在供體收獲過程期間抑制胰島細(xì)胞遭受凋亡的方法，該方法包括在胰島分離前將elF5A siRNA施用于胰島細(xì)胞供體的胰島細(xì)胞，其中所述elF5AsiRNA抑制胰島細(xì)胞中elF5A的表達并因此抑制胰島細(xì)胞中的凋亡。任何siRNA或反義構(gòu)建體是可應(yīng)用的，只要這樣的構(gòu)建體抑制elF5A的表達。優(yōu)選的siRNA包含核苷酸序列AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT 。
siRNA的施用可通過任何合適的途徑。示例施用方法包括通過胰島細(xì)胞供體的門靜脈的灌注(perfusion)和通過胰島細(xì)胞供體的門靜脈的流體動力灌注(hydrodynamic perfusion )。
本發(fā)明同樣提供了抑制胰島細(xì)胞中elF5A表達的方法，包括將elF5AsiRNA施用于胰島細(xì)胞，其中所述elF5A siRNA抑制胰島細(xì)胞中elF5A的表達。
本發(fā)明的另 一 實施方案提供抑制收獲的胰島細(xì)胞中的凋亡的方法，包括將elF5A siRNA施用于所述胰島細(xì)胞，其中所述elF5A siRNA抑制胰島細(xì)胞中elF5A的表達，并且其中所述elF5A表達的抑制抑制凋亡。本發(fā)明也提供了抑制胰島細(xì)胞中的凋亡的組合物，包括elF5AsiRNA,其中所述siRNA抑制elF5A的表達且因此抑制胰島細(xì)胞中的凋亡。優(yōu)選的組合物包括包含核苷酸序列AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT的elF5AsiRNA。
附圖簡述


圖1給出在通過門靜脈灌注elF-5A siRNA之后的為p-肌動蛋白、
mAAT和elF5A進行的RT-PCR結(jié)果。本圖表明elF5A表達是可測量的
且因此摻入到了胰島中。
圖2表明慢逆行門靜脈灌注。為預(yù)備結(jié)(深色縫合線(suture))準(zhǔn)
備的膽管(透明的)和門靜脈(紅)。針在結(jié)的下方進入(箭標(biāo)表示的
方向)，穿過結(jié)的下方并且向血管釋放siRNA,血管可以達到胰、脾、
腸和三分之一的遠(yuǎn)端結(jié)腸。
圖3表明將elF5AsiRNA灌注到胰島中，引起elF5A表達的減少(所
示為elF5A的mRNA水平的減小)。
圖4表明相比于對照和鹽水處理的胰島(此處每組11=2),用elF5
siRNA處理的胰島細(xì)胞的凋亡的減小。
圖5表明相比于對照和鹽水處理的胰島(此處每組n=3),用elF5
s i RN A處理的胰島細(xì)胞的凋亡的減小。
圖6給出與elF5A2比對的人elF5Al的核芬酸序列。
圖7給出elF5A2比對的人elF5Al的氨基酸序列。
圖8給出具有示例性反義寡核苷酸的人elF5A的核苦酸序列。
圖9給出具有示例性反義寡核苦酸的人elF5A的核苦酸序列。
圖10A和B給出具有示例性siRNAs的人elF5A的核苷酸序列。
圖11給出具有示例性siRNAs的人elF5A的核苷酸序列。
發(fā)明詳述
前文已表明，siRNA摻入胰島中能夠通過逆行門靜脈接種經(jīng)由胰灌注完成。見Bradley，等人，Transplantation Proceedings, 37, 233-236, 2005。簡單地，用Lipofectamine 2000包裹的或未包裹的Cy-3標(biāo)記的荄光素酶(Luciferase) (Luc) siRNA GL2雙鏈體均可使用，且通過尾,爭脈(體內(nèi)，每只小鼠50 pg)注射或直接通過逆行門靜脈接種(原位，每只小鼠2 pg)進入胰。在原位送遞(delivery)后24小時，或體內(nèi)送遞后4小時，獲取胰并且在4。C下貯藏，并且胰島被分離并在檢查前再培養(yǎng)16小時。為使siRNA分布可見，將胰針對胰島素進行染色并在熒光顯微鏡下檢查。分離的胰島直接在熒光顯微鏡下檢查。未包裹的siRNA達到胰島的程度類似于使用脂質(zhì)體包裹的siRNA觀察到的，與所謂的體內(nèi)"棵"-siRNA送遞的報告一致。Lewis等人，Nat. Genet 32:107-108, Epub 2002 Jul 2029,2002和McCaffrey AP,等人，Nature 418:38-39, 2002)。
本發(fā)明提供了用于抑制胰島細(xì)胞中的elF5A的表達的方法，所述方法包括將elF5A siRNA施用于所述胰島細(xì)胞，其中所述elF5A siRNA抑制胰島細(xì)胞中的elF5A的表達。圖1表明對胰島細(xì)胞的灌注給出對于胰島細(xì)胞的適合的送遞機制，并且圖3表明所述elF5AsiRNA處理的胰島細(xì)胞確實表達了較少的elF5A siRNA。通過抑制elF5A的表達，凋亡也被抑制。圖4和5表明在分離前用elF5AsiRNA處理的胰島細(xì)胞，抑制這些細(xì)胞凋亡(如在sub-Gl相中的細(xì)胞數(shù)目的減少所表明的)。因此，本發(fā)明也提供了抑制收獲的胰島細(xì)胞凋亡的方法，包括將elF5A siRNA施用于所述胰島細(xì)胞，其中所述elF5AsiRNA抑制胰島細(xì)胞中elF5A的表達并且其中所述elF5A表達的抑制抑制凋亡。
可使用抑制elF5A表達的任何elF5A siRNA。術(shù)語"抑制，，也意味著減少。 一 種示例性 elF5A siRNA 包含序列 AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT。在2005年11月28號提交的共同未決的申請11/293,391 (其全部內(nèi)容并入本文作為參考)給出了另外的示例性elF5A siRNA和其它反義構(gòu)建體，其已^皮應(yīng)用于抑制其它細(xì)胞類型中的elF5A的表達且同時表明抑制凋亡。給出elF5A序列，在無不合適的實-瞼下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計其它elF5A siRNA并且能夠容易地測試siRNA抑制表達的能力。圖6-11給出elF5A、示例性elF5AsiRNA和反義構(gòu)建體的序列。在本發(fā)明的另一實施方案中，elF5A的反義構(gòu)建體可被應(yīng)用于抑制elF5A的表達且因此抑制胰島細(xì)胞的凋亡。
在優(yōu)選的實施方案中，所述elF5A siRNA包含核苷酸序列AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT 。
本發(fā)明也給出在供體收獲過程期間抑制胰島細(xì)胞遭受凋亡的方法。如上所述，許多胰島細(xì)胞在被收獲時遭受凋亡。本發(fā)明人已表明在收獲前給胰島細(xì)胞提供elF5AsiRNA,對于凋亡起到防護的益處。所述elF5AsiRNA在胰島分離前被施用于胰島細(xì)胞供體的胰島細(xì)胞。所述供體(且由此胰島細(xì)胞)可為動物，包括人胰島細(xì)胞?？?吏用任何施用方法。例如，所述siRNA可通過胰島細(xì)胞供體的門靜脈經(jīng)由灌注施用，或通過胰島細(xì)胞供體的門靜脈經(jīng)由流體動力灌注施用。
通過門靜脈的灌注類似于膽管插管，但針指向相反路徑。所述門靜脈由于肝的收縮和內(nèi)臟器官至小鼠左側(cè)的轉(zhuǎn)移而暴露。預(yù)備結(jié)
(preparative knot)在其周圍制成且包括所述膽管。在穿刺血管后，鈍的針朝向胰前進且結(jié)在其周圍變緊。在小鼠模型中，lmL的鹽水或siRNA
(5嗎)被緩慢釋放，所述針被移開，且所述結(jié)在針后閉合以防止流體漏出。在該點使小鼠轉(zhuǎn)身(turnaround)且使膽管可接近以進行胰消化。所述胰可與siRNA保持更長時間?？蛇x擇地，其可被去除但與膠原酶一起保持寒冷更久。遵循常規(guī)胰島分離法且所述胰島(50)可被溫育16小時。
本發(fā)明也提供了抑制胰島細(xì)胞中的凋亡的組合物，包括elF5AsiRNA,其中siRNA抑制elF5A的表達并且因此抑制胰島細(xì)胞中的凋亡。所述組合物可包括其它或另外的如上所述的elF5A siRNAs。優(yōu)選的siRNA包含核苦酸序列AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT。
實施例
V、it應(yīng)4衷^e/F5v4。
總RNA被從分離的小鼠胰島中提取且對于P-肌動蛋白和eIFSA實施RT-PCR(圖1 )。靜息非刺激的胰島顯示了 eIFSA-mRNA的陽性水平。
^ e/F5v4-w7 A^送遽y^ e//04-m^A64減,^,A"f, /7靜#凝~度#;^。小鼠被導(dǎo)入lmL的siRNA ( CT (對照)序列或elF5A, 5嗎)或鹽水，每組11=2,通過慢逆行門靜脈灌注(圖2)。胰被胰管的膠原酶沖洗消化且胰島被分離，如Lewis等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,102:12153-12158 Epub 12005 Aug. 12110, 2005所述。胰島(每小鼠50 )被溫育16小時?？俁NA被提取且對于(3-肌動蛋白和elF5A執(zhí)行RT-PCR(圖3 )。對于elF5A/卩-肌動蛋白的mRNA的比率為5.24 ( CT-siRNA )和3.01 (elF5A-siRNA)。圖3表明elF5A的mRNA水平在用siRNA處理的那些細(xì)胞中降低。重復(fù)本實驗，11=3只小鼠，且對于RNA提取一式三份溫育胰島；結(jié)果與初始的觀察一致。
^ e/RL4_w7^\M送遽y^， e/F5y4-m化、/y4水乎減V、及腐《源亡遽率減V、.' /7靜脈^伴動力滲;^。
小鼠被導(dǎo)入lmL的siRNA ( CT或elF5A， 5 )或鹽水，每組n=2,通過流體動力逆行門靜脈灌注，其在5秒鐘內(nèi)完成。胰被胰管的膠原酶沖洗消化且胰島被分離。胰烏被溫育16小時且隨后被分開 一組為評價凋亡以碘化丙錠染色(每小鼠50胰島)且另一組被加工用于執(zhí)行RT-PCR (每小鼠25胰島)。對于elF5A/(3-肌動蛋白的CT-siRNA組的mRNA水平又比eIFSA-siRNA組的高。凋亡率減少28.1% (圖4 )。重復(fù)本實驗，n=3,凋亡率又減小(圖5)。
生物素化的siRNA(50 )ig)被灌注于上述的胰島中(慢灌注，n=l )。胰在福爾馬林中固定用于染色。
w麗丄
siRNA分子由下述公司合成Dharmacon, Lafayette, CO. 。 elF5A和對照siRNA的序列分別為5' CGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT 3'和5'AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT 3'。
總RNA被從細(xì)胞中提取，其中使用Qiagen RNeasy試劑盒。elF5A引物正向5'-GAC AGT GGG GAG GTA CGA GA-3';反向5'-GGG GTGAGG AAAACC AAAAT隱3'。
^必巧^ ("尸/,源亡襲g。
胰島單細(xì)胞懸浮液通過溫和胰蛋白酶消化獲得。細(xì)胞用PBS洗滌且加入在PBS中的含有0.3%皂普、EDTAlmM 、 RNA酶、1%疊氮化物、1% FCS和50昭/ml PI的皂苦-PI混合物。細(xì)胞在用FACS分析sub-GI群體前被徹底渦旋(thoroughly vortexed)且在4。C下在黑暗中溫育6小時。
權(quán)利要求
1.用于在供體收獲過程期間抑制胰島細(xì)胞遭受凋亡的方法，包括在胰島分離前將eIF5A siRNA施用于胰島細(xì)胞供體的胰島細(xì)胞，其中所述eIF5A siRNA抑制胰島細(xì)胞中eIF5A的表達且因此抑制胰島細(xì)胞中的凋亡。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述elF5AsiRNA包含核苷酸序列AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述siRNA通過胰島細(xì)胞供體的門靜脈經(jīng)由灌注施用。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述siRNA通過胰島細(xì)胞供體的門靜脈經(jīng)由流體動力灌注施用。
5. 用于抑制胰島細(xì)胞中elF5A表達的方法，包括將elF5A siRNA施用于胰島細(xì)胞，其中所述elF5AsiRNA抑制胰島細(xì)胞中elF5A的表達。
6. 用于抑制收獲的胰島細(xì)胞中的凋亡的方法，包括將elF5A siRNA施用于胰島細(xì)胞，其中所述elF5AsiRNA抑制胰島細(xì)胞中elF5A的表達且其中所述elF5A表達的抑制抑制凋亡。
7. 用于抑制胰島細(xì)胞中的凋亡的組合物，包括elF5AsiRNA,其中所述siRNA抑制elF5A的表達且因此抑制胰島細(xì)胞中的凋亡。
8. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述siRNA包含核苷酸序列AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT 。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于改善從供體器官分離用于后續(xù)移植的胰島的生活力和恢復(fù)的方法，且更具體涉及使用eIF5A siRNAs來增強胰島的生活力。
文檔編號C07K14/47GK101605893SQ200780009616
公開日2009年12月16日 申請日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月20日
發(fā)明者C·A·迪納雷洛, J·E·湯普遜 申請人:森尼斯科技術(shù)公司