一種改良的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種改良的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基及其使用方法。在HAM’S?F10培養(yǎng)基中添加細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hFGF-β、血管內(nèi)皮生長因子VEGF、胰島素樣生長因子R3-IGF-1、人表皮生長因子hEGF、肝細(xì)胞生長因子hHGF、豬血清、亞硒酸鈉、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺、1-甲基3-異丁基黃嘌呤、煙堿、皮質(zhì)醇、青霉素、鏈霉素。該培養(yǎng)基能使細(xì)胞凋亡下降，回收率增加；培養(yǎng)細(xì)胞有敏感葡萄糖刺激應(yīng)答，功能比一般培養(yǎng)的胰島細(xì)胞要成熟；相同量的胰島細(xì)胞胰島素分泌量增加；胰島β細(xì)胞活力增加；胰島細(xì)胞團(tuán)破碎減少，細(xì)胞團(tuán)包膜完整，更適于移植。
【專利說明】一種改良的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種改良的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人胰島細(xì)胞移植是治療糖尿病的有效方法，但人源供體的短缺使人們越來越多的將目光投向?qū)ふ胰艘葝u替代品上，豬胰島素同人胰島素十分類似，并且有相近的血糖調(diào)定點，十分適合作為人體胰島替代品，成體豬胰島十分脆弱容易離散，新生豬胰島具有免疫源性低，β細(xì)胞分裂潛能等特性，成熟后具有良好血糖刺激反應(yīng)(Korbutt，G.S.;Elliott, J.F.; Aoj Z.; Smith, D.Κ.; War-nock, G.L.; Rajottej R.V.Large scale isolation, growth, andfunction of porcine neonatal islet cells.J.Clin.1nvest.97 (9):2119 - 2129;1996),經(jīng)過一段時間的體外培養(yǎng)過程有助于純化胰島細(xì)胞并使β細(xì)胞發(fā)育成熟，從生理生化特性上來說相對于成體豬胰島更適合作為人胰島的替代品。
[0003]而胰島細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)早在二十世紀(jì)60年代就由Lacy(Lacy PE, Kost ianovsky M.Meth od for the isolat ion of int act islet s of langerhans from the ratpancreas.Diabet es, 1967, 16:35~39)等人提出，經(jīng)過不斷改進(jìn),培養(yǎng)方法已逐步趨向完善，胰島細(xì)胞的培養(yǎng)是為了在體外獲取純化有活力的性能成熟胰島細(xì)胞，而胰島細(xì)胞不能形成單層細(xì)胞，而是作為細(xì)胞團(tuán)(cluster)而存在，從而為培養(yǎng)增加了難度。
[0004]現(xiàn)今新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)操作方法，一般采用1-5天的新生豬，解剖取胰腺，破碎后用膠原酶消化成細(xì)胞團(tuán) ，置于CMRL1066，RPMI等細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)3_5天，維持其生長或誘導(dǎo)其定向分化。但這些方法以及使用的培養(yǎng)基總是存在著很多缺陷，如:培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定，純化獲得的有活性功能胰島細(xì)胞的量各不相同(2000IEQ/g-4000IEQ/g)，培養(yǎng)胰島細(xì)胞的純度也各有差別(70-90%);在低溫培養(yǎng)過程中胰島細(xì)胞會因細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生丟失，尤其是β細(xì)胞，而且培養(yǎng)過程長短難于選擇，培養(yǎng)時間短則β細(xì)胞不能發(fā)育成熟，培養(yǎng)時間過長則會有大量胰島細(xì)胞因凋亡產(chǎn)生丟失，一般回收率只有60%左右，且由于β細(xì)胞凋亡使得同等量胰島細(xì)胞胰島素分泌量減少(insulin/DNA值為〈49.00mIU/g)。此外，隨著培養(yǎng)時間延長，胰島細(xì)胞團(tuán)易破碎，進(jìn)而形成的小胰島細(xì)胞團(tuán)(直徑<50um)更易于死亡，難于培養(yǎng)，而且使培養(yǎng)過程難于清除污染，易于給后續(xù)的移植過程帶來炎癥反應(yīng)，對后期移植的治療效果十分不利。至今沒有能大量提供高純度有活性并且穩(wěn)定產(chǎn)量的胰島細(xì)胞培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)基，所以如何通過建立優(yōu)化最佳細(xì)胞分離方案、培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)方式成為胰島細(xì)胞培養(yǎng)最迫切的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種改良的能經(jīng)過培養(yǎng)提供有高活性，高存活度，包膜更完整，細(xì)胞團(tuán)大小合適并且有穩(wěn)定產(chǎn)量的針對新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基及其使用方法。
[0006]本發(fā)明的改良的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基，是在HAM’ S FlO培養(yǎng)基中添加細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK20y Μ、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hFGF-β 10-20 μ g/L，血管內(nèi)皮生長因子VEGF10-20 μ g/L,胰島素樣生長因子R3-1GF-110-20 μ g/L,人表皮生長因子hEGF10-20l.! g/L，肝細(xì)胞生長因子hHGF10-20l.! g/L以及占培養(yǎng)基體積百分比10%的豬血清，還有亞硒酸鈉6.7ng/L,胰島素10 μ g/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白5.5 μ g/L,乙醇胺2 μ g/L, 1-甲基3-異丁基黃嘌呤0.011g/L，煙堿1.22g/L,皮質(zhì)醇5 μ M,80U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素。
[0007]所述的改良的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基的使用方法，新生豬胰島細(xì)胞在培養(yǎng)基中的接種濃度為5000-10000IEQ/25-30ml，在37°C、5%C02、95%空氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，制備的細(xì)胞在第一天更換培養(yǎng)皿及培養(yǎng)基，此后每隔一天更換一次，培養(yǎng)6-10天。
[0008]本發(fā)明選用的各種原料作用如下:
[0009]1、細(xì)胞凋亡抑制劑 Z-VAD-FMK，分子式為 Z-Val-Ala-Asp-CH2F,即 C21H28FN3O7,分子
量
[0010]為453.5，純度>95%，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。
[0011]2、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子:是一個傳遞發(fā)育信號的多肽，具有強(qiáng)烈的血管生成作用，在體外，能刺激細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)纖溶酶原激活物及膠原酶活性，是與肝素有高親和力的細(xì)胞促分裂原。
[0012]3、血管內(nèi)皮生長因子:能促血管生成，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管的發(fā)生。
[0013]4、人表皮生長因子:能促進(jìn)DNA合成，并由此趨向刺激多種細(xì)胞分裂、增殖和分化。
[0014]5、胰島素樣生長因子:是一類多功能`細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在細(xì)胞的分化、增殖、個體的生長發(fā)育中具有重要的促進(jìn)作用。
[0015]6、肝細(xì)胞生長因子:是一類保護(hù)性因子，對細(xì)胞生長，分化有重要調(diào)控作用。
[0016]7、亞硒酸鈉:能增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶活性，清除自由基，加快脂質(zhì)過氧化物分解，保護(hù)細(xì)胞完整性。
[0017]8、轉(zhuǎn)鐵蛋白:是一種結(jié)合鐵離子的糖蛋白，它對細(xì)胞生長的作用與其結(jié)合鐵離子減少其毒性的特性相關(guān)，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)抗體合成與分泌。
[0018]9、皮質(zhì)醇:能加速糖代謝，促進(jìn)細(xì)胞生長。
[0019]10、胰島素，乙醇胺，1-甲基3-異丁基黃嘌呤和煙堿都是一般市售無血清培養(yǎng)基常用成分，有促進(jìn)細(xì)胞生長作用。
[0020]本發(fā)明的有益效果(以下數(shù)據(jù)來源于大量試驗結(jié)果，并具有統(tǒng)計學(xué)意義):
[0021]同樣胰島當(dāng)量(I X IO4IEQ)培養(yǎng)6天，本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的活性胰島細(xì)胞存活率達(dá)到97.68±1.75%，遠(yuǎn)高于一般培養(yǎng)的胰島細(xì)胞存活率68.57±0.67%，且本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)6天的胰島細(xì)胞團(tuán)顆粒直徑大多大于100 μ m,細(xì)胞團(tuán)包膜完整，破碎胰島細(xì)胞團(tuán)(直徑<50um)少于一般培養(yǎng)基培養(yǎng)6天的胰島細(xì)胞，更適合用于移植。培養(yǎng)6天獲得的胰島細(xì)胞對葡萄糖刺激具有敏感應(yīng)答能力，其SI指數(shù)為一般培養(yǎng)基的2倍左右，并且培養(yǎng)6天的胰島細(xì)胞中β細(xì)胞比例為85.25±1.69%，本發(fā)明培養(yǎng)10天的β細(xì)胞比例是96.8±0.45%，較一般培養(yǎng)的比例高，證明本發(fā)明培養(yǎng)的胰島細(xì)胞功能好，胰島素分泌量明顯增多(Ρ〈0.05 ),彌補(bǔ)了一般培養(yǎng)的胰島細(xì)胞因凋亡導(dǎo)致胰島素分泌下降的不足。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)化培養(yǎng)基降低了細(xì)胞凋亡率，增加了培養(yǎng)細(xì)胞回收率，減少了細(xì)胞凋亡數(shù)量，使得培養(yǎng)后胰島細(xì)胞團(tuán)破碎減少，包膜更完整，胰島較短時間培養(yǎng)的更為成熟，相同量胰島細(xì)胞的胰島素分泌量顯著提升，建立了穩(wěn)定高效，細(xì)胞獲得量大的能經(jīng)過長期培養(yǎng)提供有高活性，高存活度，細(xì)胞團(tuán)大小合適并且有穩(wěn)定產(chǎn)量的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)體系。[0023]本發(fā)明優(yōu)勢總結(jié)如下:
[0024]1、細(xì)胞凋亡下降，回收率增加；
[0025]2、培養(yǎng)細(xì)胞有敏感葡萄糖刺激應(yīng)答，功能比一般培養(yǎng)的胰島細(xì)胞要成熟；
[0026]3、相同量的胰島細(xì)胞胰島素分泌量增加；
[0027]4、胰島β細(xì)胞活力增加；
[0028]5、胰島細(xì)胞團(tuán)破碎減少，細(xì)胞團(tuán)包膜完整，更適于移植。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為:普通培養(yǎng)基和本發(fā)明改良培養(yǎng)基分別培養(yǎng)一天和六天的顯微鏡圖像，放大倍數(shù)100 X，圖中標(biāo)尺長度1000 μ m ；
[0030]圖2為本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)新生豬胰島細(xì)胞效果對比圖。
【具體實施方式】
[0031]以下結(jié)合實施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0032]實施例1，本發(fā)明培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法試驗
[0033]本發(fā)明于新生豬取胰腺術(shù)前腹腔注射10IU/kg肝素鈉，本發(fā)明針對已分離純化的新生豬胰島細(xì)胞在培養(yǎng)基中的接種濃度為5000-10000IEQ/25-30ml，培養(yǎng)基(HAM’ S FlO培養(yǎng)基并添加有細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK20y Μ、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hFGF- β 10-20 μ g/L,血管內(nèi)皮生長因子VEGF10-20 μ g/L,胰島素樣生長因子R3-1GF-110-20 μ g/L,人表皮生長因子 hEGF10-20 μ g/L,肝細(xì)胞生長因子 hHGF10-20 μ g/L以及占培養(yǎng)基體積百分比10%的豬血清，還有亞硒酸鈉6.7ng/L，胰島素10 μ g/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白5.5 μ g/L，乙醇胺21^/1，1-甲基3-異丁基黃嘌呤0.011g/L，煙堿1.22g/L，皮質(zhì)醇(hydrocortisone) 5 μ M、80U/ml 青霉素、100U/ml 鏈霉素)的培養(yǎng)皿，置于 37°C、5%C02、95%空氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，制備的細(xì)胞在第一天更換培養(yǎng)皿及培養(yǎng)基，此后每隔一天更換一次，于培養(yǎng)第6天和第10天時收集細(xì)胞計數(shù)并做相關(guān)檢測。
[0034]實驗檢測手段:
[0035]細(xì)胞團(tuán)計數(shù):收集培養(yǎng)細(xì)胞，1000rpm離心I分鐘，棄上清，定容至50ml吹打為細(xì)胞團(tuán)懸液，懸液取50ul，雙硫腙(DTZ)染色，顯微鏡下計數(shù)，乘以1000，即總數(shù)。
[0036]活死細(xì)胞比例:取1500-2000IEQ胰島細(xì)胞團(tuán)acutase酶消化為單個細(xì)胞，PI/HO染色后通過流式細(xì)胞儀對活細(xì)胞和死細(xì)胞計數(shù)。
[0037]胰島素測量:市售化學(xué)發(fā)光試劑盒。
[0038]DNA提取:市售DNA提取試劑盒。
[0039]β細(xì)胞活力檢測:取1500-2000IEQ胰島細(xì)胞acutase酶消化為單個細(xì)胞，NEWPORTGREEN特異染β細(xì)胞，過流式細(xì)胞儀檢測活性β細(xì)胞。
[0040]實施例2，本發(fā)明與專利申請201210330427.9，以及一般培養(yǎng)方法的效果對比，結(jié)果見表1-3。[0041]本發(fā)明培養(yǎng)6天活性胰島細(xì)胞存活率達(dá)到97.68 ± 1.75%，比一般培養(yǎng)的胰島細(xì)胞(〈70%)以及原專利201210330427.9(≤ 82%)高；本發(fā)明培養(yǎng)10天活性胰島細(xì)胞存活率達(dá)到88.9±1.63%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般培養(yǎng)基(〈10%)以及原專利201210330427.9 (69.20%)；本發(fā)明培養(yǎng)6天β細(xì)胞所占百分比85.25±1.69%，也比一般培養(yǎng)基(〈50%)和原專利201210330427.9 (≤72.0%);本發(fā)明培養(yǎng)10天β細(xì)胞所占百分比達(dá)到96.8±0.45%，比一般培養(yǎng)基(〈60%)和原專利201210330427.9≤ 94.65%)高；此外，本發(fā)明的SI葡萄糖刺激指數(shù)(3.45±1.04)也遠(yuǎn)高于一般培養(yǎng)基(1.8±0.08)和原專利201210330427.9的培養(yǎng)基(2.09±0.08)和方法。
[0042]且本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)6天的胰島細(xì)胞團(tuán)顆粒直徑大多大于100 μ m，細(xì)胞團(tuán)包膜完整，破碎胰島細(xì)胞團(tuán)(直徑〈50 μ m)少于一般培養(yǎng)基培養(yǎng)6天的胰島細(xì)胞,更適合用于移植。如圖2，將細(xì)胞同時用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色，活細(xì)胞在熒光顯微鏡488nm激發(fā)光下呈綠色熒光，死細(xì)胞在546nm激發(fā)光下呈紅色熒光，圖片為胰島細(xì)胞分別在本發(fā)明改良培養(yǎng)基，專利申請201210330427.9培養(yǎng)基，普通培養(yǎng)基(HAM’ S F10)中培養(yǎng)10天，放大40 X的圖片，由圖2中可以看出，本發(fā)明新改良培養(yǎng)基細(xì)胞團(tuán)周邊包膜完整，細(xì)胞團(tuán)大小均勻，大部分直徑在100-200nm，死細(xì)胞極少，疊加圖片幾乎看不到死細(xì)胞；專利申請201210330427.9培養(yǎng)基雖然活細(xì)胞團(tuán)多但細(xì)胞團(tuán)大小分布不均，包膜不完整，細(xì)胞團(tuán)邊緣不平滑，容易破碎為單個細(xì)胞而死亡；普通市售培養(yǎng)基的細(xì)胞團(tuán)大部分已破碎死亡。
[0043]表1
[0044]胰島細(xì)胞存活率
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種改良的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，是在HAM’ S FlO培養(yǎng)基中添加細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK20y M、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hFGF-β 10_20μ g/L，血管內(nèi)皮生長因子VEGFlOIOyg/L，胰島素樣生長因子RS-1GF-llOIOyg/L，人表皮生長因子hEGF10-20l.! g/L，肝細(xì)胞生長因子hHGF10-20l.! g/L以及占培養(yǎng)基體積百分比10%的豬血清，還有亞硒酸鈉6.7ng/L,胰島素10 μ g/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白5.5 μ g/L,乙醇胺2 μ g/L, 1-甲基3-異丁基黃嘌呤0.011g/L,煙堿1.22g/L,皮質(zhì)醇5 μ M，80U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素。
2.權(quán)利要求1所述的改良的新生豬胰島細(xì)胞培養(yǎng)基的使用方法，其特征在于，新生豬胰島細(xì)胞在培養(yǎng)基中的接種濃度為5000-10000IEQ/25-30ml，在37°C、5%C02、95%空氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，制備的細(xì)胞在第一天更換培養(yǎng)皿及培養(yǎng)基，此后每隔一天更換一次，培養(yǎng)6-10天 。
【文檔編號】C12N5/071GK103695367SQ201310719927
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】王維, 易授南 申請人:湖南賽諾生物科技有限責(zé)任公司