專利名稱：用于在表面上形成分子序列的方法
用于在表面上形成分子序列的方法 與相關(guān)申請的交叉參考
本申請要求于2006年3月24日提交的美國臨時(shí)專利申請系列號 60/785,938的利益，所述申請整體引入本文作為參考。
關(guān)于聯(lián)邦政府贊助研發(fā)的聲明 本發(fā)明在由來自國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health ) (NIH)撥款部分支持的研究過程中進(jìn)行，撥款號為1R01RR018625-01 和1R21HG003725-01。美國政府在本發(fā)明中享有一定權(quán)利。
背景
總的來說，本公開內(nèi)容涉及用于在表面上形成分子序列的方法。 在固體表面上的生物聚合物的高密度微陣列，或用于診斷和研究目 的的生物芯片已顯示具有巨大的潛力。包含原位合成的微陣列的生物芯 片(包括DNA生物芯片、蛋白質(zhì)生物芯片、肽生物芯片等)已在多種 應(yīng)用中使用，包括指導(dǎo)患者護(hù)理、通過基因表達(dá)變化監(jiān)控疾病進(jìn)展、鑒 定單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、鑒定關(guān)于許多癌癥的遺傳原因、檢測感染 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒、檢測和鑒定病原體、了解鳴禽基因組學(xué)與學(xué)習(xí)模 式之間的關(guān)系、開發(fā)藥物、和響應(yīng)環(huán)境改變植物遺傳學(xué)。
生物芯片制作包括涉及墨水噴射的直接芯片上合成(每次制備幾個(gè) 序列)；涉及光刻法和包含UV敏感性保護(hù)基團(tuán)的特別制備分子的直接 芯片上平行合成(同時(shí)制備整個(gè)序列陣列)；涉及光生成酸和堿以及基
成酸以及涉及自動(dòng)點(diǎn)樣的預(yù)合成分子文庫的固定的直接芯;合成。
點(diǎn)樣和墨水噴射技術(shù)可以包括在某些情況下可能稍微無效、復(fù)雜和 相對勞動(dòng)密集的另外步驟。例如，點(diǎn)樣和墨水噴射技術(shù)可以包括在將其 置于基質(zhì)上之前分別預(yù)合成每個(gè)分子序列、樣品的重復(fù)微量移液、以及
使用的接頭和單體上專門的、、;貴的和難以;成、光可切割的保護(hù)基:、
4和合成可能具有低序列保真度。
用于形成生物芯片的許多技術(shù)包括通過物理屏障、聚合物矩陣或 表面張力屏障來限制合成區(qū)域。此種屏障的添加可能需要使用半導(dǎo)體制
造技術(shù)或疏水表面圖案形成(patterning)在兩種基質(zhì)之間制作三維合成室。
同樣，希望提供相對簡單、通用、節(jié)省成本、且能產(chǎn)生具有改善 純度的高密度分子陣列的合成方法。
概述
公開了用于形成分子序列的方法。該方法包括用包含保護(hù)反應(yīng)基團(tuán) 的至少一個(gè)接頭衍生無限制基質(zhì)表面。使基質(zhì)與包含光生成試劑前體和 緩沖液和/或中和劑的溶液接觸。光生成試劑在至少部分溶液中產(chǎn)生。設(shè) 定光生成試劑以起始基質(zhì)表面上的至少一個(gè)活性區(qū)域的形成。使單體與 活性區(qū)域結(jié)合。
附圖簡述
通過參考下述詳細(xì)說明書和附圖，本公開內(nèi)容的實(shí)施方案的特征和 優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的，其中相似的參考數(shù)字對應(yīng)相似盡管不一定相同的 組分。為了簡潔起見，具有前述功能的參考數(shù)字或部件不必與它們在其 中出現(xiàn)的其他附圖結(jié)合描述。


圖1是形成分子序列的實(shí)施方案的示意圖(SEQIDNO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQIDNO: 3、 SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5顯示為 非限制性示例序列)；
圖2是光生成試劑的化學(xué)限制的數(shù)字模擬；
圖3是使用光生成酸前體形成分子序列的實(shí)施方案的示意圖(SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8顯示為非限制性示例序 列)；
圖4是使寡核苷酸合成中的基于常規(guī)溶液的酸脫保護(hù)反應(yīng)與基于 光生成酸的寡核苷酸合成的實(shí)施方案比較的示意圖5是使用光生成堿前體形成分子序列的實(shí)施方案的示意圖(SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: ll顯示為非限制性示例序
列)；圖6是用于合成分子序列的實(shí)施方案的裝置的示意圖； 圖7A描迷在未成形玻璃基質(zhì)上形成的寡核苷酸序列； 圖7B描迷在玻璃顯微鏡載玻片上形成的寡核普酸序列； 圖7C描迷在200微米硅球上形成的寡核苷酸序列；和 圖7D描述在毛細(xì)管內(nèi)壁上形成的寡核苷酸序列。
詳述
本文公開的方法的實(shí)施方案有利地允許在無物理分隔、多孔凝膠/ 聚合物矩陣圖案形成、或表面化學(xué)處理(例如，疏水性或者親水性圖案 形成)的基質(zhì)表面上的預(yù)定位置處制備不同的化學(xué)序列。此外，可以應(yīng) 用本文公開的方法以在固體基質(zhì)上制備DNA、 RNA寡核苷酸、肽、寡 糖、糖脂及其他有機(jī)和生物聚合物的大規(guī);漠陣列。本文形成的陣列的實(shí) 施方案可用于多種化學(xué)、生物和/或醫(yī)學(xué)應(yīng)用。此種應(yīng)用的例子包括^(旦不 限于，生物活性篩選(例如，藥物、抗體)、藥物開發(fā)、臨床診斷、基 因表達(dá)分析、基因型分型、生物基因突變的發(fā)現(xiàn)、后續(xù)測序、單核普酸 多態(tài)性的檢測、通過雜交測序、啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)的測定、聚合酶鏈反應(yīng)、 表位結(jié)合、配體-肽相互作用、重金屬檢測、基因合成、蛋白質(zhì)DNA相 互作用、聚合分子組合文庫的制備等，和/或其組合。
現(xiàn)在參考圖1,描述了形成分子序列IO的實(shí)施方案的示意圖。應(yīng)當(dāng) 理解序列10可以在基質(zhì)表面的預(yù)定區(qū)域形成，無需使用光不穩(wěn)定性保 護(hù)基團(tuán)、光掩蔽、或其他物理限制方式，例如表面張力、疏水性或親水 性屏障、微制作壁等。經(jīng)由該方法的實(shí)施方案形成的序列10包括但不 限于寡核苷酸、寡肽、聚酯、尼龍、聚氨基甲酸脂、聚酰胺、聚碳酸酯、 寡糖等，和/或其組合。在圖1中顯示的實(shí)施方案中，形成寡核苷酸序列。
在實(shí)施方案中，無限制基質(zhì)12表面用至少一個(gè)接頭分子14進(jìn)行 衍生化?；|(zhì)12 —般是任何固體或半固體材料、或表面包被的固體材 料。在實(shí)施方案中，基質(zhì)12的表面是由微珠層、具有任意形狀的微粒 和/或納米顆粒表面、或其組合組成的基本上平的、圓形的(例如，毛細(xì) 管的內(nèi)部)。合適的基質(zhì)材料的非限制性例子包括玻璃、石英、硅、硅 球、多孔玻璃、尼龍片或膜、TENTAGEL (從德國Tiibingen的Rapp Polymere GmbH商購可得的TentaGel樹脂是4妻枝共聚物，包4舌在其上接 枝聚乙二醇(PEG或POE)的低交聯(lián)聚苯乙烯矩陣)等，和/或其組合。
6應(yīng)當(dāng)理解接頭分子14可以是任何分子，其具有能夠與基質(zhì)12表 面結(jié)合/鍵合的末端，且具有包含受保護(hù)的反應(yīng)基團(tuán)的另一個(gè)末端。在實(shí)
施方案中，分子14經(jīng)由共價(jià)鍵、多價(jià)效應(yīng)、靜電吸引、絡(luò)合(例如， 與金表面結(jié)合的硫醇基)等或其組合與基質(zhì)12表面結(jié)合/鍵合。接頭分 子14的非限制性例子包括3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅 烷、3-羧丙基珪烷、核亞石粦酰胺(nucleophosphoramidites)、核膦酸酯 (nucleophosphonate )(其的非限制性例子包括5'-二甲氧三苯甲基-2'-脫氧胸苷、3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磚酰胺)、氨基酸(其 的非限制性例子包括叔丁氧羰基(t-BOC)丙氨酸)等，和/或其組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭分子14的反應(yīng)基團(tuán)受酸或者堿不穩(wěn)定性 保護(hù)基團(tuán)Pd呆護(hù)。不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)PL的非限制性例子包括二甲氧三 苯甲基(DMT )、單甲氧三苯甲基(MMT )、 二酯、芴基甲氧羰基(Fmoc )、 t-BOC、千氧羰基(CBZ)、甲氧亞乙基(MED)、乙?；?、三氟乙酰 基、酯及其衍生物等，和/或其組合。
衍生基質(zhì)12可以與包含光生成試劑前體18和緩沖液或中和劑20 的溶液]6接觸。溶液16可以包含壽丈化劑、穩(wěn)定劑、粘度添加劑、和/ 或其組合。
認(rèn)為敏化劑(例如，光敏劑)可以增加光生成試劑22 (下文進(jìn)一步 描述)的產(chǎn)生效率和/或改變光生成試劑22在其上產(chǎn)生的波長。合適的 光敏劑的非限制性例子是蒽、蒽衍生物、二氰基蒽、噻噸酮、氯噻噸、 芘、二苯酮、苯乙酮、苯偶姻基(benzoinyl) Cl-C12烷基醚、氧化苯甲 酰三苯基膦、RU2+絡(luò)合物、Ru2+絡(luò)合物衍生物、任何生色 (chromophogenic)化合物、其衍生物等、和/或其組合。包括敏化劑的 溶液16的實(shí)施方案還可以包括激發(fā)分子收集器(trapper),其基本上阻 止敏化劑分子遠(yuǎn)離照明位點(diǎn)的擴(kuò)散(下文進(jìn)一步描述)。此種分子的非 限制性例子包括分子氧、甘露糖醇、疊氮離子、GRPCarotenal (p-阿樸 胡蘿卜素醛的Girards試劑P衍生物)、肌肽(B-丙氨酰-L-組氨酸)、 十六烷基曱基紫精、三乙醇胺、金屬卟啉(metall叩horphyrms) 、 A-生 育酚、B-胡蘿卜素衍生物等、和/或其組合。
穩(wěn)定劑的例子包括但不限于R-H穩(wěn)定劑，其的非限制性例子包括 碳酸異丙烯酯、丙二醇醚、叔丁烷、叔丁醇、硫醇、環(huán)己烷、其取代衍 生物、或其組合。這些非限制性例子的取代衍生物包括下述取代基中的至少一種卣素、N02、 CN、 OH、 SH、 CF3、 C (0) H、 C (〇)CH3、C廣C3-醜基、S02GH3、 C廣C3-S02R2、 OCH3、 SCH3、 CrCg-OR" d-Cg-SR^NH2、 C!-C3-NHR2、 OC3-N (R2) 2,(其中R2 =烷基，當(dāng)在化合物中出現(xiàn)超過一次時(shí)，其可以是相同的或不同的基團(tuán))等。
粘度改性劑的非限制性例子包括丙三醇、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚異丁烷、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、其衍生物、等、或其組合。
光生成試劑前體18是當(dāng)暴露于具有足夠能量以起始前體分解的電磁輻射時(shí)，形成酸或石咸和副產(chǎn)品的前體分子。光生成試劑前體18可以是光酸產(chǎn)生劑(photoacid generator )(產(chǎn)生有機(jī)酸、路易斯酸、或無機(jī)酸形式的H+)或光堿(photobase)產(chǎn)生劑(產(chǎn)生有機(jī)堿、路易斯堿、或無機(jī)堿)。
光酸產(chǎn)生劑前體的非限制性例子包括重氮酮、三芳基锍鹽、碘(iodinum)鹽、萘二曱酰亞胺化合物、萘二甲酰亞胺-氧化合物、節(jié)氧羰基化合物、苯乙氧基羰基化合物、苯丙氧基羰基化合物、等、和/或其組合。合適的光酸產(chǎn)生劑前體的具體例子包括但不限于二( 4-叔丁基苯基)碘徵全氟—l-丁磺酸鹽；二 (4-叔丁基苯基)碘錄對甲苯磺酸鹽；二(4-叔丁基苯基)碘鈸三氟甲磺酸鹽；(4-溴苯基)二苯锍三氟曱磺酸鹽；(叔丁氧羰基甲氧基萘基)-二苯锍三氟甲磺酸鹽；(叔丁氧羰基甲氧基苯基)二苯锍三氟甲磺酸鹽；(4-叔丁基苯基)二苯锍三氟甲磺酸鹽；(4-氯苯基)二苯锍三氟曱磺酸鹽；二苯碘鈸-9,10-二甲氧基蒽-2-磺酸鹽；二苯碘鎮(zhèn)六氟磷酸鹽；二苯碘鏃硝酸鹽；二苯碘鈸全氟-l-丁磺酸鹽；二苯碘衛(wèi)對甲苯磺酸鹽；二苯碘錄三氟曱磺酸鹽；(4-氟苯基)二苯锍三氟甲磺酸鹽；N-羥基萘二甲酰亞胺三氟甲磺酸鹽；N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二羧酰亞胺全氟-l-丁磺酸鹽；N-羥基鄰苯二甲酰亞胺三氟甲磺酸鹽；[4_[ (2-羥基十四烷基)氧]苯基]苯碘鏇六氟銻酸鹽；(4-碘苯基)二苯锍三氟甲磺酸鹽；(4-曱氧基苯基)二苯锍三氟甲磧酸鹽；2-(4-曱氧基苯乙烯基)-4,6-二 (三氯曱基)-1，3,5-三溱；(4-曱苯基)二苯锍三氟曱磺酸鹽；(4-甲硫基苯基)甲基苯基锍三氟甲磺酸鹽；2-萘基二苯锍三氟甲磺酸鹽；(4-苯氧基苯基)二苯锍三氟甲磺酸鹽；(4-苯硫基苯基)二苯锍三氟甲磺酸鹽；硫代二 (三苯锍六氟磷酸鹽)溶液；三芳基锍六氟銻酸鹽；三芳基锍六氟磷酸鹽；三苯基锍全氟-l-丁磺酸鹽；三苯基锍三氟甲磺酸鹽；三(4-叔丁基苯基)锍全氟-l-丁磺酸鹽；三(4-
叔丁基苯基)锍三氟曱磺酸鹽；和/或其組合。
光堿前體的例子包括但不限于o-苯并氨基甲酸酯、苯偶姻基氨基曱酸酯(benzoinlycarbamates)、肟氨基曱酸乙酯、,曱酰苯胺、二甲基千基-氧羰基胺、芐氧基胺衍生物、苯乙氧基羰基衍生物、包含受光不穩(wěn)定性基團(tuán)保護(hù)的氨基或胺基團(tuán)的任何其他分子(所述光不穩(wěn)定性基團(tuán)在暴露于光后能夠釋放氨基或胺或路易斯堿)、等、和/或其組合。
應(yīng)當(dāng)理解所選擇的緩沖液或中和劑20可能至少部分依賴于溶液16中的光生成試劑前體18。用于與光酸前體一起使用的合適的緩沖液或中和劑20的非限制性例子包括吡咬，二甲基吡啶，哌啶，伯、仲或叔胺或其糸f生物，在有機(jī)溶劑(例如，氨)中可溶的任何有機(jī)堿或^各易斯堿，等，和/或其組合。在使用光堿前體的實(shí)施方案中，緩沖液或中和劑20選自弱酸、在有機(jī)溶劑中可溶的路易斯酸、等、和/或其組合。此種酸的非限制性例子包括二苯乙醇酸(benzillicacid)、氯化鋁、氯化鐵(III)、三氟化硼、三氟甲石黃酸鐿(III) 、 丁酸、丙酸、苯酚、等、和/或其組合。
使基質(zhì)12和溶液16暴露于在預(yù)定區(qū)域處的電磁輻射(例如，光)，從而使得光生成試劑22在預(yù)定區(qū)域處的溶液16中產(chǎn)生。應(yīng)當(dāng)理解預(yù)定區(qū)域可以是由用于使區(qū)域暴露于光的光學(xué)器件部分確定的任何合適的大小和/或形狀。
光生成試劑22在其下產(chǎn)生的條件一般是溫和的(例如，室溫、中性或溫和溶劑)，且反應(yīng)是相對快速的(例如，數(shù)秒或秒的分?jǐn)?shù))。
認(rèn)為溶液16中存在的緩沖液和/或中和劑20與光生成試劑22反應(yīng)，從而形成不能進(jìn)一步反應(yīng)的中性種類。中性種類的形成使光生成試劑22的作用限制且約束于基質(zhì)12預(yù)定區(qū)域的基本緊鄰區(qū)域。同樣，光生成試劑22的化學(xué)活性可以導(dǎo)向在基質(zhì)12表面上的預(yù)定位置，而無需使用屏障、光掩蔽、疏水性圖案形成等。認(rèn)為這種緩沖液-試劑相互作用增加其中小部分光生成試劑被激活的區(qū)域處的酸或堿脫保護(hù)的閾值。這導(dǎo)致接受光照射的區(qū)域和由于光散射而接受照射的區(qū)域之間改善的對比。
圖2中顯示了緩沖液和/或中和劑20和光生成試劑22反應(yīng)的數(shù)字才莫擬。酸由前體18基本上持續(xù)生成最高達(dá)約0.6秒，在這個(gè)點(diǎn)上光暴露停止。通常， 一旦光暴露停止，光生成試劑22濃度就快速下降，并且在相對短的時(shí)間段例如約兩秒內(nèi)基本上變成零。應(yīng)當(dāng)理解舉例說明的濃度是在基質(zhì)12的表面上的。如每個(gè)模擬中所示，雖然光暴露的形狀為矩形，但在其中發(fā)生酸產(chǎn)生的基質(zhì)12上的區(qū)域?yàn)閳A形。認(rèn)為這個(gè)變化至少部分是由于投射圖像角落附近的中性種類的更高利用度而發(fā)生。
光生成試劑22可以是酸或堿，這至少部分依賴于所選擇的光生成試劑前體18。光生成試劑22也進(jìn)行設(shè)定以起始基質(zhì)12上的至少一個(gè)活性區(qū)域的形成。暴露于照射后，光生成試劑22擴(kuò)散至基質(zhì)12表面，在其中它催化接頭分子14的脫保護(hù)。去除不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)Pl,以暴露預(yù)定區(qū)域內(nèi)的反應(yīng)基團(tuán)R且形成活性區(qū)域。
基質(zhì)12可以進(jìn)行洗滌，且隨后與包含一種或多種單體24和活化劑的溶液接觸。單體24能夠與每一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)R偶l關(guān)，并且認(rèn)為活化劑有利地促進(jìn)這種偶聯(lián)反應(yīng)。單體24的非限制性例子包括核苷酸(DNA(例如，圖1的分子序列10中顯示的C、 T、 A和G)或RNA(例如，C、 U、 A和G))，鎖定核酸(LNA)單體，氨基酸(肽或蛋白質(zhì)(例如，Ala、 Cys、 Asp等))，單糖和二糖(例如，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等)，和/或其組合。應(yīng)當(dāng)理解任何單體24都可以是天然的，合成的，或兩者的組合。活化劑的非限制性例子包括四唑；4，5,二氰基咪唑(DCI);三氟乙酸吡咬衛(wèi)；5-乙硫基四唑(5-ethlythiotetrazole ) ; 5 ( 3,5-二硝基苯基(dmtrophenyl) ) -lH-四唑；三曱基氯硅烷；活化劑42 ( 5- ( 二-3,5-三氟甲基苯基)-l-H-四唑；其衍生物；等；和/或其組合。
應(yīng)當(dāng)理解單體24可以具有能夠與反應(yīng)基團(tuán)R偶聯(lián)的一個(gè)末端，和包括受保護(hù)基P (其可以與不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)Pl相同或不同)保護(hù)的反應(yīng)基團(tuán)的另一個(gè)末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，受保護(hù)的單體24用于合成已知序列。然而，應(yīng)進(jìn)一步理解單體24可以不包括保護(hù)基團(tuán)P。在一個(gè)實(shí)施方案中，未保護(hù)的單體24用于合成隨機(jī)序列。
需要時(shí)可以重復(fù)該過程，以使接頭14、單體24、或其組合脫保護(hù)，且使另外的單體24與之選擇性偶聯(lián)，以形成所需序列10。在非限制性例子中，對于包含任何指定序列模式的陣列的寡核苷酸生物芯片，如果使用天然核苷酸，那么每個(gè)循環(huán)中的反應(yīng)步驟的最大數(shù)目是4x1,且如果還使用包含非天然核堿基(nucleobase)的核苷酸，則是12x1。因此，如果使用天然DNA單體，那么用于合成"n個(gè)"核苷酸的寡核苷酸陣列的最大循環(huán)數(shù)目是4xn,且如果還使用非天然單體，則更多。
圖3描述了合成寡核普酸序列IO的實(shí)施方案。與圖1類似，預(yù)定
10的接頭分子14在與溶液16接觸且暴露于光后脫保護(hù)。各種單體24(例如，核亞磷酰胺單體、T、 A、 C和G)與脫保護(hù)的接頭分子14的活性
部位附著。
現(xiàn)在參考圖4，描述了在寡核苷酸合成中基于溶液的酸脫保護(hù)反應(yīng)。在光暴露后產(chǎn)生酸后，切割接頭的保護(hù)基團(tuán)(例如，DMT)以暴露反應(yīng)性5'-OH基團(tuán)。亞磷酸鍵能夠在接頭的-OH基團(tuán)和單體的反應(yīng)性磷原子之間形成。可以進(jìn)行一般的亞磷酰胺或膦酸鹽合成過程的洗滌、氧化和加帽步驟，這將完成第一種單體的添加。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用包含受保護(hù)的3，-OH基團(tuán)的單體代替5'-OH基團(tuán)，以以3，至5，方向執(zhí)行寡核苷酸的合成。這種類型的合成可以在合成PCR引物中使用。
現(xiàn)在參考圖5,描述了使用F-moc法在開放基質(zhì)12上以平行方式合成氨基酸聚合物(例如，寡肽)的非限制性例子。受保護(hù)的接頭分子14與基質(zhì)12的表面附著。在這個(gè)非限制性例子中，每個(gè)接頭分子14包含受堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)P, PL (在這個(gè)例子中為F-moc)保護(hù)的反應(yīng)性官能團(tuán)(例如，-NH2)。
應(yīng)當(dāng)理解在本文公開的實(shí)施方案中，基質(zhì)12可以與反應(yīng)器筒(cartridge )在其底部或頂部附著，從而使得書f生的表面朝向筒的內(nèi)部。
基質(zhì)12隨后與包含光生成試劑前體18的溶液16接觸。在這個(gè)示例實(shí)施方案中，光生成試劑前體18是選自2-硝基千氧(benzyoxy)羰基-哌啶、2-硝基苯基丙氧基羰基、5-芐基-l,5-二氮雜雙環(huán)-壬烷、5-千基-1,5-二氮雜雙環(huán)-十一烷、5-千基-l,4-二氮雜雙環(huán)-咪唑及其組合的光堿產(chǎn)生劑。
隨后將預(yù)定光模式投射到基質(zhì)12和溶液16上。光生成試劑22是堿(例如，胺，包括例如哌啶、C5HnN (即六氫吡咬)、五亞曱基亞胺、氮雜環(huán)己烷、1,5-二氮雜雙環(huán)-十一碳烯(DBU) 、 5-千基-l,5-二氮雜雙環(huán)-壬烯(DBN) 、 1,4-二氮雜雙環(huán)-咪唑等)，并且在暴露于光的溶液16的部分中產(chǎn)生。光生成試劑22使保護(hù)基團(tuán)P, Pl從接失分子14處去除。在這個(gè)非限制性例子中，保護(hù)基團(tuán)P， PL的去除導(dǎo)致反應(yīng)性NH群的暴露。
應(yīng)當(dāng)理解光生成試劑22在未暴露于光的區(qū)域處的溶液16中不產(chǎn)生，并且光生成試劑22至非暴露位點(diǎn)的擴(kuò)散通過與溶液16中存在的中和(在這個(gè)例子中為弱酸)或緩沖分子反應(yīng)而被阻止。
基質(zhì)表面進(jìn)行洗滌且隨后與第 一種氨基酸單體24 (其的非限制性例子包含反應(yīng)性羧酸基團(tuán)和受保護(hù)的胺基團(tuán))的溶液和偶聯(lián)劑/活化劑(例
如，碳二亞胺介導(dǎo)的偶聯(lián)、苯并三唑-l-基氧-三(二甲氨基)磷鐓(BOP )、O-苯并三唑-l-基-N,N,N',N'-四甲基脲鏘六氟磷酸鹽(HBTU) 、 0- ( 7-氮雜苯并三唑-l-基)-N，N,N',N'-四甲基脲鏇六氟磷酸鹽(HATU)等)接觸。將氨基酸單體24加入脫保護(hù)的接頭分子14中，以產(chǎn)生酰胺鍵。
在這個(gè)示例實(shí)施方案中，附著的氨基酸單體24包含受堿不穩(wěn)定性基團(tuán)(例如，F(xiàn)-moc)保護(hù)的反應(yīng)性功能末端胺基團(tuán)?；|(zhì)12表面可與第二批溶液16接觸，且暴露于第二種預(yù)定的光模式。暴露區(qū)域中的單體24或接頭14進(jìn)行脫保護(hù)，且洗滌基質(zhì)12，隨后供應(yīng)第二種單體(F-moc-R,其中R可能是任何合適的氨基酸)。第二種單體與已通過光暴露脫保護(hù)的表面位點(diǎn)附著。
如前所述，合成可以進(jìn)行重復(fù)，直至在所選擇的表面位點(diǎn)上形成具有所需長度和化學(xué)序列的聚合物(例如，順次連接的氨基酸AHVSK( SEQID NO: 12)的序列)。應(yīng)當(dāng)理解如果使用天然存在的氨基酸和/或其衍生物，那么向基質(zhì)12上的預(yù)定位點(diǎn)添加所需氨基酸單體24的循環(huán)數(shù)目通常少于或等于20xl，但如果還使用非天然氨基酸類似物，則可以顯著超過20xl。
圖6舉例說明了用于合成大規(guī)模序列10的裝置100。通常，裝置100包括化學(xué)反應(yīng)器筒102、試劑歧管104、光學(xué)系統(tǒng)106、和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)108。
化學(xué)反應(yīng)器102包括具有歧管的殼(housing),用于使液體試劑與基質(zhì)12接觸。在實(shí)施方案中，化學(xué)反應(yīng)器102是用惰性材料(其的非限制性例子包括氟化聚合物、聚乙烯、PPEK、不銹鋼和/或其他合適的材料)進(jìn)行機(jī)械加工或鑄造。反應(yīng)器102具有供給試劑和洗滌溶液的進(jìn)口和出口。在實(shí)施方案中，反應(yīng)器102通過與加熱和/或冷卻源(例如，IR、微波、加熱元件、冷卻螺管等)接觸進(jìn)行加熱和/或冷卻。
可以至少部分使用兩個(gè)或更多水平的分形歧管，以使試劑在基質(zhì)12上均勻流動(dòng)。反應(yīng)器的頂部和/或底部由基質(zhì)12覆蓋，在其上將以預(yù)定模式合成所需聚合序列。通常，基質(zhì)12與化學(xué)反應(yīng)器筒102之間的連接用合適材料的O型環(huán)或者墊圈進(jìn)行密封。在另一個(gè)實(shí)施方案中，流動(dòng)
12引導(dǎo)歧管用硅、玻璃、或另一種惰性陶瓷材料蝕刻出來，且基質(zhì)12通 過陽極鍵合、擴(kuò)散鍵合、或通過使用粘合劑(例如，環(huán)氧樹脂)進(jìn)行附著。
反應(yīng)器102隨后通過將反應(yīng)器102固定到筒內(nèi)與試劑歧管連接。 試劑歧管104執(zhí)行試劑計(jì)量、遞送、循環(huán)和處置。通常，歧管104 包括試劑瓶、電磁(solenoid)或壓力啟動(dòng)閥、計(jì)量泵、惰性氣體處理系統(tǒng)、 管道系統(tǒng)和/或過程控制器。應(yīng)當(dāng)理解試劑歧管104可以分開構(gòu)建，或 DNA/RNA、肽、或其他類型的自動(dòng)化合成儀可以用作試劑歧管104。
光學(xué)系統(tǒng)106產(chǎn)生預(yù)定模式用于光指導(dǎo)的合成。光學(xué)系統(tǒng)106包括 光源、空間光調(diào)節(jié)器、透鏡、鏡子和Z或?yàn)V光器。在實(shí)施方案中，光源是
汞uv燈、氛氣燈、白熾燈、可見或uv激光器、發(fā)光二極管、或任何
其他合適的光發(fā)射器。在非限制性例子中，光源是與帶通濾波器一起使
用的高壓汞燈，以選^奪340nm-420nm的波長。在另一個(gè)非限制性例子中， 光源是具有340nm-420nm的波長的UV激光器。通常，導(dǎo)向基質(zhì)12表 面的光強(qiáng)度范圍為約lmW-約1000mWcm2。
在實(shí)施方案中，可編程的空間光調(diào)節(jié)器用于產(chǎn)生光模式用于所需合 成模式?？臻g光調(diào)節(jié)器的非限制性例子是微鏡陣列調(diào)節(jié)器(DMD,這從 位于Dallas, TX的Texas Instruments商購可得)。用于投射光才莫式的其 他合適工具是液晶顯示器(LCD)、液晶光閥、聲-光掃描光調(diào)節(jié)器 (SLMs)、檢流計(jì)激光掃描儀等。
本文公開的裝置IOO和方法有利地允許同時(shí)合成超過一種基質(zhì)。通 常，這包括將超過一種基質(zhì)12置入反應(yīng)器102內(nèi)，且具有透明基質(zhì)作 為反應(yīng)器筒的頂部覆蓋物。通過逐步和反復(fù)暴露方案或通過旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤系 統(tǒng)可以平行制作多個(gè)陣列。
應(yīng)當(dāng)理解這種多重合成系統(tǒng)可以同時(shí)加工少至2個(gè)和多至數(shù)十個(gè)基 質(zhì)12。在例子中，6-30種基質(zhì)12可以以固定在基本上線形的X-Y平移 臺上的多重方式進(jìn)行加工。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在其上進(jìn)行合成的基質(zhì)12是靜止的，且投 射光一莫式以編程方式從基質(zhì)12移動(dòng)到基質(zhì)12。
現(xiàn)在參考圖7A-7D，顯示了在各種基質(zhì)上的寡核普酸序列10的合 成。圖7A和7B描述了在未成形的載玻片上的寡核苷酸序列10。使用 光生成酸前體和本文公開的方法的實(shí)施方案，在顯微鏡載玻片上合成各種長度(n=15-90)和各種序列(A、 C、 G和T)的寡核苷酸。圖7A 中顯示的垂直條帶是由于使用的投影。圖7C描述了在200微米球體上 以字母(左)和條紋(右)的形式合成的寡核苷酸，且圖7D描述了在 0.5mm毛細(xì)管的內(nèi)部表面上以條形碼形式的寡核苷酸合成。黑條為DNA序列。
雖然已詳細(xì)描述了幾個(gè)實(shí)施方案，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見 的是，所公開的實(shí)施方案可以進(jìn)行修改。因此，上述說明書應(yīng)視為示例 性而不是限制性的。
權(quán)利要求
1. 一種用于形成分子序列(10)的方法，其包括用包含受保護(hù)的反應(yīng)基團(tuán)(PL)的至少一個(gè)接頭(14)衍生無限制基質(zhì)(12)表面；使所述基質(zhì)(12)與包含光生成試劑前體(18)和緩沖液或中和劑(20)中的至少一種的溶液(16)接觸；在至少部分溶液(16)中產(chǎn)生光生成試劑(22)，設(shè)定所述光生成試劑(22)以起始所述基質(zhì)表面(12)上的至少一個(gè)活性區(qū)域的形成；和使單體(24)與所述至少一個(gè)活性區(qū)域偶聯(lián)。
2. 如權(quán)利要求1中限定的方法，其中所述光生成試劑前體(18) 選自光酸生成分子和光堿生成分子。
3. 如權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)限定的方法，其中所述光生成試劑 (22 )選自酸和石咸。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)限定的方法，其中產(chǎn)生所述光生成試劑 (22)經(jīng)由使所述基質(zhì)(12)的至少一個(gè)區(qū)域選擇性暴露于電磁輻射來%成。
5. 如權(quán)利要求中4限定的方法，其中所述光生成試劑(22)經(jīng)由 所述緩沖液或中和劑(20)中的至少一種基本上限制于所述至少一個(gè)暴 露區(qū)域。
6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)限定的方法，其中所述光生成試劑(22) 擴(kuò)散至所述基質(zhì)(12 )的表面，在其中它催化所述受保護(hù)的反應(yīng)基團(tuán)() 的脫保護(hù)，從而暴露反應(yīng)基團(tuán)(R)且形成至少一個(gè)活性區(qū)域。
7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)限定的方法，其中在使所迷單體(24) 與所述至少一個(gè)活性區(qū)域偶聯(lián)前，所述方法進(jìn)一步包括從所迷基質(zhì)(12) 處去除所述溶液(16)。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)限定的方法，其中所述單體(24)具有 2個(gè)末端，所述2個(gè)末端之一是未保護(hù)的，且所述2個(gè)末端中的另一個(gè) 具有與之附著的受保護(hù)的反應(yīng)基團(tuán)(p)。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)限定的方法，其中重復(fù)所述接觸、所述 產(chǎn)生、和所迷偶聯(lián)步驟以形成預(yù)定序列(10)。
10. 如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)限定的方法，其中所述溶液(16)進(jìn)一步包含敏化劑、穩(wěn)定劑、粘度添加劑或其組合中的至少一種。
11. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)限定的方法，其中所述光生成試劑(22)是酸，且其中所述緩沖液或中和劑(20)選自吡啶、二甲基吡啶、 哌咬、伯胺、仲胺、叔胺、其衍生物及其組合。
12. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)限定的方法，其中所述光生成試劑 (22)是堿，且其中所述緩沖液或中和劑(20)選自二苯乙醇酸、氯化鋁、氯化鐵(III)、三氟化硼、三氟甲磺酸鐿(III) 、 丁酸、丙酸、苯 酚及其組合。
13. 如權(quán)利要求1-7或9-12中任一項(xiàng)限定的方法，其中所述單體(24) 具有2個(gè)未保護(hù)的末端。
14. 如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)限定的方法，其中所述單體(24)是 包含至少一種活化劑的溶液。
15. 如權(quán)利要求14中限定的方法，其中所述至少一種活化劑選自 四唑；4,5,二氰基咪唑(DCI);三氟乙酸吡啶微；5-乙硫基四哇；5(3,5-二硝基苯基))-lH-四唑；三甲基氯硅烷；活化劑42 (5- (二-3,5-三氟 甲基苯基)]-H-四唑；其衍生物；及其組合。
16. —種分子序列(10),其通過權(quán)利要求1中的方法形成。
17. —種裝置，其包括 無限制基質(zhì)(12)表面；和與所述無限制基質(zhì)(12)表面偶聯(lián)的分子序列(10)。
18. 如權(quán)利要求17中限定的裝置，其中所述分子序列(10)包括 經(jīng)由接頭(14)的反應(yīng)基團(tuán)(R)與所述無限制基質(zhì)(12)表面偶聯(lián)的 第一種單體(24)。
19. 如權(quán)利要求18中限定的裝置，其中所述反應(yīng)基團(tuán)(R)最初包 含經(jīng)由光生成試劑(22)去除的保護(hù)基團(tuán)(PL)。
20. 如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)限定的裝置，其中所述分子序列(10) 由偶聯(lián)在一起的多種單體(24)形成。
21. 如權(quán)利要求20中限定的裝置，其中所述多種單體(24)中的 每一種選自核苷酸、鎖定核酸單體、氨基酸、單糖、二糖及其組合。
全文摘要
用于形成分子序列(10)的方法包括用包含受保護(hù)的反應(yīng)基團(tuán)(P_L)的至少一個(gè)接頭(14)衍生無限制基質(zhì)(12)表面。使基質(zhì)(12)與包含光生成試劑前體(18)和緩沖液和/或中和劑(20)的溶液(16)接觸。光生成試劑(22)在至少部分溶液(16)中產(chǎn)生。設(shè)定光生成試劑(22)以起始基質(zhì)(12)表面上的至少一個(gè)活性區(qū)域的形成。使單體(24)與活性區(qū)域偶聯(lián)。
文檔編號C07K14/00GK101512340SQ200780018836
公開日2009年8月19日 申請日期2007年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月24日
發(fā)明者E·古拉里, J·-M·魯亞爾, X·周, X·高 申請人:密執(zhí)安大學(xué)評議會(huì);休斯頓大學(xué)