專利名稱：血球凝集素多肽和其相關(guān)試劑和方法
血球凝集素多肽和其相關(guān)試劑和方法
優(yōu)先權(quán)的主張
本申請(qǐng)案根據(jù)35 USC 119(e)主張2006年8月14日申請(qǐng)的共同待決美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第60/837,868號(hào)以及2006年8月14日申請(qǐng)的共同待決美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第60/837,869號(hào)的優(yōu)先權(quán)。這些現(xiàn)有申請(qǐng)案中每一者的完整內(nèi)容是以引用的方式并入本文中。
政府支持
本發(fā)明是由美國(guó)國(guó)立綜合醫(yī)學(xué)研究所(National Institute of General MedicalSciences )依據(jù)合同號(hào)U54 GM62116和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)依據(jù)合同號(hào)GM57073所授予的美國(guó)政府支持下進(jìn)行。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
流感具有流行性、傳染性、復(fù)發(fā)性和爆發(fā)性的長(zhǎng)久歷史。禽流感(包括H5N1菌株)是高度感染性且潛在致命病原體，但其現(xiàn)在僅具有有限感染人類的能力。然而，已在歷史上觀察發(fā)現(xiàn)禽流感病毒積聚改變其宿主特異性并使其易于感染人類的突變。實(shí)際上，上個(gè)世紀(jì)的主要流感流行病中的兩者是源自于已改變遺傳組成、從而允許人類感染的禽流感病毒。
對(duì)于當(dāng)前H5N1、 H7N7、 H9N2和H2N2禽流感菌株可積聚改變其宿主特異性并使其易于感染人類的突變存在顯著關(guān)注。因此，需要評(píng)估HA蛋白在此等菌株中實(shí)際上是否可以轉(zhuǎn)化成可易于感染人類的形式，且進(jìn)一步需要鑒別具有這種能力的HA變體。進(jìn)一步需要理解通常允許或禁止不同受檢者(尤其人類)感染的HA蛋白的特征。同時(shí)需:要用于有效地治療或延遲由流感病毒所引起的疾病發(fā)作的疫苗和治療策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供具有特定聚糖結(jié)合特征的血球凝集素多肽。詳細(xì)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供結(jié)合具有傘形拓?fù)涞耐僖核峄厶堑难蚰囟嚯摹Ｔ谀承?shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽結(jié)合具有高親和力和/或特異性的傘形聚糖。在一些實(shí)施例中，與錐形拓?fù)渚厶窍啾容^，
本發(fā)明的HA多肽對(duì)傘形聚糖展示結(jié)合優(yōu)選性。
本發(fā)明同時(shí)提供與包括疫苗的所提供血球凝集素多肽相關(guān)的診斷和治療試劑和方法。


厲/,努全^ 游示范絲岸身必^W。磁i減瘋毒濟(jì)評(píng)教^庫(kù)(http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)獲淳 卩》
,2; ft4褒^^^鍵/^^/#/^/。灰色結(jié)合唾液酸所涉及的保守氨基酸。紅色
結(jié)合Neu5Aca2-3/6Gal基元所涉及的特定氨基酸。黃色影響Q226 ( 137、 138)和E190(186、 228)定位的氨基酸。綠色與連接到Neu5Acot2-3/6Gal基元的其它單糖(或修飾)結(jié)合所涉及的氨基酸。ASI30、 APR34、 ADU63、 ADS97和Viet04的序列是從其各自的晶體結(jié)構(gòu)獲得。其它序列是從SwissProt (http7Zus.expasv.org)獲得?？s寫(xiě)ADA76，A/鴨/阿爾伯達(dá)(Alberta)/35/76 (H1N1); ASI30, A/豬/愛(ài)荷華(Iowa)/30 (H1N1); APR34,A/波多黎各(Puerto Rico) /8/34 (H1N1); ASC18， A/南卡羅來(lái)納(South Carolina) /1/18(H1N1); AT91， A/得克薩斯(Texas) /36/91 (H1N1); ANY18， A/紐約(New York) /1/18(H1N1); ADU63， A/鴨/烏克蘭(Ukraine) /1/63 (H3N8); AAI68， A/愛(ài)知(Aichi) /2/68(H3N2); AM99， A/莫斯科(Moscow) /10/99 (H3N2); ADS97, A/鴨/新加坡(Singapore)/3/97(H5N3); Viet04， A/越南(Vietnam) /1203/2004 (H5N1)。
說(shuō)欲//7 ft4游保伊ff身特^"游,/^^/。
^4..說(shuō)^沼ffi4游保寧f,身淳^"游,身慫者。房5:說(shuō)^/Z5/M游保伊f^W錄,游,^/慫^。
^76, ^f潘,豕瀞受沐特弄絲游嚴(yán)架。(x2-3-和/或cc2-6-連接聚糖可采用不同拓?fù)?。根?jù)本發(fā)明，HA多肽結(jié)合某些所述拓?fù)涞哪芰x予其介導(dǎo)不同宿主(例如，人類)感染的能力。如本圖中所說(shuō)明，本發(fā)明指定兩種尤其相關(guān)的拓?fù)?錐形"拓?fù)浜?傘形"拓?fù)?。ct2-3-和/或(x2-6-連接聚糖都可采用錐形拓?fù)?，且錐形拓?fù)錇檫B接到核心的短鏈寡糖或分枝寡糖所特有(但某些長(zhǎng)鏈寡糖也可以采用這種拓?fù)?。僅a2-6-連接聚糖可以采用傘形拓?fù)?這可能歸因于a2-6-鍵聯(lián)中存在的額外C5-C6鍵所提供的構(gòu)象多樣性增加)，;且傘形拓?fù)渲饕怯砷L(zhǎng)鏈寡糖或具有長(zhǎng)鏈寡糖分枝、尤其含有Neu5Aca2-6Gal(31-3/4GlcNAc-基元的分枝聚糖采用。如本文中所述，HA多肽結(jié)合傘形;聚糖拓?fù)涞哪芰x予對(duì)人類受體的結(jié)合和/或介導(dǎo)人類感染的能力。
房7.* /M殘基與薪形^傘彤豕,務(wù)//裙互伊屑游^夢(mèng)。HA-聚糖共晶體的分析表明，Neu5Ac的位置相對(duì)于HA結(jié)合位點(diǎn)幾乎無(wú)變化。與Neu5Ac的接觸涉及諸如F98、S/T136、W153、 H183和L/I194等高度保守的殘基。與其它糖的接觸涉及不同殘基，這取決于糖鍵聯(lián)是cx2-3還是(x2-6以及聚糖拓?fù)錇殄F形還是傘形。舉例來(lái)說(shuō)，在錐形拓?fù)渲校饕佑|Neu5Ac和Gal糖。E190和Q226對(duì)于此結(jié)合起到特別重要的作用。本圖還說(shuō)明可參與結(jié)合錐形結(jié)構(gòu)的其它位置(例如，137、 145、 186、 187、 193、 222)。在一些情況中，不同殘基可引起與不同聚糖結(jié)構(gòu)的不同接觸。這些位置中的氨基酸的類型可影響HA多肽與在聚糖結(jié)構(gòu)中具有不同修飾和/或分枝模式的受體結(jié)合的能力。在傘形拓?fù)渲?，與除Neu5Ac和Gal外的糖發(fā)生接觸。本圖說(shuō)明可參與結(jié)合傘形結(jié)構(gòu)的殘基(例如，137、145、 156、 159、 186、 187、 189、 190、 192、 193、 196、 222、 225、 226)。在一些情況中，不同殘基可引起與不同聚糖結(jié)構(gòu)的不同接觸。這些位置中的氨基酸的類型可影響HA多肽與在聚糖結(jié)構(gòu)中具有不同修飾和/或分枝模式的受體結(jié)合的能力。在一些實(shí)施例中，190位的D殘基和/或225位的D殘基引起與傘形拓?fù)涞慕Y(jié)合。
厲S;示范絲麥形務(wù)//。本圖說(shuō)明采用錐形拓?fù)涞哪承┦痉缎?但不詳盡)聚糖結(jié)構(gòu)。
厲9;示^絲傘麼/《//。本圖說(shuō)明采用傘形拓?fù)涞哪承┦痉缎?但不詳盡)聚糖結(jié)構(gòu)。
yt類玄^,J:皮潘應(yīng),乂類薪羼J:座潘應(yīng)游覆潛分恭。為進(jìn)一步研究上呼吸道組織中的聚糖多樣性，從HBE (代表性上呼吸道細(xì)胞系)分離N-連接聚糖并使用MALDI-MS分析。通過(guò)使用唾液酸酶S ((x2-3特異性)和唾液酸酶A (裂解和SA)預(yù)處理樣本來(lái)證實(shí)ot2-6在HBE中的顯著表達(dá)。通過(guò)代表性質(zhì)峰(以藍(lán)綠色突出)的TOF-TOF片段化分析來(lái)證實(shí)具有長(zhǎng)鏈分枝拓?fù)涞木厶堑娘@著表達(dá)。為提供上呼吸道組織中聚糖多樣性的參考，獲得人類結(jié)腸上皮細(xì)胞(HT29;代表性腸管細(xì)胞系)的N-連接聚糖分布。選擇所述細(xì)胞系的原因是已展示當(dāng)前H5N1病毒感染腸管細(xì)胞。唾液酸酶A和S預(yù)處理調(diào)控展示cx2-3聚糖(以紅色突出)在HT-29細(xì)胞中的顯著表達(dá)。此外，長(zhǎng)鏈分枝聚糖拓?fù)洳⒉蝗鐚?duì)HBE所觀察到的情形般普遍。因此，H5N1HA的人類適應(yīng)作用將涉及將能夠?qū)崿F(xiàn)在人類上呼吸道組織中表達(dá)的不同聚糖(例如傘形聚糖)的高親和力結(jié)合的HA突變。
房7h嚴(yán)薪挖薪^臺(tái)。(A)中展示數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)的主要組件。特征是從提取自數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)對(duì)象得到。將所述特征制備成分類方法中所使用的數(shù)據(jù)集以導(dǎo)出模式或規(guī)則。B展示使用戶能將數(shù)據(jù)挖掘方法應(yīng)用于聚糖陣列數(shù)據(jù)的關(guān)鍵軟件模塊。
曆"教^^^^"分沐^伊I游錄^"。本圖展示在本文中指定為代表性基元的特征，其說(shuō)明從聚糖微陣列上的聚糖提取的不同類型的對(duì)、三聯(lián)體和四聯(lián)體。選擇所述特征的基本原則是基于二-(四糖)與HA的聚糖結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。最終數(shù)據(jù)集包含來(lái)自聚糖的特.征以及在所述陣列上篩選的各HA的結(jié)合信號(hào)。在不同分類方法中，使用規(guī)則歸納分類
7法。所述方法的主要優(yōu)勢(shì)之一為其產(chǎn)生當(dāng)與其它統(tǒng)計(jì)或數(shù)學(xué)法相比時(shí)可更易于解釋的IF-THEN規(guī)則。分類的兩個(gè)主要目標(biāo)為(1)鑒別一組高親和力聚糖配體上存在的增強(qiáng)結(jié)合的特征；和(2)鑒別處于低親和力聚糖配體中的不利于結(jié)合的特征。
房U, ^f教薪^^漱分界游分類器。本圖提供分類器id和規(guī)則的表。
房〃,A^"5Am2-3Ga/浙Wew5Aca2-6Ga/基^游稱家激 ^/^^絲。圖A展示Neu5Aca2-3Gal鍵聯(lián)的構(gòu)象圖。經(jīng)包圍區(qū)域2為在APR34—HI—23、 ADU63—H3—23和ADS97—H5—23共晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的反式構(gòu)象。經(jīng)包圍區(qū)域1為在AAI68_H3—23共晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的構(gòu)象。圖B展示Neu5Aca2-6Gal的構(gòu)象圖，其中順式構(gòu)象(經(jīng)包圍區(qū)域3)在所有HA-a2-6唾液酸化聚糖共晶體結(jié)構(gòu)中都可觀察到。圖C展示在個(gè)別HA-聚糖共晶體結(jié)構(gòu)中Neu5Ac cx2-3與a2-6唾液酸化寡糖的溶劑可及表面積(SASA)之間的差異。紅色和藍(lán)綠色柱分別指示a2-6(正值)或(x2-3 (負(fù)值)唾液酸化聚糖中的Neu5Ac造成與聚糖結(jié)合位點(diǎn)的更多接觸。圖D展示結(jié)合豬和人類H1 (Hla2.3)、禽類和人類H3(H3a2.3)的a2-3唾液酸化聚糖中的NeuAc的SASA與結(jié)合豬和人類HI (Hla2.6)的a2-6唾液酸化聚糖中的NeuAc的SASA之間的差異。藍(lán)綠色的H3a2.3負(fù)值柱指示與禽類H3相比，人類H3 HA與Neu5Aca2-3Gal的接觸較少。扭轉(zhuǎn)角一O: C2-Cl-0-C3 (對(duì)于Neu5Aca2-3/6鍵聯(lián))；\(/: Cl-0-C3-H3 (對(duì)于Neu5Aca2-3Gal)或Cl-0-C6-C5 (對(duì)于Neu5Aca2-6Gal): ro: 0-C6-C5-H5 (對(duì)于Neu5Aca2-6Gal)鍵聯(lián)。O、 \|/圖是從GlycoMapsDB (http:〃www.glvcosciences.de/modeling/glvcomapsdb/)獲得，其是由馬丁'富蘭克博士(Dr. Martin Frank)和克洛斯-維爾姆范德利特博士 (Dr. Claus-Wilhelm von der Lieth)(德國(guó)癌癥研究院(German Cancer Research Institute)，德國(guó)海姆堡(Heidelberg, Germany))開(kāi)發(fā)的。從高能量到低能量的著色方案分別為從亮紅色到亮綠色。
房"，歷、7/3浙H5 與a2-3/6麼液邀眾,薪游錄^W,涉J!游嫂基。圖A-D展示ASI30—H1、APR34—H1、ADU63—H3和ADS97—H5共晶體結(jié)構(gòu)中分別與a2-3和a2-6唾液酸化聚糖相互作用的殘基的溶劑可及表面積(SASA)的差異(橫坐標(biāo)的A)。綠色柱對(duì)應(yīng)于與聚糖直接相互作用的殘基且淺橙色柱對(duì)應(yīng)于與Glu/Asp190和Gln/Leu226臨近的殘基。綠色柱的△的正值指示所述殘基與a2-6唾液酸化聚糖的接觸較多，而△的'負(fù)值指示與a2-3唾液酸化聚糖的接觸較多。圖E以表格形式概述結(jié)合Hl、 H3和H5 HA中的oc2-3/6唾液酸化聚糖所涉及的殘基。結(jié)合cx2-3唾液酸化聚糖所涉及的某些關(guān)鍵殘基為藍(lán)色且結(jié)合(x2-6唾液酸化聚糖所涉及的某些關(guān)鍵殘基為紅色。
激M, Wef04—//5 與現(xiàn)敏a2-6麼液潔眾覆薪f統(tǒng)形l/"游碧^。表面的立體視圖呈現(xiàn)利用Neu5Aca2-6Gal鍵聯(lián)的呈延長(zhǎng)構(gòu)象的Viet04—H5聚糖結(jié)合位點(diǎn)(從百日咳;毒素共晶體結(jié)構(gòu)獲得；PDBID: 1PT0)。 Lysl93 (橙色)與呈此構(gòu)象的聚糖無(wú)任何接觸。結(jié)合呈此構(gòu)象的聚糖潛在涉及的其它氨基酸為Asnl86、 Lys222和Ser227。然而，結(jié)合呈順式構(gòu)象的ct2-6唾液酸化寡糖的HA中所觀察到的某些接觸在延長(zhǎng)構(gòu)象中并不存在。不希望受仟何特定理論的束縛，應(yīng)注意，這表明延長(zhǎng)構(gòu)象與HA的結(jié)合可能不如順式構(gòu)象理想。其中Neu5Aca2-6Gal(31-4GlcNAcb分枝連接到Manal-3Man (PDB ID: 1LGC)和Manal-6Man (PDB ID: 1ZAG)的分枝N連接聚糖的結(jié)構(gòu)附加于Neu5Aca2-6Gal鍵聯(lián)的順式和延長(zhǎng)構(gòu)象的Viet04一H5 HA結(jié)合位點(diǎn)中的Neu5Aca2-6Gal鍵聯(lián)上。所述附加展示，具有連接到核心的Manal-6Man的Neu5Aca2-6Gal(31-4GlcNAc分枝的結(jié)構(gòu)與結(jié)合位點(diǎn)具有不利的空間重疊(在兩種構(gòu)象中)。另一方面，具有所述連接到核心的Manal-3Man的分枝的結(jié)構(gòu)(如圖中所示，其中三甘露糖核心呈紫色)與順式構(gòu)象中的Lysl93具有空間重疊，但盡管不太理想，仍能在不與延長(zhǎng)構(gòu)象中的Lysl93具有任何接觸的情況下結(jié)合。
房〃，WT///、 //3浙H5/M游產(chǎn)全。圖A展示在4-12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上跑膠且印跡于硝酸纖維素膜上的來(lái)自H1N1 (A/南卡羅來(lái)納/1/1918)、 H3N2 (A/莫斯科/10/1999)禾卩H5N1 (A/越南/1203/2004)的HA蛋白的可溶形式。H1N1HA是使用山羊抗流感A抗體和抗山羊IgG-HRP探査。H3N2是使用雪貂抗H3N2 HA抗血清和抗雪貂HRP探查。H5N1是使用抗禽類H5N1 HA抗體和抗兔IgG-HRP探查。H1N1 HA和H3N2HA是以HAO提供，而H5N1 HA是以HAO與HA1提供。圖B展示在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上跑膠且印跡于硝酸纖維素膜上的全長(zhǎng)H5N1 HA和兩種變體(Glul90Asp、'Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Gln226Leu ， "DSDL";禾Q GLul90Asp Lysl93Ser Gln223LeuGly228Ser， "DSLS")。 HA是使用抗禽類H5N1抗體和抗兔IgG-HRP探查。
房M,丄呼欲遣邀織級(jí)#游凝桌*:染經(jīng)。利用木菠蘿凝集素Uacalin)(綠色)和刀豆凝集素(ConA)(紅色)的氣管組織共染色揭示木菠蘿凝集素(特異性結(jié)合O連接聚糖)優(yōu)先與氣管頂表面上的杯狀細(xì)胞結(jié)合，且刀豆凝集素(特異性結(jié)合N連接聚糖)優(yōu)先結(jié)合氣管纖毛上皮細(xì)胞。不希望受任何特定理論的束縛，應(yīng)注意，此發(fā)現(xiàn)表明杯狀細(xì)胞主要表達(dá)O連接聚糖，而纖毛上皮細(xì)胞主要表達(dá)N連接聚糖。利用木菠蘿凝集素和SNA(紅色；特異性結(jié)合(x2-6)的氣管共染色展示SNA與杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞的結(jié)合。另一方面，木菠蘿凝集素(綠色)和特異性結(jié)合a2-3唾液酸化聚糖的MAL (紅色)的共染色展示MAL與假?gòu)?fù)層氣管上皮的結(jié)合很弱甚至不結(jié)合，但與所述組織的底層區(qū)域廣泛結(jié)合?？偟恼f(shuō)來(lái)，凝集素染色數(shù)據(jù)指示分別作為氣管上皮頂面上的纖毛和杯狀細(xì)胞中的N連接和0連接聚糖的一部分的a2-6唾液酸化聚糖的顯著表達(dá)和廣泛分布。
9f邀絲//7、 MT/M與J:伊欲遭資織級(jí)/f,7^F欲遣邀織級(jí)/f游浙量友應(yīng)^f會(huì)。針對(duì)碘化丙啶染色(紅色)，以綠色展示HA結(jié)合。氣管組織的頂面主要表達(dá)具有長(zhǎng)鏈分枝拓?fù)涞腶2-6聚糖。另一方面，肺泡組織主要表達(dá)a2-3聚糖。HI HA顯著結(jié)合氣管的頂表面且其結(jié)合隨著從40嗎/ml稀釋到10 ^g/ml而逐漸降低。HI HA僅在最高濃度下也展示與肺泡組織的某些弱結(jié)合。H3 HA的結(jié)合模式不同于HI HA的結(jié)合模式。舉例來(lái)說(shuō)，H3 HA在40 pg/ml和20 pg/ml下展示與氣管和肺泡組織切片顯著結(jié)合。然而，在10pg/ml的濃度下，H3HA展示主要結(jié)合氣管組織的頂面，且?guī)缀醪慌c肺泡組織結(jié)合。總的說(shuō)來(lái)，這些組織結(jié)合數(shù)據(jù)突出與氣管組織的頂面以高親和力結(jié)合的重要性。此外，此等數(shù)據(jù)還揭示，由于H3 HA對(duì)a2-3唾液酸化聚糖展示某些親和力，因此并非絕對(duì)需要對(duì)a2-6唾液酸化聚糖的高特異性(如通過(guò)H1HA所證實(shí))來(lái)介導(dǎo)人類感染。
房20, ///、 /W//7//5WT/M游苴麥禁會(huì)^/量f應(yīng)。從上到下分別展示野生型Hl、H3和H5 HA在各種濃度下的結(jié)合信號(hào)(正規(guī)化為約800000的飽和水平)。聚糖的圖例是展示為插圖，其中LN對(duì)應(yīng)于Galbl04GlcNAc且3'SLN和6'SLN分別對(duì)應(yīng)于在LN處的a2-3和(x2-6連接唾液酸。適于感染人類的Hl和H3 HA的特征結(jié)合模式為在從40pg/ml稀釋下降到5 pg/ml的范圍內(nèi)在飽和水平下結(jié)合長(zhǎng)鏈ct2-6 (6'SLN-LN)聚糖。盡管HI HA對(duì)于結(jié)合長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸化聚糖高度特異，H3 HA也以高親和力結(jié)合短鏈a2-6唾液酸化聚糖(6'SLN)并相對(duì)于a2-6以較低親和力結(jié)合長(zhǎng)鏈a2-3。 Hl和H3 HA的此直接結(jié)合劑量反應(yīng)與組織結(jié)合模式相一致。此外，Hl和H3 HA對(duì)長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸化聚糖的高親和力結(jié)合與其與氣管組織的頂面(其表達(dá)具有長(zhǎng)鏈分枝拓?fù)涞腶2-6唾液酸化聚糖)的廣泛結(jié)合有關(guān)。此相關(guān)性提供對(duì)人類適應(yīng)性Hl和H3 Has的上呼吸道組織嗜性的有益洞察。另一方面，H5 HA展示相反的聚糖結(jié)合趨勢(shì)，即與其對(duì)a2-6唾液酸化聚糖的相對(duì)低親和力(顯著信號(hào)僅在20-40嗎/ml可見(jiàn))相比較，以高親和力結(jié)合a2-3 (飽和信號(hào)從40ng/ml下降到2.5 ^g/ml)。因此，不希望受任何特定理論的束縛，本發(fā)明者提出HA多肽(例如禽類H5HA)的人類適應(yīng)作用的必要條件是獲得以高親和力結(jié)合主要表達(dá)在人類上氣管中的長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸化聚糖(例如傘形拓?fù)渚厶?的能力。
HA序列元件的說(shuō)明
HA序列元件1
/M ^^/《元斧7為近似對(duì)應(yīng)于天然流感分離株中所見(jiàn)的許多HA蛋白的殘基97-185(其中使用H3 HA作為參考來(lái)指定殘基位置)的序列元件。所述序列元件具有基本結(jié)構(gòu)C (Y/F) P X， C X2 W X3 W X4 H H P，其中X,近似30-45個(gè)氨基酸長(zhǎng)；X2近似5-20個(gè)氨基酸長(zhǎng)；
X3近似25-30個(gè)氨基酸長(zhǎng)且 X4近似2個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
在一些實(shí)施例中，X,為約35-45,或約35-43，或約35、 36、 37、 38、 38、 40、 41、 42或43個(gè)氨基酸長(zhǎng)。在一些實(shí)施例中，X2為約9-15，或約9-14，或約9、 10、 11、 12、 13或14個(gè)氨基酸長(zhǎng)。在一些實(shí)施例中，X3為約26-28，或約26、 27或28個(gè)氨基酸長(zhǎng)。 在一些實(shí)施例中，X4具有序列(G/A)(I/V)。在一些實(shí)施例中，X4具有序列GI;在一些實(shí) 施例中，X4具有序列GV;在一些實(shí)施例中，X4具有序列AI;在一些實(shí)施例中，X4具 有序列AV。在一些實(shí)施例中，HA序列元件1包含二硫鍵。在一些實(shí)施例中，所述二硫 鍵橋殘基對(duì)應(yīng)于97位和139位(基于本文中所用的標(biāo)準(zhǔn)H3編號(hào)系統(tǒng))。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H1多肽中，X,為約43個(gè)氨基酸長(zhǎng)，和/或X2為約13 個(gè)氨基酸長(zhǎng)，和/或X3為約26個(gè)氨基酸長(zhǎng)。在一些實(shí)施例中，且尤其在H1多肽中，HA 序列元件1具有以下結(jié)構(gòu)
C Y P X, A T (A/T) (A/S) C X2 W X3 W X4 H H P，其中
X,a近似27-42，或近似32-42,或近似32-40,或近似26-41，或近似31-41，或近 似31-39,或近似31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40個(gè)氨基酸長(zhǎng)，且X2-X4 如上所述。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H1多肽中，HA序列元件1具有以下結(jié)構(gòu)
C Y P X1A T (A/T) (A/S) C X2 W (I/L) (T/V) X3A W X4 H H P，其中
Xm近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似32、 33、 34、 35、 36、 37、
38、 39或40個(gè)氨基酸長(zhǎng)；
Xm近似23-28，或近似24-26，或近似24、 25或26個(gè)氨基酸長(zhǎng)，且X2和X4如上所述。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H1多肽中，HA序列元件1包括以下序列 GLS S IS S FEK，
其通常在X,內(nèi)(包括在X,a內(nèi))且尤其約在X,的殘基12處開(kāi)始(如在例如圖l-3
中所說(shuō)明)。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H3多肽中，X,為約39個(gè)氨基酸長(zhǎng)，和/或X2為約13 個(gè)氨基酸長(zhǎng)，和/或X3為約26個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H3多肽中，HA序列元件1具有以下結(jié)構(gòu) C YPX1AS (S/N) (A/S)CX2WX3WX4HHP，其中
11XtA近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似23-38，或近似28-38，或近 似28-36,或近似28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40個(gè)氨基酸
長(zhǎng)，且X2-X4如上所述。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H3多肽中，HA序列元件1具有以下結(jié)構(gòu)
C Y P X, a S (S/N) (A/S) C X2 W L (T/H) X3A W X4 H H P，其中
X，a近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似32、 33、 34、 35、 36、 37、
38、 39或40個(gè)氨基酸長(zhǎng)；
Xm近似23-28，或近似24-26，或近似24、 25或26個(gè)氨基酸長(zhǎng)，且X2和X4如上所述。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H3多肽中，HA序列元件1包括以下序列 (L/I) (V/I) ASSGTLEF,
其通常在X,內(nèi)(包括在X,a內(nèi))且尤其約在X,的殘基12處開(kāi)始(如在例如圖l、 2和4中所說(shuō)明)。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H5多肽中，Xi為約42個(gè)氨基酸長(zhǎng)，禾B/或X2為約13 個(gè)氨基酸長(zhǎng)，和/或&為約26個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件1具有以下結(jié)構(gòu) CYPXiASSACX2WX3WX4HHP，其中
X,a近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似23-38，或近似28-38，或近 似28-36，或近似28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40個(gè)氨基酸
長(zhǎng)，且X2-X4如上所述。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件1具有以下結(jié)構(gòu) C YPX1AS SACX2WLIX3AWX4HHP,其中
X,a近似27-42，或近似32-42，或近似32-40，或近似32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40個(gè)氨基酸長(zhǎng)；且
Xm近似23-28，或近似24-26，或近似24、 25或26個(gè)氨基酸長(zhǎng)，且乂2和乂4如上 所述。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件1經(jīng)以下序列延長(zhǎng)(即在對(duì)應(yīng) 于殘基186-193的位置) N D AAE X X (K/R)。
在一些實(shí)施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件1包括以下序列 YEELKHLXSXXNHFEK，其通常在X,內(nèi)且尤其約在X,的殘基6處開(kāi)始(如在例如圖l、 2和5中所說(shuō)明)。 HA序列元件2
ft4 ^/y無(wú)伴2為近似對(duì)應(yīng)于天然流感分離株中所見(jiàn)的許多HA蛋白的殘基324-340 (再次使用基于H3HA的編號(hào)系統(tǒng))的序列元件。所述序列元件具有基本結(jié)構(gòu) G AIAG F IE。
在一些實(shí)施例中，HA序列元件2具有以下序列 PX!GAIAGFIE，其中
X,近似4-14個(gè)氨基酸長(zhǎng)，或約8-12個(gè)氨基酸長(zhǎng)，或約12、 11、 10、 9或8個(gè)氨基 酸長(zhǎng)。在一些實(shí)施例中，所述序列元件提供HA0裂解位點(diǎn)，從而允許產(chǎn)生HA1和HA2。 在一些實(shí)施例中，且尤其在H1多肽中，HA序列元件2具有以下結(jié)構(gòu) PS(I/V)QSRXIAGAIAGFIE，其中 X，a近似3個(gè)氨基酸長(zhǎng)；在一些實(shí)施例中，X^為G(L/I)F。 在一些實(shí)施例中，且尤其在H3多肽中，HA序列元件2具有以下結(jié)構(gòu) PXKXTRX1AGAIAGFIE，其中 X^近似3個(gè)氨基酸長(zhǎng)；在一些實(shí)施例中，XtA為G(L/I)F。 在一些實(shí)施例中，且尤其在H5多肽中，HA序列元件2具有以下結(jié)構(gòu) PQRXXXRXXRX,aGAIAGFIE，其中 X!a近似3個(gè)氨基酸長(zhǎng)；在一些實(shí)施例中，X!a為G(L/I)F。 定義
7黃//7力如所屬領(lǐng)域中已知，"親和力"為特定配體(例如，HA多肽)與其搭配物 (例如，HA受體)結(jié)合的緊密度的量度。親和力可以不同方式測(cè)量。
生笏活絲如本文所使用，短語(yǔ)"生物活性"是指在生物系統(tǒng)且尤其在生物體中具 有活性的任何試劑的特征。舉例來(lái)說(shuō)，認(rèn)為當(dāng)投與生物體時(shí)，對(duì)所述生物體具有生物作 用的試劑具有生物活性。在特定實(shí)施例中，如果蛋白或多肽具有生物活性，那么共有所 述蛋白或多肽的至少一種生物活性的蛋白或多肽的一部分通常稱為"生物活性"部分。
廣譜乂類茲^ ^W/^Z/5/M多嚴(yán)，如本文所使用，短語(yǔ)"廣譜人類結(jié)合H5HA" 是指結(jié)合人類上皮組織中所見(jiàn)的HA受體且尤其結(jié)合具有a2-6唾液酸化聚糖的人類HA 受體的H5 HA多肽的型式。此外，本發(fā)明的BSHBH5HA結(jié)合多種不同的ct2-6唾液酸 化聚糖。在一些實(shí)施例中，BSHB H5 HA結(jié)合大量人類樣本中所見(jiàn)的不同a2-6唾液酸化 聚糖，含有其的病毒具有感染人群且尤其結(jié)合所述群體中上呼吸道受體的顯著能力。在 一些實(shí)施例中，BSHBH5HA結(jié)合如本文所述的傘形聚糖(例如，長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸化聚糖)。
獰ff^Ti^如本文所使用，短語(yǔ)蛋白或多肽的"特征部分"為含有連續(xù)氨基酸片段 或者一起為蛋白或多肽的特征的大量連續(xù)氨基酸片段的部分。各所述連續(xù)片段通常將含 有至少兩個(gè)氨基酸。此外，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，蛋白的特征通常需要至少5、 10、 15、 20或更多個(gè)氮基酸。 一般來(lái)說(shuō)，特征部分為除上文所指定的序列一致性外與相關(guān)完 整蛋白共有至少一個(gè)功能特征的部分。
獰趙—^^力"特征序列"為見(jiàn)于多肽或核酸家族所有成員中的序列，且因此所屬領(lǐng) 域技術(shù)人員可將其用于定義所述家族的成員。
^"艱/f辦短語(yǔ)"錐形拓?fù)?在本文中用于指某些聚糖且尤其HA受體上的聚糖所 采用的三維排列。如圖6中所說(shuō)明，a2-3唾液酸化聚糖或(x2-6唾液酸化聚糖都可采用 錐形拓?fù)洌移錇槎坦押塑账徭溗赜?，但一些長(zhǎng)鏈寡核苷酸也可以采用此構(gòu)象。錐形 拓?fù)涫怯蒒eu5Aca2-3Gal鍵聯(lián)的糖苷扭轉(zhuǎn)角來(lái)表征，其抽取由約-60、 60或180的$ (Cl-C2-0-C3/C6)值以及-60到60的V (C2-0-C3/C6-H3/C5)樣本所指定的具有最小能 量構(gòu)象的三個(gè)區(qū)域(圖14)。圖8呈現(xiàn)采用錐形拓?fù)涞木厶堑哪承┐硇?但不詳盡) 實(shí)例。
^//i f,如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"對(duì)應(yīng)于"通常用于表示HA多肽中氨基酸殘基的位 置/一致性。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，出于簡(jiǎn)化的目的，本文中利用標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)系統(tǒng)(基 于野生型H3HA)(如在例如圖1-5中所說(shuō)明)，因此，例如"對(duì)應(yīng)于"l卯位殘基的氨 基酸實(shí)際上無(wú)需為特定氨基酸鏈中的第190個(gè)氨基酸，而是對(duì)應(yīng)于在野生型H3 HA中 190位所見(jiàn)的殘基；所屬領(lǐng)域技術(shù)人員易于了解如何鑒別對(duì)應(yīng)氨基酸。
^;^游力SCff度，如本文所使用，作為"去除的分離程度"的氨基酸為對(duì)聚糖結(jié)合 具有間接影響的HA氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，去除的l度分離氨基酸可(1)與直接結(jié)合氨 基酸相互作用；和/或(2)以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與宿主細(xì)胞HA受體所締合 的聚糖相互作用的能力；所述去除的l度分離氨基酸可或可不直接結(jié)合聚糖本身。去除 的2度分離氨基酸(1)與去除的1度分離氨基酸相互作用；和/或(2)以其它方式影響 去除的l度分離氨基酸與直接結(jié)合氨基酸相互作用的能力等。
羞麥-智^氯基發(fā)..如本文所使用，短語(yǔ)"直接結(jié)合氨基酸"是指與一個(gè)或一個(gè)以上 與宿主細(xì)胞HA受體締合的聚糖直接相互作用的HA多肽氨基酸。
經(jīng)—I薦眾如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"經(jīng)工程化"描述一種氨基酸序列已由人類選擇的 多肽。舉例來(lái)說(shuō)，經(jīng)工程化的HA多肽具有不同于天然流感分離株中所見(jiàn)的HA多肽的 氨基酸序列的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，經(jīng)工程化的HA多肽具有不同于NCBI數(shù)
14據(jù)庫(kù)中所包括的HA多肽的氨基酸序列的氨基酸序列。
//7多嚴(yán)，當(dāng)將"HI多肽"用于本文中時(shí)，所述術(shù)語(yǔ)為氨基酸序列包括至少一個(gè)作 為HI的特征且使HI與其它HA亞型相區(qū)別的序列元件的HA多肽。代表性所述序列元 件可通過(guò)比對(duì)諸如圖1-3中所說(shuō)明的序列來(lái)確定，且其包括例如本文中關(guān)于HA序列元 件的HI特異性實(shí)施例所述的序列。
當(dāng)將"H3多肽"用于本文中時(shí)，所述術(shù)語(yǔ)為氨基酸序列包括至少一個(gè)作 為H3的特征且使H3與其它HA亞型相區(qū)別的序列元件的HA多肽。代表性所述序列元 件可通過(guò)比對(duì)諸如圖1、 2和4中所述的序列來(lái)確定，且其包括例如本文中關(guān)于HA序 列元件的H3特異性實(shí)施例所述的序列。
//5^#,當(dāng)將"H5多肽"用于本文中時(shí)，所述術(shù)語(yǔ)為氨基酸序列包括至少一個(gè)作 為H5的特征且使H5與其它HA亞型相區(qū)別的序列元件的HA多肽。代表性所述序列元 件可通過(guò)比對(duì)諸如圖1、 2和5中所述的序列確定，且其包括例如本文中關(guān)于HA序列 元件的H5特異性實(shí)施例所述的序列。
i承凝桌,多嚴(yán)；如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"血球凝集素多肽"(或"HA多肽") 是指氨基酸序列包括至少一個(gè)HA特征序列的多肽。所屬領(lǐng)域中已知多種來(lái)自流感分離 株的HA序列；事實(shí)上，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)保留到本申請(qǐng)案申請(qǐng)時(shí)為止包括9796個(gè)HA序列的數(shù)據(jù)庫(kù) (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/flu.html)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員參考此數(shù)據(jù)庫(kù)可易于 鑒別通常為HA多肽和/或特定HA多肽(例如，Hl、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 Hll、 H12、 H13、 H14、 H15或H16多肽)或介導(dǎo)例如禽類、駱駝、犬、貓、 香貓、環(huán)境、馬、人類、豹、貂、小鼠、海豹、石燕(stone martin)、豬、虎、鯨等特 定宿主感染的HA的特征的序列。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，HA多肽包括一個(gè)或一 個(gè)以上見(jiàn)于天然流感病毒分離株中所見(jiàn)的HA蛋白的約殘基97與185、 324與340、 96 與100和/或130-230之間的特征序列元件。在一些實(shí)施例中，HA多肽具有包含如本文 中所定義的HA序列元件1和2中至少一個(gè)的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，HA多肽 具有包含HA序列元件1和2的氨基酸序列，在一些實(shí)施例中，所述元件彼此分隔約 100-200,或約125-175，或約125-160，或約125-150，或約129-139,或約129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、 138或139個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，HA多 肽具有包括區(qū)域96-100和/或130-230內(nèi)參與聚糖結(jié)合的各位置處的殘基的氨基酸序列。 舉例來(lái)說(shuō)，許多HA多肽包括一個(gè)或一個(gè)以上以下殘基Tyr98、 Ser/Thrl36、 Trpl53、 Hisl83和Leu/Ile194。在一些實(shí)施例中，HA多肽包括至少2、 3、 4或全部5個(gè)所述殘基。
經(jīng)分,；如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"經(jīng)分離"是指試劑或?qū)嶓w(i)己從至少一些當(dāng)最初 產(chǎn)生(在自然界或?qū)嶒?yàn)環(huán)境中)時(shí)其所締合的組分分離；或(ii)由人工產(chǎn)生。經(jīng)分離 試劑或?qū)嶓w可與至少約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或90% 以上其最初所締合的其它組分分離。在一些實(shí)施例中，經(jīng)分離試劑為超過(guò)90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%純。
長(zhǎng)錢(qián)—^#,出于本揭示案的目的，如果寡糖包括至少一個(gè)具有至少4個(gè)糖殘基的直 鏈，那么通常將其視為"長(zhǎng)"的。
求天然氯著^:短語(yǔ)"非天然氨基酸"是指具有氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)(即，
o
II
H2N-CH—C-OH
R )且因此能夠參與至少兩個(gè)肽鍵但R基團(tuán)不同于自然界中所見(jiàn)的基
團(tuán)的實(shí)體。在一些實(shí)施例中，非天然氨基酸也可以具有非氫的另一 R基團(tuán)，和/或可在 氨基或羧酸部分上具有一個(gè)或一個(gè)以上其它取代。
一般說(shuō)來(lái)，"多肽"為具有至少兩個(gè)彼此通過(guò)肽鍵連接的氨基酸的鏈。在一 些實(shí)施例中，多肽可包括至少3-5個(gè)氨基酸，其各自借助于至少一個(gè)肽鍵與其它氨基酸 連接。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，多肽有時(shí)包括"非天然"氨基酸或仍能夠任選整合入 多肽鏈中的其它實(shí)體。
/發(fā)，如本文所使用，如果試劑或?qū)嶓w實(shí)質(zhì)上無(wú)其它組分，那么其為"純"的。舉例 來(lái)說(shuō)，通常將含有超過(guò)約90%特定試劑或?qū)嶓w的制劑視為純制劑。在一些實(shí)施例中，試 劑或?qū)嶓w為至少91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%<或99%純。
出于本揭示案的目的，如果寡糖在任何直鏈中具有不到4個(gè)或當(dāng)然不到 3個(gè)殘基，那么通常將其視為"短"的。
錄岸絲如所屬領(lǐng)域中已知，"特異性"為特定配體(例如，HA多肽)區(qū)別其結(jié)合 搭配物(例如人類HA受體，且尤其是人類上呼吸道HA受體)與其它潛在結(jié)合搭配物 (例如，禽類HA受體)的能力的量度。
翁^f/f.如本文所使用，短語(yǔ)"治療劑"是指引起所需生物或藥理作用的任何試劑。
滑#,如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"治療"是指用于減輕疾病、病癥或病狀的一種或一種 以上癥狀或方面、延緩其發(fā)作、降低其嚴(yán)重程度或發(fā)病率或引起其預(yù)防的任何方法。出 于本發(fā)明的目的，治療可在癥狀發(fā)作之前、期間和/或之后投與。
短語(yǔ)"傘形拓?fù)?在本文中用于指某些聚糖且尤其HA受體上的聚糖所采用的三維排列。本發(fā)明涵蓋關(guān)于結(jié)合傘形拓?fù)渚厶菫榻閷?dǎo)人類宿主感染的HA蛋白的 特征的認(rèn)知。如圖6中所說(shuō)明，通常僅a2-6唾液酸化聚糖采用傘形拓?fù)?，且傘形拓?fù)錇?長(zhǎng)鏈(例如大于四糖)寡糖所特有。傘形拓?fù)涞膶?shí)例是由為約-60的Neu5Aca2-6Gal鍵 聯(lián)的O角提供(參看例如圖14)。圖9呈現(xiàn)采用傘形拓?fù)涞木厶堑哪承┐硇?但不詳 盡)實(shí)例。
度滯麥辨，如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"疫苗接種"是指投與預(yù)期會(huì)例如對(duì)致病因子產(chǎn)生 免疫反應(yīng)的組合物。出于本發(fā)明的目的，疫苗接種可在暴露于致病因子之前、期間和/ 或之后投與，且在某些實(shí)施例中，疫苗接種可在暴露于所述因子之前、期間和/或之后不 久投與。在一些實(shí)施例中，疫苗接種包括間隔適當(dāng)時(shí)間的疫苗接種組合物的多次投與。
,沐，如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"變體"為描述所關(guān)注的特定HA多肽與進(jìn)行序列比較 的"母體"HA多肽之間的關(guān)系的相關(guān)術(shù)語(yǔ)。如果所關(guān)注的HA多肽具有與母體HA多 肽一致但在特定位置具有少量序列變化的氨基酸序列，那么將所關(guān)注的HA多肽視為母 體HA多肽的"變體"。通常，當(dāng)與母體相比較時(shí)，所述變體中不到20%、 15%、 10%、: 9%、 8%、 7%、 6%、 5%、 4%、 3%、 2%的殘基經(jīng)取代。在一些實(shí)施例中，當(dāng)與母體相 比較時(shí)，變體具有10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2或1個(gè)經(jīng)取代殘基。通常，變體具有 極少量(例如，不到5、 4、 3、 2或1個(gè))經(jīng)取代功能性殘基(即，參與特定生物活性 的殘基)。此外，當(dāng)與母體相比較時(shí)，變體通常具有不超過(guò)5、 4、 3、 2或1個(gè)添加或缺 失，且通常不具有添加或缺失。另外，任何添加或缺失通常不到約25、 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 10、 9、 8、 7、 6個(gè)殘基，且通常不到約5、 4、 3或2個(gè)殘基。在一些 實(shí)施例中，母體HA多肽為見(jiàn)于天然流感病毒分離株中的多肽(例如，野生型HA)。
載沐，如本文所使用，"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)已與其連接的另一核酸的核酸分子。 在一些實(shí)施例中，載體能夠在諸如真核細(xì)胞或原核細(xì)胞等宿主細(xì)胞中染色體外復(fù)制和/ 或表達(dá)與其連接的核酸。能夠引導(dǎo)可操作性連接的基因的表達(dá)的載體在本文中稱為"表 達(dá)載體"。
^F主星y,如所屬領(lǐng)域中所了解，短語(yǔ)"野生型" 一般是指如在自然界中所見(jiàn)的蛋白 或核酸的標(biāo)準(zhǔn)形式。舉例來(lái)說(shuō)，野生型HA多肽見(jiàn)于天然流感病毒的分離株中。多種不 同的野生型 HA 序列可見(jiàn)于 NCBI 流感病毒序列數(shù)據(jù)庫(kù) http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html中。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供結(jié)合傘形拓?fù)渚厶堑腍A多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供結(jié)合特定標(biāo)靶物種的HA受體上所見(jiàn)的傘形拓?fù)渚厶堑腍A多肽。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中， 本發(fā)明提供結(jié)合人類HA受體(例如，人類上皮細(xì)胞上所見(jiàn)的HA受體)上所見(jiàn)的傘形 拓?fù)渚厶堑腍A多肽，且尤其提供結(jié)合上呼吸道內(nèi)的人類HA受體上所見(jiàn)的傘形拓?fù)渚?糖的HA多肽。
本發(fā)明提供結(jié)合人類上呼吸道細(xì)胞上所見(jiàn)的HA受體的HA多肽，且尤其提供以經(jīng) 指示的親和力和/或特異性結(jié)合所述受體(和/或其聚糖，尤其其傘形聚糖)的HA多肽。
本發(fā)明涵蓋以下認(rèn)知獲得結(jié)合傘形拓?fù)渚厶?例如長(zhǎng)鏈(x2-6唾液酸化聚糖)的能 力和尤其以高親和力結(jié)合的能力可賦予HA多肽變體感染人類的能力(其中其親本HA 多肽則不能)。不希望受任何特定理論約束，本發(fā)明者提出結(jié)合傘形拓?fù)渚厶强蔀闃O為 重要的且尤其提出可不要求與其它聚糖類型結(jié)合的損失。
本發(fā)明進(jìn)一步提供與本發(fā)明的HA多肽相關(guān)的各種試劑和方法，包括例如用于鑒別 其的系統(tǒng)、用于制備其的策略、結(jié)合其的抗體和各種與其相關(guān)的診斷和治療方法。下文 提供本發(fā)明的這些和其它方面的某些實(shí)施例的進(jìn)一步描述。
血球凝集素(HA)
流感病毒為核糖核酸病毒，其表征在于脂膜包膜含有經(jīng)嵌埋入特定病毒的膜內(nèi)的兩 個(gè)糖蛋白、血球凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。存在16種已知HA亞型和9種NA 亞型，且不同流感菌株是基于菌株HA和NA亞型的數(shù)目來(lái)命名?；诎被嵝蛄幸恢?性和晶體結(jié)構(gòu)的比較，已將HA亞型分成兩個(gè)主要的組和四個(gè)較小的種系分枝。不同HA 亞型不必共有強(qiáng)烈氨基酸序列一致性，但不同HA亞型的總體三維結(jié)構(gòu)彼此相似，具有 數(shù)種可用于分類目的的細(xì)微差異。舉例來(lái)說(shuō)，膜遠(yuǎn)端子域相對(duì)于中心a-螺旋的特定取向: 為一種通常用以測(cè)定HA亞型的結(jié)構(gòu)特征(拉塞爾(Russell)等人，病毒學(xué)(Virology), 325:287,2004)。
HA以稱為H1-H16的16種亞型中的一種的同源三聚體形式存在于膜中。迄今為止， 這些亞型中僅三種(hi、 h2和h3)已適應(yīng)于人類感染。ha的已適應(yīng)于感染人類的一 種經(jīng)報(bào)道特征(例如來(lái)自流行性H1N1 (1918)禾B H3N2 ( 1967-68)流感亞型的HA的 特征)為與優(yōu)選地結(jié)合a2-3唾液酸化聚糖的禽類祖細(xì)胞相比較，其優(yōu)選地結(jié)合cx2-6唾 液酸化聚糖的能力(斯科爾和懷利(Skehel & Wiley),生物化學(xué)年度評(píng)論(Annu Rev Biochem)， 69:531,2000;羅格和波爾遜(Rogers & Paulson),病毒學(xué)，127:361,1983; 羅格等人，自然(Nature), 304:76,1983;蘇特(Sauter)等人，生物化學(xué)(Biochemistry), 31:9609,1992;康諾(Connor)等人，病毒學(xué)，205:17,1994;吐穆佩(Tumpey)等人， 科學(xué)(Science), 310:77， 2005)。然而，本發(fā)明涵蓋以下認(rèn)知感染人類宿主的能力與
18結(jié)合特定鍵聯(lián)的聚糖的相關(guān)性較小，且與結(jié)合特定拓?fù)涞木厶堑南嚓P(guān)性較大。因此，本 發(fā)明證實(shí)介導(dǎo)人類感染的HA結(jié)合傘形拓?fù)渚厶牵璐送ǔＵ故緜阈瓮負(fù)渚厶莾?yōu)先于錐 形拓?fù)渚厶堑膬?yōu)選性(即使錐形拓?fù)渚厶强蔀?x2-6唾液酸化聚糖)。
可利用來(lái)自HI (人類和豬)、H3 (禽類)和H5 (禽類)亞型的HA的結(jié)合(a2-3 與a2-6鍵聯(lián)的)唾液酸化寡糖的數(shù)種晶體結(jié)構(gòu)，且其提供對(duì)HA與此等聚糖的不同相互 作用所涉及的特異性氨基酸的分子洞察(艾森(Eisen)等人，病毒學(xué)，232:19， 1997; 哈(Ha)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(ProcNatl AcadSciUSA)， 98:11181,2001;哈等 人，病毒學(xué)，309:209, 2003;蓋博林(Gamblin)等人，科學(xué)，303:1838, 2004;史蒂文 斯(Stevens)等人，科學(xué)，303:1866,2004;拉塞爾等人，糖連接物雜志(Glycoconj J)， 23:85,2006;史蒂文斯等人，科學(xué)，312:404,2006)。
舉例來(lái)說(shuō)，單獨(dú)或結(jié)合a2-3或(x2-6唾液酸化寡糖的H5 (A/鴨/新加坡/3/97)的晶 體結(jié)構(gòu)鑒別直接與所結(jié)合聚糖相互作用的某些氨基酸，以及去除的一度或一度以上分離 氨基酸(史蒂文斯等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，98:11181,2001)。在一些情況下，所述 殘基的構(gòu)象在結(jié)合對(duì)未結(jié)合狀態(tài)方面有所不同。舉例來(lái)說(shuō)，Glul90、 Lysl93和Gln226 全部都參與直接結(jié)合相互作用且在結(jié)合對(duì)未結(jié)合狀態(tài)中具有不同構(gòu)象。接近Glul90的 Asnl86的構(gòu)象在結(jié)合對(duì)未結(jié)合狀態(tài)方面也顯著不同。
本發(fā)欲游ft4游潛^殍f
如上所述，本發(fā)明涵蓋以下發(fā)現(xiàn)結(jié)合傘形拓?fù)渚厶桥c介導(dǎo)特定宿主(包括例如人 類)的感染的能力有關(guān)。因此，本發(fā)明提供結(jié)合傘形聚糖的HA多肽。在某些實(shí)施例中， 本發(fā)明的HA多肽以高親和力結(jié)合傘形聚糖。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽通常 以高親和力和/或特異性結(jié)合多種不同的傘形拓?fù)渚厶恰?br> 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽以高親和力結(jié)合傘形拓?fù)渚厶?例如長(zhǎng)鏈a2-6 唾液酸化聚糖，諸如Neu5Aca2-6Gal卩l(xiāng)-4GlcNAc(31-3Galpl-4GlcNAc-)。舉例來(lái)說(shuō)，在一 些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽以與關(guān)于介導(dǎo)人類感染的野生型HA (例如H1N1 HA或 H3N2HA)所觀察到的親和力相當(dāng)?shù)挠H和力結(jié)合傘形拓?fù)渚厶?。在一些?shí)施例中，本發(fā) 明的HA多肽以至少為以下值的親和力結(jié)合傘形聚糖在與介導(dǎo)人類感染的野生型HA 相當(dāng)?shù)臈l件下所觀察到的值的25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 ％%、 97%、 98%、 99%或100%。在一些實(shí)施例; 中，本發(fā)明的HA多肽以大于在與介導(dǎo)人類感染的野生型HA相當(dāng)?shù)臈l件下所觀察到的 值的親和力結(jié)合傘形聚糖。
在某些實(shí)施例中，在某一濃度范圍內(nèi)評(píng)估本發(fā)明的HA多肽的結(jié)合親和力。這種策
19略尤其在多價(jià)結(jié)合檢定中提供比單一濃度分析顯著更多的信息。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施 例中，在高出至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10倍或10倍以上的濃度范圍內(nèi)評(píng)估本發(fā) 明的HA多肽的結(jié)合親和力。
在某些實(shí)施例中，如果本發(fā)明的HA多肽在諸如本文所述的多價(jià)聚糖陣列結(jié)合檢定 中展示飽和信號(hào)，那么其展示高親和力。在一些實(shí)施例中，如果本發(fā)明的HA多肽在所 述研究中展示高于約400000或更高(例如高于約500000、 600000、 700000、 800000等) 的信號(hào)，那么其展示高親和力。在一些實(shí)施例中，HA多肽展示在至少2倍、3倍、4倍、 5倍或5倍以上的濃度范圍內(nèi)，且在某些實(shí)施例中在達(dá)IO倍或IO倍以上的濃度范圍內(nèi) 飽和結(jié)合傘形聚糖。
此外，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽比其結(jié)合錐形拓?fù)渚厶歉鼜?qiáng)烈地結(jié)合傘 形拓?fù)渚厶?。在某些?shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽對(duì)于傘形聚糖對(duì)錐形聚糖展示為約10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3或2的相對(duì)親和力。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽結(jié)合a2-6唾液酸化聚糖；在一些實(shí)施例中，本 發(fā)明的HA多肽優(yōu)選地結(jié)合a2-6唾液酸化聚糖。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽結(jié) 合多種不同的a2-6唾液酸化聚糖。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽不能結(jié)合a2-3 唾液酸化聚糖，且在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽能夠結(jié)合a2-3唾液酸化聚糖。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽結(jié)合人類上呼吸道上皮細(xì)胞上所見(jiàn)的受體。在 某些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽結(jié)合支氣管和/或氣管中的HA受體。在一些實(shí)施例中，: 本發(fā)明的HA多肽不能結(jié)合深肺中的受體，且在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽能夠 結(jié)合深肺中的受體。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽結(jié)合至少約10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或95%以上 的在人類上呼吸道組織(例如上皮細(xì)胞)內(nèi)的HA受體上所見(jiàn)的聚糖。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽結(jié)合圖9中所說(shuō)明的一種或一種以上聚糖。在 一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽結(jié)合圖9中所說(shuō)明的多種聚糖。在一些實(shí)施例中，本 發(fā)明的HA多肽以高親和力和/或特異性結(jié)合圖9中所說(shuō)明的聚糖。在一些實(shí)施例中，與 結(jié)合圖8中所說(shuō)明的聚糖相比較，本發(fā)明的HA多肽優(yōu)選地結(jié)合圖9中所說(shuō)明的聚糖。
本發(fā)明提供經(jīng)分離的具有指定結(jié)合特異性的HA多肽，以及提供關(guān)于傘形聚糖具有 指定結(jié)合特征的經(jīng)工程化HA多肽。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為Hl多肽。在一些實(shí)施 例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為H2多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為H3多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特 征的HA多肽為H4多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為 H5多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為H6多肽。在一些 實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為H7多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā) 明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為H8多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié) 合特征的HA多肽為H9多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多 肽為H10多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為Hll多肽。 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為H12多肽。在一些實(shí)施例中， 本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為H13多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指 定結(jié)合特征的HA多肽為H14多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的 HA多肽為H15多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽為H16 多肽。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的具有指定結(jié)合特征的HA多肽不為Hl多肽、不為H2 多肽且/或不為H3多肽。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽并不包括來(lái)自以下任一菌株的Hl蛋白A/南 卡羅來(lái)納/l/1918; A/波多黎各/8/1934; A/臺(tái)灣(Taiwan) /1/1986; A/得克薩斯/36/1991; A/北京(Beijing) /262/1995; A/約翰內(nèi)斯堡(Johannesburg) /92/1996; A/新喀里多尼亞 (New Caledonia) /20/1999; A/所羅門(mén)群島(Solomon Islands) /3/2006。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽不為來(lái)自1957-58的亞洲型流感傳染病的任一 菌株的H2蛋白。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽并不包括來(lái)自以下任一菌株的H2 蛋白A/日本(Japan) /305+/1957: A/新加坡/l/1957; A/臺(tái)灣/l/1964; A/臺(tái)灣/1/1967。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽并不包括來(lái)自以下任一菌株的H3蛋白A/愛(ài) 知/2/1968; A/菲律賓(P函pines) /2/1982; A/密西西比(Mississippi) /1/1985; A/列寧 格勒(Leningrad) /360/1986; A/四川(Sichuan) /2/1987; A/上海(Shanghai) /11/1987; A/北京/353/1989; A/山東(Shandong)/9/1993; A/約翰內(nèi)斯堡/33/1994; A/南昌(Nanchang) /813/1995; A/悉尼(Sydney)/5/1997; A/莫斯科/10/1999; A/巴拿馬(Panama)/2007/1999; A/懷俄明(Wyoming) /3/2003; A/俄克拉荷馬(Oklahoma) /323/2003; A/加利福尼亞 (California) /7/2004; A/威斯康星(Wisconsin) /65/2005。
/M多嚴(yán)
在某些實(shí)施例中，HA多肽為母體HA多肽的變體，由于除少量特定序列變化之外， 其氨基酸序列與母體HA的氨基酸序列一致。在一些實(shí)施例中，母體HA為流感病毒的例如野生型HA多肽)。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽變體具有與其對(duì)應(yīng)的母體HA多肽不同的聚糖 結(jié)合特征。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA變體多肽對(duì)于傘形聚糖(例如與錐形聚糖相 比較)具有比其同源母體HA多肽大的親和力和/或特異性。在某些實(shí)施例中，所述HA 多肽變體為工程化變體。
在一些實(shí)施例中，具有經(jīng)改變的聚糖結(jié)合特征的HA多肽變體在殘基中具有序列交 替或具有影響聚糖結(jié)合位點(diǎn)的序列交替。在一些實(shí)施例中，這些取代為直接與所結(jié)合的 聚糖相互作用的氨基酸；在其它實(shí)施例中，這些取代為從與所結(jié)合的聚糖相互作用的氨 基酸去除的1度分離的氨基酸，這是由于去除的1度分離氨基酸(1)與直接結(jié)合氨基 酸相互作用；(2)以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，但不與聚糖 本身直接相互作用；或(3)以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力， 且同時(shí)與聚糖本身直接相互作用。本發(fā)明的HA多肽變體含有一種或一種以上直接結(jié)合 氨基酸、 一種或一種以上第一程度分離氨基酸、 一種或-種以上第二程度分離氨基酸或 所述情況的任何組合的取代。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽變體可含有具有甚至 更高分離程度的一種或一種以上氨基酸的取代。
在一些實(shí)施例中，具有改變的聚糖結(jié)合特征的HA多肽變體在接觸除Neu5Ac和Gal 以外的糖的殘基中具有序列變化(參見(jiàn)，例如圖7)。
在一些實(shí)施例中，與野生型母體HA相比較，HA多肽變體具有至少一種氨基酸取 代。在某些實(shí)施例中，與同源野生型母體HA相比較，本發(fā)明的HA多肽變體具有至少 兩種、三種、四種、五種或五種以上氨基酸取代；在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽 變體具有兩種、三種或四種氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，所有這些氨基酸取代都位于 聚糖結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)。
在一些實(shí)施例中，HA多肽變體在對(duì)應(yīng)于殘基137、 145、 156、 159、 186、 187、 189、 190、 192、 193、 196、 222、 225、 226和228中的一者或一者以上的位置處具有序列取 代。在一些實(shí)施例中，HA多肽變體在對(duì)應(yīng)于殘基156、 159、 189、 192、 193和196中 的一者或一者以上的位置處具有序列取代；和/或在對(duì)應(yīng)于殘基186、 187、 189和190 中的一者或一者以上的位置處具有序列取代；和/或在對(duì)應(yīng)于殘基190、 222、 225和226 中的一者或一者以上的位置處具有序列取代；和/或在對(duì)應(yīng)于殘基137、 145、 190、 226 和228中的一者或一者以上的位置處具有序列取代。在一些實(shí)施例中，HA多肽變體在 對(duì)應(yīng)于殘基190、 225、 226和228中的一者或一者以上的位置處具有序列取代。
在某些實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA (例如H5)在選自由以下殘基組成的群組的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代殘基98、 136、 138、 153、 155、 159、 183、 186、 187、 190、 193、 194、 195、 222、 225、 226、 227和228。在其它實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA 在選自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域中的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基 酸取代，所述殘基包括(但不限于)殘基98、 136、 153、 155、 183、 190、 193、 194、 222、 225、 226、 227和228。在其它實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于 野生型母體HA在選自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域的臨近處的氨基酸的殘基處具有 --種或一種以上氨基酸取代，所述殘基包括(但不限于)殘基98、 138、 186、 187、 195 和228。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA 在選自由以下殘基組成的群組的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代殘基138、 186、 187、 190、 193、 222、 225、 226、 227和228。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽變 體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在選自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域中 的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代，所述殘基包括(但不限于)殘基190、 193、 222、 225、 226、 227和228。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽變體和尤其H5 多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在選自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域的臨近處的氨基 酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代，所述殘基包括(但不限于)殘基138、 186、 187和228。
在其它實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在選自由' 以下殘基組成的群組的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代殘基98、 136、 153、 155、 183、 194和195。在其它實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體 HA在選自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域中的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨 基酸取代，所述殘基包括(但不限于)殘基98、 136、 153、 155、 183和194。在其它實(shí) 施例中，本發(fā)明的HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在選自位于 直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域的臨近處的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取 代，所述殘基包括(但不限于)殘基98和195。
在某些實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在選自從 與所結(jié)合的聚糖相互作用的氨基酸去除的1度分離的氨基酸的殘基處具有一種或一種以 上氨基酸取代，這是由于去除的l度分離氨基酸(1)與直接結(jié)合氨基酸相互作用；(2) 以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，但不與聚糖本身直接相互作 用；或(3)以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，且同時(shí)與聚糖本
23身直接相互作用，所述殘基包括(但不限于)殘基98、 138、 186、 187、 195和228。
在其它實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在選自從 與所結(jié)合的聚糖相互作用的氨基酸去除的1度分離的氨基酸的殘基處具有一種或一種以 上氨基酸取代，這是由于去除的l度分離氨基酸(1)與直接結(jié)合氨基酸相互作用；(2) 以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，但不與聚糖本身直接相互作 用；或(3)以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，且同時(shí)與聚糖本 身直接相互作用，所述殘基包括(但不限于)殘基138、 186、 187和228。
在其它實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在選自從 與所結(jié)合的聚糖相互作用的氨基酸去除的1度分離的氨基酸的殘基處具有一種或一種以 上氨基酸取代，這是由于去除的l度分離氨基酸(1)與直接結(jié)合氨基酸相互作用；(2) 以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，但不與聚糖本身直接相互作 用；或(3)以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，且同時(shí)與聚糖本 身直接相互作用，所述殘基包括(但不限于)殘基98和195。
在某些實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在殘基 159處具有氨基酸取代。
在其它實(shí)施例中，HA多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在選自: 190、 193、 225和226的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，HA 多肽變體和尤其H5多肽變體相對(duì)于野生型母體HA在選自190、 193、 226和228的殘 基處具有一種或一種以上氨基酸取代。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽變體和尤其H5變體具有以下氨基酸取代中的 一者或一者以上Serl37Ala、Lysl56Glu、 Asnl86Pro、 Aspl87Ser、 Aspl87Thr、 Alal89Gln、 Alal89Lys、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Glul90Thr、 Lysl93Arg、 Lysl93Asn、 Lysl93His、 Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Gln226Ile、 Gln226Leu、 Gln226Val、 Ser227Ala、 Gly228Ser。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽變體和尤其H5變體具有以下氨基酸取代組中 的一者或一者以上
Glul卯Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp和Gln226Leu;
Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gln226Leu和Gly228Ser;
Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser;
Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser;
Aspl87Ser/Thr、 Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser;
Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser;
24Aspl87Ser/Thr、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Lysl93His、 Gln226Leu/Ile/Val、 Gly228Ser; Lysl93Arg、 Gln226Leu/Ile/Val、 Gly228Ser; Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Serl37Ala、 Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Glul90Thr、 Lysl93Ser、 Gly225Asp;
Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp; Asnl86Pro、 Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp; Asnl86Pro、 Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Ser227Ala。
在某些所述實(shí)施例中，與野生型HA相比較，HA多肽具有至少一種其它取代，使得變 體對(duì)傘形聚糖的親和力和/或特異性增加。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽(包括HA多肽變體)具有包括D190、 D225、 L226禾Q/或S228的序列。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽具有包括D190和D225 的序列；在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽具有包括L226和S228的序列。
在一些實(shí)施例中，與母體HA且尤其與母體野生型HA相比較，本發(fā)明的HA多肽 變體具有開(kāi)放結(jié)合位點(diǎn)。
ft4多it游教分或/f皮
本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明的HA多肽的特征部分和其編碼核酸。通常，特征部分為 含有連續(xù)氨基酸片段或者一起為HA多肽的特征的大量連續(xù)氨基酸片段的部分。各所述 連續(xù)片段通常將含有至少兩個(gè)氨基酸。此外，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，H5HA多肽的 特征通常需要至少5、 10、 15、 20或更多個(gè)氨基酸。 一般來(lái)說(shuō)，特征部分為除上文所指 定的序列一致性外還與相關(guān)完整H5多肽共有至少一個(gè)功能特征的部分。在一些實(shí)施例 中，本發(fā)明的HA多肽的特征部分與相關(guān)全長(zhǎng)HA多肽共有聚糖結(jié)合特征。
產(chǎn)主/M多嚴(yán)
可通過(guò)任何可用方式產(chǎn)生本發(fā)明的HA多肽和/或其特征部分或其編碼核酸。 舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)使用經(jīng)工程化以表達(dá)本發(fā)明的HA多肽編碼核酸的宿主細(xì)胞系統(tǒng)
產(chǎn)生本發(fā)明的HA多肽(或特征部分)。
可使用任何系統(tǒng)產(chǎn)生HA多肽(或特征部分)，所述系統(tǒng)諸如卵、桿狀病毒、植物、
酵母、馬-達(dá)二氏犬腎臟(Madin Darby Canine Kidney， MDCK)細(xì)胞或Vero (非洲綠猴腎臟)細(xì)胞?；蛘呋蛄硗?，可使用重組技術(shù)，諸如通過(guò)使用表達(dá)載體將HA多肽(或特 征部分)表達(dá)在細(xì)胞中(薩布魯克(Sambrook)等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(CSHL Press), 1989)。
或者或另外，可通過(guò)合成方式產(chǎn)生本發(fā)明的HA多肽(或其特征部分)。 或者或另外，可在完整病毒環(huán)境中產(chǎn)生本發(fā)明的HA多肽(或其特征部分)，而無(wú) 論所述病毒是否另外為野生型、經(jīng)減毒、經(jīng)殺死等。也可以在病毒樣顆粒環(huán)境中產(chǎn)生本 發(fā)明的HA多肽或其特征部分。
在一些實(shí)施例中，可由流感病毒分離和/或純化HA多肽(或其特征部分)。舉例來(lái) 說(shuō)，病毒可在諸如含胚雞蛋等卵中生長(zhǎng)，在所述情況下所收集的材料通常為尿囊液。或 者或另外，可由使用組織培養(yǎng)使病毒生長(zhǎng)的任何方法獲得流感病毒。用于使病毒生長(zhǎng)的 適當(dāng)細(xì)胞底物包括例如狗腎臟細(xì)胞(諸如MDCK或來(lái)自MDCK、 MDCK樣細(xì)胞的克隆 的細(xì)胞)，猴腎臟細(xì)胞(諸如包括Vero細(xì)胞的AGMK細(xì)胞)，作為連續(xù)細(xì)胞系的經(jīng)培養(yǎng) 上皮細(xì)胞，293T細(xì)胞，BK-21細(xì)胞，CV-1細(xì)胞，或適于產(chǎn)生用于疫苗目的的流感病毒 的任何其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，其易于由商業(yè)來(lái)源獲得(例如美國(guó)馬里蘭州的羅克維爾 的美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC，Rockville，Md))。適當(dāng)細(xì)胞底物又包括人類細(xì)胞， 諸如MRC-5細(xì)胞。適當(dāng)細(xì)胞底物并不局限于細(xì)胞系；例如，也包括諸如雞胚胎纖維母 細(xì)胞等初級(jí)細(xì)胞。
同時(shí)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解可通過(guò)在允許迅速篩選和/或選擇能夠結(jié)合傘形拓?fù)?聚糖的HA多肽的條件下培養(yǎng)產(chǎn)生HA (無(wú)論單獨(dú)或作為復(fù)合物的部分，包括作為病毒 顆?；虿《镜牟糠?的細(xì)胞或生物體，來(lái)制備、鑒別、分離和/或產(chǎn)生如本文所述的HA 多肽和尤其變體HA多肽。為僅提供一個(gè)實(shí)例，在一些實(shí)施例中，在揭示和/或有利于結(jié) 合傘形拓?fù)渚厶?例如以特定特異性和/或親和力)的變體的條件下產(chǎn)生和/或研究許多 HA變體可能適用。在一些實(shí)施例中，由在自然界中進(jìn)化產(chǎn)生所述許多HA變體。在一 些實(shí)施例中，由工程化產(chǎn)生所述許多HA變體。在一些實(shí)施例中，由工程化與自然進(jìn)化 的組合產(chǎn)生所述許多HA變體。
HA受體
HA通過(guò)結(jié)合糖蛋白受體與細(xì)胞表面相互作用。
HA受體上的N-連接聚糖主要介導(dǎo)HA與HA受體的結(jié)合。具體說(shuō)來(lái)，流感病毒顆 粒表面上的HA識(shí)別與細(xì)胞宿主表面上的HA受體相締合的唾液酸化聚糖。識(shí)別和結(jié)合 后，宿主細(xì)胞吞沒(méi)病毒細(xì)胞且病毒能夠復(fù)制并產(chǎn)生更多分配到鄰近細(xì)胞的病毒顆粒。
通過(guò)受體的HA結(jié)合位點(diǎn)附近的a2-3或(x2-6唾液酸化聚糖來(lái)修飾HA受體，且受體結(jié)合的聚糖的鍵聯(lián)類型影響受體的HA結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象，因此影響受體對(duì)不同HA的 特異性。
舉例來(lái)說(shuō)，禽類HA的聚糖結(jié)合口袋變窄。根據(jù)本發(fā)明，此口袋結(jié)合cx2-3唾液酸化 聚糖的反式構(gòu)象和/或cx2-3或a2-6連接的錐形拓?fù)渚厶恰?br> 禽類組織以及人類深肺和胃腸(GI)道組織中的HA受體都由oc2-3唾液酸化聚糖鍵 聯(lián)表征，且另外(根據(jù)本發(fā)明)由包括a2-3唾液酸化和/或(x2-6唾液酸化聚糖在內(nèi)的主 要采用錐形拓?fù)涞木厶潜碚鳌?br> 相比之下，在支氣管和上呼吸道氣管中的人類HA受體是經(jīng)ot2-6唾液酸化聚糖修飾。 與a2-3基元不同，a2-6基元因C6-C5鍵而具有額外的構(gòu)象自由度(拉塞爾(Russell) 等人，糖結(jié)合物雜志(GZycocow' /) 23:85, 2006)。結(jié)合所述a2-6唾液酸化聚糖的HA 具有開(kāi)口較大的結(jié)合口袋來(lái)容納由此構(gòu)象自由所引起的結(jié)構(gòu)多樣性。此外，根據(jù)本發(fā)明， HA可能需要結(jié)合傘形拓?fù)涞木厶?例如，a2-6唾液酸化聚糖)且尤其可能需要結(jié)合具 有強(qiáng)親和力和/或特異性的所述傘形拓?fù)渚厶牵员阌行У亟閷?dǎo)人類上呼吸道組織的感 染。
歸因于這些空間受限的糖基化特征，人類通常不會(huì)感染含有許多野生型禽類HA(例 如，禽類H5)的病毒。具體說(shuō)來(lái)，由于最有可能遭遇病毒的人類呼吸道部分(即，氣 管和支氣管)缺乏具有錐形聚糖(例如，a2-3唾液酸化聚糖和/或短鏈聚糖)的受體， 且野生型禽類HA通常主要或僅結(jié)合與錐形聚糖(例如，a2-3唾液酸化聚糖和/或短鏈聚 糖)締合的受體，所以人類很少感染禽類病毒。只有在與病毒足夠緊密地接觸以致其可 進(jìn)入深肺和/或胃腸道中時(shí)，具有傘形聚糖(例如，長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸化聚糖)的受體才 使人類受到感染。
聚糖陣列
為了迅速擴(kuò)充關(guān)于已知的特異性聚糖-聚糖結(jié)合蛋白(GBP)相互作用的當(dāng)前知識(shí)， 一個(gè)國(guó)際性協(xié)作研究發(fā)起組織一功能糖原組學(xué)聯(lián)盟(Consortium for Functional Glycomics, CFG; www.functionalglvcomics.org)已開(kāi)發(fā)出聚糖陣列，其包含數(shù)種使得 能針對(duì)新穎聚糖配體特異性高通量篩選GBP的聚糖結(jié)構(gòu)。聚糖陣列包含單價(jià)與多價(jià)聚 糖基元(即，連接到聚丙烯酰胺主鏈)且各陣列包含264個(gè)具有低(10 nM)和高(100 ) 濃度和針對(duì)各濃度的 6 個(gè)點(diǎn)的聚糖(參見(jiàn) http:〃www.functionalglvcomics,org/static/consortium/resources/resourcecoreh5.shtml )。
所述陣列主要包含捕集N和O連接聚糖的生理學(xué)多樣性的合成聚糖。除合成聚糖 外，得自不同哺乳動(dòng)物糖蛋白的N連接聚糖混合物也呈現(xiàn)于所述陣列上。如本文所使用，聚糖"陣列"是指一組一種或一種以上的聚糖，其任選地固定化于 固體支撐物上。在一些實(shí)施例中，"陣列"為在空間上物理分離的兩個(gè)或兩個(gè)以上位置 處作為有組織的排列或模式而存在的許多聚糖。通常，聚糖陣列將具有至少4、 8、 16、 24、 48、 96或數(shù)百或數(shù)千個(gè)離散位置。通常，本發(fā)明的聚糖陣列可具有多種形式中的任 一種。所屬領(lǐng)域中已知可適用于生物分子的各種不同陣列形式。舉例來(lái)說(shuō)，熟知極大數(shù) 目的蛋白和/或核酸陣列。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將迅速了解適合于本發(fā)明的聚糖陣列的標(biāo)準(zhǔn) 陣列形式。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的聚糖陣列以"微陣列"形式存在。微陣列通?？删哂邢?隔50-200微米或以下的距離的樣本位置和在毫微到微莫耳濃度范圍內(nèi)或毫微到皮克范 圍內(nèi)的固定化樣本。所屬領(lǐng)域中已知的陣列形式包括例如各離散樣本位置具有例如10 微米的尺度的形式。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的聚糖陣列包含多個(gè)在空間上固定化于支撐物上的聚糖。 本發(fā)明在支撐物上提供聚糖分子陣列。如本文所使用，"支撐物"是指適合用于陣列聚 糖分子的任何材料。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可采用多種材料中的任一種。為僅提供 數(shù)個(gè)實(shí)例，可用于本發(fā)明的支撐物材料包括疏水性膜，例如硝化纖維素、PVDF或尼龍 膜。所述膜為所屬領(lǐng)域中所熟知且可獲自例如英國(guó)赫默爾亨普斯特德的伯樂(lè)公司 (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK)。
在其它實(shí)施例中，承載聚糖陣列的支撐物可包含金屬氧化物。適當(dāng)金屬氧化物包括 (但不限于)氧化鈦、氧化鉭和氧化鋁。所述材料的實(shí)例可獲自英國(guó)多賽BH12 4QH想 象路西格瑪奧德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Company Ltd, Fancy Road, Poole， Dorset-BH12 4QHUK)。在其它實(shí)施例中，所述支撐物為金屬氧化物凝膠，或包含金屬氧化物 凝膠。認(rèn)為金屬氧化物凝膠在給定的肉眼可見(jiàn)區(qū)域內(nèi)提供大的表面積以輔助含碳水化合 物的分子的固定化。
可根據(jù)本發(fā)明使用的其它或替代支撐物材料包括凝膠，例如硅膠或氧化鋁凝膠。所 述材料的實(shí)例可獲自例如德國(guó)達(dá)姆施塔特的默克集團(tuán)(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，使聚糖陣列固定化在可在正常使用期間抵抗尺寸或形狀 變化的支撐物上。舉例來(lái)說(shuō)，支撐物可為涂布有適用于陣列聚糖的組分材料的載玻片。 同時(shí)，某些復(fù)合材料可合意地向支撐物提供牢固性。
如本文所證實(shí)，本發(fā)明的陣列適用于鑒別和/或表征不同的HA多肽和其結(jié)合特征。 在某些實(shí)施例中，在所述陣列上對(duì)本發(fā)明的H5多肽加以測(cè)試，以評(píng)估其結(jié)合傘形拓?fù)渚厶?例如，a2-6唾液酸化聚糖和尤其以傘形拓?fù)渑帕械拈L(zhǎng)鏈(x2-6唾液酸化聚糖)的 能力。
事實(shí)上，本發(fā)明提供可用于表征HA多肽結(jié)合能力和/或作為例如檢測(cè)人類結(jié)合的 HA多肽的診斷物的a2-6唾液酸化聚糖和任選a2-3唾液酸化聚糖的陣列。在一些實(shí)施 例中，本發(fā)明的陣列含有呈傘形拓?fù)湫问降木厶?例如(x2-6唾液酸化聚糖和尤其長(zhǎng)鏈 cx2-6唾液酸化聚糖)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)，所述陣列適用于表征或檢測(cè)任何 HA多肽，包括例如天然流感分離株中所見(jiàn)的HA多肽以及研究人員所設(shè)計(jì)和/或制備的 HA多肽。
在一些實(shí)施例中，所述陣列包括表示人類HA受體和尤其人類上呼吸道HA受體上 所見(jiàn)的聚糖(例如，傘形聚糖，其通常將為a2-6唾液酸化聚糖，尤其長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸 化聚糖)的約腦、15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或95%以上的聚糖。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的陣 列包括圖10中所述的某些或全部聚糖結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，陣列包括至少約10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或95%以上的這些所述聚糖。
本發(fā)明提供使用聚糖陣列來(lái)鑒別或表征HA蛋白的方法。在一些實(shí)施例中，舉例說(shuō) 來(lái)，所述方法包含以下步驟(1)提供含有HA多肽的樣本；(2)使樣本與聚糖陣列接 觸；和(3)檢測(cè)HA多肽與陣列上的一種或一種以上聚糖的結(jié)合。
含有將與根據(jù)本發(fā)明的聚糖陣列接觸的HA多肽的樣本的適當(dāng)來(lái)源包括(但不限于) 病理樣本，諸如血液、血清/血漿、外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞/外周血液淋巴細(xì)胞(PBMC/PBL)、 唾液、尿、糞便、喉拭子、皮膚病變拭子、腦脊髓液、宮頸刮片、膿樣本、食物基質(zhì)和 來(lái)自身體的各種部分(諸如大腦、脾臟和肝臟)的組織?；蛘呋蛄硗猓蠬A多肽的 樣本的其它適當(dāng)來(lái)源包括(但不限于)諸如土壤、水和植物群的環(huán)境樣本。其它樣本包 括例如由研究人員設(shè)計(jì)和/或制備的工程化HA多肽的實(shí)驗(yàn)室樣本。也可以應(yīng)用尚未列舉 的其它樣本。所屬領(lǐng)域中已知適于檢定結(jié)合本發(fā)明聚糖陣列的HA多肽的多種檢測(cè)系統(tǒng)。 舉例來(lái)說(shuō)，HA多肽可以在與陣列接觸之前或之后經(jīng)可檢測(cè)性標(biāo)記(直接或間接)；然后， 可通過(guò)檢測(cè)局部化標(biāo)記來(lái)檢測(cè)結(jié)合。在一些實(shí)施例中，可使用掃描裝置來(lái)檢查陣列上的 特定位置。
或者或另外，可使用例如量熱、熒光或放射性檢測(cè)系統(tǒng)或其它標(biāo)記方法或其它并不 要求標(biāo)記的方法來(lái)測(cè)量與排列成陣列的聚糖的結(jié)合。通常，熒光檢測(cè)通常涉及以熒光分 子直接探査陣列并監(jiān)控?zé)晒庑盘?hào)?；蛘呋蛄硗猓梢越?jīng)標(biāo)記(例如以生物素標(biāo)記)用于間接熒光檢測(cè)的分子探查陣列(在所述情況下，通過(guò)測(cè)試熒光標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素的 結(jié)合)?；蛘呋蛄硗猓墒褂脽晒獯銣绶?，其中排列成陣列的聚糖經(jīng)熒光標(biāo)記并以測(cè)試 分子(其可經(jīng)或可不經(jīng)不同熒光團(tuán)標(biāo)記)探查。在所述實(shí)施例中，與陣列的結(jié)合起作用 以消除由排列成陣列的聚糖發(fā)出的熒光，因此通過(guò)熒光發(fā)射的損失來(lái)檢測(cè)結(jié)合?；蛘呋?另外，可以已在放射性物質(zhì)存在下生長(zhǎng)(從而得到經(jīng)放射性標(biāo)記的探針)的活組織樣本 探査排列成陣列的聚糖?？赏ㄟ^(guò)測(cè)量放射性發(fā)射來(lái)檢測(cè)所述實(shí)施例中的結(jié)合。所述方法 適用于測(cè)定HA多肽與本發(fā)明的聚糖陣列的結(jié)合和/或結(jié)合程度。在本發(fā)明的某些實(shí)施例 中，可進(jìn)一步使用所述方法來(lái)鑒別和/或表征干擾或者改變聚糖-HA多肽相互作用的試 劑。例如，下文所述的方法尤其可用于鑒別被認(rèn)為能夠與碳水化合物相互作用的分子是 否實(shí)際上可確實(shí)如此，或鑒別分子是否出乎意料地具有與碳水化合物相互作用的能力。
本發(fā)明也提供使用本發(fā)明的陣列來(lái)例如檢測(cè)測(cè)試樣本中的特定試劑的方法。舉例來(lái) 說(shuō)，所述方法可包含以下步驟(1)使聚糖陣列與測(cè)試樣本(例如，被認(rèn)為含有HA多 肽的樣本)接觸；和(2)檢測(cè)測(cè)試樣本中的任何試劑與所述陣列的結(jié)合。
另外，可使用與本發(fā)明陣列的結(jié)合來(lái)例如測(cè)定結(jié)合劑與聚糖之間的相互作用的動(dòng)力 學(xué)。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的用于測(cè)定相互作用動(dòng)力學(xué)的方法可包括以下步驟(1)使聚糖 陣列與所測(cè)試分子接觸；和(2)測(cè)量結(jié)合劑與排列成陣列的聚糖之間的相互作用的動(dòng) 力學(xué)。
可通過(guò)例如如上文所詳述的比色或熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)變化來(lái)測(cè)量結(jié)合劑與本發(fā)明陣 列中的任一聚糖的相互作用的動(dòng)力學(xué)。所述方法尤其可用于例如測(cè)定特定結(jié)合劑是否能 夠以比與特定碳水化合物相互作用的不同結(jié)合劑高的結(jié)合程度與同一碳水化合物相互 作用。
當(dāng)然，應(yīng)了解可針對(duì)陣列形式本身中不存在的聚糖樣本或來(lái)源來(lái)評(píng)估本發(fā)明的HA 多肽的聚糖結(jié)合。舉例來(lái)說(shuō)，可使本發(fā)明的HA多肽結(jié)合組織樣本和/或細(xì)胞系以評(píng)估其 聚糖結(jié)合特征。適當(dāng)細(xì)胞系包括例如多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的任一種，尤其表現(xiàn)含有傘 形拓?fù)渚厶?例如，其中至少一些可為a2-6唾液酸化聚糖和尤其長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸化聚 糖)的HA受體的細(xì)胞系。在一些實(shí)施例中，所使用的細(xì)胞系表現(xiàn)具有傘形拓?fù)涞膫€(gè)別 聚糖。在一些實(shí)施例中，所使用的細(xì)胞系表現(xiàn)多種聚糖。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞系是獲 自臨床分離株；在一些情況下，其經(jīng)維持或操縱以具有所需聚糖分布和/或普遍性。在一 些實(shí)施例中，組織樣本和/或細(xì)胞系表現(xiàn)哺乳動(dòng)物上呼吸道上皮細(xì)胞的聚糖特征。
數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)
如此處所討論，根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)來(lái)自聚糖結(jié)合研究的挖掘數(shù)據(jù)、結(jié)構(gòu)信息(例如HA晶體結(jié)構(gòu))和/或蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)程序來(lái)鑒別和/或表征HA多肽。
圖11中說(shuō)明本發(fā)明者所使用(且本文中例示)的特定數(shù)據(jù)挖掘方法中涉及的主要 步驟。這些步驟涉及針對(duì)三個(gè)元件的操作數(shù)據(jù)對(duì)象、特征和分類器。"數(shù)據(jù)對(duì)象"為 存儲(chǔ)于數(shù)據(jù)庫(kù)中的原始數(shù)據(jù)。在聚糖陣列數(shù)據(jù)的情況下，聚糖結(jié)構(gòu)在單糖和鍵聯(lián)方面的 化學(xué)描述以及其與所篩選的不同GBP的結(jié)合信號(hào)構(gòu)成數(shù)據(jù)對(duì)象。數(shù)據(jù)對(duì)象的特性為"特 征"。選擇基于特征所獲得的規(guī)則或模式來(lái)描述數(shù)據(jù)對(duì)象。"分類器"為用于將數(shù)據(jù)對(duì)象 群集成特定類別或確定特征之間的關(guān)系的規(guī)則或模式。分類器提供以高親和力結(jié)合GBP 的聚糖所滿足的特定特征。這些規(guī)則分為兩類(1)存在于一組高親和力聚糖配體上的 特征，認(rèn)為其可增強(qiáng)結(jié)合；和(2)不應(yīng)存在于高親和力聚糖配體中的特征，認(rèn)為其對(duì) 結(jié)合不利。
本文使用的數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)包含彼此相互作用的軟件模塊(圖11)來(lái)執(zhí)行上文所述的 操作。特征提取器將作為CFG數(shù)據(jù)庫(kù)的界面以便提取特征，且CFG所使用的基于所述 對(duì)象的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)有利于特征的靈活確定。
獰f楚欲浙教薪,備，
從聚糖陣列上的聚糖提取的代表性特征列于表l中。 表l.從聚糖陣列上的聚糖提取的特征。
基于規(guī)則的分類算法使用本表中所述的特征來(lái)鑒別表征與特異性GBP結(jié)合的模式。
所提取的特征 卓薪體
組成
明確組成
微辨, 對(duì)
三聯(lián)體 四聯(lián)體
特征描述
hex、 hexNAc、 dHex、唾液酸等的數(shù)量[在圖1中，組成為Hex=5; HexNAc=4]。清楚地記錄末端組成[在圖1中，末端組成為Hex=2; HexNAc=2]。
Glc、 Gal、 GlcNAc、 Fuc、 GalNAc、 Neu5Ac、 Neu5Gc等的數(shù)量[在圖 l中，明確組成為Man-5; GlcNAc=4]。明確記錄末端明確組成[在圖 l中，末端明確組成為Man=2; GlcNAc=2]。
對(duì)是指一對(duì)通過(guò)鍵聯(lián)共價(jià)連接的單糖。所述對(duì)分為兩類正規(guī)[B]和用 于區(qū)分對(duì)與以非還原端封端的一個(gè)單糖的末端[T][圖2]。提取所述對(duì) 的頻率作為特征。
三聯(lián)體是指一組三個(gè)通過(guò)兩個(gè)鍵聯(lián)共價(jià)連接的單糖?，F(xiàn)將其分為三 類，即正規(guī)[B]、末端[T]和表面[S][圖2]。提取各類三聯(lián)體的組成作為 特征。
與三聯(lián)體特征類似，也提取具有四個(gè)單糖和其鍵聯(lián)的四聯(lián)體特征[圖 2]。四聯(lián)體分為兩類，正規(guī)[B]和表面[S]。提取不同四聯(lián)體的頻率作 為特征。
在上述表面三聯(lián)體和四聯(lián)體的情況下，如果忽略鍵聯(lián)信息，那么將得平均葉片深度 葉片數(shù)量
每個(gè)聚糖的平均信號(hào) 信噪比
到一組單糖群集，且將其出現(xiàn)頻率(組成)列表。選擇這些特征來(lái)分 析單糖之間鍵聯(lián)類型的重要性。
作為探針有效長(zhǎng)度的指示，提取樹(shù)的還原端的平均深度作為聚糖特 征。在圖2B中，葉片深度為3、 4和3，且平均值為3.34。 作為聚糖樹(shù)擴(kuò)展的量度,提取非還原單糖的數(shù)量作為特征。對(duì)于圖2B， 葉片數(shù)量為3。對(duì)于圖l，葉片數(shù)量為4。 蕕淳伊1,述,身,遂游 0￡尸游這些存肥
對(duì)相同聚糖的三聯(lián)體或四聯(lián)體[視陣列型式而定]表示的原始信號(hào)值求 平均值。
根據(jù)陰性對(duì)照計(jì)算平均噪聲[由CFG研發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)化方法]以計(jì)算信噪比 岡。
選擇所展示的這些特定特征的基本原理為GBP上的聚糖結(jié)合位點(diǎn)通常容納二-四 糖。使用基于樹(shù)的表示法來(lái)捕集關(guān)于聚糖結(jié)構(gòu)中的單糖和鍵聯(lián)的信息(樹(shù)根在還原端)。 這種表示法有利于各種特征的抽取，包括高級(jí)特征，諸如經(jīng)連接的單糖三聯(lián)體組等(圖 12)。數(shù)據(jù)準(zhǔn)備涉及產(chǎn)生聚糖陣列中的所有聚糖以及所抽取的各聚糖的特征(表l)的分 欄式列表。針對(duì)基于規(guī)則的分類法(參看下文)，從聚糖和其特征的此主表中選擇出一 個(gè)子集以確定控制與特定GBP或GBP組結(jié)合的特定模式。
已研發(fā)出不同類型的分類器且將其用于許多應(yīng)用中。其主要分為三個(gè)主要類別數(shù) 學(xué)法、距離法和邏輯法。這些不同方法以及其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)詳細(xì)論述于維斯(Weiss)及英 杜克亞(Indrukhya)(預(yù)測(cè)性數(shù)據(jù)挖掘一實(shí)踐指南(fVe&c"ve dam m!'m'"g—A prac〃c^ 摩根考夫曼(Morgan Kaufmann)，圣弗朗西斯科(San Francisco), 1998)中。 對(duì)于此特定應(yīng)用，我們選擇一種稱為規(guī)則歸納的方法，其屬于邏輯法。規(guī)則歸納分類器 產(chǎn)生呈^7菜-J 4規(guī)則(/F-7W￡Wrule)形式的模式。
邏輯法且尤其產(chǎn)生^7菜-J74規(guī)則的諸如規(guī)則歸納法等分類器的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)在于， 當(dāng)與其它統(tǒng)計(jì)學(xué)或數(shù)學(xué)法相比較時(shí)，分類器的結(jié)果可更容易地得到解釋。這使得能探索 出所發(fā)現(xiàn)的規(guī)則或模式的結(jié)構(gòu)和生物顯著性。使用早前描述的特征所產(chǎn)生的示范性規(guī)則 (表l)為—畝菜聚糖"Galb4GlcNAcb3Gal『Bl"且^^f "Fuca3GlcNAc[B]"，遵 益聚糖將以較高親和力結(jié)合半乳糖凝集素3。在此情況下使用的特定規(guī)則歸納算法為維 斯及英杜克亞(預(yù)測(cè)性數(shù)據(jù)挖掘一實(shí)踐指南摩根考夫曼，圣弗朗西斯科，1998)所研 發(fā)的算法。
茲緒度
確定各聚糖陣列篩選數(shù)據(jù)集的區(qū)分低親和力與高親和力結(jié)合的臨界值。核酸
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供編碼HA多肽或HA多肽的特征或生物學(xué)活性部分的 核酸。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供與編碼HA多肽或HA多肽的特征或生物學(xué)活性部 分的核酸互補(bǔ)的核酸。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)朋提供與編碼HA多肽或HA多肽的特征或生物學(xué)活性部分 的核酸雜交的核酸分子?？蓪⑺龊怂崂缬米饕踊蛱结槨H舉數(shù)個(gè)實(shí)例，可將所述 核酸用作聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中的引子、用于雜交(包括原位雜交)的探針和/或用于 逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)的引子。
在某些實(shí)施例中，核酸可為DNA或RNA且可為單鏈或雙鏈的。在一些實(shí)施例中， 本發(fā)明的核酸可包括一種或一種以上非天然核苷酸；在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸僅 包括天然核苷酸。
抗體
本發(fā)明提供本發(fā)明的HA多肽的抗體。這些抗體可為單克隆或多克隆抗體，且可通 過(guò)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的任一種來(lái)制備(參見(jiàn)例如，哈露(Harlow)及 蘭尼(Lane)，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(A油》o&w A i^7orafo^y Ma""^),美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室 出版社，1988)。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)包括產(chǎn)生單克隆抗體在內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)或經(jīng)由將 抗體基因轉(zhuǎn)染到適當(dāng)細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主中以允許產(chǎn)生重組抗體來(lái)制備抗體。
醫(yī)藥組合物
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供醫(yī)藥組合物，所述組合物包括HA多肽、編碼所述多 肽、所述多肽的特征或生物學(xué)活性片段的核酸或核酸、結(jié)合所述多肽或片段的抗體、與 所述多肽或結(jié)合其的聚糖相互作用的小分子等。
本發(fā)明包涵通過(guò)投與所述本發(fā)明的醫(yī)藥組合物來(lái)治療流感感染。在一些實(shí)施例中， 通過(guò)投與疫苗實(shí)現(xiàn)治療。迄今為止，盡管在研發(fā)流感疫苗方面己取得顯著成就，但仍存 在進(jìn)一步改善的空間。本發(fā)明提供包含本發(fā)明的HA多肽且尤其包含結(jié)合傘形聚糖(例 如(x2-6連接的傘形聚糖，諸如長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸化聚糖)的HA多肽的疫苗。
僅舉一個(gè)實(shí)例，至少部分歸因于H5HA的低免疫原性，在人類中產(chǎn)生對(duì)H5N1菌株 具有特異性的疫苗的嘗試通常無(wú)法獲得成功。在一個(gè)研究中，針對(duì)H5N1菌株的疫苗經(jīng) 展示產(chǎn)生l:40的抗體效價(jià)，這并非足以確保防止受到感染的高效價(jià)。此外，產(chǎn)生甚至適 度的l:40抗體效價(jià)所需的劑量(2個(gè)劑量的90pg經(jīng)純化的殺死病毒或抗原)為常見(jiàn)季 節(jié)性流感病毒疫苗的情況下通常所用劑量的12倍(曲阿諾(Treanor)等人,新英格蘭醫(yī) 學(xué)雜志(NEngJMed) ,354:1343,2006)。其它研究已類似地展示當(dāng)前的H5疫苗并不具有高度免疫原性(布瑞森(Bresson)等人，柳葉刀(Lancet), 367:1657,2006)。在一些 實(shí)施例中，使用一種或一種以上旨在允許使用較低劑量的H5 HA蛋白和/或達(dá)成較高免 疫原性的策略(參見(jiàn)例如，愛(ài)斯瑞克(E隨ink)，科學(xué)，309:996,2005)來(lái)調(diào)配本發(fā)明 的疫苗。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，(例如經(jīng)由使用樹(shù)狀聚合物)提高多價(jià)；在一些 實(shí)施例中，使用一種或一種以上佐劑，等等。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供疫苗和這些 疫苗向人類受檢者的投與。在某些實(shí)施例中，疫苗為包含以下各物中的一者或一者以上 的組合物(1)滅活病毒；(2)活減毒流感病毒，例如復(fù)制缺陷病毒；(3)本發(fā)明的 HA多肽或其特征或生物學(xué)活性部分；(4)編碼HA多肽或其特征或生物學(xué)活性部分的 核酸；(5)編碼HA多肽或其特征或生物學(xué)活性部分的DNA載體；和/或(6)表達(dá)系統(tǒng)， 例如表達(dá)一種或一種以上欲用作抗原的流感蛋白的細(xì)胞。
因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供滅活流感疫苗。在某些實(shí)施例中，滅活流感疫 苗包含以下三種類型的抗原制劑中的一種滅活全病毒；亞病毒顆粒，其中由清潔劑或 其它試劑破壞經(jīng)純化的病毒顆粒以溶解脂質(zhì)包膜("裂解"疫苗)；或經(jīng)純化的HA多肽
("亞基"疫苗)。在某些實(shí)施例中，可通過(guò)使用甲醛、e-丙內(nèi)酯、乙醚、乙醚與清潔劑
(諸如吐溫-80)、十六垸基三甲基溴化銨(CTAB)和曲通(Triton) NlOl、脫氧膽酸鈉 和磷酸三(正丁酯)進(jìn)行處理將病毒滅活。滅活可發(fā)生在(從在卵中制備的病毒)凈化尿 囊液之后或之前；通過(guò)離心來(lái)分離并純化病毒顆粒(尼克爾森(Nicholson)等人編，流 感教科書(shū)(Textbook of Influenza),美國(guó)布萊克威爾科學(xué)出版公司(Blackwell Science), 梅登(Maiden),馬里蘭州(MA)， 1998)。為評(píng)估疫苗的效能，可使用單向放射免疫擴(kuò) 散(SRD)測(cè)試(斯切爾德(Schild)等人，世界衛(wèi)生組織簡(jiǎn)報(bào)(Bull. World Health Organ.), 52:43-50 & 223-31, 1975;莫斯托(Mostow)等人，臨床微生物學(xué)雜志(J. Clin. Microbiol), 2:531， 1975)。
本發(fā)明也提供活的減毒流感疫苗且減毒方法為所屬領(lǐng)域所熟知。在某些實(shí)施例中， 經(jīng)由使用諸如定點(diǎn)誘變等反向遺傳學(xué)來(lái)實(shí)現(xiàn)減毒作用。
在一些實(shí)施例中，使用于疫苗的流感病毒在卵中生長(zhǎng)，例如在含胚雞蛋中生長(zhǎng)，在 所述情況下，所收集的材料為尿囊液。或者或另外，可由使用組織培養(yǎng)使病毒生長(zhǎng)的任 何方法獲得流感病毒。用于使病毒生長(zhǎng)的適當(dāng)細(xì)胞底物包括例如狗腎臟細(xì)胞(諸如 MDCK或來(lái)自MDCK、 MDCK樣細(xì)胞的克隆的細(xì)胞)，猴腎臟細(xì)胞(諸如包括Vero細(xì) 胞的AGMK細(xì)胞)，作為連續(xù)細(xì)胞系的經(jīng)培養(yǎng)上皮細(xì)胞，293T細(xì)胞，BK-21細(xì)胞，CV-1: 細(xì)胞，或適于產(chǎn)生用于疫苗目的的流感病毒的任何其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型(包括上氣道 上皮細(xì)胞)，其易于由商業(yè)來(lái)源獲得(例如美國(guó)馬里蘭州的羅克維爾的美國(guó)典型培養(yǎng)物'收藏中心(ATCC，Rockville,Md))。適當(dāng)細(xì)胞底物又包括人類細(xì)胞，諸如MRC-5細(xì)胞。 適當(dāng)細(xì)胞底物并不局限于細(xì)胞系；例如，也包括諸如雞胚胎纖維母細(xì)胞等初級(jí)細(xì)胞。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的疫苗進(jìn)一步包含一種或一種以上佐劑。舉例來(lái)說(shuō)，可使 用鋁鹽(拜勒(Baylor)等人，疫苗(Vaccine), 20:S18， 2002)和單磷酰基脂質(zhì)A (MPL; 拉比(Ribi)等人，(1986),細(xì)菌內(nèi)毒素免疫學(xué)與免疫藥理學(xué)(Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins), 普萊南出版公司 (Plenum Publ. Corp.), 紐約(NY)，第407頁(yè)，1986)作為人類疫苗中的佐劑?；蛘呋蛄硗猓壳罢跍y(cè)試在 人類疫苗中用作佐劑的新化合物，諸如MF59 (美國(guó)凱龍集團(tuán)(Chiron Corp.), http:〃www.chiron.com/investors/pressreleases/2005/051028.html ) 、 CPG 7909 (庫(kù)柏 (Cooper)等人，f滯，22:3136, 2004)和皂角苷，諸如QS21 (弗奇克安(Ghochikyan) 等人，疫滯，24:2275,2006)。
另外，所屬領(lǐng)域中己知某些增強(qiáng)流感疫苗的免疫原性的佐劑，諸如聚[二(羧根基苯 氧基)磷氮烯](PCCP;派恩(Payne)等人，疫苗16:92， 1998)、干擾素-Y (曹(Cao) 等人，疫苗，10:238,1992)、嵌段共聚物P1205 (CRL1005;卡茨(Katz)等人，疫苗， 18:2177， 2000)、介白素-2 (IL-2;姆烏克(Mbwuike)等人，疫苗，8:347, 1990)和聚 甲基丙烯酸甲酯(PMMA;克如特(Kreuter)等人，醫(yī)藥科學(xué)雜志(J. Pharm. Sci.)， 70:367， 1981)。 i
除疫苗外，本發(fā)明還提供其它適用于治療病毒性感染的治療組合物。舉例來(lái)說(shuō)，在 一些實(shí)施例中，通過(guò)投與干擾本發(fā)明的HA多肽的表達(dá)或活性的藥劑實(shí)現(xiàn)治療。舉例來(lái) 說(shuō)，可使用包含抗體(諸如識(shí)別含有特定HA多肽(例如結(jié)合傘形聚糖的HA多肽)的 病毒顆粒的抗體)、核酸(諸如與HA序列互補(bǔ)的核酸序列，其可用于RNAi)、競(jìng)爭(zhēng)結(jié) 合HA受體的聚糖、競(jìng)爭(zhēng)聚糖-HA多肽相互作用的小分子或糖模擬劑(glycomometics) 或其任何組合的組合物實(shí)現(xiàn)治療。在一些實(shí)施例中，使用大量具有不同結(jié)構(gòu)的不同藥劑。 在一些實(shí)施例中，治療組合物包含一種或一種以上多價(jià)藥劑。在一些實(shí)施例中，治療包 含在暴露或疑似暴露之后不久緊急投與。
通常，除一種或一種以上諸如無(wú)菌生物相容性載劑(包括(但不限于〉無(wú)菌水、生 理鹽水、緩沖生理鹽水或右旋糖溶液)等惰性試劑外，醫(yī)藥組合物還將包括治療劑?；?者或另外，所述組合物可含有多種添加劑中的任一種，諸如穩(wěn)定劑、緩沖液、賦形劑或 防腐劑。在某些實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物將包括經(jīng)囊封、捕獲或結(jié)合在脂囊泡、生物可用: 和/或生物相容性和/或生物可降解底物或其它微粒內(nèi)的治療劑。
可單獨(dú)或者組合一種或一種以上其他治療劑(包括(但不限于)疫苗和/或抗體)投與本發(fā)明的醫(yī)藥組合物。"組合"并不打算暗示藥劑必須同時(shí)投與或必須經(jīng)調(diào)配用于一 起遞送，雖然這些遞送方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通常，將以針對(duì)各藥劑所確定的劑量 和時(shí)程投與所述藥劑。另外，本發(fā)明包涵組合可提高生物可用性、降低或改善新陳代謝、 抑制排泄或改善在身體內(nèi)的分布的藥劑來(lái)遞送本發(fā)明的醫(yī)藥組合物。雖然可使用本發(fā)明 的醫(yī)藥組合物來(lái)治療任何有需要的受檢者(例如任何動(dòng)物)，但最優(yōu)選地使用其治療人 類。
可通過(guò)多種途徑投與本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，包括經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、 皮下、心室內(nèi)、經(jīng)皮、皮內(nèi)、經(jīng)直腸、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(通過(guò)粉劑、軟膏、乳膏 或滴劑)、經(jīng)黏膜、經(jīng)口腔，或以經(jīng)口或經(jīng)鼻噴霧劑或氣溶膠形式投與。通常，最適當(dāng) 的投與途徑將依賴多種因素，包括藥劑的性質(zhì)(例如其在胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性)、患 者的狀況(例如患者是否能夠耐受經(jīng)口投與)等。目前，經(jīng)口或經(jīng)鼻噴霧劑或氣溶膠途 徑最常用于將治療劑直接遞送到肺和呼吸系統(tǒng)。然而，考慮到藥物遞送科學(xué)的可能進(jìn)步， 本發(fā)明包涵通過(guò)任何合適途徑遞送本發(fā)明的醫(yī)藥組合物。
用于遞送本文所述的皮內(nèi)醫(yī)藥組合物的適當(dāng)裝置包括短針裝置，諸如描述于美國(guó)專 利第4,886,499號(hào)、美國(guó)專利第5,190,521號(hào)、美國(guó)專利第5,328,483號(hào)、美國(guó)專利第 5,527,288號(hào)、美國(guó)專利第4,270,537號(hào)、美國(guó)專利第5,015,235號(hào)、美國(guó)專利第5,141,496 號(hào)、美國(guó)專利第5,417,662號(hào)中的裝置。也可以通過(guò)限制針在皮膚中的有效穿透長(zhǎng)度的 裝置投與皮內(nèi)組合物，所述裝置諸如描述于WO99/34850 (以引用的方式并入本文中) 中的裝置，和其功能等效物。經(jīng)由刺入角質(zhì)層且產(chǎn)生達(dá)到真皮的射流的液體射流注射器 或針將液體疫苗遞送到真皮的射流噴射裝置同樣合適。射流噴射裝置是描述于例如以下 專利中美國(guó)專利第5,480,381號(hào)、美國(guó)專利第5,599,302號(hào)、美國(guó)專利第5,334,144號(hào)、 美國(guó)專利第5,993,412號(hào)、美國(guó)專利第5,649,912號(hào)、美國(guó)專利第5,569,189號(hào)、美國(guó)專 利第5,704,911號(hào)、美國(guó)專利第5,383,851號(hào)、美國(guó)專利第5,893,397號(hào)、美國(guó)專利第 5,466,220號(hào)、美國(guó)專利第5,339,163號(hào)、美國(guó)專利第5,312,335號(hào)、美國(guó)專利第5,503,627 號(hào)、美國(guó)專利第5,064,413號(hào)、美國(guó)專利5,520,639第號(hào)、美國(guó)專利第4,596,556號(hào)、美 國(guó)專利第4，790，824號(hào)、美國(guó)專利第4,941,880號(hào)、美國(guó)專利第4,940,460號(hào)、WO 97/37705 和WO 97/13537。使用壓縮氣體來(lái)加速粉末形式的疫苗穿過(guò)皮膚外層到達(dá)真皮的彈道粉 末/顆粒遞送裝置同樣合適。另外，在皮內(nèi)投藥的典型曼托(mantoux)法中可使用常規(guī) 注射器。
醫(yī)藥劑的調(diào)配和制造中的通?？紤]事項(xiàng)可見(jiàn)于例如雷明頓醫(yī)藥科學(xué)(Remington' s Pharmaceutical Sciences),第19版，麥克出版公司(Mack Publishing Co.),伊斯頓(Easton),賓夕法尼亞(PA), 1975中。 診斷/試劑盒
本發(fā)明提供用于檢測(cè)病理樣本中的HA多肽且尤其檢測(cè)具有特定聚糖結(jié)合特征(例 如，結(jié)合傘形聚糖、a2-6唾液酸化聚糖、長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸化聚糖等)的HA多肽的試 劑盒，所述病理樣本包括(但不限于)血液、血清/血漿、外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞/外周血液 淋巴細(xì)胞(PBMC/PBL)、唾液、尿、糞便、喉拭子、皮膚病變拭子、腦脊髓液、宮頸刮 片、膿樣本、食物基質(zhì)，和來(lái)自身體各部分(諸如大腦、脾臟和肝臟)的組織。本發(fā)明 也提供用于檢測(cè)環(huán)境樣本(包括(但不限于)土壤、水和植物群)中的所關(guān)注HA多肽 的試劑盒。也可以應(yīng)用尚未列舉的其它樣本。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的試劑盒可包括一種或一種以上特異性檢測(cè)具有特定聚糖 結(jié)合特征的HA多肽的藥劑。所述藥劑可包括例如特異性識(shí)別某些HA多肽(例如，結(jié) 合傘形聚糖和/或a2-6唾液酸化聚糖和/或長(zhǎng)鏈a2-6唾液酸化聚糖的HA多肽)的抗體， 其可用于通過(guò)ELISA、免疫熒光和/或免疫印跡法特異性檢測(cè)所述HA多肽。這些抗體也 可以用于病毒中和測(cè)試，其中以所關(guān)注的HA多肽的特異性抗體處理樣本并測(cè)試其相對(duì) 于未經(jīng)處理樣本感染所培養(yǎng)的細(xì)胞的能力。如果所述樣本中的病毒含有所述HA多肽， 那么抗體將中和病毒并防止其感染所培養(yǎng)的細(xì)胞?；蛘呋蛄硗?，也可以將所述抗體用于 HA抑制測(cè)試，其中從給定樣本分離HA蛋白，以特定HA多肽或HA多肽組的特異性 抗體處理并測(cè)試其相對(duì)于未經(jīng)處理樣本凝聚紅血球的能力。如果樣本中的病毒含有所述 HA多肽，那么抗體將中和HA多肽的活性并防止其凝聚紅血球(哈露及蘭尼，抗體 實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1988 ; http:〃www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO CDS CSR NCS 2002 5/en/ index.html ;
施例中，所述藥劑可包括特異性結(jié)合編碼特定HA多肽且可用于通過(guò)RT-PCR或原位雜 交特異性檢測(cè)所述 HA 多肽的核苷酸的核酸 (http:〃www.who.mt/csr/resources/publications/influenza/WHO CDS CSR NCS 2002 5/en /index.html ; http:〃www.who.int/csr/disease/avian influenza/guidelines/labtests/en/index.html)。在某些實(shí) 施例中，在檢測(cè)之前擴(kuò)增已從樣本分離的核酸。在某些實(shí)施例中，診斷試劑可經(jīng)可檢測(cè) 性標(biāo)記。
本發(fā)明同時(shí)提供含有本發(fā)明的用于產(chǎn)生流感病毒和疫苗的試劑的試劑盒。試劑盒的內(nèi)含物包括(但不限于)含有編碼所關(guān)注的HA多肽(或特征或生物學(xué)活性部分)的HA 核苷酸(或特征或生物學(xué)活性部分)的表達(dá)質(zhì)粒?；蛘呋蛄硗?，試劑盒可含有表達(dá)所關(guān) 注的HA多肽(或特征或生物學(xué)活性部分)的表達(dá)質(zhì)粒。也可以包括不含病毒基因的表 達(dá)質(zhì)粒，以便用戶能夠并入來(lái)自任何所關(guān)注的流感病毒的HA核苷酸。試劑盒也可以包 括哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括(但不限于)Vero和MDCK細(xì)胞系。在某些實(shí)施例中，診斷 試劑可經(jīng)可檢測(cè)性標(biāo)記。
在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明使用的試劑盒可包括參考樣本、用于處理樣本、進(jìn)行 測(cè)試的說(shuō)明書(shū)、用于解釋結(jié)果的說(shuō)明書(shū)、緩沖液和/或進(jìn)行測(cè)試所必需的其他試劑。在某 些實(shí)施例中，試劑盒可包含抗體組。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，可使用如上文所討論的聚糖陣列作為診斷劑和/或試劑盒。
在某些實(shí)施例中，使用本發(fā)明的聚糖陣列和/或試劑盒來(lái)進(jìn)行劑量反應(yīng)研究，以評(píng)估 HA多肽與傘形聚糖在多個(gè)劑量(例如，如本文所述)下的結(jié)合。所述研究提供對(duì)所測(cè) 試的HA多肽的結(jié)合特征的尤其有益洞察，且尤其適用于評(píng)估特異性結(jié)合。此種類型的 劑量反應(yīng)結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)許多適用的應(yīng)用。僅舉一個(gè)實(shí)例，其可有助于追蹤相關(guān)系列的 HA多肽變體中結(jié)合特征的進(jìn)化，而無(wú)論所述系列是經(jīng)由自然進(jìn)化、有意工程化還是兩 者的組合所產(chǎn)生。
在某些實(shí)施例中，使用本發(fā)明的聚糖陣列和/或試劑盒來(lái)誘導(dǎo)、鑒別和/或選擇HA 多肽，和/或具有所需結(jié)合特征的HA多肽變體。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，使用本發(fā) 明的聚糖陣列和/或試劑盒對(duì)HA多肽的群體施加進(jìn)化(例如，篩選和/或選擇)壓力。
例證
實(shí)例l:關(guān)于H1、 H3和H5HA與a2-3和ot2-6唾液酸化聚糖的結(jié)合特異性的框架 來(lái)自Hl (PDBID: 1RD8、 1RU7、 1RUY、 1RV0、 1RVT、 1RVX、 1RVZ)、 H3 (PDB ID: 1MQL、 1MQM、 1MQN)禾卩H5 (1JSN、 1JS0、 2FK0)的HA的晶體結(jié)構(gòu)以及其 與(x2-3和/或a2-6唾液酸化寡糖的復(fù)合物已提供關(guān)于特異性HA-聚糖相互作用中所涉及 的殘基的分子洞察。近來(lái)，已通過(guò)篩選包含多種cx2-3和(x2-6唾液酸化聚糖的聚糖陣列 上的野生型和突變體來(lái)詳細(xì)描述禽類和人類Hl和H3亞型的聚糖受體特異性。
1918年人類流行性病毒的HA中的Asp 190Glu突變使其特異性從a2-6反向?yàn)閏x2-3 唾液酸化聚糖(史蒂文斯等人，分子生物學(xué)雜志( /. A^/. 355:1143,2006;格拉
瑟(Glaser)等人，病毒學(xué)雜志(/. 79:11533， 2005)。另一方面，禽類HI (A/
鴨/阿爾伯達(dá)/35/1976)上的雙重突變Glul90Asp禾fl Gly225Asp使其特異性從a2-3反向?yàn)閍2-6唾液酸化聚糖。在H3亞型的情況下，1963年禽類H3N8病毒株與1967-68年流 行性人類H3N2病毒株之間Gln226變?yōu)長(zhǎng)eu和Gly228變?yōu)镾er的氨基酸改變與其從a2-3 到a2-6唾液酸化聚糖的優(yōu)選性的改變相關(guān)(羅杰斯(Rogers)等人，自然，304:76， 1983)。 在雪貂模型中，使用高致病性和毒力的1918 H1N1病毒來(lái)證實(shí)HA聚糖結(jié)合特異性與傳 播效率之間的關(guān)系(塔姆佩T. M. (Tumpey， T. M.)等人，科學(xué)，315:655,2007)。
將受體結(jié)合特異性從親本人類(x2,6唾液酸化聚糖(SC18)受體優(yōu)選性轉(zhuǎn)變成禽類 a2，3唾液酸化受體優(yōu)選性(AV18)會(huì)產(chǎn)生無(wú)法傳播的病毒。另一方面， 一種混合a2，3/a2,6 唾液酸化聚糖特異性病毒(A/紐約/1/18 (NY18))不展現(xiàn)傳播性，意外的是同樣為混合 a2，3Ax2,6唾液酸化聚糖特異性的A/得克薩斯/36/91 (Tx91)病毒能有效傳播。此外，如上 文所述，各種高致病性H5N1病毒菌株也展示混合(x2，3/a2,6唾液酸化聚糖特異性(山田 S. (YamadaS.)等人，自然444:378,2006)，且仍能在人與人之間傳播。關(guān)于HA的唾 液酸化聚糖特異性和傳播的混合結(jié)果引起以下問(wèn)題。第一，在人類上呼吸道中所見(jiàn)的唾 液酸化聚糖是否存在多樣性，且這能否解釋病毒的特異性和組織嗜性？第二，是否存在 可能對(duì)于a2-3和/或a2-6唾液酸化聚糖與HA聚糖結(jié)合口袋如何結(jié)合起作用的聚糖構(gòu)象 的細(xì)微變化？總的來(lái)說(shuō)，關(guān)于人類適應(yīng)性，聚糖結(jié)合A型流感病毒HA的要求是什么？
幼覆瀞務(wù)//浙耽/《對(duì)亍W、沼浙//5 ffi4茲合a2-3麼#麼化褒靜,嚴(yán)》/7游茲裕銜
劍
所有HA-聚糖共晶體結(jié)構(gòu)的分析指示Neu5Ac糖(SA)的定向是相對(duì)于HA聚糖 結(jié)合位點(diǎn)固定。錨定SA涉及不同HA亞型中高度保守的氨基酸Phe95、 Ser/Thr136、 Trpl53、 Hisl83、 Leu/Ile194組。因此，HA對(duì)a2-3或a2-6的特異性受HA聚糖結(jié)合位 點(diǎn)與糖苷氧原子和除SA外的糖的相互作用控制。
Neu5Aca2-3Gal鍵聯(lián)的構(gòu)象使得a2-3中的Gal和除Gal外的糖定位在受此鍵聯(lián)處的 糖苷扭轉(zhuǎn)角控制的錐形區(qū)中(圖6)。最小能量構(gòu)象的典型區(qū)域是通過(guò)約-60或60或180 的0)值指定，其中\(zhòng)|/從-60到60抽樣(圖14)。在這些最小能量區(qū)域中，a2-3中除Gal 外的糖伸出 HA聚糖結(jié)合位點(diǎn)外。這也可從HA與a2-3基元 (Neu5Aca2-3Gal(31-3/4GlcNAc-)的共晶體結(jié)構(gòu)顯而易見(jiàn)，其中①值通常為約180 (稱 為反式構(gòu)象)。反式構(gòu)象使得a2-3基元伸出口袋外。這暗示，以三個(gè)糖(或三糖)a2-3 基元為中心在Gal禾n/或GlcNAc (或GalNAc)糖處分枝的結(jié)構(gòu)變化(硫酸化和巖藻糖基 化)將對(duì)HA結(jié)合具有最大影響(圖7)。此結(jié)構(gòu)含義與從數(shù)據(jù)挖掘分析獲得的關(guān)于HA 與(x2-3唾液酸化聚糖結(jié)合的三類不同分類器相符(表3)。所有這三個(gè)類別的共有特征 為不應(yīng)存在Neu5Aca2-3Gal以及GalNAcot/pi-4Gal 。晶體結(jié)構(gòu)分析表明，連接到Neu5Aca2-3Gal的Gal的GalNAc造成與蛋白的不利空間接觸，這與分類器相符。
除唾液酸結(jié)合的保守錨定點(diǎn)外，結(jié)合Neu5Accx2-3Gal基元涉及兩個(gè)關(guān)鍵殘基Gln226 和Glul90。位于結(jié)合位點(diǎn)底部的Gln226與Neu5Aca2-3Gal鍵聯(lián)的糖苷氧原子相互作用 (圖15,圖C、 D)。位于Gln226的相對(duì)側(cè)上的Glul90與Neu5Ac和Gal單糖相互作用 (圖15,圖C、 D)。此外，在禽類HA中高度保守的殘基Alal38 (鄰近Gln226)和Gly228 (鄰近Glul90)可涉及在促進(jìn)供與a2-3唾液酸化聚糖最佳相互作用的Gln226和Glul90 的正確構(gòu)象中(圖15)。如在晶體結(jié)構(gòu)中所觀察到的，人類H1亞型APR34含有所有四 個(gè)氨基酸Alal38、 Glul90、 Gln226和Gly228且結(jié)合a2-3唾液酸化聚糖(圖14,圖B)。 在AAI68—H3—23、 ADU67JH3—23和APR34—Hl_23的晶體結(jié)構(gòu)中附加聚糖結(jié)合位 點(diǎn)將提供關(guān)于Glul90側(cè)鏈定位和其對(duì)HA與a2-3唾液酸化聚糖結(jié)合的影響的額外洞察。 HI HA中的Glul90的側(cè)鏈伸入結(jié)合位點(diǎn)比H3 HA中的Glul90的側(cè)鏈遠(yuǎn)(約1埃)。這 可歸因于鄰近Glul90殘基的HI HA中的Pro 186與H3 HA中的Serl86的氨基酸差異。 如聚糖微陣列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)挖掘分析所示，Glul90側(cè)鏈構(gòu)象的這種改變可與禽類Hl (且 非禽類H3)以適度親和力結(jié)合一些a2-6唾液酸化聚糖相關(guān)(表3)。此外，以Gly228 取代Ser (禽類與人類H3亞型之間的標(biāo)志性改變)將改變Glul90的構(gòu)象且干擾人類H3 HA與反式構(gòu)象的Neu5Aca2-3Gal的相互作用。這將通過(guò)在人類AAI68—H3—23共晶體結(jié) 構(gòu)中所觀察到的Neu5Aca2-3Gal基元的不同構(gòu)象(非反式構(gòu)象)進(jìn)一步詳述。此構(gòu)象中 的Neu5Aca2-3Gal基元所提供的與人類H3 HA結(jié)合位點(diǎn)的最佳接觸比呈反式構(gòu)象的所 述基元所提供的與禽類H3 HA的最佳接觸少(圖14)。歸因于這種接觸損失，故人類 H3 HA中的Gly228Ser突變使其聚糖結(jié)合位點(diǎn)不太有利于與a2-3唾液酸化聚糖的相互作 用。此結(jié)構(gòu)觀察與由數(shù)據(jù)挖掘分析獲得的結(jié)果(表3)相符，其展示人類H3HA對(duì)于一 些a2-3唾液酸化聚糖僅具有適度的親和力。
關(guān)于Neu5Aca2-3Gal的結(jié)構(gòu)變化如何影響HA-聚糖相互作用？定位在禽類H5中高 度保守的Lysl93 (圖5)以使其與Neu5 Aca2-3Gal卩l(xiāng)-4GlcNAc中的6-0硫酸化Gal禾口/ 或6-0硫酸化GlcNAc相互作用?？赏ㄟ^(guò)數(shù)據(jù)挖掘分析來(lái)驗(yàn)證此觀察結(jié)果，其中僅禽類 H5以高親和力結(jié)合在Gal或GlcNAc處硫酸化的a2-3唾液酸化聚糖(表3)。 222位的 基本氨基酸可以類似方式與Neu5Aca2-3Galpl-3GlcNAc基元中的4-0硫酸化GlcNAc或 Neu5Aca2-3Gal(31-4GlcNAc基元中的6-0硫酸化GlcNAc相互作用。另一方面，諸如Hl 和H5中的Lys222和H3中的Trp222等龐大側(cè)鏈潛在地干擾Neu5Aca2-3Galpl-4(Fucal-3) GlcNAc基元中的巖藻糖基化GlcNAc。這一結(jié)構(gòu)觀察確證關(guān)于禽類H3和H5菌株所觀 察到的分類器規(guī)則a2-3C型(表3)，這表明在GlcNAc處巖藻糖基化對(duì)結(jié)合不利。由于
40Viet04—H5 HA與ADS97—H5 HA各自的聚糖結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸幾乎相同，故二者與 a2-3唾液酸化聚糖的結(jié)合類似(表3)。
因此，對(duì)于結(jié)合oi2-3唾液酸化聚糖，除錨定Neu5Ac的殘基外，在所有禽類Hl、 H3和H5亞型中高度保守的Glul卯和Gln226對(duì)于結(jié)合Neu5Aca2-3Gal基元至關(guān)重要。 與GlcNAc或GalNAc的接觸以及(x2-3基元中的諸如硫酸化和巖藻糖基化等取代涉及 137、 186、 187、 193和222位的氮基酸。來(lái)自H1、 H3和H5的HA顯示對(duì)于聚糖微陣 列中存在的不同ct2-3唾液酸化聚糖的不同結(jié)合特異性。這些位置中的氨基酸殘基在不同 HA中并不保守，且這解釋不同結(jié)合特異性。
^褒瀞務(wù)/////攻"對(duì)于//7 *沼ffi4潛^ 2-6摩液潔眾覆游,嚴(yán)勿游翁賴A《激 在Neu5Aca2-6Gal鍵聯(lián)的情況下，額外C6-C5鍵的存在提供增加的構(gòu)象靈活性。a2-6 中Gal且隨后的糖的位置將跨越比在(x2-3情況中的錐形區(qū)域大得多的傘形區(qū)域(圖6)。 視寡糖的長(zhǎng)度而定，結(jié)合a2-6將涉及與所述傘形拓?fù)涞撞刻幍腘eu5Ac和Gal糖以及隨 后的糖的最佳接觸。諸如Neu5Ac(x2-6Gaipi-3/4Glc等短鏈a2-6寡糖將潛在地采用錐形 拓?fù)?。另一方面，a2-6基元Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAc-中GlcNAc而非Glc的存在將潛 在地有利于傘形拓?fù)?，這可通過(guò)GlcNAc與Neu5Ac的乙酰碳之間的最佳范德華(ran der 接觸得到穩(wěn)定。然而，a2-6基元也可采用錐形拓?fù)?，以致諸如分枝和HA結(jié)合 等額外因素可補(bǔ)償由傘形拓?fù)渌峁┑姆€(wěn)定性?？赏ㄟ^(guò)糖內(nèi)相互作用來(lái)穩(wěn)定作為N連接 聚糖中多個(gè)短寡糖分枝的一部分存在的a2-6基元的錐形拓?fù)?。另一方面，在長(zhǎng)寡糖分枝 (至少四糖)中的a2-6基元有利于傘形拓?fù)?。Hl禾P H3 HA與a2-6基元 (Neu5Aca2-6Gal(31-4GlcNAc-)的共晶體結(jié)構(gòu)支持上述觀點(diǎn)，其中約為-60的①(稱為順 式構(gòu)象)引起除Neu5Aca2-6Gal外的糖朝著HA蛋白彎曲，從而與結(jié)合位點(diǎn)最佳接觸(圖 7)。
在Hl HA中，附加來(lái)自人類H1N1 (A/南卡羅來(lái)納/1/1918)亞型的HA以及 ASI30—H1—26和APR34—Hl一26的聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑻峁╆P(guān)于提供對(duì)a2-6唾液酸化聚糖 的特異性所涉及的氨基酸的洞察。定位Lys222和Asp225以與Neu5Aca2-6Gal基元中的 Gal 的氧原子相互作用。定位 Aspl90 和 Ser/Asn193 以與 Neu5Aca2-6Galal-4GlcNAcal-3Gal基元的額外單糖GlcNAcal-3Gal相互作用(圖15， 圖A、 B)。
在1918年人類流行性病毒株的Hl HA中，Aspl90、 Lys222和Asp225高度保守。 盡管氨基酸Gln226在所有禽類和人類Hl亞型中高度保守，但與其在結(jié)合a2-3唾液酸 化聚糖中的作用(在禽類H1亞型中)相比，其似乎不涉及在結(jié)合a2-6唾液酸化聚糖(在人類H1亞型中)中。關(guān)于禽類和人類H1HA的野生型和突變形式的聚糖陣列結(jié)果的數(shù) 據(jù)挖掘分析進(jìn)一步證實(shí)上述氨基酸在結(jié)合0t2-6唾液酸化聚糖方面的作用(表3)。禽類 HI HA的Glul90Asp/Gly225Asp雙重突變體使其與a2-6唾液酸化聚糖的結(jié)合反向(表 3)。此外，人類ANY18—HI的Lys222Leu突變體去除其與所述陣列上所有唾液酸化聚糖 的結(jié)合，這與Lys222在聚糖結(jié)合中的重要作用相符。
為鑒別提供H3N2 HA結(jié)合a2-6唾液酸化聚糖的特異性的氨基酸，附加人類H3N2 (AAI68—H3)、 ADU63—H3—26和ASI30—HI—26的HA的聚糖結(jié)合域。對(duì)于這些附加結(jié)構(gòu) 的分析展示，定位Leu226以提供與Neu5a2-6Gal基元的C6原子的最佳范德華接觸且定 位Ser228以與唾液酸的09相互作用。人類H3中的Ser228也與Glul90相互作用(與 無(wú)法進(jìn)行所述相互作用的禽類ADU63_H3中的Gly228不同)，從而影響其側(cè)鏈構(gòu)象。與 禽類H3 HA中的Glul90相比較，人類H3 HA中Glul90的側(cè)鏈在結(jié)合位點(diǎn)中略微移位 約0.7埃。這些差異限制了人類H3 HA結(jié)合a2-3唾液酸化聚糖的能力且與其優(yōu)選地結(jié) 合a2-6唾液酸化聚糖相關(guān)。因此，Gln226Leu和Gly228Ser突變引起在1967年流行病 期間禽類H3與人類H3亞型的聚糖受體特異性的反向。
來(lái)自1967-68年流行性H3N2的HA與來(lái)自近期(1990年后)H3亞型的HA的比較 展示，在近期亞型中，Glul90突變成Asp。由于定位人類H3中的Aspl90以有利地與 這些聚糖相互作用，故這一突變進(jìn)一步增強(qiáng)人類H3與a2-6唾液酸化聚糖的結(jié)合。此結(jié) 構(gòu)含義將通過(guò)關(guān)于人類H3亞型(A/莫斯科/10/1999)的聚糖陣列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)挖掘分析進(jìn) 一步確證。此HA包含Asp190、 Leu226和Ser228 (圖2)且對(duì)a2-6唾液酸化聚糖展示 極強(qiáng)的優(yōu)選性(表3)。
上述觀察結(jié)果突顯出Hl與H3 HA結(jié)合a2-6唾液酸化聚糖之間的相似性以及差異。 在Hl和H3 HA中，定位Aspl90和Ser/Asn193以使得能與除Neu5Aca2-6Gal基元外的 單糖有利地接觸(圖15,圖A、 B)。 H1與H3 HA之間的氨基酸以及其與(x2-6唾液酸 化聚糖接觸的差異提供用于結(jié)合這些聚糖的不同表面和離子互補(bǔ)性。Neu5Acct2-6Gal鍵 聯(lián)具有比Neu5Aca2-3Gal多的構(gòu)象自由度。因此，結(jié)合a2-6唾液酸化聚糖的HA具有 較大的結(jié)合口袋開(kāi)口來(lái)容納此構(gòu)象自由。盡管定位人類H3 HA中的Leu226來(lái)提供與 Neu5Aca2-6Gal的最佳范德華接觸，但由Hl HA中的Gln226所提供的與此基元的離子 接觸并非最佳。另一方面，在Hl中，氨基酸Lys222和Asp225提供比H3中的Trp222 和Gly225更多的與a2-6唾液酸化聚糖的最佳離子接觸。
關(guān)f夢(mèng)主盧/Z7突變沐H5ffi4與ct2-6麼茨虔眾褒^^茲^游茲裕腐^
由Hl和H3 HA中的不同氨基酸所提供的與a2-6唾液酸化聚糖的相互作用表明，當(dāng)前禽類H5N1 HA可突變成H1樣或H3樣聚糖結(jié)合位點(diǎn)以便使其聚糖受體特異性反向。 根據(jù)上述框架，進(jìn)一步確證H5 HA的假定的Hl和H3樣突變并如下文所論述加以測(cè)試。
對(duì)于附加的ASI30—HI—26、 APR34—HI—26、 ADS97—H5—26禾卩Viet04_H5結(jié)構(gòu)的分 析提供關(guān)于H5 HA與(x2-6唾液酸化聚糖的HI樣結(jié)合的洞察。由于HI和H5 HA屬于 相同結(jié)構(gòu)進(jìn)化枝，故其聚糖結(jié)合位點(diǎn)共有類似的拓?fù)浜桶被岱植?拉塞爾等人，病毒 學(xué)，325:287, 2004)。將在禽類H5 HA中高度保守的Lys222定位以提供類似于HI HA 中的類似Lys的與Neu5Aca2-6Gal基元的Gal的最佳接觸。Viet04—H5中的Glul90和 Gly225 (替代Hl中的 Aspl90和 Asp225 ) 不提供類似于Hl 的與 Neu5Aca2-6Gal(3l-4GlcNAc基元的必要接觸。因此H5 HA中的Glul卯Asp和Gly225Asp 突變可潛在地改進(jìn)與a2-6唾液酸化聚糖的接觸。
關(guān)于Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAc(31-3Gal(31-4Glc寡糖中除GlcNAc外的相互作用以 及Hl和H5 HA的聚糖結(jié)合口袋的分析展示，盡管Hl HA中的Ser/Asn193提供與倒數(shù) 第二個(gè)Gal的有利接觸，但H5中的類似Lysl93與GlcNAcpi-3Gal基元具有不利的空間 重疊。因此，Lysl93Ser突變可提供與a2-6唾液酸化聚糖的額外有利接觸(連同Glul90Asp 和Gly225As突變一起)。
Hl HA中高度保守的Gln226在禽類H5 HA中也保守。由于Gln226在HI HA結(jié)合 ct2-6唾液酸化聚糖方面起到不太積極的作用(如上文所論述)，故此氨基酸突變成諸如 Leu等疏水性氨基酸可潛在地增強(qiáng)其與Neu5Aca2-6Gal基元中Gal的C6原子的范德華 接觸。
附加ADU63—H3—26、 AAI68_H3、 ADS97—H5—26和Viet04—H5將提供關(guān)于H5 HA 與(x2-6唾液酸化聚糖的H3樣結(jié)合的洞察。盡管此附加在結(jié)構(gòu)上對(duì)準(zhǔn)H5和H3 HA的聚 糖結(jié)合位點(diǎn)，但其不如H5與Hl之間的結(jié)構(gòu)對(duì)準(zhǔn)那樣好。分別由H3 HA中的Leu226 和Ser228所提供的與Neu5a2-6Gal基元的有利范德華接觸和離子接觸在H5 HA (具有 Gln226和Gly228)中不存在。由于Leu226和Ser228對(duì)于結(jié)合人類H3 HA中的a2-6唾 液酸化聚糖至關(guān)重要，故H5 HA中的Gln226Leu和Gly228Ser突變可潛在地提供與a2-6 唾液酸化聚糖的最佳接觸。此外，甚至在比較H3與H5時(shí)，將Lysl93定位，以致與經(jīng) 定位以提供有利接觸的人類H3 HA中的Serl93相比，Lysl93將與除Neu5Aca2-6Gal基 元外的單糖具有不利的空間接觸。盡管來(lái)自1967-68年流行性H3N2的HA包含GIul90, 但H5 HA中的Asp 190將經(jīng)定位從而提供與較長(zhǎng)寡糖中的Neu5Aca2-6Gal基元的較佳 離子接觸。
上述殘基的作用將通過(guò)針對(duì)Viet04一H5的野生型和突變形式的聚糖陣列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)
43挖掘分析得到進(jìn)一步確證(表3)。雙重突變體Glul90Asp/Gly225Asp不結(jié)合任何聚糖結(jié) 構(gòu)，這是因?yàn)槠涫ソY(jié)合a2-3唾液酸化聚糖的氨基酸GIul90且Lysl93對(duì)于結(jié)合a2-6 唾液酸化聚糖具有空間干擾。與雙重突變體類似，Gln226Leu/Gly228Ser結(jié)合一些a2-3 唾液酸化聚糖(a2-3B型分類器)，而且還結(jié)合單個(gè)雙觸a2-6唾液酸化聚糖(a2-6A型 分類器)。
關(guān)于所述與雙觸a2-6唾液酸化聚糖結(jié)合的分析表明，此聚糖中的Neu5Aca2-6Gal 鍵聯(lián)可潛在地以延長(zhǎng)構(gòu)象結(jié)合雙重突變體，但僅具有較少接觸(圖16)。此外， Mala 1 -3Man分枝上的Neu5Aca2-6Gal比Mana 1 -6Man分枝上的相同基元更有利地結(jié)合， 所述Mancxl-6Man分枝上的相同基元與H5 HA的聚糖結(jié)合位點(diǎn)具有不利的空間接觸(圖 16)。Gln226Leu/Gly228Ser雙重突變體對(duì)于a2-6唾液酸化聚糖的較窄特異性與干擾結(jié)合 的Lysl93 —致。
不希望受任何特定理論的束縛，發(fā)明者提出人類適應(yīng)A型流感病毒HA的必要條件 為得到以高親和力結(jié)合長(zhǎng)a2-6 (主要在人上呼吸道中表達(dá))的能力。舉例來(lái)說(shuō)，聚糖多 樣性的一個(gè)方面為經(jīng)唾液酸封端的乳糖胺分枝的長(zhǎng)度。這通過(guò)由數(shù)據(jù)挖掘分析所得到的 (x2-6唾液酸化聚糖的兩個(gè)不同特征來(lái)捕集(表3)。 一個(gè)特征通過(guò)連接到N連接核心的 Man的Neu5Aca2-6Gal(31-4GlcNAc表征且另一特征是通過(guò)連接到另一乳糖胺單元從而 形成較長(zhǎng)分枝(通常采用傘形拓?fù)?的所述基元表征。因此，突變體H5 HA與上呼吸 道的廣泛結(jié)合只有在這些突變體以高親和力結(jié)合采用傘形拓?fù)涞木哂虚L(zhǎng)a2-6的聚糖時(shí) 才可能。舉例來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明，理想結(jié)合模式包括結(jié)合圖9中所述的傘形聚糖。
相比之下，我們注意到 一 則有關(guān)經(jīng)修飾H5 HA蛋白(含有Gly228Ser和 Gln226Leu/Gly228Ser取代)的近期報(bào)導(dǎo)，其展示僅結(jié)合聚糖陣列上的單個(gè)雙觸a2-6唾 液酸基-乳糖胺聚糖結(jié)構(gòu)(史蒂文斯等人，科學(xué)312:404,2006)。因此，如本文中所述， 所述經(jīng)修飾H5 HA蛋白不是BSHB H5 HA。
實(shí)例2: HA的克隆、桿狀病毒合成、表達(dá)和純化
病毒中的血球凝集素以三聚體形式存在且固定到膜上。HA的全長(zhǎng)構(gòu)筑體具有N末 端信號(hào)肽和C末端跨膜序列。對(duì)于HA的重組表達(dá)來(lái)說(shuō)，通常使用允許分泌蛋白的HA 的短構(gòu)筑體。通過(guò)以Gp67信號(hào)肽序列置換HA的N末端信號(hào)肽來(lái)產(chǎn)生此短的可溶性構(gòu): 筑體，且C末端跨膜區(qū)域是經(jīng)后接胰蛋白酶裂解位點(diǎn)和6X-His標(biāo)記的'foldon'序列置 換(史蒂文斯等人，分子生物學(xué)雜志，355:1143， 2006)。 HA的全長(zhǎng)與可溶性形式都表 達(dá)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中。以含有全長(zhǎng)或可溶性形式的HA的桿狀病毒感染Sf-9細(xì)胞在Sf900 II SFM培養(yǎng)基(美國(guó)英杰生命技術(shù)公司(Invitrogen))中的懸浮培養(yǎng)物。感染后72-96小
44時(shí)收集細(xì)胞。
來(lái)自A/越南/1203/2004的血球凝集素(HA)是由呵道爾夫加-沙(Adolfo Garcia-Sastre)友善饋贈(zèng)。使用速變(QuikChange) IIXL定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?美國(guó)斯特精 公司(Stratagene))和速變多定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?美國(guó)斯特精公司)，將此"野生型"(WT) HA用作產(chǎn)生兩種不同的突變構(gòu)筑體DSLS和DSDL的模板。使用基于網(wǎng)站的程序 PrimerX (http:脂oinfo腿tics.org/primerx/)來(lái)設(shè)計(jì)用于誘變的引子，且由美國(guó)英杰生命 技術(shù)公司合成。使用TOPO連接反應(yīng)將WT和突變HA基因次克隆到入門(mén)載體pENTR-D TOPO (美國(guó)英杰生命技術(shù)公司)中。使用通路(Gateway)克隆技術(shù)將含有WT和突變 基因的入門(mén)載體與桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BaculoDirect)線性DNA (美國(guó)英杰生命技術(shù)公 司)重組。在各次克隆步驟中進(jìn)行DNA定序以證實(shí)序列的準(zhǔn)確度。使用所制備的重組 桿狀病毒DNA來(lái)轉(zhuǎn)染草地粘蟲(chóng)(S/K^o/7"ra/rag!'peWa) Sf-9細(xì)胞(美國(guó)英杰生命技術(shù) 公司)以產(chǎn)生原始病毒儲(chǔ)備物。
通過(guò)根據(jù)王(Wang)等人，(2006)疫苗，24:2176修正的方法從受感染細(xì)胞的膜部 分純化全長(zhǎng)HA。簡(jiǎn)要說(shuō)來(lái)，通過(guò)離心來(lái)收集來(lái)自150 ml培養(yǎng)物的細(xì)胞，且在4。C下以 30ml在緩沖液A (20mM磷酸鈉、1.0mMEDTA、 0.01%特級(jí)托(Tergitol) -NP9、 5% 甘油，pH5.93)中的l免特級(jí)托NP-9提取細(xì)胞小球達(dá)30min。然后，使提取物在6,000 g下經(jīng)受離心達(dá)15 min。使用0.45微米過(guò)濾器過(guò)濾上清液且將其加載到先前已使用緩沖 液A達(dá)到平衡的Q/SP管柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE healthcare),皮斯卡塔韋 (Piscataway)，新澤西(NJ))上。加載后，以20 ml緩沖液A洗滌管柱。然后，斷開(kāi)陰 離子交換管柱Q且使用5個(gè)5 ml份的緩沖液B (20 mM磷酸鈉、0.03%特級(jí)托、5%甘 油，pH8.2)和兩個(gè)5ml份的緩沖液C (20mM磷酸鈉、150 mM NaCl、 0.03%特級(jí)托、 5%甘油，pH 8.2)使用SP管柱來(lái)洗脫蛋白。將含有所關(guān)注蛋白的洗脫份匯集在一起且 使用艾米肯超濾(Amicon Ultra) IOOKNMWL膜過(guò)濾器(密理博公司(Millipore))使 其經(jīng)受超濾。將蛋白濃縮且在PBS中重構(gòu)。
使用史蒂文斯等人(2004)中所述的方案，由受感染細(xì)胞的上清液純化可溶性形式 的HA。簡(jiǎn)要說(shuō)來(lái)，濃縮上清液且通過(guò)使用Ni-NTA珠粒(全精公司(Qiagen))進(jìn)行親 和性層析而從濃縮的細(xì)胞上清液回收可溶性HA。匯集含有HA的洗脫份且針對(duì)10 mM Tris-HCl、 50mMNaCl; pH8.0透析。使用單-Q HR10/10管柱(法瑪西亞(Pha觀cia))， 對(duì)透析樣本進(jìn)行離子交換層析法。將含有HA的洗脫份匯集在一起且使用艾米肯超濾100 KNMWL膜過(guò)濾器(密理博公司)使其經(jīng)受超濾。將蛋白濃縮且在PBS中重構(gòu)。
通過(guò)以抗禽類H5N1 HA抗體進(jìn)行西方印跡分析來(lái)驗(yàn)證樣本中蛋白的存在。經(jīng)由斑點(diǎn)免疫檢定(使用獲自蛋白科學(xué)公司(Protein Sciences Inc)的WT H5 HA作為參考)， 測(cè)定WT和突變體的蛋白濃度。在所進(jìn)行的各種實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)H5HA (WT和突變體) 的蛋白濃度通常在20-50微克/毫升范圍內(nèi)?；诮o定批次的蛋白濃度，使用在1:10-1:100 范圍內(nèi)的適當(dāng)連續(xù)稀釋液(參見(jiàn)圖17)。
實(shí)例3:應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)來(lái)研究HA的聚糖結(jié)合特異性
研發(fā)H5N1亞型與cx2-3/6唾液酸化聚糖的結(jié)合框架(圖7)。這一框架包含兩個(gè)互補(bǔ) 分析。第一個(gè)分析涉及使用Hl、 H3和H5 HA-聚糖共晶體結(jié)構(gòu)系統(tǒng)性分析HA聚糖結(jié)合 位點(diǎn)以及其與a2-3和a2-6唾液酸化聚糖的相互作用(表2)。
這一分析提供對(duì)HA聚糖結(jié)合位點(diǎn)與多種(x2-3/6唾液酸化聚糖(包括傘形或錐形拓 撲的聚糖)的相互作用的重要洞察。第二個(gè)分析涉及分析關(guān)于不同Hl、 H3和H5HA的 聚糖陣列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)挖掘方法。此數(shù)據(jù)挖掘分析使不同野生型和突變體HA的強(qiáng)、弱和 非結(jié)合劑與微陣列中的聚糖的結(jié)構(gòu)特征相關(guān)(表3)。
重要的是，這些相關(guān)性(分類器)捕集a2-3/6唾液酸化鍵聯(lián)的微小結(jié)構(gòu)變化和/或 不同拓?fù)鋵?duì)結(jié)合不同HA的影響。如下文所論述，將從數(shù)據(jù)挖掘分析獲得的聚糖特征的 相關(guān)性定位于HA聚糖結(jié)合位點(diǎn)上，從而提供系統(tǒng)地研究H1、H3和H5 HA與a2-3和a2-6 唾液酸化聚糖(包括不同拓?fù)涞木厶?的結(jié)合的框架。
僅舉一個(gè)實(shí)例，將此框架應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的H5 HA來(lái)說(shuō)明a2-6寡糖鏈的鏈長(zhǎng)、 尤其在分枝程度的情況下如何變得比關(guān)于聚糖的結(jié)構(gòu)變化的細(xì)微差別更重要。舉例來(lái) 說(shuō)，與針對(duì)關(guān)于個(gè)別(x2-6基元的結(jié)構(gòu)變化相比較，具有單一a2-6基元的三觸結(jié)構(gòu)與具 有較長(zhǎng)a2-6基元的雙觸結(jié)構(gòu)將影響HA-聚糖結(jié)合。這可通過(guò)用于本文中從數(shù)據(jù)挖掘獲得 的a2-6基元的不同長(zhǎng)度依賴性分類器來(lái)確定(表3)。
實(shí)例4:廣譜人類結(jié)合H5HA多肽
在本發(fā)明的一些特定實(shí)施例中，HA多肽為H5多肽。在一些所述實(shí)施例中，本發(fā)明 的H5多肽展示結(jié)合(例如高親和力和/或特異性結(jié)合)傘形聚糖。在一些實(shí)施例中，將 本發(fā)明的H5多肽稱為"廣譜人類結(jié)合"(BSHB) H5多肽。
最初設(shè)計(jì)短語(yǔ)"廣譜人類結(jié)合"(BSHB)來(lái)指H5多肽結(jié)合人類上皮組織中所見(jiàn)的 HA受體且尤其結(jié)合由(x2-6唾液酸化聚糖表征的人類HA受體。如以上通常關(guān)于HA多 肽所討論，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHBH5HA多肽結(jié)合人類上呼吸道上皮細(xì)胞上 所見(jiàn)的受體。此外，本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽結(jié)合多種不同的a2-6唾液酸化聚糖。 在某些實(shí)施例中，BSHBH5HA多肽結(jié)合傘形聚糖。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHB HAHA多肽結(jié)合支氣管和/或氣管中的HA受體。在一些實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽不能結(jié)合深肺中的受體，且在其它實(shí)施例中，BSHB H5HA多肽能夠結(jié)合深肺中的受體。在其它實(shí)施例中，BSHBH5HA多肽不能結(jié)合a2-3 唾液酸化聚糖，且在其它實(shí)施例中BSHBH5HA多肽能夠結(jié)合a2-3唾液酸化聚糖。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHBH5HA多肽為母體H5HA (例如，天然流感分離 物中所見(jiàn)的H5HA)的變體。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施例中，與野生型H5HA相比較， 本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽在聚糖結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)具有至少一個(gè)氨基酸取代或具有至少一 個(gè)影響聚糖結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，所述取代為直接與所結(jié)合的聚糖 相互作用的氨基酸；在其它實(shí)施例中，所述取代為從與所結(jié)合的聚糖相互作用的氨基酸 去除的1度分離的氨基酸，這是由于去除的1度分離氨基酸(1)與直接結(jié)合氨基酸相 互作用；(2)以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，但不與聚糖本身 直接相互作用；或(3)以其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，且同 時(shí)與聚糖本身直接相互作用。本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽含有一種或一種以上直接結(jié)合 氨基酸、 一種或一種以上第一程度分離氨基酸、 一種或一種以上第二程度分離氨基酸或 所述情況的任何組合的取代。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHBH5HA多肽可含有具有 甚至更高的分離程度的一種或一種以上氨基酸的取代。
在某些實(shí)施例中，與野生型H5HA相比較，本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽具有至少 兩種、三種、四種、五種或五種以上氨基酸取代；在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHBH5 HA多肽具有兩種、三種或四種氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，所有這些氨基酸取代都 位于聚糖結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)。
在某些實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自由以下殘基組成的 群組的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代殘基98、 136、 138、 153、 155、 159、 183、 186、 187、 190、 193、 194 195、 222、 225、 226、 227和228。在其它實(shí)施例中， BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域中的氨 基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代，所述殘基包括(但不限于)殘基98、 136、 153、 155、 183、 190、 193、 194、 222、 225、 226、 227和228。在其它實(shí)施例中，BSHB: H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域的鄰近處的氨 基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代，所述殘基包括(但不限于)殘基98、 138、 186、 187、 195和228。
在其它實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自由以下殘基組成的 群組的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代殘基138、 186、 187、 190、 193、 222、 225、 226、 227和228。在其它實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選
47自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域中的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取 代，所述殘基包括(但不限于)殘基190、 193、 222、 225、 226、 227和228。在其它實(shí) 施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域 的鄰近處的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代，所述殘基包括(但不限于) 殘基138、 186、 187和228。
在其它實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自由以下殘基組成的 群組的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代殘基98、 136、 153、 155、 183、 194和 195。在其它實(shí)施例中，BSHBH5HA多肽相對(duì)于野生型H5HA在選自位于直接結(jié)合聚 糖的受體的區(qū)域中的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代，所述殘基包括 (但不限于)殘基98、 136、 153、 155、 183和194。在其它實(shí)施例中，BSHB H5 HA多 肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自位于直接結(jié)合聚糖的受體的區(qū)域的鄰近處的氨基酸的殘 基處具有一種或一種以上氨基酸取代，所述殘基包括(但不限于)殘基98和195。
在某些實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自從與所結(jié)合的聚糖 相互作用的氨基酸去除的1度分離的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代， 這是由于去除的1度分離氨基酸(1)與直接結(jié)合氨基酸相互作用；(2)以其它方式影 響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，但不與聚糖本身直接相互作用；或(3)以 其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，且同時(shí)與聚糖本身直接相互作 用，所述殘基包括(但不限于)殘基98、 138、 186、 187、 195和228。 1
在其它實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自從與所結(jié)合的聚糖 相互作用的氨基酸去除的1度分離的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代， 這是由于去除的1度分離氨基酸(1)與直接結(jié)合氨基酸相互作用；(2)以其它方式影 響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，但不與聚糖本身直接相互作用；或(3)以 其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，且同時(shí)與聚糖本身直接相互作 用，所述殘基包括(但不限于)殘基138、 186、 187和228。
在其它實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自從與所結(jié)合的聚糖 相互作用的氨基酸去除的1度分離的氨基酸的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代， 這是由于去除的1度分離氨基酸(1)與直接結(jié)合氨基酸相互作用；(2)以其它方式影 響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，但不與聚糖本身直接相互作用；或(3)以 其它方式影響直接結(jié)合氨基酸與聚糖相互作用的能力，且同時(shí)與聚糖本身直接相互作 用，所述殘基包括(但不限于)殘基98和195。
在某些實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在殘基159處具有氨基酸取代。
在其它實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽相對(duì)于野生型H5 HA在選自190、 193、 225 和226的殘基處具有一種或一種以上氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，BSHB H5 HA多肽 相對(duì)于野生型H5 HA在選自190、 193、 226和228的殘基處具有一種或一種以上氨基 酸取代。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽變體和尤其H5變體具有以下氨基酸取代 中的一者或一者以上Serl37Ala、 Lysl56Glu、 Asnl86Pro、 Aspl87Ser、 Aspl87Thr、 Alal89Gln、 Alal89Lys、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Glul90Thr、 Lysl93Arg、 Lysl93Asn、 Lysl93His、 Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Gln226Ile、 Gln226Leu、 Gln226Val、 Ser227Ala、 Gly228Ser。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HA多肽變體和尤其H5變體具有以下氨基酸取代組中 的一者或一者以上
Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp和Gln226Leu: Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gln226Leu和Gly228Ser; Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Aspl87Ser/Thr、 Alal89Gln、 Lysl93Ser、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Aspl87Ser/Thr、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gln226Leu、 Gly228Ser; Lysl93His、 Gln226Leu/Ile/Val、 Gly228Ser; Lysl93Arg、 Gln226Leu/Ile/Val、 Gly228Ser; Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Serl37Ala、 Lysl56Glu、 Alal89Lys、 Lysl93Asn、 Gly225Asp; Glul90Thr、 Lysl93Ser、 Gly225Asp;
Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp; Asnl86Pro、 Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp; Asnl86Pro、 Aspl87Thr、 Alal89Thr、 Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gly225Asp、 Ser227Ala。
在某些所述實(shí)施例中，與野生型HA相比較，HA多肽具有至少一種其它取代，使 得變體對(duì)傘形聚糖的親和力和/或特異性增加。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽具有Hl HA的胺基酸序列特征。舉
49例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，所述HI樣BSHB H5 HA多肽具有取代Glul90Asp、Lysl93Ser、 Gly225Asp和Gln226Leu。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽具有HI HA的胺基酸序列特征。舉 例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，所述H3樣BSHB H5 HA含有取代Glul90Asp、 Lysl93Ser、 Gln226Leu和Gly228Ser。
在一些實(shí)施例中，與野生型H5HA相比較，本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽具有開(kāi)放 結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHBH5HA多肽結(jié)合以下a2-6唾液酸化聚糖
(》 (》)、d)、(o^:^)、(c^^)、e^核心)、(^~核心)、
^x2;^ +六、
("Gh^"fe心)和其組合。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽結(jié)合以下結(jié)構(gòu)
的豕鵬、H )、 )、 d )和其組合；和/或(^"^);和/或(^""^");
和/或r^"核心)、r^"核心)、r^^核心)；和其組合。在一些實(shí)施例中，:
本發(fā)明的BSHBH5HA多肽結(jié)合(，)、)和/或^°~ );在一些實(shí)施例中'結(jié) 合(O^Q--)；在一些實(shí)施例中，結(jié)合C^^"—);且在一些實(shí)施例中，結(jié)合
("^i-核心)(-S^"核心)和,或("fe^核心)
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽結(jié)合傘形拓?fù)渚厶?。在某些?shí)施例中， 本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽結(jié)合圖9中所述的至少一些聚糖(例如a2-6唾液酸化聚糖)。 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHBH5HA多肽結(jié)合圖9中所述的多種聚糖。
在些實(shí)施例中，本發(fā)明的BSHB H5 HA多肽結(jié)合至少約10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95% 或95%以上的在人類上呼吸道組織(例如上皮細(xì)胞)內(nèi)的HA受體上所見(jiàn)的聚糖。
實(shí)例5:人類上呼吸道組織中的聚糖多樣性
凝集素結(jié)合研究展示a2-3和(x2-6在上呼吸道組織中的分布的多樣性。染色研究指 示ct2-6唾液酸化聚糖作為N-連接(纖毛細(xì)胞)與O連接聚糖(在杯狀細(xì)胞中)的一部 分在氣管上皮的頂面上的顯著分布(圖18)。另一方面，氣管組織的內(nèi)部區(qū)域主要包含 分布于N-連接聚糖上的a2-3。長(zhǎng)期探究何種(x2-6唾液酸化聚糖受體存在于人類肺中。
50MALDI-MS聚糖分布分析展示a2-6唾液酸化聚糖在人類上氣道上的實(shí)質(zhì)多樣性(圖 10)以及顯著表達(dá)。顯著地，使用MALDITOF-TOF的代表性質(zhì)峰的片段化證實(shí)具有多 個(gè)乳糖胺(lactosamine)重復(fù)序列的較長(zhǎng)寡糖分枝與短寡糖分枝相比廣泛地分布的聚糖 拓?fù)?圖10)。為提供上氣道中聚糖分布和拓?fù)涞亩鄻有缘膮⒖?，?duì)來(lái)自人類結(jié)腸上皮 細(xì)胞(HT29)的N-連接聚糖進(jìn)行MALDI-MS分析。已知當(dāng)前的H5N1病毒主要感染腸 管，且因此選擇這些細(xì)胞來(lái)作為代表性腸管細(xì)胞。HT29細(xì)胞的聚糖分布顯著不同于HBE 的分布，其中a2-3分布顯著且長(zhǎng)鏈寡糖分枝聚糖拓?fù)洳⒉蝗缢^察到的那樣(圖IO)。
通過(guò)以下方法產(chǎn)生圖18的數(shù)據(jù)。從美國(guó)生物科學(xué)公司(US Biological)購(gòu)買(mǎi)由福爾 馬林(Formalin)固定且由石蠟包埋的人類氣管組織切片。將組織切片去石蠟且再水合 后，使用抗生蛋白鏈菌素/生物素阻斷試劑盒(載體實(shí)驗(yàn)室(Vector Labs))來(lái)阻斷內(nèi)源 性生物素。然后，使用FITC標(biāo)記的木菠蘿凝集素(對(duì)O連接聚糖具有特異性)、生物素 化伴刀豆凝集素A (Concanavalin A) (Con A，對(duì)a連接甘露糖殘基具有特異性，所述 殘基為構(gòu)成N連接聚糖的核心寡糖結(jié)構(gòu)的-一部分)、生物素化懷槐(Maackiaamurensis) 凝集素(MAL，對(duì)SAa2，3-gal具有特異性)和生物素化西洋接骨木(Sambuccus nigra) 凝集素(SNA,對(duì)SAa2，6-gal具有特異性)(載體實(shí)驗(yàn)室；在具有0.5%吐溫-20的PBS 中10 pg/ml)將切片培育3小時(shí)。以TBST洗滌(具有1%吐溫-20的Tris緩沖生理鹽水) 后，以阿拉克斯弗洛(Alexa fluor) 546抗生蛋白鏈菌素(在具有0.5%吐溫-20的PBS 中2叫/ml)將切片培育1小時(shí)。使用TBST洗滌載玻片且在共聚焦顯微鏡(蔡斯(Zeiss) LSM510激光掃描共聚焦顯微鏡術(shù))下檢視。在室溫下(RT)進(jìn)行所有培育。
使用以下方法產(chǎn)生圖10的數(shù)據(jù)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到>90%長(zhǎng)滿時(shí)，利用100mM檸檬酸鹽 生理鹽水緩沖液收集細(xì)胞(約70乂106個(gè))，且在用蛋白酶抑制劑(卡百科姆生化公司 (Calbiochem))處理和均質(zhì)化后分離細(xì)胞膜。以PNGaseF (紐英倫生物技術(shù)公司(New England Biolabs))處理細(xì)胞膜部分且將反應(yīng)混合物在37'C下培育過(guò)夜。使反應(yīng)混合物 沸騰10min以使酶失活，并使用賽普-巾白克(Sep-Pak)C18SPE料筒(沃特世公司(Waters)) 去除經(jīng)脫糖基化的肽和蛋白。將聚糖進(jìn)一步脫鹽且使用石墨化碳固相萃取管柱(蘇普克 公司(Supelco))純化成中性(25%乙腈部分)和酸性(含有0.05%三氟乙酸的50%乙 腈)部分。使用軟電離條件(加速電壓22kV、柵極電壓93%、導(dǎo)線0.3%和150ns的萃 取延遲時(shí)間)，通過(guò)MALDI-TOFMS分別以陽(yáng)性和陰性模式分析酸性部分。將峰值校正 為未sodiated物質(zhì)。由使用唾液酸酶A和S進(jìn)行的樣本預(yù)處理證實(shí)a2-6唾液酸化聚糖 的顯著表達(dá)。然后，在37。C下，使用在lOOmL最終體積的50mM磷酸鈉(pH6.0)中 的0.1U尿節(jié)桿菌(A"/iroZ7a""i^a/ade/w)唾液酸酶(唾液酸酶A，非特異性)或肺炎鏈球菌(&repfococaw/^ewwom'ae)唾液酸酶(唾液酸酶S，對(duì)a2-3唾液酸化聚糖具 有特異性)將經(jīng)分離聚糖培育24小時(shí)。通過(guò)MALDI-TOFMS分別以陽(yáng)性和陰性模式分 析中性和酸性部分。
實(shí)例6: Hl和H3 HA與人類肺組織的劑量反應(yīng)結(jié)合
氣管組織的頂面主要表達(dá)具有長(zhǎng)分枝拓?fù)涞腶2-6聚糖。另一方面，肺泡組織主要表 達(dá)a2-3聚糖。Hl HA顯著結(jié)合氣管的頂表面且其結(jié)合隨著從40 ing/ml稀釋到10 |iig/ml 而逐漸降低(圖19)。 Hl HA僅在最高濃度下也展示與肺泡組織的某些弱結(jié)合。H3HA 的結(jié)合模式不同于Hl HA，其中H3 HA展示在40和20 pg/ml下與氣管和肺泡組織切片 顯著結(jié)合(圖19)。然而，HA在IO pg/ml的濃度下展示主要結(jié)合氣管組織的頂面且與 肺泡組織的結(jié)合很弱甚至不結(jié)合?？偟恼f(shuō)來(lái)，組織結(jié)合數(shù)據(jù)指出1) H1和H3 HA與氣 管組織的頂面的高親和力結(jié)合；和2)當(dāng)H3HA對(duì)a2-3展示親和力(比a2-6相對(duì)較低) 時(shí)，HI HA對(duì)a2-6高度特異。
使用以下方法產(chǎn)生圖19中的數(shù)據(jù)。分別從美國(guó)生物底物公司(USBiomax，Inc)和 美國(guó)生物科學(xué)公司購(gòu)買(mǎi)由福爾馬林(Formalin)固定且由石蠟包埋的人類組織肺和氣管 切片。將組織切片去石蠟、再水合且使用PBS中的1% BSA培育30分鐘以防止非特異 性結(jié)合。使H1N1和H3N2 HA分別與一級(jí)抗體(小鼠抗6X His標(biāo)記，德碩公司(Abeam)) 和二級(jí)抗體(阿拉克斯弗洛488山羊抗小鼠，美國(guó)英杰生命技術(shù)公司)以4:2:1的比率 在冰上預(yù)復(fù)合20分鐘。將所形成的復(fù)合物稀釋于1% BSA-PBS中，達(dá)到40、20或10 pg/ml 的最終HA濃度。然后，將組織切片與HA抗體復(fù)合物一起在室溫下培育3小時(shí)。將切 片用碘化丙啶(美國(guó)英杰生命技術(shù)公司；在TBST中1:100)復(fù)染色，充分洗滌且然后 在共聚焦顯微鏡(蔡斯LSM510激光掃描共聚焦顯微鏡術(shù))下檢視。
實(shí)例7:野生型HA多肽與不同拓?fù)涞木厶堑膭┝糠磻?yīng)直接結(jié)合
如本文所述，本發(fā)明包涵以下認(rèn)知HA多肽與具有本文中稱為"傘形"拓?fù)涞奶?定拓?fù)涞木厶堑慕Y(jié)合與HA多肽介導(dǎo)人類宿主的感染的能力有關(guān)。本實(shí)例描述介導(dǎo)不同 宿主感染的不同HA多肽的直接結(jié)合研究的結(jié)果且說(shuō)明人類感染與傘形聚糖結(jié)合之間的 相關(guān)性。
直接結(jié)合檢定通常使用聚糖陣列，其中通常使用聚合物主鏈?zhǔn)怪付ǖ木厶墙Y(jié)構(gòu)(例 如單價(jià)或多價(jià))呈現(xiàn)于支撐物(例如玻璃載片或孔板)上。在所謂的"序列"檢定中， 使三聚HA多肽與陣列結(jié)合且然后，例如使用經(jīng)標(biāo)記(例如經(jīng)FITC或辣根過(guò)氧化物酶 標(biāo)記)的一級(jí)和二級(jí)抗體進(jìn)行檢測(cè)。在"多價(jià)"檢定中，首先使三聚HA與一級(jí)和二級(jí) 抗體(通常以4:2:1 HA: —級(jí):二級(jí)比率)復(fù)合，使得每個(gè)預(yù)復(fù)合的HA存在12個(gè)聚糖結(jié)合位點(diǎn)，且然后使三聚HA與陣列接觸。通常在一系列HA濃度內(nèi)進(jìn)行結(jié)合檢定，以便 獲得關(guān)于對(duì)陣列中的不同聚糖的相對(duì)親和力的信息。
舉例來(lái)說(shuō)，使用具有不同聚糖的陣列進(jìn)行直接結(jié)合研究，所述聚糖諸如3'SLN、 6'SLN、 3'SLN- LN、 6'SLN-LN禾P 3'SLN-LN-LN，其中LN表示Gal P l-4GlcNAc， 3'表 示Neu5Aca2-3且6'表示Neu5Acct2-6。具體來(lái)說(shuō)，使用先前用PBS清洗三次的經(jīng)抗生蛋 白鏈菌素涂布的高結(jié)合力384孔板將生物素化聚糖(50 pi 120pmol/ml)培育過(guò)夜(在 PBS中，在4。C下)。然后，使用PBS將板洗滌三次以去除過(guò)量聚糖，且無(wú)進(jìn)一步處理 即直接使用。
以4:2:1 HA: —級(jí):二級(jí)比率，將適量的His標(biāo)記的HA蛋白、一級(jí)抗體(小鼠抗6X His 標(biāo)記)和二級(jí)抗體(HRP結(jié)合的山羊抗小鼠IgG)在冰上培育15分鐘。然后，使用PBS 中的1呢BSA將混合物(即，預(yù)復(fù)合的HA)補(bǔ)足到250 ^1的最終體積。然后，將50 pl 預(yù)復(fù)合的HA添加到384孔板中的經(jīng)聚糖涂布的孔中且在室溫下培育2小時(shí)。然后，使 用含有0.059b吐溫-20的PBS將孔洗滌3次，且然后使用PBS洗滌3次。根據(jù)制造商的 說(shuō)明書(shū)，使用埃普萊斯(Amplex)紅過(guò)氧化物酶試劑盒(美國(guó)英杰生命技術(shù)公司，加利 福尼亞(CA))來(lái)評(píng)估HRP活性。研究HA預(yù)復(fù)合物的連續(xù)稀釋液。包括適當(dāng)?shù)年幮?非 唾液酸化聚糖)和背景(無(wú)聚糖或無(wú)HA)對(duì)照，且將所有檢定重復(fù)進(jìn)行三次。將結(jié)果 提供于圖20中。
已知的人類適應(yīng)性Hl和H3 HA的結(jié)合模式的一個(gè)特征為其在從40叫/ml稀釋下降 到5 pg/ml的范圍內(nèi)在飽和水平下結(jié)合長(zhǎng)鏈a2-6 (6'SLN-LN)(圖20)。盡管HI HA對(duì) 于結(jié)合長(zhǎng)鏈a2-6高度特異，H3 HA也以高親和力結(jié)合短鏈a2-6 (6'SLN)且相對(duì)于a2-6 以較低親和力結(jié)合長(zhǎng)鏈a2-3 (圖20)。 H1禾BH3 HA的直接結(jié)合劑量反應(yīng)與組織結(jié)合模 式相一致。此外，Hl和H3 HA與長(zhǎng)鏈cx2-6的高親和力結(jié)合與其與表達(dá)具有長(zhǎng)分枝拓?fù)?的a2-6聚糖的氣管組織的頂面的廣泛結(jié)合有關(guān)。此相關(guān)性提供對(duì)人類適應(yīng)Hl和H3 HA 的上呼吸道組織嗜性的有益洞察。另一方面，所測(cè)試H5HA展示相反的聚糖結(jié)合趨勢(shì)， 其中與對(duì)a2-6的相對(duì)低親和力(顯著信號(hào)僅在20-40 pg/ml下可見(jiàn))相比，其以高親和 力結(jié)合a2-3 (飽和信號(hào)從40下降到2.5 |ag/ml)(圖20)。
等效物
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)將認(rèn)識(shí)到或能夠確定本文所述的本發(fā)明的特定 實(shí)施例的許多等效物。本發(fā)明的范圍不打算限于上述實(shí)施方式，而是如隨附權(quán)利要求中 所述。
權(quán)利要求
1.一種工程化HA多肽，其結(jié)合傘形拓?fù)渚厶恰?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化HA多肽，其中所述傘形拓?fù)渚厶前琣2-6唾液酸化聚糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以高親和力結(jié)合所述傘形拓?fù)渚厶恰?br> 4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以與介導(dǎo)人類感染的野生型人類適應(yīng)性HA的親和力相當(dāng)?shù)挠H和力結(jié)合所述傘形拓?fù)渚厶恰?br> 5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以為介導(dǎo)人類感染的野生型HA的親和力的至少50%的親和力結(jié)合所述傘形拓?fù)渚厶恰?br> 6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以為介導(dǎo)人類感染的野生型HA的親和力的至少70%的親和力結(jié)合所述傘形拓?fù)渚厶恰?br> 7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以為介導(dǎo)人類感染的野生型HA的親和力的至少80%的親和力結(jié)合所述傘形拓?fù)渚厶恰?br> 8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以為介導(dǎo)人類感染的野生型HA的親和力的至少90%的親和力結(jié)合所述傘形拓?fù)渚厶恰?br> 9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以為介導(dǎo)人類感染的野生型HA的親和力的至少100%的親和力結(jié)合所述傘形拓?fù)渚厶恰?br> 10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的工程化HA多肽，其中與錐形拓?fù)渚厶窍啾容^，所述HA多肽優(yōu)選地結(jié)合所述傘形拓?fù)渚厶恰?br> 11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少為2的相對(duì)親和力相對(duì)于錐形拓?fù)渚厶墙Y(jié)合傘形拓?fù)渚厶恰?br> 12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少為3的相對(duì)親和力相對(duì)于錐形拓?fù)渚厶墙Y(jié)合傘形拓?fù)渚厶恰?br> 13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少為4的相對(duì)親和力相對(duì)于錐形拓?fù)渚厶墙Y(jié)合傘形拓?fù)渚厶恰?br> 14. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少為5的相對(duì)親和力相對(duì)于錐形拓?fù)渚厶墙Y(jié)合傘形拓?fù)渚厶恰?br> 15. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的工程化HA多肽，其中所述HA多肽以至少為IO的相對(duì)親和力相對(duì)于錐形拓?fù)渚厶墙Y(jié)合傘形拓?fù)渚厶恰?br> 16. —種結(jié)合傘形拓?fù)渚厶堑慕?jīng)分離HA多肽，所述HA多肽不為來(lái)自以下任一菌株的Hl蛋白A/南卡羅來(lái)納(South Carolina) /1/1 918 、 A/波多黎各(Puerto Rico) /8/1934 、A/臺(tái)灣(Taiwan)/1/1986、 A/得克薩斯(Texas)/36/1991、 A/北京(Beijing)/262/1995、A/約翰內(nèi)斯堡(Johannesburg)/92/1996、 A/新咯里多尼亞(New Caledonia)/20/1999、A/所羅門(mén)群島(Solomon Islands) /3/2006;或來(lái)自以下任一菌株的H2蛋白A/日本(^口&11)/305+/1957、八/新加坡"11^&口(^)/1/1957、八/臺(tái)灣/1/1964、八/臺(tái)灣/1/1967;或來(lái)自以下任一菌株的H3蛋白A/愛(ài)知(Aichi) /2/1968、 A/菲律賓(Phillipines)/2/1982、 A/密西西比(Mississippi) /1/1985、 A/列寧格勒(Leningrad) /360/1986、A/四川(Sichuan) /2/1987、 A/上海(Shanghai) /11/1987、 A/北京/353/1989、 A/山東(Shandong) /9/1993、 A/約翰內(nèi)斯堡/33/1994、 A/南昌(Nanchang) /813/1995、A/悉尼(Sydney) /5/1997、 A/莫斯科/10/1999、 A/巴拿馬(Panama) /2007/1999、A/懷俄明(Wyoming) /3/2003、 A/俄克拉荷馬(Oklahoma) /323/2003、 A/加利福尼亞(California) /7/2004、 A/威斯康星(Wisconsin) /65/2005。 '
17. —種工程化HA多肽的特征部分，其結(jié)合傘形拓?fù)渚厶恰?.
18. —種HA多肽的特征部分，所述HA多肽不為來(lái)自以下任一菌株的H1蛋白A/南卡羅來(lái)納/1/1918、 A/波多黎各/8/1934、 A/臺(tái)灣/1/1986、 A/得克薩斯/36/1991 、 A/北京/262/1995、 A/約翰內(nèi)斯堡/92/1996、 A/新喀里多尼亞/20/1999、 A/所羅門(mén)群島/3/2006;或來(lái)自以下任一菌株的H2蛋白A/日本/305十/1957、 A/新加坡/1/1957、A/臺(tái)灣/1/1964、 A/臺(tái)灣/l/1967;或來(lái)自以下任一菌株的H3蛋白A/愛(ài)知/2/1968、-A/菲律賓/2/1982、 A/密西西比/1/1985、 A/列寧格勒/360/1986、 A/四川/2/1987、 A/上海/11/1987、 A/北京/353/1989、 A/山東/9/1993、 A/約翰內(nèi)斯堡/33/1994、 A/南昌/813/1995、 A/悉尼/5/1997、 A/莫斯科/10/1999、 A/巴拿馬/2007/1999、 A/福建(Fujian)/411/2002、 A/懷俄明/3/2003、 A/俄克拉荷馬/323/2003、 A/加利福尼亞/7/2004、 A/威斯康星/65/2005，其中所述特征部分結(jié)合傘形拓?fù)渚厶恰?br> 19. 一種多肽，其包含根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的特征部分。
20. —種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的特征部分。
21. —種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求19所述的多肽。
22. —種載體，其含有根據(jù)權(quán)利要求20所述的核酸。
23. —種載體，其含有根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸。
24. —種宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求20所述的核酸。
25. —種宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸。
26. —種宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求22所述的載體。
27. —種宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求23所述的載體。
28. —種抗體，其與結(jié)合傘形拓?fù)渚厶堑墓こ袒疕A多肽結(jié)合。
29. —種抗體，其結(jié)合HA多肽，所述HA多肽不為來(lái)自以下任一菌株的H1蛋白A/南卡羅來(lái)納/1/1918、 A/波多黎各/8/1934、 A/臺(tái)灣/1/1986、 A/得克薩斯/36/1991 、 A/北京/262/1995、 A/約翰內(nèi)斯堡/92/1996、 A/新瞎里多尼亞/20/1999、 A/所羅門(mén)群島/3/2006;或來(lái)自以下任一菌株的H2蛋白八/日本/305+/1957、 A/新加坡/1/1957、A/臺(tái)灣/1/1964、 A/臺(tái)灣/l/1967;或來(lái)自以下任一菌株的H3蛋白A/愛(ài)知/2/1968、A/菲律賓/2/1982、 A/密西西比/1/1985、 A/列寧格勒/360/1986、 A/四川/2/1987、 A/上海/U/1987、 A/北京/353/1989、 A/山東/9/1993、 A/約翰內(nèi)斯堡/33/1994、 A/南昌/813/1995、 A/悉尼/5/1997、 A/莫斯科/10/1999 、 A/巴拿馬/2007/1999 、 A/福建/411/2002、 A/懷俄明/3/2003、 A/俄克拉荷馬/323/2003、 A/加利福尼亞/7/2004、 A/威斯康星/65/2005,其中所述HA多肽結(jié)合傘形拓?fù)渚厶恰?br> 30. 根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的抗體，所述抗體為多克隆的。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的抗體，所述抗體為單克隆的。
32. —種病毒顆粒，其包括結(jié)合傘形拓?fù)渚厶堑墓こ袒疕A多肽。
33. —種通過(guò)投與組合物來(lái)治療流感感染的方法，所述組合物包含以下各物結(jié)合傘形拓?fù)渚厶堑墓こ袒疕A多肽、包含結(jié)合傘形拓?fù)渚厶堑墓こ袒疕A多肽的特征片段的多肽、與結(jié)合傘形拓?fù)渚厶堑墓こ袒疕A多肽或其特征部分結(jié)合的抗體、編碼結(jié)合傘形拓?fù)渚厶堑墓こ袒疕A多肽或其特征部分的核酸，或其組合。
34. —種聚糖陣列，其包含至少約10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、'50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或95%以上的在人類上呼吸道組織內(nèi)的HA受體上所見(jiàn)的聚糖結(jié)構(gòu)。
35. —種用于鑒別或表征HA多肽的方法，所述方法包含以下步驟提供含有HA蛋白的樣本；使所述樣本與根據(jù)權(quán)利要求26所述的聚糖陣列接觸；和檢測(cè)HA與所述陣列上的一種或一種以上聚糖的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于分析聚糖與結(jié)合其的相互作用搭配物之間的相互作用的系統(tǒng)。本發(fā)明同時(shí)提供結(jié)合傘形拓?fù)渚厶堑腍A多肽和其相關(guān)試劑和方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK101553502SQ200780030072
公開(kāi)日2009年10月7日 申請(qǐng)日期2007年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月14日
發(fā)明者S·拉古拉姆, 卡西克·維斯瓦那坦, 拉姆·薩西謝卡爾安, 拉胡爾·拉曼, 維斯瓦那坦·薩西謝卡爾安, 阿爾特·錢(qián)德拉塞卡朗, 阿拉溫德·斯里尼瓦桑 申請(qǐng)人:麻省理工學(xué)院