專利名稱：：一種非洲馬瘟檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種非洲馬瘟檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，尤指采用ELISA方法檢測(cè)非洲馬瘟病毒抗體的抗原制備、純化，檢測(cè)試劑盒和方法，不僅適用于感染后對(duì)馬科動(dòng)物血清中的非洲馬瘟病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)，也適用于非洲馬瘟病毒疫苗免疫后的抗體評(píng)價(jià)，屬于動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：非洲馬瘟(Africanhorsesickness,AHS)是馬科動(dòng)物的一種由節(jié)肢動(dòng)物傳播的非接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(0IE)列為A類重大傳染病，我國也將其列為一類重大動(dòng)物疫病。病原為非洲馬瘟病毒(AHSV)，該病原屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬(fe^^'ra^e鼎s，Weow'nVae)。環(huán)狀病毒屬不同的血清群可根據(jù)主要的群特異性抗原VP7的抗原性來鑒別。對(duì)于易感馬群，感染本病后致死率可達(dá)95%。以呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的病理變化為特征；騾的易感性稍差，而驢感染后很少發(fā)生死亡。斑馬感染后通常不出現(xiàn)癥狀，可成為自然貯存宿主攜帶和傳播病原。病原的傳播媒介為Cullicoidesspecies。本病在非洲的撒哈拉地區(qū)呈地方流行，呈季節(jié)性發(fā)生，但歷史上本病在摩洛哥(1992)，中東(1960)和歐洲(1992)的暴發(fā)給馬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于本病的巨大破壞性，在國際上進(jìn)行馬的運(yùn)輸過程中，尤其是在無AHS的地區(qū)，應(yīng)執(zhí)行嚴(yán)格的獸醫(yī)衛(wèi)生措施。南非在控制AHS時(shí)，主要采用給易感動(dòng)物接種多價(jià)活疫苗的免疫措施，并定期進(jìn)行檢測(cè)。目前已發(fā)現(xiàn)非洲馬瘟病毒具有9個(gè)血清型。與環(huán)狀病毒的原型病毒一一藍(lán)舌病(BTV)相似，非洲馬瘟病毒沒有囊膜，具有3層呈二十面體對(duì)稱的衣殼。病毒基因組包含10個(gè)dsRNA片段，編碼IO種蛋白，其中的7種為結(jié)構(gòu)蛋白和4種非結(jié)構(gòu)蛋白。病毒粒子的外衣殼由VP2和VP5組成，內(nèi)衣殼由VP3和VP7組成，其中VP7為主要的內(nèi)衣殼蛋白，在9個(gè)血清型的病毒中最為保守，為群特異性抗原蛋白。對(duì)AHSV感染馬匹和免疫接種馬匹進(jìn)行快速的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)對(duì)決定是否對(duì)馬匹進(jìn)行運(yùn)輸極為重要。病毒分離鑒定是對(duì)本病進(jìn)行準(zhǔn)確診斷的傳統(tǒng)方法，但病毒分離鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要一定的工作經(jīng)驗(yàn)。傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷方法包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)以及病毒中和試驗(yàn)(VN)。但VN相當(dāng)繁瑣，而且需要有標(biāo)準(zhǔn)的參考毒株，特定型的血清，因此目前很少采用該方法，只有較少的國際參考實(shí)驗(yàn)室采用此方法。目前廣泛采用CF檢測(cè)AHS群特異性抗體，而且該方法也是(OfficeInternationaldesEpizooties，OIE)推薦的在國際貿(mào)易中使用的方法，但改方法同樣需要標(biāo)準(zhǔn)化的抗原和血清，而且方法相對(duì)繁瑣，不適于大批量血清的篩査。而檢測(cè)群特異性抗體的ELISA方法和快速的核酸檢測(cè)方法有望解決這些問題。目前已有一些研究致力于建立可檢測(cè)AHSV和其抗體的ELISA方法，大多數(shù)用于檢測(cè)AHSV抗原的ELISA方法使用哺乳動(dòng)物的多抗，單抗或禽源抗體。而抗體檢測(cè)方法主要采用純化病毒制備抗原的方法。同重組抗原方法相比，純化等量的全病毒或病毒亞單位相對(duì)更為耗時(shí)和昂貴。VP7抗原穩(wěn)定而且不具有感染性，適合于作為ELISA檢測(cè)的抗原。SonjaMareea等于2005采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)的VP7蛋白建立了ELISA檢測(cè)方法，但目前尚未有采用原核表達(dá)的重組蛋白建立ELISA檢測(cè)方法。目前已報(bào)道的采用可溶性或重組抗原建立的ELISA方法尚有一些缺點(diǎn)抗原制備費(fèi)時(shí)且昂貴；抗原的特異性評(píng)價(jià)不充分等。為進(jìn)一步建立能滿足國際貿(mào)易需求的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試劑，我們開展了本研究。本研究利用IPTG對(duì)含有VP7蛋白抗原域的原核表達(dá)載體pET-30a-VP7進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果得到了目的融合蛋白，經(jīng)包涵體的洗滌、溶解和復(fù)性，獲得較高純度的目的蛋白，同時(shí)，通過方陣滴定初步建立了檢測(cè)AHSV抗體的間接ELISA方法，并對(duì)臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)，為試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化和商品化奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明首次采用原核表達(dá)的重組蛋白應(yīng)用于非洲馬瘟病毒抗體的檢測(cè)，制備純化了重組蛋白，建立了間接ELISA檢測(cè)方法，研制出了檢測(cè)試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是人工拼接一段含有非洲馬瘟病毒VP7蛋白大多數(shù)線性表位的核酸片段，并實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá)。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是將表達(dá)的重組蛋白純化，作為包被抗原，建立重組間接ELISA方法。本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是研制出重組間接ELISA檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案人工拼接一段含有非洲馬瘟病毒VP7蛋白大多數(shù)線性表位的核酸片段，為序列表SEQIDNo.29所示的核苷酸序列。1)AHSVVP7編碼基因的序列分析本發(fā)明選擇非洲馬瘟病毒VP7基因編碼區(qū)作為靶區(qū)域，采用在線軟件NetNGlyc1.0Server,査詢AHSVVP7編碼基因中相對(duì)于大腸桿菌的稀有密碼子，將查詢得到的稀有密碼子改為大腸桿菌所偏好的密碼子，以利于基因的原核表達(dá)。2)AHSVVP7編碼基因拼接合成根據(jù)己發(fā)表的AHSVVP7編碼基因序列，合成25條長度為50nt的引物，相鄰的正向和反向引物存在10bp的重疊，采用雙不對(duì)稱PCR(DualasymmetricalPCR，DA-PCR)和重疊PCR(OverlapextensionPCR，OE-PCR)進(jìn)行序列的拼接，引物序列見表l。表1用于VP7基因拼接的引物引物名稱序列Fl5'-attagatctgacagatgcgcgtgttagcttggatccaggagtgatggaga-3'F25'-gtttaacgaatcattcggtatcgatgcgtccacaaacccaagcagaacgt-3'F35'-gttttagcggcattgaacgtccaaattgggaatattteaccagattatga-3'F45'-aacgactgaaattccatataatgtteaggccatgaatgacatcgttegta-3'F55'-gcaaagtacagaegggaccttatgcaggagcagttgaggtgcaacaatct-3'F65'-cgtggtgggtacattaatteaaatattgetgaagtgtgtatggatgcagg-3'F75'-cccacgtegtggggacgcagtcatgatetattttgtttggcgtccattgc-3'F85'-ttgaaagcgetccaggggetccagggacttttgteaccgttgatggagta-3'F95'-aataccattgcaccagtgaatgttggaaatcctggggcacgccgtteaat-3'F105'-tttggategttcgetggacacggttccggaattggctccaacgetcacac-3'Fll5'-acgcattacgcgctgteatttttcageagatgaatatgcageetattaat-3'F125'-gaaattgttgcgtatctgttattagtagettctttagetgatgtgtatgc-3'Rl5'-cttgtcgacttaattcatacggaaatctggacgcaaagecgcatacacat-3'R25'-caacaatttcattacgttcagteggtggaaaaattggcggattaataggc-3'R35'-cgtaatgcgtgccaagtcggagaaacatacgcataacaacgtgtgagegt-3'R45'-acgatccaaagacgtataccataacacttcaaactgtaaaattgaacggc-3'R55'-caatggtattccatgcgacgacatetccagccgcaacatttaetccatca-3'R65'-gcgcttteaagtgacgcaccttgaggateacaaaagatacgcaatggacg-3'R75'-acgacgtggggccagcagcgcattgacctgtcccgcagegectgcatcca-3'<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>釆用三步法拼接目的片段。第一步為DA-PCR，在此驟中，每4條連續(xù)的引物混合用于合成12個(gè)分別為150bp的片段，4條引物分為2條外引物和2條內(nèi)引物。外引物摩爾數(shù)是內(nèi)引物摩爾數(shù)的5倍，這樣可以充分消耗內(nèi)引物，生成的主產(chǎn)物為最長的150bp的片段。在第二步中，將這些獲得的12個(gè)片段混合后，經(jīng)酚氯仿抽提后，用乙醇進(jìn)行沉淀，由于DA-PCR產(chǎn)物長于寡核苷酸引物，因此純化后的產(chǎn)物中DA-PCR產(chǎn)物比例顯著高于寡核苷酸引物，這樣在進(jìn)行OE-PCR時(shí)可有效合成全長的目的片段，然后在第三步進(jìn)行常規(guī)PCR時(shí)，就可擴(kuò)增出全長的目的片段。將經(jīng)預(yù)測(cè)后含所有抗原位點(diǎn)的VP7基因片段分解成25個(gè)寡核苷酸片段，每個(gè)引物長50nt，相鄰片段的5'端和3'端存在10nt的重疊，引物序列見表1，反應(yīng)體系如下滅菌水31.0pllOXPfu緩沖液(含Mg2+)5.0pldNTPs(2.0Mm)5.0pi外正向引物(5pM)2.0^1外反向引物(5pM)2.0^1內(nèi)正向引物(5pM)0.4^1內(nèi)反向引物(5pM)0.4|xlPfu酶(5U小1)l.O(il反應(yīng)參數(shù)為94°C/20s，45°C/15s，72°C/30s;共20個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5^1進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下進(jìn)行觀察。將上述DA-PCR各管中的擴(kuò)增產(chǎn)物各5.(^l混合于一個(gè)管中，加入滅菌水至總體積30(^1，然后用等體積的酚一氯仿一異戊醇(體積比為25:24:1)進(jìn)行抽提，12OOOg離心5min，吸取上清加入卯Opl無水乙醇，于—2(TC沉淀30min，然后12000g離心15min，吸棄上清后，于室溫干燥10min，然后配成下述反應(yīng)體系滅菌水79.0pllOXPfu緩沖液(含Mg2+)10.0^1dNTPs(2崖m)10.0nlPfu酶(5U/pl)LOW反應(yīng)參數(shù)為94°C/30s，68°C/2min;15個(gè)循環(huán)。將上述產(chǎn)物作為模板，用2個(gè)最外側(cè)引物進(jìn)一步擴(kuò)增全長目的片段，反應(yīng)體系如下:滅菌水28.0^110XPfu緩沖液(含Mg2+)5.0^1dNTPs(2.0Mm)5.0/il最外正向引物F1(5pM)5.0^最外反向引物R1(5pM)5.0pi模板i.owPfu酶(5U/|_il)l.Oial反應(yīng)參數(shù)為94°C/20s,55°C/20s，72'C/90s;共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5(il進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下進(jìn)行觀察。3)AHSVVP7編碼基因克隆和序列分析將擴(kuò)增得到的目的片段用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化后，分別用限制性內(nèi)切酶Sail和BglII對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和pET—30a進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下滅菌水10.0(^110XH緩沖液3.0plPET—30a15単Saill単BglIIl単然后用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中，于37'C條件下過夜培養(yǎng)。第2天挑取菌落于LB中37'C培養(yǎng)8h，然后吸取菌液分別用F1,R1;以及F3，R3引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系同2.6.3。將鑒定為陽性的菌落送TaKaRa公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)得的序列與預(yù)計(jì)合成的序列片段進(jìn)行比較。4)AHSVVP7編碼基因的改造和定點(diǎn)突變根據(jù)拼接獲得的AHSVVP7編碼基因序列，合成以下4條引物(見表2)，采用3次PCR以突變序列中的插入突變。表2用于VP7基因序列突變的4條引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>第1次和第2次PCR分別用AHV-DF1和AHV-DMR1;AHV-DMF1禾QAHV-DR1擴(kuò)增相互交疊的兩個(gè)片段，反應(yīng)體系如下滅菌水28.0|J10XPfu緩沖液(含Mg2+)5.0pidNTPs(2細(xì)m)5.0piAHV-DF1或AHV-DMF1(5)5.0piAHV-DMR1或AHV-DR1(5^M)5.0pi模板1.0piPfu酶(5U/|al)l単反應(yīng)參數(shù)為94°C/20s，55°C/20s，72°C/60s;共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5pl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下進(jìn)行觀察。將目的片段分別用瓊脂糖凝膠進(jìn)行回收，將兩種片段的產(chǎn)物等體積混合，用引物AHV-DF1和AHV-DR1進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)同上。反應(yīng)結(jié)束后，取5pl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下進(jìn)行觀察。將獲得的目的片段和載體分別用克隆用限制性內(nèi)切酶Sail和BglII酶切后，克隆于pET—30a，進(jìn)行序列分析，將測(cè)得的序列與預(yù)計(jì)合成的序列片段進(jìn)行比較。下面為經(jīng)過拼接獲得的基因序列:1ATGCACCATCATCATCATGATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGGGGTTCTGGTATGAAAGAA61ACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGATATAATGTT121GAGGCCATGAATGACATCGTTCGTATCACGGGTCAAATGGAAACATTCGGACCAAGCAAA181GTACAGACGGGACCTTATGCAGGAGCAATTGAGGTGCAACAATCTGGCCGTTATTACGTA241GCGCAAGGTCGTACACGTGGTGGGTACATTAATTCAAATATTGCTGAAGTGTGTATGGAT301GCAGGCGCTGCGGGACAGGTGAATGCGGTGCTGGGCCCACGTCGTGGGGACGCAGTCATG361ATCTATTTTGTTTGGCGTCCATTGCGTATCTTTTGTGATCCTCAAGGTGCGTCACTTGAA421AGCGCTCCAGGGGCTCCAGGGACTTTTGTCACCGTTGATGGAGTAAATGTTGCGGCTGGA481GATGTCGTCGCATGGAATACCATTGCACCAGTGAATGTTGGAAATCCTGGGGCAGGCCGT541TCAATTTTACAGTTTGAAGTGTTATGGTATACGTCTTTGGATCGTTCGCTGGACACGGTT601CCGGAATTGGCTCCAACGCTCACACGTTGTTATGCGTATGTTTCTCCGACTTGGCACGCA661TTACGCGCTGTCTAA5)重組AHSVVP7的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒Pet-30a-AHSVVP7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21宿主菌后，挑取單菌落接種于3.0mLLB培養(yǎng)基中，活化過夜后，按1:100接種于100mL培養(yǎng)基中，37。C，250rpm振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(OD60(^0.6左右)，加入終濃度為O.lmM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后lh，2h，3h，取菌液l.OmL，5000rpm離心10min，收集菌體，加入2XSDS上樣緩沖液，煮沸5min，用12%SDS-PAGE膠檢查。取誘導(dǎo)表達(dá)菌100mL，5000rpm離心10min，收集菌體，用BugBusterProteinExtractionReagent(Novagen產(chǎn)品)洗滌菌塊后，用包涵體溶解液(50mMTris-Cl，100mMNaCl，lmMEDTA，0.5%TritonX-100,8M尿素，pH9.0)溶解沉淀，冰上作用l一2h，其間不斷振蕩。4'C12000g離心15min，收集上清和菌體裂解后的上清，加入2XSDS上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢查溶解包涵體后上清以及菌體裂解后上清中的蛋白。將溶解的上清裝入已經(jīng)處理好的透析袋中，置于復(fù)性緩沖液中(1XPBS，lmMEDTA，尿素，pH8.0)在4"C條件下進(jìn)行梯度透析，復(fù)性緩沖液中尿素濃度依次遞減(尿素濃度分別為4.5M，3.5M,2.5M，1.5M，0.5M，0M)，換液間隔時(shí)間1012h。將透析后的蛋白溶液上清于4。C12000g離心15min，收集上清，過濾除菌后，小份分裝，保存于一8(TC。將純化的蛋白作1:100稀釋后，用分光光度計(jì)分別測(cè)定260nm和280nm的吸光度值，按下式計(jì)算蛋白濃度蛋白質(zhì)濃度=(mg/ml)二(1.45XA280—0.74XA260)X稀釋倍數(shù)6)重組蛋白的抗原性鑒定將NC膜用蒸餾水浸泡后晾干，分別用2pL87.4嗎/mL的純化蛋白滴加于上膜上，晾干，將NC膜置于含1X卵清蛋白的PBST封閉液中，室溫輕搖35h后4'C封閉過夜。棄去封閉液，用PBST浸泡洗滌3遍，加入1:10的陽性血清中，室溫下震蕩1.5h。用PBST浸泡洗滌3遍，加入1:500稀釋的HRP酶標(biāo)蛋白G溶液中，室溫振蕩lh，用PBST浸泡洗滌3遍，置于底物中顯色，至斑點(diǎn)清晰后，用蒸餾水終止顯色。用濃度分別為43.7pg/mL，21.9(ig/mL，10.9pg/mL，5.45pg/mL，2.73|ag/mL，1.36嗎/mL，0.68嗎/mL以及0.3化g/mL的蛋白包被酶標(biāo)板，1(%117孔，包被條件為4'C條件下過夜，之后用含lX卵清蛋白的PBST封閉液37。C封閉2h，用用PBST洗滌3遍，拍干后，于4'C條件下備用。分別用陽性血清和陰性血清作l:20稀釋后，加lOO)aL于板上，37。C作用lh，用PBST洗滌3遍，拍干后，加入1:2000稀釋的HRP酶標(biāo)蛋白G溶液lOO^L,37。C作用lh，用PBST洗滌3遍，加入ABT底物溶液100pL，室溫避光作用15min，用100pL2MH2S04終止反應(yīng)，用405nm濾光片讀取OD值。7)重組ELISA方法的建立用包被液將提純得到的重組蛋白抗原分別作200倍(43.7嗎/mL)，400倍(21.9|_ig/mL)，800倍(10.9pg/mL)，1600倍(5.45|ag/mL)，3200倍(2.73嗎/mL)，6400倍(1.36嗎/mL)，12800倍(0.68嗎/mL)，25600(0.34嗎/mL)倍以及51200(0.17pg/m_L)倍9個(gè)倍比稀釋度，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，包被條件為4'C條件下過夜，用血清稀釋液將陽性血清及陰性血清作1:20,1:40，1:80，1:160倍比稀釋，進(jìn)行方針滴定，作ELISA測(cè)定，方法同上，從而確定抗原最適包被濃度和血清稀釋度。以最適濃度抗原包被酶標(biāo)板，100pL/孔，分成2組第1組為37°Clh，然后于4。C條件下過夜；第2組，僅為4。C條件下過夜。作ELISA測(cè)定，方法同上，從而確定最佳包被條件。由于我們采用的酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組蛋白G，因此我們使用了兩種適用于此酶標(biāo)抗體的封閉液，比較封閉效果。一種為含1X明膠的PBST封閉液，另一種為含有1°"卵清蛋白的PBST封閉液。100pL/L，37。C封閉2h，對(duì)最適稀釋的陰陽性血清作ELISA測(cè)定，方法同上，從而確定合適的封閉液。隨機(jī)取30份進(jìn)口馬血清，經(jīng)非洲馬瘟阻斷ELISA試劑盒檢測(cè)為非洲馬瘟抗體陰性，作1:40稀釋，用已經(jīng)建立的間接ELISA方法檢測(cè)，每份血清重復(fù)2孔，讀取OD值，計(jì)算出血清的OD值平均值，和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，陰陽性臨界值等于陰性血清OD平均值X+3XSD，從而算出陰陽性臨界值。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，可以在99.9%的置信水平上判定為陽性。以最適濃度抗原包被酶標(biāo)板，對(duì)收集到的馬傳染性貧血病毒陽性血清，馬鼻肺炎病毒陽性血清以及藍(lán)舌病病毒陽性血清作1:40稀釋，作ELISA測(cè)定，方法同上，從而驗(yàn)證方法的特異性。用建立的間接ELISA方法檢測(cè)2000年以來進(jìn)口馬血清184份，并與西班牙INGENASA公司生產(chǎn)的非洲馬瘟阻斷ELISA試劑盒進(jìn)行比較。一種檢測(cè)血清中非洲馬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒，由以下組分組成1)包被有非洲馬瘟病毒抗原的重組酶標(biāo)反應(yīng)板將純化的重組蛋白用包被液(pH9.6的碳酸鹽緩沖液)稀釋為0.20嗎/mL，100pL/孔加入酶標(biāo)反應(yīng)板，包被條件為37°Clh，然后于4'C條件下過夜；棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液(PBST)洗滌3遍，排干反應(yīng)板，加入1%明膠，100pL/孔，37'C封閉2h，棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液(PBST)洗滌3遍，排干反應(yīng)板，然后真空包裝，存于4'C;2)樣品稀釋液1%卵清蛋白溶液，取卵清蛋白lg，溶于100mL1XPBST緩沖液中；3)IOX濃縮洗滌液IOX濃縮的PBST洗滌液(含0.5%Tween-20的O.01mol/L、pH7.4的PBS);4)陽性對(duì)照，非洲馬瘟病毒陽性血清，用樣品稀釋液稀釋至用本方法檢測(cè)的OD值為1.0+/-0.1的范圍內(nèi)；5)陰性對(duì)照，非洲馬瘟病毒抗體呈陰性的馬血清，用樣品稀釋液作l:40稀釋；6)底物稀釋液，含0.15mg/mL尿素過氧化氫的磷酸鹽檸檬酸緩沖液(PH5.0，24.3ml0.1M檸檬酸溶液加入到25.7ml0.2M磷酸鈉溶液中，用純水定容至100mL);7)lOX濃縮ABTs底物液lOmgABTs溶于lmL的底物稀釋液中；8)2000X濃縮辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組蛋白G:HRP標(biāo)記的recProteinG;9)終止液，1XSDS溶液。一種檢測(cè)非洲馬瘟病毒抗體的間接ELISA方法如下1)用樣品稀釋液40倍稀釋被測(cè)樣品(例如10nl樣品加39(Vl樣品稀釋液)；不稀釋陽性和陰性對(duì)照。取每個(gè)樣品后都要更換吸頭，準(zhǔn)確記錄每個(gè)樣品在板上的位置。每個(gè)樣品應(yīng)在添加到包被板前混勻；2)使用前所用試劑應(yīng)恢復(fù)至室溫。試劑應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)或振蕩予以混合。濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖動(dòng)使沉淀鹽溶解。使用前濃縮洗滌液應(yīng)用蒸餾水或去離子水IO倍稀釋；3)取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣本的位置；在Al孔內(nèi)分別加入100iil沒有稀釋的陰性對(duì)照；在Bl的孔內(nèi)分別加入10(Hil沒有稀釋的陽性對(duì)照。在其余孔內(nèi)分別加入100ul已稀釋好的樣本；4)37'C下孵育1小時(shí)(濕盒內(nèi))；5)吸取各孔的液體棄入廢液筒；用大約350)al洗滌液洗滌板孔，重復(fù)4次；每次洗滌后應(yīng)吸去孔內(nèi)的液體；注意應(yīng)避免包被板孔干燥；在最后一次洗滌液吸去后，將每塊板中殘留的洗滌液扣拍到吸水材料上；6)稀釋酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗用樣品稀釋液作1:2000稀釋；每孔加入100pl稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗；7)37'C下孵育1小時(shí)(濕盒內(nèi))。重復(fù)上面的步驟5);8)每孔加入100iiLABTs底物液，室溫下孵育15分鐘；每孔加入100nL終止液，使反應(yīng)終止；測(cè)量并且記錄樣本和對(duì)照的OD值(405nm);9)結(jié)果判定符合下列條件，實(shí)驗(yàn)方能有效陽性對(duì)照的值必須大于或等于0.5，陰性對(duì)照值必須小于或等于0.250。如果試驗(yàn)無效，試驗(yàn)中的操作值得懷疑，試驗(yàn)應(yīng)重做，并應(yīng)全面的仔細(xì)核對(duì)各組份。AHSV抗體的臨界值為計(jì)算為陰性對(duì)照+0.25。如果測(cè)定的OD值低于臨界值，樣品應(yīng)判為AHSV抗體陰性。如果測(cè)定的OD值低于臨界值，樣品應(yīng)判為AHSV抗體陽性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明選擇非洲馬瘟病毒保守的VP7內(nèi)衣殼蛋白作為目標(biāo)，采用人工拼接的方式獲得了含大多數(shù)線性表位的部分VP7蛋白，并實(shí)現(xiàn)了在原核系統(tǒng)的高效表達(dá)，建立了間接ELISA檢測(cè)方法并研制出試劑盒，取得了優(yōu)異的技術(shù)效果1)簡(jiǎn)便快速可快速的對(duì)馬科動(dòng)物的非洲馬瘟病毒抗體作出評(píng)價(jià)。2)適用范圍廣由于表達(dá)的蛋白為非洲馬瘟的群特異性抗原蛋白，因此可檢測(cè)9個(gè)型非洲馬瘟病毒誘導(dǎo)的抗體，不僅可用于感染動(dòng)物的檢測(cè)，還可用于免疫動(dòng)物的抗體評(píng)價(jià)。3)特異與同屬的藍(lán)舌病病毒陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。4)穩(wěn)定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。5)安全不接觸病毒，不具有生物安全問題。下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為目的基因片段拼接原理圖。圖2為DA-PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖3為OE-PCR及最終擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果。圖4為重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果。圖5為用以糾正插入和缺失的PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖6為糾正插入和缺失后的測(cè)序結(jié)果。圖7為表達(dá)于BL21的重組AHSVVP7SDS-PAGE電泳分析結(jié)果。圖8為Dot-ELISA評(píng)價(jià)重組蛋白的抗原性結(jié)果。圖9為ELISA評(píng)價(jià)重組蛋白的抗原性結(jié)果。閣10為研制的非洲馬瘟抗體檢測(cè)ELISA試劑盒外觀。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:試劑盒的配制和使用1.試劑盒的外觀見圖l，配制組成見表3。表3試劑盒配制組成<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.試劑盒的使用方法1)用樣品稀釋液40倍稀釋被測(cè)樣品(例如10nl樣品加390nl樣品稀釋液)。不稀釋陽性和陰性對(duì)照。取每個(gè)樣品后都要更換吸頭，準(zhǔn)確記錄每個(gè)樣品在板上的位置。每個(gè)樣品應(yīng)在添加到包被板前混勻。2)使用前所用試劑應(yīng)恢復(fù)至室溫。試劑應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)或振蕩予以混合。濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖動(dòng)使沉淀鹽溶解。使用前濃縮洗滌液應(yīng)用蒸餾水或去離子水IO倍稀釋。3)取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣本的位置。在Al孔內(nèi)分別加入100)al沒有稀釋的陰性對(duì)照。在Bl的孔內(nèi)分別加入100nl沒有稀釋的陽性對(duì)照。在其余孔內(nèi)分別加入100nl已稀釋好的樣本。4)37'C下孵育1小時(shí)(濕盒內(nèi))。5)吸取各孔的液體棄入廢液筒。用大約350)il洗滌液洗滌板孔，重復(fù)4次。每次洗滌后應(yīng)吸去孔內(nèi)的液體。注意應(yīng)避免包被板孔干燥。在最后一次洗滌液吸去后，將每塊板中殘留的洗滌液扣拍到吸水材料上。6)稀釋酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗用樣品稀釋液作1:2000稀釋。每孔加入100W稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。7)37。C下孵育l小時(shí)(濕盒內(nèi))。重復(fù)上面的步驟5)。8)每孔加入100pLABTs底物液，室溫下孵育15分鐘。每孔加入10(HiL終止液，使反應(yīng)終止。測(cè)量并且記錄樣本和對(duì)照的OD值(405nm)。9)結(jié)果判定。符合下列條件，實(shí)驗(yàn)方能有效陽性對(duì)照的值必須大于或等于0.5，陰性對(duì)照值必須小于或等于0.250。如果試驗(yàn)無效，試驗(yàn)中的操作值得懷疑，試驗(yàn)應(yīng)重做，并應(yīng)全面的仔細(xì)核對(duì)各組份。AHSV抗體的臨界值為計(jì)算為陰性對(duì)照+0.25。如果測(cè)定的OD值低于臨界值，樣品應(yīng)判為AHSV抗體陰性。如果測(cè)定的OD值低于臨界值，樣品應(yīng)判為AHSV抗體陽性。實(shí)施例2:基因拼接與重組蛋白的表達(dá)1.材料PfuDNA聚合酶，購自北京欣經(jīng)科公司TaqDNA聚合酶、dNTPs:購自上海Promega公司。限制性內(nèi)切酶SalI，BglII購自TaKara公司。胰蛋白胨及酵母粉購自O(shè)xiod公司。IPTG，X-Gal等購自GIBCOBRL公司。T4DNA連接酶購自TaKara公司。DNA快速純化回收試劑盒購自TaKam公司。質(zhì)?？焖偬崛〖兓噭┖匈徸訲aKara公司。三羥甲基氨基甲垸(Tris-堿)、甘氨酸購自上海生物工程公司。N'N'—二甲基甲叉雙丙稀酰胺、丙烯酰胺購自華美生物工程公司。BugBusterProteinExtractionReagent,貝勾自Novagen公司。2.方法1)拼接原理見圖2，采用三步法拼接目的片段。第一步為DA-PCR，生成的主產(chǎn)物為最長的150bp的片段。在第二步中，可合成全長的目的片段，然后在第三步進(jìn)行常規(guī)PCR時(shí)，就可擴(kuò)增出全長的目的片段。2)將上述擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切后，與pET-30a載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，于37"C條件下過夜培養(yǎng)。第2天挑取菌落于LB中培養(yǎng)8h后，吸取菌液分別用F1,R1;以及F3，R3引物進(jìn)行擴(kuò)增鑒定。3)將上述克隆挑取5個(gè)進(jìn)行序列測(cè)定比對(duì)，我們選取了插入和缺失相對(duì)最少的克隆進(jìn)一步采取重疊PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變后進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序分析。4)對(duì)序列正確的克隆轉(zhuǎn)化BL21菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)前以及誘導(dǎo)后不同時(shí)間，取菌液1.0mL，5000rpm離心10min，收集菌體，加入2XSDS上樣緩沖液，煮沸5min，用12XSDS-PAGE膠檢查。包涵體重新溶解后，收集上清和菌體裂解后的上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢查包涵體溶解后重組蛋白的純度。5)將純化的蛋白作1:100稀釋后，用分光光度計(jì)分別測(cè)定260nm和280nm的吸光度值，計(jì)算蛋白濃度。3.結(jié)果1)將25個(gè)寡核苷酸片段，分解為ll個(gè)反應(yīng)體系，反應(yīng)結(jié)束后，取5pl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下進(jìn)行觀察，所有管中均形成了150bp的片段，見圖3。將DA-PCR各管中的擴(kuò)增產(chǎn)物混合反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物作為模板，用2個(gè)最外側(cè)引物進(jìn)一步擴(kuò)增全長目的片段，擴(kuò)增到了預(yù)期的l.lkb的片段，見圖4。2)將擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切后，與載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)鑒定，結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物已克隆入載體。圖5為部分菌落的擴(kuò)增結(jié)果。3)將上述克隆挑取5個(gè)進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng)序列比對(duì)結(jié)果表明實(shí)際序列與預(yù)期序列存在多處插入和缺失。經(jīng)過比對(duì)，我們選取了插入和缺失相對(duì)最少的克隆進(jìn)一步采取重疊PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變。三次PCR擴(kuò)增電泳圖見圖6。經(jīng)序列分析表明，3處插入已經(jīng)完全得到糾正，見圖7。4)誘導(dǎo)后不同時(shí)間均可觀察到約24KD的重組蛋白，與預(yù)期大小一致。誘導(dǎo)后2h，蛋白量達(dá)到高峰。包涵體重新溶解后，收集上清和菌體裂解后的上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢查包涵體溶解后重組蛋白的純度。表明溶解后的包涵體為高純度重組蛋白，結(jié)果見圖8。5)蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定結(jié)果為8.741mg/ml。實(shí)施例3:重組蛋白的抗原性分析1.材料陽性血清和陰性血清，來自非洲馬瘟阻斷ELISA試劑盒，購自西班牙INGENASA公司。2.方法1)將NC膜用蒸餾水浸泡后晾干，分別用2pL87.4嗎/mL的純化蛋白滴加于上膜上，晾干，將NC膜置于含1%卵清蛋白的PBST封閉液中，室溫輕搖35h后4'C封閉過夜。棄去封閉液，用PBST浸泡洗滌3遍，加入1:10的陽性血清中，室溫下震蕩1.5h。用PBST浸泡洗滌3遍，加入1:500稀釋的HRP酶標(biāo)蛋白G溶液中，室溫振蕩lh，用PBST浸泡洗滌3遍，置于底物中顯色，至斑點(diǎn)清晰后，用蒸餾水終止顯色。2)用濃度分別為43.7pg/mL，21.9嗎/mL，10.9嗎/mL，5.45pg/mL，2.73ng/mL，1.36嗎/mL，0.68嗎/mL以及0.34嗎/mL的蛋白包被酶標(biāo)板，100nL/孔，包被條件為4°C條件下過夜，之后用含1%卵清蛋白的PBST封閉液37'C封閉2h，用用PBST洗滌3遍，拍干后，于4'C條件下備用。分別用陽性血清和陰性血清作l:20稀釋后，加100pL于板上，37。C作用lh，用PBST洗滌3遍，拍干后，加入1:2000稀釋的HRP酶標(biāo)蛋白G溶液lOO)iL，37。C作用lh，用PBST洗滌3遍，加入ABTs底物溶液IO(VL，室溫避光作用15min，用100pL1%SDS終止反應(yīng)，用405nm濾光片讀取OD值。3.結(jié)果1)結(jié)果見圖9。表明重組蛋白具有良好的抗原性。2)結(jié)果見圖10。進(jìn)一步表明重組蛋白具有良好的抗原性。測(cè)得的ELISA試驗(yàn)結(jié)果(0D405)見表4。表4ELISA試驗(yàn)結(jié)果(0D405)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例4:ELISA方法的建立及對(duì)臨床樣品的檢測(cè)1.材料非洲馬瘟阻斷ELISA試劑盒，購自西班牙INGENASA公司。2000年以來進(jìn)口馬血清184份2.方法1)重組蛋白抗原最適包被濃度和待檢血清稀釋濃度的確定用包被液將提純得到的重組蛋白抗原分別作200倍(43.7嗎/mL)，400倍(21,9pg/mL)，800倍(10.9嗎/mL)，1600倍(5.45嗎/mL)，3200倍(2.73嗎/mL)，6400倍(1.36嗎/mL)，12800倍(0.68嗎/mL),25600(0.34嗎/mL)倍以及51200(0,17嗎/mL)倍9個(gè)倍比稀釋度，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，包被條件為4'C條件下過夜。用血清稀釋液將陽性血清及陰性血清作1:20，1:40，1:80,1:160倍比稀釋，進(jìn)行方針滴定，作ELISA測(cè)定。2)重組蛋白抗原包被條件的確定以最適濃度抗原包被酶標(biāo)板，100pL/孔，分成2組第1組為37°Clh，然后于4'C條件下過夜；第2組，僅為4'C條件下過夜。作ELISA測(cè)定。3)封閉液的確定使用了兩種適用于酶標(biāo)重組蛋白G的封閉液，比較封閉效果。一種為含1X明膠的PBST封閉液，另一種為含有1%卵清蛋白的PBST封閉液。4)間接ELISA方法陰陽臨界值的確定隨機(jī)取30份進(jìn)口馬血清，經(jīng)非洲馬瘟阻斷ELISA試劑盒檢測(cè)為非洲馬瘟抗體陰性，作1:40稀釋，用已經(jīng)建立的間接ELISA方法檢測(cè)，每份血清重復(fù)2孔，讀取OD值。5)間接ELISA方法特異性試驗(yàn)以最適濃度抗原包被酶標(biāo)板，對(duì)收集到的馬傳染性貧血病毒陽性血清，馬鼻肺炎病毒陽性血清以及藍(lán)舌病病毒陽性血清作1:40稀釋，作ELISA測(cè)定。6)用建立的間接ELISA方法檢測(cè)2000年以來進(jìn)口馬血清184份，并與西班牙INGENASA公司生產(chǎn)的非洲馬瘟阻斷ELISA試劑盒進(jìn)行比較。3.結(jié)果1)結(jié)果見表5。隨著抗原濃度的減小和血清稀釋倍數(shù)的增加，血清的OD405不斷減小，當(dāng)重組抗原蛋白濃度為0.17嗎/mL0.34嗎/mL時(shí)，陽性血清OD405在1.0左右，而且陰性血清OD405值較低，P/N值高(4.494.77)。一般來說，酶標(biāo)移在OD值為1時(shí)，誤差相對(duì)最小。據(jù)此，我們確定抗原包被濃度為0.20|ag/mL,血清稀釋度為1:40。表5重組蛋白抗原最適包被濃度與血清稀釋度的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注"+"表示陽性血清OD405值，"一"表示陰性血清OD405值。2)結(jié)果見表6。用重組蛋白在最適包被濃度包被酶標(biāo)板，在為37。Clh，然后于4'C條件下過夜的條件下，所測(cè)得的OD405值相對(duì)較高，陰性值較低，P/N值高，因此選為37'Clh，然后于4'C條件下過夜作為最適包被條件。表6重組蛋白抗原包被條件的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注"+"表示陽性血清OD405值，"一"表示陰性血清OD405值。3)結(jié)果見表7。明膠封閉的效果明顯優(yōu)于卵清蛋白，因此選用1%明膠作為封閉液。表7封閉液的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>4)結(jié)果見表8。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，樣本的OD405值>陰性血清OD平均值X+3XSD，可以在99.9%的置信水平上判定為陽性。計(jì)算30份血清的OD405值平均值=0.159，標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.0243，因此，ELISA陰陽性臨界值等于0.159+3X0.0243二0.2319。為便于判定結(jié)果，確定樣本臨界值為陰性對(duì)照+0.25。表8間接ELISA陰陽性臨界值的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>5)結(jié)果見表9。結(jié)果表明，馬傳染性貧血、馬鼻肺炎以及藍(lán)舌病陽性血清的OD405值均小于0.25，判為陰性，初步說明重組蛋白與傳染性貧血、馬鼻肺炎以及藍(lán)舌病陽性血清無交叉反應(yīng)，有較好的特異性，可以用于非洲馬瘟病毒抗體的檢測(cè)。表9間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>6)用建立的間接ELISA方法檢測(cè)2000年以來進(jìn)口馬血清184份，并與西班牙INGENASA公司生產(chǎn)的非洲馬瘟阻斷ELISA試劑盒進(jìn)行比較，結(jié)果均為陰性，兩個(gè)方法的檢測(cè)結(jié)果完全符合。從此結(jié)果也可以看出，進(jìn)口血清中尚無非洲馬瘟抗體。序列表〈110〉中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局〈120〉一種非洲馬瘟檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法〈130>〈160〉29〈170〉Patentlnversion3.5〈210〉1<211>50<212>DNA〈213〉人工合成〈400>1attagatctgacagatgcgcgtgttagcttggatccaggagtgatggaga50〈210〉2〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>2gtttaacgaatcattcggtatcgatgcgtccacaaacccaagcagaacgt50〈210〉3〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉3gttttagcggcattgaacgtccaaattgggaatatttcaccagattatga50〈210〉4〈211〉50〈212〉腿〈213〉人工合成〈400〉4aacgactgaaattccatataatgttcaggccatgaatgacatcgttcgta50〈210>5〈211〉50<212>DNA〈213〉人工合成<400〉5gcaaagtacagacgggaccttatgcaggagcagttgEiggtgcaacaatct50<210>6<211〉50〈212〉DNA<213>人工合成<400〉6cgtggtgggtacattaattcEuaatattgctgaagtgtgtatggatgcagg5〔〈210〉7〈211〉50〈212〉DNA<213〉人工合成〈400〉7cccacgtcgtggggacgcagtcatgatctattttgtttggcgtccattgc〈210〉8<211〉50<212>DNA<213>人工合成〈400〉8ttg犯agcgctccaggggctccagggacttttgtcaccgttgatggagta〈210〉9<211>50〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>9aataccattgcaccagtgaatgttggaaatcctggggcacgccgttcaat〈210〉10<211>50<212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉10tttggatcgttcgctggacacggttccggaattggctccaacgctcacac50〈210〉11〈211〉50〈212〉DNA<213〉人工合成〈400〉11acgcattacgcgctgtcatttttcagcagatgaeitatgcagcctattaat50〈210〉12<211〉50〈212〉DNA<213〉人工合成〈400〉12gaaattgttgcgtatctgttattagtagcttctttagctgatgtgtatgc50<210〉13〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉13cttgtcgacttaattcatacggaaatctggacgcaaagccgcatacacat〈210〉14〈211〉50<212>DNA<213〉人工合成〈400〉14caacaatttcattacgttcagtcggtggaaaaattggcggattaataggc<210>15〈211〉50<212>DNA〈213>人工合成〈400>15cgtaatgcgtgccaagtcggagaaacatacgcataacaacgtgtgagcgt<210>16〈211〉50〈212〉DNA<213〉人工合成<400〉16acgatccaaagacgtataccataacacttcaaactgtaaaattgaacggc50505050〈210〉17〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉17caatggtattccatgcgacgacatctccagccgcaacatttactccatca50〈210〉18〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>18gcgctttcaagtgacgcaccttgaggatcacaaaagatacgcaatggacg50〈210〉19〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉19acgacgtggggccagcagcgcattgacctgtcccgcagcgcctgcatcca50〈210〉20〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>20acccaccacgtgtacgaccttgcggtacgtaataacggccagattgttgc〈210〉21〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>21tgtactttgcttggtccgaatgtttgcatttgacccgtgatacgaacgat〈210〉22〈211〉50<212>DNA〈213〉人工合成〈400〉22ttcagtcgttgcaagagctcccacagttgccaacgcctgatcataatctg〈210〉23〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成505050〈400〉23ccgctaaaaccatatcagtacacataaaaaacatttcattacgttctgct50〈210〉24〈211〉50〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉24ttcgttaaaccattgtaacgattaattgcaatccctaacgtctccatcac50<210>25<211〉32<212〉DNA<213〉人工合成〈400〉25gacagatctgccatataatgttcaggccatga32〈210〉26〈211〉32<212>DNA〈213〉人工合成〈400〉26cgcaacatttactccatcaacggtgacaaaag32〈210〉27〈211〉32〈212〉DNA〈213>人工合成〈400〉27gcgctccaggggctccagggacttttgtcacc32〈210〉28<211>32〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉28ctggtcgacttagacagcgcgtaatgcgtgcc32<210>29〈211〉675<212>DNA〈213〉人工合成〈400〉29atgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggUctggtatgaaagaa60accgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgccatataatgtt120caggccatgaatgacatcgttcgtatcacgggtcaaatgcaaacattcggaccaagcaaa180gtacagacgggaccttatgc已ggagcaattg已ggtgcaacaatctggccgttattacgta240ccgcaaggtcgtacacgtggtgggtacattaattcaaatsttgctgasgtgtgtatggat300gcaggcgctgcgggacaggtcaatgcgctgctggccccacgtcgtggggacgc已gtcatg加Oatctattttgtttggcgtccattgcgtatcttttgtgatcctcaaggtgcgtcacttgaa420agcgctcc已ggggctccagggacttttgtcaccgttgatggagt3aatgttgcggctgga480gatgtcgtcgcatggaataccattgcaccagtgsatgttggaaatcctggggcacgccgt540tcaattttacagtttgaagtgttatggtatacgtctttggatcgttcgctggacacggtt600ccggaattggctccEiacgctcacacgttgttatgcgtatgtttctccgacttggcacgca660ttacgcgctgtctaa67權(quán)利要求1.人工拼接一段含有非洲馬瘟病毒VP7蛋白大多數(shù)線性表位的核酸片段，其特征在于為序列表SEQIDNo.29所示的核苷酸序列。2.—種檢測(cè)非洲馬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒，96testsX2/盒，由以下組分組成1)包被有非洲馬瘟病毒抗原的重組酶標(biāo)反應(yīng)板；2)樣品稀釋液1%卵清蛋白溶液；3)IOX濃縮洗滌液IOX濃縮的PBST洗滌液，含0.5%Tween-20的0.01mol/L、pH7.4的PBS;4)陽性對(duì)照非洲馬瘟病毒陽性血清，用樣品稀釋液稀釋至用本方法檢測(cè)的OD值為1.0+/-0.1的范圍內(nèi)；5)陰性對(duì)照非洲馬瘟病毒抗體呈陰性的馬血清，用樣品稀釋液作l:40稀釋；6)底物稀釋液含0.15mg/mL尿素過氧化氫的磷酸鹽檸檬酸緩沖液；7)lOX濃縮ABTs底物液lOmgABTs溶于lmL的底物稀釋液中；8)2000X濃縮辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組蛋白G:HRP標(biāo)記的recProteinG;9)終止液1XSDS溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)非洲馬瘟病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于抗原為人工拼接合成的一段序列，于原核載體pET-30a中高效表達(dá)獲得，其編碼核苷酸序列為序列表SEQIDNo.29所示的核苷酸序列。4.一種檢測(cè)測(cè)非洲馬瘟病毒抗體的間接ELISA方法，其特征在于包括如下步驟1)用樣品稀釋液40倍稀釋被測(cè)樣品，不稀釋陽性和陰性對(duì)照；2)使用前所用試劑恢復(fù)至室溫，使用前濃縮洗滌液應(yīng)用蒸餾水或去離子水10倍稀釋；3)取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣本的位置；在Al孔內(nèi)分別加入100nl沒有稀釋的陰性對(duì)照；在Bl的孔內(nèi)分別加入100nl沒有稀釋的陽性對(duì)照；在其余孔內(nèi)分別加入IO(VI已稀釋好的樣本；4)37'C下孵育1小時(shí)；5)吸取各孔的液體棄入廢液筒；用大約350)^1洗滌液洗滌板孔，重復(fù)4次；每次洗滌后應(yīng)吸去孔內(nèi)的液體；在最后一次洗滌液吸去后，將每塊板中殘留的洗滌液扣拍到吸水材料上；6)稀釋酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗用樣品稀釋液作1:2000稀釋；每孔加入100pl稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗；7)37'C下孵育1小時(shí)；重復(fù)上面的步驟5);8)每孔加入100pLABTs底物液，室溫下孵育15分鐘；每孔加入100iaL終止液，使反應(yīng)終止；波長405nm條件下測(cè)量并且記錄樣本和對(duì)照的OD值；9)結(jié)果判定陽性對(duì)照的值必須大于或等于0.5，陰性對(duì)照值必須小于或等于0.250;AHSV抗體的臨界值為計(jì)算為陰性對(duì)照+0.25;如果測(cè)定的OD值低于臨界值，樣品判為AHSV抗體陰性；如果測(cè)定的OD值低于臨界值，樣品判為AHSV抗體陽性。全文摘要本發(fā)明公開了一種非洲馬瘟檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，尤指采用ELISA方法檢測(cè)非洲馬瘟病毒抗體的抗原制備、純化，檢測(cè)試劑盒和方法，屬于動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。人工拼接一段含有非洲馬瘟病毒VP7蛋白大多數(shù)線性表位的核酸片段，為序列表SEQIDNo.29所示的核苷酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)簡(jiǎn)便快速可快速的對(duì)馬科動(dòng)物的非洲馬瘟病毒抗體作出評(píng)價(jià)。2)適用范圍廣可檢測(cè)9個(gè)型非洲馬瘟病毒誘導(dǎo)的抗體，不僅可用于感染動(dòng)物的檢測(cè)，還可用于免疫動(dòng)物的抗體評(píng)價(jià)。3)特異與同屬的藍(lán)舌病病毒陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。4)穩(wěn)定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。5)安全不接觸病毒，不具有生物安全問題。文檔編號(hào)C07K14/005GK101392250SQ20081011686公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年7月18日優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日發(fā)明者喬彩霞,劉月煥,丹吳,琦周,張向東,柏亞鐸,段生濤,琳汪,靜蒲,強(qiáng)谷,賴平安,高志強(qiáng)申請(qǐng)人:中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局