專利名稱：一種產(chǎn)氫相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氫相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
十八世紀(jì)世界工業(yè)革命以來(lái)建立的化石能源體系如今正面臨著兩大挑戰(zhàn)1) 化石能源儲(chǔ)量日益減小，面臨著枯竭的危險(xiǎn)；2)化石燃料的燃燒產(chǎn)生了大量污染 物質(zhì)，特別是C02等溫室氣體的排放引起的溫室效應(yīng)，給人類賴以生存的環(huán)境帶來(lái)巨 大的威脅。因此，開發(fā)可持續(xù)發(fā)展的可再生清潔能源，逐步替代化石能源是關(guān)系國(guó) 家能源安全、環(huán)境安全及社會(huì)穩(wěn)定和平發(fā)展的重要戰(zhàn)略課題。
氫能作為極具潛力的未來(lái)替代清潔能源之一，是高效的能源載體，具有能量密 度高、清潔、可再生、燃燒產(chǎn)物為水和無(wú)污染等特點(diǎn)，是十分理想的可再生能源。 目前，氫氣主要來(lái)自化石燃料的重整轉(zhuǎn)化(占?xì)錃鈦?lái)源的96%)和電解水制氫(占4 %)，未能擺脫對(duì)原有的化石能源的依賴。因此，如何利用可再生資源持續(xù)地獲取 氫氣受到人們的廣泛的關(guān)注。生物制氫是解決這一問(wèn)題的重要途徑之一。生物制氫 具有常溫常壓反應(yīng)、條件溫和、對(duì)環(huán)境友好、可利用廢棄生物物質(zhì)為底物等優(yōu)點(diǎn)， 可以和環(huán)境污染治理、減少污染排放相聯(lián)系，是十分理想的制氫方法。
現(xiàn)代生物制氫的研究始于20世紀(jì)70年代的能源危機(jī)，90年代以來(lái)，隨著人們對(duì) 溫室效應(yīng)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，生物制氫作為可持續(xù)發(fā)展的制氫方法更加引起了人們的廣 泛重視。生物制氫技術(shù)包括光驅(qū)動(dòng)過(guò)程和厭氧發(fā)酵兩種路線。前者利用光合細(xì)菌或 藻類直接將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為氫氣，是一個(gè)非常理想的過(guò)程，但是由于光利用效率很低， 光反應(yīng)器設(shè)計(jì)困難等因素，近期內(nèi)很難推向應(yīng)用。后者采用的是產(chǎn)氫菌厭氧發(fā)酵， 它的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)氫速度快、反應(yīng)器設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、且能夠和廢棄生物的利用相結(jié)合，相對(duì) 于前者更容易在近期內(nèi)實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用。
發(fā)酵法制氫始于六十年代中期，九十年代受到重視，但進(jìn)展并不大。九十年代 末到本世紀(jì)初，人們意識(shí)到發(fā)酵制氫更容易在近期內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，大大增加了暗發(fā) 酵制氫方面的科研投入，產(chǎn)生了一批有關(guān)培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)性研究結(jié)果。近年來(lái)與廢 棄生物質(zhì)處理相結(jié)合的制氫過(guò)程的研究大為增加，其中一些達(dá)到了中試水平，但主 要集中在反應(yīng)器類型設(shè)計(jì)、工藝研究上，且混合培養(yǎng)產(chǎn)氫效率低于純培養(yǎng)，總的轉(zhuǎn)化率都不高，這也正是發(fā)酵制氫的瓶頸所在。解決發(fā)酵制氫瓶頸的關(guān)鍵，是實(shí)現(xiàn)技 術(shù)突破，提高氫氣得率。研究表明，僅從工藝的角度，無(wú)法從根本上突破產(chǎn)氫效率 低的問(wèn)題，必須注重高效產(chǎn)氫菌種的研究與開發(fā)。
多年以來(lái)，暗發(fā)酵制氫中應(yīng)用的產(chǎn)氫菌種主要包括腸桿菌屬(f/^eroteWe》、 梭菌屬(67oWria^i///7)、埃希氏菌屬(^sc力e/^c/^'a)和芽孢桿菌屬(5acj77fAS)，其中 尤以腸桿菌屬和梭菌屬的相關(guān)研究最多。梭菌屬產(chǎn)氫率最高可達(dá)到2. 36mol/mol葡 萄糖，產(chǎn)氣腸桿菌屬產(chǎn)氫率最高可達(dá)3mol/mol葡萄糖(g卩6 mol/mol蔗糖)[Kumar， N. and Das， D. Bioprocess Engineering 23， 205—208 (2000)]， [Kumar, N. and Das， D. Process Biochemistry 35, 589-593 (2000)]。以梭菌(67a^riW咖5jd) 為代表的專性厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)氫的機(jī)理為葡萄糖酵解后生成丙酮酸，在形成醋酸過(guò) 程中， 一部分電子通過(guò)鐵氧還蛋白在氫酶作用下形成氫氣。 一摩爾的葡萄糖可形成 4摩爾氫氣和2分子醋酸。因此，專性厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)氫的同時(shí)，必然伴隨醋酸等有機(jī) 酸的形成。兼性厭氧產(chǎn)氫菌￡ se/y^朋asai過(guò)糖解途徑和三羧酸循環(huán)(TCA)途徑產(chǎn) 生NADH和ATP，氫酶通過(guò)NADH將質(zhì)子轉(zhuǎn)換為氫氣，產(chǎn)氫理論轉(zhuǎn)換率為l摩爾葡萄糖形 成12mol氫氣，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于專性厭氧菌的氫得率。因此，￡ ae/r^e/7e5"是開發(fā)高效發(fā)酵 制氫工藝的重要菌種。
隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，單純的菌種篩選和培養(yǎng)工藝的優(yōu)化已不能滿足提高 產(chǎn)氫效率的需求。發(fā)酵制氫的研究需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，通過(guò)對(duì)氫酶及其代謝網(wǎng)絡(luò)的 改造來(lái)強(qiáng)化產(chǎn)氫過(guò)程。目前在基因庫(kù)上已經(jīng)可以獲得超過(guò)100種氫酶的基因序列 [Paulette M. Vigrmis, Bernard Billoud， Jacques Meyer. FEMS Microbiology Reviews 25， 455-501(2001)]，但仍有大量已知產(chǎn)氫菌株的氫酶基因尚未被克隆， 尋找更多的氫酶基因是生物制氫研究的重要方向[Kalia， V.C., Lal， S. ， Ghai, R.， Mandal， M. and Chauhan, A. Trends in Biotechnology 21, 152-156 (2003)]。 不同的氫酶具有不同的功能，和其它酶系相比，人們對(duì)氫酶的認(rèn)識(shí)還十分有限。
目前，研究的比較清楚的是大腸桿菌的氫酶I、 II、 III和IV的基因，它們都 屬于Ni-Fe氫酶，其中氫酶III和IV和產(chǎn)氫有關(guān)[Andrews, S. C. ， Berks, B.C., Mcclay， J. ， Ambler, A. ， Quail, M. A. ， Golby， P. and Guest, J. R. Microbiology 143， 3633-3647 (1997)]，而I、 II和吸氫過(guò)程相關(guān)。梭菌屬的氫酶都屬于鐵氫酶， 三梭菌的鐵氫酶已有測(cè)序結(jié)果，但是關(guān)于其附屬基因、調(diào)控機(jī)制還不清楚。已經(jīng)克 隆到梭菌的鐵氫酶基因，并在光合細(xì)菌內(nèi)獲得了異源表達(dá)，強(qiáng)化了光合菌的產(chǎn)氫過(guò)程。梭菌的鐵氫酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)卻沒(méi)有成功，可能是由于梭菌和大腸桿 菌對(duì)于鐵氫酶表達(dá)的附屬基因系統(tǒng)不相同造成的[Yasuo Asada， Yoji Koike， Jorg Schnackenberg， Masato Miyake， Ieaki Uemura, J"un Miyake. Biochimica et Biophysica Acta 1490, 269-278 (2000)]。最近，Mishra J.等通過(guò)鐵氫酶保守序 列設(shè)計(jì)的方法從￡ c7oacae 1IT-BT08中克隆出450bp左右的鐵氫酶，并在不產(chǎn)氫的 大腸桿菌中異源表達(dá)，驗(yàn)證了其功能，結(jié)果顯示這個(gè)氫酶位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[Mishra， J.， Kumax， N. ， Ghosh， A. K. and Das， D. International Journal of Hydrogen Energy 27,1475-1479 (2002) ]， [Mishra， J. ， Khurana， S. ， Kumar, N. ， Ghosh, A. K, and Das， D. Biochemical and Biophysical Research Communications 324， 679—685 (2004)]。產(chǎn)氣腸桿菌Asero《e/7^的前期研究表明，在其細(xì)胞膜上，氫酶與細(xì)胞內(nèi) 產(chǎn)生的NADH作用生成氫氣[Nakashimada， Y. ， Rachman， M. A. ， Kakizono， T. and Nishio， N. International Journal of Hydrogen Energy 27， 1399-1405 (2002)]。 因此研究該菌屬的氫酶特性、基因及其功能解析，對(duì)于實(shí)現(xiàn)提高產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫得 率的技術(shù)突破具有重要意義。
對(duì)大腸桿菌產(chǎn)氫過(guò)程的研究表明，大腸桿菌可直接利用甲酸，也可以在同化糖 類物質(zhì)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的甲酸為底物，在甲酸裂解酶系的作用下，分解甲酸生成C02 禾口112。 [Akihito Yoshida， Taku Nishimura， Hideo Kawaguchi， 1 Masayuki Inui， and Hideaki Yukawa*. Appl Environ Microbiol. 71:6762 - 6768(2005)]。甲酸產(chǎn)氫 途徑是產(chǎn)氫速度最快的途徑。
產(chǎn)氣腸桿菌是兼性厭氧菌，生長(zhǎng)速度快，在厭氧條件下可以產(chǎn)生氫氣，且具有 利用底物范圍廣，生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是具有優(yōu)良工業(yè)性狀的菌株。已有許多關(guān) 于產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫的報(bào)道，但多是在工藝及培養(yǎng)方面[E. Palazzi， B. Fabiano， P. Perego. Bioprocess Eng. 22:205 - 213(2000).]，有關(guān)產(chǎn)氫相關(guān)的基因還沒(méi)有 任何報(bào)道。研究表明，產(chǎn)氣腸桿菌具有和大腸桿菌相似的利用甲酸產(chǎn)氫的能力 [Tatsuo， K., Shigeharu， T. Mar Biotechnol. 7:112 - 118(2005).]，而且其具有 吸氫過(guò)程，即有吸氫酶的存在[Y.L Ren., X. H. Xing. ， C. Zhang. ， and Z. X. Gou. Biotechnol Lett. 27 (14) : 1029-1033(2005).]。代謝分析表明，在以葡萄糖為底 物進(jìn)行發(fā)酵制氫時(shí)，其代謝終產(chǎn)物中，乳酸的濃度接近70%，這也是引起發(fā)酵過(guò)程 中培養(yǎng)基pH下降過(guò)快，從而抑制菌體生長(zhǎng)及降低了發(fā)酵時(shí)對(duì)底物更有效利用的主要 原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)氫相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。 本發(fā)明提供的產(chǎn)氫相關(guān)蛋白，名稱為L(zhǎng)dhD，來(lái)源于產(chǎn)氣腸桿菌￡ ae^^朋^ IAM1183，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)
(a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b) 將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與產(chǎn)氫相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
為了使(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序 列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。
表l標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為5個(gè))RRRRR
Poly-His2-10 (通常為6個(gè))H冊(cè)冊(cè)H
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c一myc10EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得
到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的DNA序列中缺 失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/ 或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。 所述蛋白的編碼基因(7fl^Z)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 所述蛋白的編碼基因具體可為如下l)或2)或3)的DNA分子
1) 其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA分子。
上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC， 0.5y。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2X SSC， 0. 1% SDS和1 XSSC, 0. 1% SDS各洗膜一次。
含有所述蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一株產(chǎn)氫工程菌，是滅活￡ aeroge/ es IAM1183中所述7dW基 因得到的。
所述滅活是通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)的，具體是通過(guò)雙親本親和的單交換實(shí)現(xiàn)的。
所述同源重組具體可將自殺性載體pGP704-ldhd導(dǎo)入￡ aer0ge/2es IAM1183實(shí) 現(xiàn)；所述自殺性載體pGP704-ldhd是在pGP704的多克隆位點(diǎn)插入序列表中序列2 自5'末端第363至898位脫氧核糖核苷酸得到的重組載體。
本發(fā)明還保護(hù)自殺性載體pGP704-ldhd，是在pGP704的多克隆位點(diǎn)插入序列表 中序列2自5'末端第363至898位脫氧核糖核苷酸得到的重組載體。
含有所述自殺性載體pGP704-ldhd的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
所述的工程菌可應(yīng)用于生物制氫。
本發(fā)明以具有高效產(chǎn)氫潛力的產(chǎn)氣腸桿菌".aerog朋as)為出發(fā)菌株，通過(guò)對(duì) 產(chǎn)氣腸桿菌U3ero《e"^)中的A/力o基因進(jìn)行滅活，獲得了一株產(chǎn)氫能力提高、利 用葡萄糖能力強(qiáng)的工程菌，可應(yīng)用于生物制氫，對(duì)利用產(chǎn)氣腸桿菌制氫，具有巨大 的指導(dǎo)意義。
本發(fā)明獲得的工程菌具有以下優(yōu)點(diǎn)
1) 出發(fā)菌株Aae/Y^e72esIAM1183是兼性厭氧菌，在好氧、厭氧條件下均能快 速生長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)；利用其進(jìn)行生物制氫具有利用底物范圍廣、利用底物能 力強(qiáng)和產(chǎn)氫較高的優(yōu)點(diǎn)，是具有潛在應(yīng)用于工業(yè)化生物制氫的優(yōu)良菌株。
2) 本發(fā)明獲得的工程菌，除了具有原始菌l)的優(yōu)點(diǎn)外，還具有底物利用能力 更強(qiáng)，產(chǎn)氫能力進(jìn)一步提高的特點(diǎn)。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為7rf/W基因的PCR電泳圖
圖2為自殺載體pGP704-ldhd的PCR鑒定圖
圖3為工程菌￡ aeroge/7es IAM1183-Aldhd的單抗和雙抗篩選圖 圖4為工程菌￡ sero《朋es IAM1183-Aldhd的PCR鑒定圖 圖5為工程菌￡ aero《朋es IAM1183-Aldhd的生長(zhǎng)曲線 圖6為工程菌A aeir^朋es IAM1183-Aldhd生長(zhǎng)過(guò)程中的pH變化曲線 圖7為工程菌A ae/Y^e/7es IAM1183-Aldhd的產(chǎn)氫情況具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 本發(fā)明中所用到的引物如下
Ldh-fw: ATGMAATCGCSGTTTATAG;
Ldh-rw: TTAGACGATGGCGTTCGGAC;
Ldh-E-fw: c gGAATTCCCGCGCTTACCAGCGTACC;
Ldh-E-rw: c gGAATTCGTCAGGAAAGCCTGATGCCC;
Primer-Pgp-1-fw: CATGCGCTCCATCAAGAAGA;
Primer-Pgp-2-rw: GTGGGTCTCGCGGTATCATT 。
以下實(shí)施例中所涉及的培養(yǎng)基配方及用途如下
(1) LB培養(yǎng)基(L—'):蛋白胨10g、酵母浸粉5g、 NaCl 10g、瓊脂粉15g (固體 培養(yǎng)基時(shí)添加)；用于菌種短期保藏和活化培養(yǎng)。
(2) 葡萄糖培養(yǎng)基(L—0 :葡萄糖15g、蛋白胨5g、 K2HP04 3H20 14g、 KH2P04 6g、 (NH4)2S04 2g、 MgS04 7H20 0. 2g;用于發(fā)酵制氫。
實(shí)施例1、產(chǎn)氣腸桿菌7必^/基因的獲得
根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的D-乳酸脫氫酶(D-lactate dehydrogenase)基因序列，設(shè)計(jì) 一對(duì)兼并引物L(fēng)dh-fw和Ldh-rw。以產(chǎn)氣腸桿菌(E aarc^OTes IAM1183)(購(gòu)自日 本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所(IAM)菌種庫(kù))的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳圖見(jiàn)圖l。圖l中，1: PCR產(chǎn)物； 2: Marker。
結(jié)果表明，得到了分子量約為900bp的條帶。將該P(yáng)CR產(chǎn)物4X:保存，送上海 Invitrogen Corporation測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增到的核苷酸序列見(jiàn)序列表的序 列2,編碼氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白質(zhì)。
經(jīng)網(wǎng)上比對(duì)，序歹U 2禾口 A7e力sie27s p/7ew/z o/n'3e subsp的D—lactate dehydrogenase基因具有84%的最高同源性，序列1和Klebsiella oxytoca和 A7eZ 57'eJ7s /7/ e咖c^'3e subsp的D-lactate dehydrogenase蛋白具有最高同源性。 將核苷酸序列如序列2所示的DNA命名為7afe/基因，將氨基酸序列如序列1所示的 蛋白質(zhì)命名為L(zhǎng)dhD蛋白。
實(shí)施例2、產(chǎn)氣腸桿菌￡ aero《朋es IAM1183-Aldhd的獲得
一、自殺載體pGP704-ldhd的構(gòu)建
設(shè)計(jì)一對(duì)帶有fcdU酶切位點(diǎn)的引物L(fēng)dh-E-fw、 Ldh-E-rw。以產(chǎn)氣腸桿菌(￡ aer塔e/ es IAM1183)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到540多bp的片段。fcoR I酶切PCR產(chǎn)物，與fcdU酶切的pGP704 [Kolter, R. Inuzuka， M. and Helinski， D. (1978). Cell 15: 1199-1208， Miller, V. and Mekalanos， J. (1988). J. Bact. 170:2575-2583]連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化A coh'DH5 a (大連寶生物公司)，在LB氯霉 素(24mg/mL)抗性平板篩選，挑取正確的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，具體如 下
根據(jù)pGP704上的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物Primer-Pgp-1-fw和Primer-Pgp-2-rw。用 引物L(fēng)dh-E-fw和Primer-Pgp-2-rw對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，見(jiàn)圖2的泳道1。同樣， 用引物Primer-Pgp-l-fw和Ldh-E-rw對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，見(jiàn)圖2的泳道2。圖2 中，泳道3為pGP704質(zhì)粒，泳道4為Marker。結(jié)果表明，得到了預(yù)期的重組質(zhì)粒，將 其命名為pGP704-ldhd自殺載體。
二、產(chǎn)氣腸桿菌A aeroge/7es IAM1183-Aldhd的獲得
1、 將pGP704-ldhD自殺載體，通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方式，導(dǎo)入原始菌￡ aeroge/7es 環(huán)1183。
2、 將轉(zhuǎn)化后的&aero卯/7es IAM1183， 37。C復(fù)壯45分鐘，涂布在含有氯霉素 (24mg/mL)的LB固體平板上進(jìn)行篩選。
3、 挑取在含有氯霉素抗性平板上生長(zhǎng)的菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素 (100mg/mL)和氯霉素(24mg/mL)的雙抗性LB平板上，培養(yǎng)12 h。將在雙抗性平
板上生長(zhǎng)的菌落，挑取到新的雙抗性LB平板。
單抗篩選和雙抗篩選的結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3中，左圖為雙抗篩選的結(jié)果，右圖為 單抗篩選的結(jié)果。觀察發(fā)現(xiàn)2#菌和5#菌的生長(zhǎng)良好。
提取2tt菌和5tt的基因組DNA，分別用引物L(fēng)dh-E-fw和Primer-Pgp-2-rw (A); Primer-Pgp-2-fw和Ldh-E-rw(B); Ldh-E-fw和Ldh-E-rw (C)作為引物對(duì)2#和5#的 DNA進(jìn)行PCR進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4所示。圖4中，1: 2tt轉(zhuǎn)化子用引物A進(jìn)行PCR的產(chǎn) 物；2: 2tt轉(zhuǎn)化子用引物B進(jìn)行PCR的產(chǎn)物；3: 2#轉(zhuǎn)化子用引物C進(jìn)行PCR的產(chǎn)物；4: 5tt轉(zhuǎn)化子用引物A進(jìn)行PCR的產(chǎn)物；5: 5tt轉(zhuǎn)化子用引物B進(jìn)行PCR的產(chǎn)物；6: 5#轉(zhuǎn)化 子用引物C進(jìn)行PCR的產(chǎn)物。
結(jié)果表明2tt轉(zhuǎn)化子與預(yù)期的結(jié)果相一致，是正確的轉(zhuǎn)化子；5#轉(zhuǎn)化子沒(méi)有 得到預(yù)期的特征帶，為假陽(yáng)性菌體。將2tt菌命名為工程菌Aaeroge"esIAM1183-A ldhd。實(shí)施例3、工程菌的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)氫性能及代謝流
一、搖瓶培養(yǎng)條件下工程菌的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)氫性能及代謝流
分別將工程菌A aeroge/ es IAM1183-Aldhd和野生菌A 3aro《e/7as IAM1183進(jìn)
行搖瓶培養(yǎng)，檢測(cè)它們的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)氫性能和代謝流，具體步驟如下
在70mL血清瓶中裝20mL葡萄糖培養(yǎng)基，將活化后的工程菌接入培養(yǎng)基，進(jìn)行搖
瓶培養(yǎng)；同時(shí)將活化后的野生菌進(jìn)行同樣條件的搖瓶培養(yǎng)，作為對(duì)照。
(1) 種子培養(yǎng)將活化的工程菌(或野生菌)接種至含5ml LB培養(yǎng)基的15ml 離心管，37°C、 170rpm、空氣浴培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子菌。
(2) 厭氧搖瓶培養(yǎng)將種子菌接種至含20ml葡萄糖培養(yǎng)基的70ml血清瓶(預(yù) 先用氮?dú)庵脫Q培養(yǎng)瓶頂部及培養(yǎng)基中的空氣)，接種量為2. 5% (v/v) 。37°C、 170rpm、 空氣浴培養(yǎng)24小時(shí)。
利用分光光度計(jì)(UV-1206， SHIMADZU公司(日本))測(cè)定菌體的生長(zhǎng)情況；利 用pH計(jì)(CHN060(828)， 0RI0N公司(美國(guó)))測(cè)定pH的變化情況。培養(yǎng)16小時(shí)后對(duì)代 謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。將發(fā)酵物離心取上清后，過(guò)濾。利用高壓液相色譜測(cè)定代謝物的 產(chǎn)量和組成。高壓液相氣譜為(HPLC-10A ， SHIMADZU公司(日本)。試驗(yàn)設(shè)三次重 復(fù)，所有結(jié)果均為三次重復(fù)的平均值，用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。
工程菌和野生菌的0D6。。的變化見(jiàn)圖5，工程菌和野生菌的培養(yǎng)液的pH變化見(jiàn)圖6。 工程菌和野生菌的產(chǎn)氫情況變化見(jiàn)圖7;工程菌的代謝流分析結(jié)果見(jiàn)表2。
_表2 ￡ aero《e/ es IAM1183-Aldhd工程菌的代謝流分析(n=3)_
濃度(mM)
底物或代謝產(chǎn)物
IAM 1183恵1183-Aldhd
葡萄糖消耗57. 7%100%
剩余葡萄糖6. 44931± 0. 10±0
琥珀酸0. 44639±0. 083435. 94719±0. 29234
乳酸36. 32475 ±1. 524933. 59903±0. 44812
甲酸16. 1897±0. 105830. 53547±0. 13806
乙酸0. 20017±0. 2001713. 79769±0. 10515
2， 3-丁二醇2. 3005±0. 1015535. 84146±0. 36089
乙醇11.65524±0. 3988939. 97261 ±1. 73077
結(jié)果表明1)工程菌的OD,明顯提高。2)工程菌的pH值下降速度小于野生菌，且在pH4.5時(shí)，不再下降。3)工程菌葡萄糖的利用率達(dá)到100%，高于野生菌的利 用率57. 7%，說(shuō)明Aldhd的滅活能有效增加產(chǎn)氫代謝途徑的通量，從而提高細(xì)胞產(chǎn) 氫得率。3)工程菌乳酸的生成量遠(yuǎn)小于野生菌。5)工程菌的2， 3-丁二醇、琥珀 酸和乙醇的得率均比野生菌有所增加，而上述物質(zhì)都是依賴胞內(nèi)NADH而產(chǎn)生的代謝 產(chǎn)物，顯示出胞內(nèi)可利用的還原力的增加，而這是有利于產(chǎn)氫的一個(gè)重要條件。6) 工程菌的乙酸和乙醇產(chǎn)量之和比野生型菌株有一定幅度的提高，表明甲酸產(chǎn)氫途徑 在產(chǎn)氫過(guò)程中被強(qiáng)化，達(dá)到了預(yù)期的產(chǎn)氫的效果。 二、罐發(fā)酵
為了檢測(cè)工程菌￡ aero^^es IAM1183-Aldhd的產(chǎn)氫能力和底物利用能力及代 謝流向，進(jìn)行如下操作
將活化好的￡ 3ara《朋es IAM1183-Aldhd工程菌，接種到30 mL的LB培養(yǎng)基中， 過(guò)夜培養(yǎng)，得到種子液。將60 mL種子液接種到含有3 L葡萄糖培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐 中，37'C進(jìn)行厭氧發(fā)酵。檢測(cè)生產(chǎn)的氫氣量和代謝產(chǎn)物，方法同步驟一。野生菌的 操作同上，作為對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 ￡ aerobe/ " IAM1183-Aldhd工程菌的產(chǎn)氫量及代謝流分析
濃度(mM)
底物或代謝產(chǎn)物IAM 1183IAM 1183-Aldhd
氫氣2. 989 (L)5. 598 (L)
葡萄糖消耗85. 8%98.96%
剩余葡萄糖2.121210.155772
琥珀酸0.6192682.266024
乳酸41. 012722.221801
甲酸06.145386
乙酸4. 92594211.30512
2， 3-丁二醇1. 14408434.39831
乙醇4. 70683129.75809
結(jié)果表明1)工程菌氫氣的產(chǎn)量是野生菌的1.9倍。2)工程菌的生長(zhǎng)情況好 于原始菌，終0D6。。是原始菌的1.5倍。3)工程菌pH下降速度遠(yuǎn)小于野生菌，且當(dāng)下 降到5.5時(shí)，則不再下降，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值略有回升，說(shuō)明產(chǎn)生的有機(jī) 酸被部分消耗。4)工程菌葡萄糖的利用率可達(dá)98.9%，遠(yuǎn)大于野生菌的85.8%。 5)工程菌乳酸的生成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于野生菌。6)工程菌琥珀酸、甲酸、乙酸、2， 3-丁二 醇、乙醇的產(chǎn)量大于野生菌。
試驗(yàn)表明，對(duì)靶基因的滅活會(huì)引起胞內(nèi)相應(yīng)酶活性的變化，進(jìn)而改變代謝通量， 增加目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。工程菌株￡ aaroge"es IAM1183-Aldhd的發(fā)酵制取氫氣的生 物性狀遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于野生菌，是極具潛力制氫菌種。序列表
<110>清華大學(xué)
〈120〉 一種產(chǎn)氫相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
<130> CGG匿Y81498
〈160〉 2
<210〉 1
<211> 329
<212> PRT
<213〉 產(chǎn)氣腸桿菌(E. aerogenes)
<400> 1 Met Lys lie 1
Gin His Val
Leu Leu Thr 35
Cys lie Phe 50
Lys Ala Tyr 65
Asn Val Asp Val Pro Ala
Ala Val Tyr Ser Thr 5
Asn Asp Thr Tyr Gly 20
Glu Lys Thr Ala Lys 40
Val Asn Asp Asp Gly 55
Gly Val Lys Tyr lie 70
Leu Asp Ala Ala Lys 85
Tyr Ser Pro Glu Ala 濯
Lys Gin Tyr Asp Lys Lys Tyr Leu
10 15 Phe Glu Leu Glu Phe Phe Asp Phe 25 30 Thr Ala Asn Gly Cys Glu Ala Val 45
Ser Arg Pro Val Leu Glu Glu Leu 60
Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn
75 80 Glu Leu Gly Leu Arg Val Val Arg
90 95 Val Ala Glu His Ala Val Gly Met 105 110Met Met Ser Leu Asn Arg Arg lie His Arg Ala Tyr Gin Arg Thr Arg
115 120 125
Asp Ala Asn Phe Ser Leu Glu Gly Leu Thr Gly Phe Thr Met His Gly
130 135 140
Lys Thr Ala Gly Val lie Gly Thr Gly Lys lie Gly Val Ala Thr Leu 145 150 155 160
Arg lie Leu Lys Gly Phe Gly Met Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Tyr
165 170 175
Pro Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Gly Val Glu Tyr Val Asp Leu Pro
180 185 190
Thr Leu Tyr Ala Gin Ser Asp Val lie Ser Leu His Cys Pro Leu Thr
195 200 205
Glu Glu Asn Tyr His Leu Leu Asn His Ala Ala Phe Glu Gin Met Lys
210 215 220
Asp Gly Val Met Val lie Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu lie Asp Ser 225 230 235 240
Gin Ala Ala lie Asp Ala Leu Lys His Gin Lys lie Gly Ala Leu Gly
245 250 255
Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Arg Asp Leu Phe Phe Glu Asp Lys Ser
260 265 270
Asn Asp Val lie Gin Asp Asp Val Phe Arg Arg Leu Ser Ala Cys His
275 280 285
Asn Val Leu Phe Thr Gly His Gin Ala Phe Leu Thr Ala Glu Ala Leu
290 295 300
lie Ser lie Ser Gin Thr Thr ILeu Asp Asn Leu Arg Gin Val Asp Ala 305 310 315 320
Gly Glu Thr Cys Pro Asn Ala lie Val 325〈210> 2
<211> 990
<212〉 DNA
〈213> 產(chǎn)氣腸桿菌(E. aerogenes)
〈400〉 2
atgaaaatcgccgtttatagtacgaagcagta_cgat3aa_a_agtaccttcagcatgttaat60
g3t￡ica_t3tggctttgaactcgaatttttcgacttcctgttaaccgaaaaaaccgcgaaa120
acggccaacggctgtg肌gccgtgtgcatatttgtcaacgatgacggcagccgtccggtg180
ctggaagagctgaaagcatacggggtg肌gtacatcgccctgcgctgcgccgggtttaac240
aacgtcgatctggatgcggcaaaagagctgggtctgcgcgttgtccgcgttcccgcctat300
tcgccggaagccgtggctgaacatgccgtcggcatgatg3tgtcgttgaaccgccgcatc360
caccgcgcttaccagcgtacccgcgatgctaacttctcgctggaaggcttaaccggcttt420
accatgcacggt3aaa_ccgccggggtgeitcggg3CCggCElaaatcggcgtcgccacgctg■
cgtattctgaaagggtttggcatgcgcctgctggcgttcgatccctatcc33gCgCCgC3540
gcgctggatctcggcgtcgagt'atgttgatttgccgacgctgtatgceicagtccgatgtg600
atctccctgcactgtccgctgacggaagagaactaccatctgctgaatcatgcggcgttt660
gagcaaatgaa,cggcgtg3tggtga_tc朋csccagccgcggggcgctgattgattct720
caggcggcgatcgatgcgct犯犯tcggggcgctgggcatggacgtgtat780
gagaacgaacgcgacctgttcttcgaagataagtccastgacgtgattcaggatgacgtc840
ttccgtcgcctgtctgcctgtcataacgtgttgttcaccgggcatcaggctttcctgacc■
gccgaagcgctgatcagcatttcacaaacgaccctggaita_acctgcgccaggtcgatgct960
ggcgaaacctgtccgaacgccatcgtctaa990
權(quán)利要求
1、一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與產(chǎn)氫相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2、 權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白編碼基因?yàn)槿缦耹)或2) 或3)的DNA分子1) 其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 3) 與l)或2)限定的DNA序列具有9(F。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA分子。
4、 含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌。
5、 一株產(chǎn)氫工程菌，是滅活f. ae^^e/2" 1細(xì)1183中權(quán)利要求2所述基因得到 的工程菌。
6、 如權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于所述滅活是通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)的。
7、 如權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于所述同源重組是將自殺性載體 pGP704-ldhd導(dǎo)入& aeroge/ es IAM1183實(shí)現(xiàn)的；所述自殺性載體pGP704-ldhd是在 pGP704的多克隆位點(diǎn)插入序列表中序列2自5'末端第363至898位脫氧核糖核苷酸 得到的重組載體。
8、 自殺性載體pGP704-ldhd，是在pGP704的多克隆位點(diǎn)插入序列表中序列2自 5'末端第363至898位脫氧核糖核苷酸得到的重組載體。
9、 含有權(quán)利要求8所述自殺性載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
10、 權(quán)利要求5至7中任一所述工程菌在產(chǎn)氫中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)氫相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明公開的蛋白，是(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與產(chǎn)氫相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。將本發(fā)明提供的產(chǎn)氫相關(guān)蛋白命名為L(zhǎng)dhD，滅活E.aerogenes IAM1183中所述蛋白的編碼基因1dhd得到了一株工程菌。本發(fā)明獲得的工程菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、底物范圍廣、利用底物能力強(qiáng)、產(chǎn)氫效率高，可應(yīng)用于生物制氫，對(duì)利用產(chǎn)氣腸桿菌制氫具有巨大的指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)C07K14/195GK101633691SQ20081011697
公開日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2008年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日
發(fā)明者元 盧, 翀 張, 程 楊, 王立言, 濤 蘇, 蔣培霞, 趙洪新, 邢新會(huì), 堃 馬 申請(qǐng)人:清華大學(xué)