專利名稱：：氨基脲衍生物半抗原、抗原和抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種氨基脲衍生物的半抗原、抗原和抗體的制備方法，以及制備得到的半抗原、抗原和抗體及抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：呋喃西林作為一種硝基呋喃類藥物，曾用于治療和預(yù)防由埃希氏菌和沙門氏菌引起的哺乳動(dòng)物消化道疾病。由于呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)具有致癌作用，歐盟已于1995年禁止在食用動(dòng)物中使用硝基呋喃類藥物，我國(guó)也于2002年頒布了禁止使用該類獸藥的禁令。目前，呋喃西林是國(guó)際動(dòng)物源性食品貿(mào)易的必檢項(xiàng)目，成為發(fā)達(dá)國(guó)家限制第三國(guó)出口的技術(shù)貿(mào)易壁壘。呋喃西林對(duì)光敏感，代謝快速，在動(dòng)物體內(nèi)主要以代謝物SEM形式存在較長(zhǎng)時(shí)間。因此，呋喃西林殘留的分析方法主要以其代謝SEM為標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的檢測(cè)方法主要是通過(guò)對(duì)SEM進(jìn)行鄰硝基苯甲醛的衍生前處理后，使用液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)等儀器測(cè)定其衍生產(chǎn)物NPSEM。儀器法是一種精確，穩(wěn)定的確證方法，但具有成本高，樣品通量低，前處理煩瑣，操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，不易實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)具有操作步驟簡(jiǎn)單、樣品通量高、成本低、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制和現(xiàn)場(chǎng)快速篩査等優(yōu)點(diǎn)，為呋喃西林大批量樣品的快速篩査，提供了新方法。建立ELISA方法首先需要制備針對(duì)目標(biāo)藥物的特異性抗體。多數(shù)藥物、毒素、環(huán)境污染物分子質(zhì)量小于1000u，屬于僅有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性的半抗原。目前制備小分子半抗原抗體的常規(guī)方法為選擇具有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物或原形藥物作為待測(cè)物，設(shè)計(jì)合成保留待測(cè)物分子結(jié)構(gòu)特征并帶有活性基團(tuán)的半抗原，通過(guò)共價(jià)鍵使半抗原與大分子蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，制備人工免疫原，經(jīng)動(dòng)物免疫程序制備針對(duì)半抗原的特異性抗體。半抗原合成是免疫化學(xué)分析中最為困難的關(guān)鍵步驟。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研人員在小分子半抗原的設(shè)計(jì)與合成做了大量工作。Goodrow等認(rèn)為在半抗原的設(shè)計(jì)中須遵循以下原則①免疫原中的半抗原應(yīng)在分子結(jié)構(gòu)立體化學(xué)和電子分布上與待測(cè)物分子盡可能相似；②半抗原結(jié)構(gòu)中的連接臂應(yīng)不易于誘導(dǎo)產(chǎn)生"臂抗體"，最好使用一定長(zhǎng)度的碳鏈；③半抗原分子應(yīng)具有便于與蛋白載體偶聯(lián)的活性基團(tuán)，且活性基團(tuán)的存在對(duì)待測(cè)物分子的電子分布應(yīng)沒(méi)有影響；④半抗原與蛋白偶聯(lián)后仍應(yīng)保留待測(cè)物分子的基本結(jié)構(gòu)。由于小分子農(nóng)獸藥無(wú)免疫原性，通常需與大分子載體蛋白偶聯(lián)制備完全抗原，借助載體蛋白的T細(xì)胞表位獲得免疫原性，以便刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。制備完全抗原時(shí)常用的載體有牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)、多聚賴氨酸(PLL)等。制備的人工抗原經(jīng)動(dòng)物免疫，抗血清的純化等程序得到可用于ELISA檢測(cè)的抗體。目前尚未有氨基脲衍生物半抗原、抗原和其特異性抗體的技術(shù)報(bào)道?！?br/>發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種氨基脲衍生物半抗原，同時(shí)提供由所述半抗原偶連載體蛋白制備的人工抗原，以及免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后使機(jī)體產(chǎn)生特異的針對(duì)氨基脲衍生物的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述半抗原、抗原和特異性抗體的制備方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)予以實(shí)現(xiàn)提供一種氨基脲衍生物半抗原的制備方法，是將氨基脲與過(guò)量的帶羧基的苯甲醛衍生物在室溫條件下于甲醇中進(jìn)行氨醛縮合反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀經(jīng)洗滌、干燥得到所述半抗原。氨醛縮合反應(yīng)時(shí)間為16個(gè)小時(shí)左右。所述帶羧基的苯甲醛衍生物優(yōu)選間羧基苯甲醛或2-(4-甲?；窖趸?乙酸。帶羧基的苯甲醛衍生物采用間羧基苯甲醛制備得到的氨基脲衍生物半抗原具有式(I)所示結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>帶羧基的苯甲醛衍生物采用2-(4-甲?；窖趸?乙酸制備得到的氨基脲衍生物半抗原具有式(II)所示結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(II)本發(fā)明提供了一種氨基脲衍生物抗原的制備方法，包括以下步驟(1)將氨基脲衍生物半抗原與縮合劑N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)反應(yīng)形成活潑酯；(2)將活潑酯滴加入蛋白溶液中反應(yīng)；(3)步驟(2)反應(yīng)得到的偶聯(lián)有氨基脲衍生物半抗原的蛋白經(jīng)透析純化得到目標(biāo)抗原。步驟(1)所述反應(yīng)時(shí)間過(guò)夜；步驟(2)所述蛋白溶液的濃度為5mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)；步驟(3)所述的透析純化時(shí)間為3天。選用式(I)所示半抗原制備得到的抗原具有式(ni)所示結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(m)選用式(II)所示半抗原制備得到的抗原具有式(IV)所示結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(IV)本發(fā)明同時(shí)提供了一種氨基脲衍生物抗體的制備方法，包括以下(a)將氨基脲衍生物抗原與弗氏佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；(b)免疫后抽取血液，分離血清；(c)血清經(jīng)辛酸硫酸銨純化得到抗體。步驟(a)所述氨基脲衍生物抗原濃度為lmg/mL，氨基脲衍生物抗原與弗氏佐劑按l:l比例免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。步驟(b)所述免疫次數(shù)為4次。本發(fā)明還提供了所述抗體的應(yīng)用，具體是應(yīng)用于呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)的ELISA方法免疫化學(xué)分析中。本發(fā)明是通過(guò)設(shè)計(jì)最適的半抗原制備相應(yīng)的人工抗原，從而獲得對(duì)目標(biāo)分析物具有特異性識(shí)別的抗體，用于快速分析肉源性食品中氨基脲的殘留量，從而達(dá)到監(jiān)控呋喃西林非法使用情況的目的。本發(fā)明的有益效果是所述半抗原和氨基脲衍生物結(jié)構(gòu)相似，突出了此獸藥分子特異性抗原決定簇，并可通過(guò)活潑酯法偶聯(lián)載體蛋白制備抗原，使用所述抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可獲得效價(jià)高，特異性好的針對(duì)氨基脲衍生物的抗體，所述抗體可用于動(dòng)物源性食品中氨基脲殘留量的快速檢測(cè)，檢測(cè)下限可達(dá)0.09ng/mL。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1氨基脲衍生物半抗原MCPSEM的制備方法在50ml圓底燒瓶中加入間羧基苯甲醛1.15g，緩慢加入甲醇直至對(duì)間羧基苯甲醛完全溶解，攪拌中加入0.3g氨基脲，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜；反應(yīng)結(jié)束，過(guò)濾，水洗兩遍，甲醇洗兩遍，干燥，得0.62g白色粉末，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示。半抗原MCPSEM的APCI-MS分子離子峰為207，HNMR(600MHz,^rDMSO,TMS):310.35(s,1H);8.14(s,1H);8.03(d，/=7.8Hz,1H);7.93(s，1H);7.90(d,J二7.8Hz，1H);7.52(t,/=7.2Hz，lH，)。以上波譜數(shù)據(jù)均能正確歸屬，與MCPSEM結(jié)構(gòu)一致，說(shuō)明半抗原MCPSEM合成成功。1STY^pCOOH(I)實(shí)施例2氨基脲衍生物半抗原CEPSEM的制備方法圓底燒瓶中加入2-(4-甲?；窖趸?乙酸1.06g，緩慢加入甲醇直至對(duì)2-(4-甲?；窖趸?乙酸完全溶解，攪拌中加入0.4g氨基脲，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束，過(guò)濾，水洗兩遍，甲醇洗兩遍，干燥，得0.90g白色粉末，其結(jié)構(gòu)式如式(II)所示。CEPSEM波譜數(shù)據(jù):APCI-MSm/z:237[M+H]+;1H匿,MHz，d6-DMS0，TMS):S10.09(s,1H);7.78(s，1H);7.64(d，J=9.0Hz，2H);6.91(d,J=9.0Hz，2H);4.71(s，2H)。以上波譜數(shù)據(jù)均能正確歸屬，與CEPSEM結(jié)構(gòu)一致，說(shuō)明半抗原CEPSEM合成成功。COOH(II)實(shí)施例3免疫原CEPSEM-BSA的制備方法取半抗原CEPSEM0.lmmol溶于2mlDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg。4。C下磁力攪拌反應(yīng)過(guò)夜，離心后上清夜為A液；稱取BSA140mg溶于10ml濃度為0.lmol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMFlml，攪拌溶解制備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4°C下反應(yīng)12h，離心后，取上清夜，4'C下用生理鹽水透析3d,每天更換3次透析液。得到的全抗原以lmg/ml的濃度分裝于0.5ml離心管中，凍存于-2(TC冰箱中，供免疫用。制備的氨基脲衍生物免疫原具有式(V)所示結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>(V)免疫原鑒定對(duì)載體蛋白BSA，半抗原CEPSEM和免疫原CEPSEM-BSA進(jìn)行紫外掃描測(cè)定(200400nm)，發(fā)現(xiàn)免疫原CEPSEM-BSA與BSA和CEPSEM相比，吸收曲線有明顯改變，說(shuō)明半抗原CEPSEM與BSA偶聯(lián)成功。三硝基苯黃酸法(TNBS)測(cè)得半抗原IV與BSA的偶聯(lián)比為16:1實(shí)施例4包被原CEPSEM-OVA的制備方法取半抗原CEPSEM0.lmmol溶于2mlDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg。4"下磁力攪拌反應(yīng)過(guò)夜，離心后上清夜為A液；稱取OVA140mg溶于10ml濃度為0.lmol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMFlml，攪拌溶解制備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4"C下反應(yīng)12h，離心后，取上清夜，4T:下用生理鹽水透析3d，每天更換3次透析液，得到的全抗原以lmg/ml的濃度分裝于0.5ml離心管中，凍存于-2(TC冰箱中，供呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)的ELISA方法免疫化學(xué)分析中包被酶標(biāo)板用。制備的包被原CEPSEM-OVA結(jié)構(gòu)如式(VI)所示(VI)包被原鑒定對(duì)載體蛋白OVA，半抗原CEPSEM和包被原CEPSEM-OVA進(jìn)行紫外掃描測(cè)定(200400nm)，發(fā)包被原CEPSEM-OVA與載體蛋白OVA及CEPSEM相比，吸收曲線有明顯改變，說(shuō)明半抗原CEPSEM與載體蛋白OVA偶聯(lián)成功。TNBS法測(cè)得半抗原CEPSEM與載體蛋白OVA的偶聯(lián)比為13:1。實(shí)施例5多克隆抗體的制備方法及抗體效價(jià)測(cè)定多克隆抗體的制備將免疫原慢慢解凍，然后加入等量的佐劑(第1次免疫用弗氏完全佐劑，以后加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑)。完全乳化后，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳緣靜脈多種注射方式免疫6只體重為2.53kg的健康新西蘭大白兔。第4次加強(qiáng)免疫后1周耳緣靜脈采血，并利用間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)。當(dāng)效價(jià)不再上升時(shí)，采用耳緣靜脈免疫兔子。1周后心臟采血，室溫靜置0.5lh，于4。C冰箱過(guò)夜后吸取上層析出的血清。抗血清采用硫酸銨沉淀法純化得到多克隆抗體，透析后冷凍干燥成粉末，于-2(TC下保存?zhèn)溆??？贵w效價(jià)的檢測(cè)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定抗體陽(yáng)性滴度以2.1倍于陰性血清的測(cè)定值為準(zhǔn)，測(cè)得抗體的陽(yáng)性滴度為1:640000實(shí)施例6抗體親和性及特異性試驗(yàn)將不同濃度的氨基脲的鄰硝基苯甲醛的衍生物NPSEM與抗體一起進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)，測(cè)定其抑制率，以確定抗體對(duì)NPSEM的親和性。其IC5。為0.12ng/mL，檢測(cè)限為0.09ng/mL。將NPSEM、鄰硝基苯甲醛、苯甲醛、硝基苯、NPAOZ、NPAMOZ和NPAHD配成不同濃度溶液，測(cè)定其交叉反應(yīng)率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與同類藥物無(wú)交叉反應(yīng)，見(jiàn)表1。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明由所設(shè)計(jì)半抗原制備的免疫原免疫產(chǎn)生的抗體具有靈敏度高，特異性好等優(yōu)點(diǎn)。表1交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1、一種氨基脲衍生物半抗原的制備方法，其特征在于將氨基脲與過(guò)量的帶羧基的苯甲醛衍生物在室溫條件下于甲醇中進(jìn)行氨醛縮合反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀經(jīng)洗滌、干燥得到半抗原。2、一種權(quán)利要求1所述制備方法制備得到的氨基脲衍生物半抗原，其特征在于具有式(I)所示結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3、一種權(quán)利要求1所述制備方法制備得到的氨基脲衍生物半抗原，其特征在于具有式(II)所示結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>4、一種氨基脲衍生物抗原的制備方法，其特征在于包括以下步(1)將權(quán)利要求1所述氨基脲衍生物半抗原與縮合劑N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺反應(yīng)形成活潑酯；(2)將活潑酯滴加入蛋白溶液中反應(yīng)；(3)步驟(2)反應(yīng)得到的偶聯(lián)有氨基脲衍生物半抗原的蛋白經(jīng)透析純化得到目標(biāo)抗原。5、一種權(quán)利要求4所述制備方法制備得到的氨基脲衍生物抗原，其特征在于所述具有式(III)所示結(jié)構(gòu)6、一種權(quán)利要求4所述制備方法制備得到的氨基脲衍生物抗原，其特征在于具有式(IV)所示結(jié)構(gòu)7、一種氨基脲衍生物抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟(a)將氨基脲衍生物抗原與弗氏佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；(b)免疫后抽取血液，分離血清；(c)血清經(jīng)辛酸硫酸銨純化得到抗體。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述氨基脲衍生物抗體的制備方法，其特征在于步驟(a)所述氨基脲衍生物抗原濃度為lmg/mL，氨基脲衍生物抗原與弗氏佐劑按l:l比例免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。9、一種氨基脲衍生物抗體的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于呋喃西林及其代謝物氨基脲的ELISA方法免疫化學(xué)分析中。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了氨基脲衍生物半抗原、抗原和抗體的制備方法，氨基脲與帶羧基的苯甲醛氨醛縮合后得到氨基脲衍生物半抗原，所述半抗原和氨基脲衍生物結(jié)構(gòu)相似，突出了此獸藥分子特異性抗原決定簇，并可通過(guò)活潑酯法偶聯(lián)載體蛋白制備抗原；使用該抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可獲得效價(jià)高、特異性好的針對(duì)氨基脲衍生物的抗體。所述抗體可用于動(dòng)物源性食品中氨基脲殘留量的快速檢測(cè)，檢測(cè)下限可達(dá)0.09ng/mL。文檔編號(hào)C07K16/06GK101407480SQ200810219299公開(kāi)日2009年4月15日申請(qǐng)日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日發(fā)明者孫遠(yuǎn)明,張世偉,楊金易,沈玉棟,弘王,肖治理,蔡肇婷,雷紅濤申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)