專利名稱：：具有鞘翅目活性的新的蘇云金芽孢桿菌基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從新的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)基因獲得的天然存在的核酸和重組核酸，所述基因編碼以抗蟲害殺蟲活性為特征的殺蟲多肽。本發(fā)明的組合物和方法使用所公開核酸及其所編碼的殺蟲多肽來控制植物疫害。
背景技術(shù)：
：蟲害是世界農(nóng)作物損失的主要因素。例如，西方玉米根蟲(Westerncornrootworm)進食、黑切根蟲損害或歐洲玉米螟損害可以在經(jīng)濟上摧毀農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者。僅歐洲玉米螟攻擊田地和甜玉米帶來的蟲害相關(guān)的農(nóng)作物損失就已在損害和控制開銷上達到每年十億美元。傳統(tǒng)地，影響蟲害群體的主要方法是應(yīng)用廣譜化學(xué)殺昆蟲劑。然而，消費者與政府調(diào)節(jié)員一樣越來越關(guān)心與生產(chǎn)和使用合成的化學(xué)殺蟲劑相關(guān)的環(huán)境危害。調(diào)節(jié)員出于這種關(guān)心已禁止或限制使用一些更為危險的殺蟲劑。因此，開發(fā)替代殺蟲劑具有實質(zhì)性利益。使用諸如真菌、細菌或其它昆蟲物種的微生物劑對農(nóng)業(yè)上重要的蟲害進行生物學(xué)控制，這為合成的化學(xué)殺蟲劑提供了對環(huán)境友好且具有商業(yè)吸引力的替代途徑。一般來講，使用生物殺蟲劑造成污染和環(huán)境危害的風(fēng)險較低，并且生物殺蟲劑相對于傳統(tǒng)廣譜化學(xué)殺昆蟲劑的性質(zhì)提供了更強的靶標特異性。此外，生物殺蟲劑的生產(chǎn)成本通常更低，并因而提高大量品種的農(nóng)作物的經(jīng)濟收益。已知芽孢桿菌屬的某些種的微生物具有抗廣譜蟲害的殺蟲活性，所述蟲害包括鱗翅目(L印idoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)及其它。蘇云金芽孢桿菌(Bt)和甲蟲芽孢桿菌(Bacilluspapilliae)屬于迄今所發(fā)現(xiàn)的最為成功的生物控制劑。昆蟲致病性還歸因于幼蟲芽孢桿菌(B.larvae)、緩病芽孢桿菌(B.Ientimorbus)、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)(Harwook,ed.,((1989)Bacillus(芽孢桿菌)(PlenumPress),306)和賭狀芽孢桿菌(B.cereus)(W096/10083)菌株。雖然也已從營養(yǎng)生長期的芽孢桿菌分離出殺蟲蛋白，但是殺蟲活性看上去集中在伴孢晶體蛋白包涵體上。已分離并表征編碼這些殺蟲蛋白的數(shù)種基因(參見，例如，美國專利第5，366，892號和第5，840，868號)。微生物殺昆蟲劑，特別是獲自芽孢桿菌菌株的那些，作為化學(xué)疫害控制的替代品在農(nóng)業(yè)上起重要作用。近來，農(nóng)業(yè)科研工作者通過基因工程改造農(nóng)作物植物來產(chǎn)生來自芽孢桿菌的殺蟲蛋白，已開發(fā)出具有增強的昆蟲抗性的農(nóng)作物植物。例如，玉米和棉花植物已被基因工程化以產(chǎn)生分離自Bt菌株的殺蟲蛋白(參見，例如，Aronson(2002)CellMol.LifeSci.59(3)417-425；Schnepfetal.(1998)MicrobiolMolBiolRev.62(3):775_806)。這些基因工程農(nóng)作物現(xiàn)在廣泛用于美國農(nóng)業(yè)，并且向農(nóng)民提供了傳統(tǒng)昆蟲控制方法的環(huán)境友好替代品。此外，已向美國農(nóng)民銷售經(jīng)基因工程改造而包含殺蟲的Cry毒素的馬鈴薯。仍需要具有更廣泛的抗蟲害殺昆蟲活性的新的Bt毒蛋白，例如對鞘翅目中更多品種的昆蟲具有活性的毒素。此外，仍需要具有抗更多蟲害活性的生物殺蟲劑和具有改良殺昆蟲活性的生物殺蟲劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供影響蟲害的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明的實施方式涉及影響昆蟲的方法，所述方法利用編碼殺昆蟲肽的核苷酸序列，從而產(chǎn)生表達實施方式中的殺昆蟲多肽的轉(zhuǎn)化的微生物和植物。這些害蟲包括農(nóng)業(yè)上重要的害蟲，諸如，例如，西方玉米根蟲，例如玉米根螢葉甲(DiabroticavirgiferaLeConte)。在一些實施方式中，該核苷酸序列編碼對屬于鞘翅目的至少一種昆蟲具有殺蟲性的多肽。實施方式提供核酸及其片段和其變體，其編碼具有抗蟲害殺蟲活性的多肽(例如，編碼SEQIDNO:2的SEQIDNO:1)。實施方式的野生型(例如，天然存在的)核苷酸序列編碼新的殺昆蟲肽，所述核苷酸序列獲得自Bt。實施方式還提供所公開的編碼生物學(xué)活性(例如，殺昆蟲)多肽的核苷酸序列的片段及變體。實施方式還提供分離的殺蟲(例如，殺昆蟲)多肽，其由實施方式的天然存在的核酸或經(jīng)修飾的(例如，突變的或經(jīng)操作的)核酸所編碼。在特定實例中，實施方式的殺蟲蛋白包括全長蛋白和多肽的片段，其產(chǎn)生自突變的核酸，所述核酸經(jīng)設(shè)計以將特定氨基酸序列引入實施方式的多肽。在特定實施方式中，所述多肽相對于其衍生自的天然存在的多肽具有增強的殺蟲活性。實施方式的核酸還可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的(例如，轉(zhuǎn)化的)單子葉或雙子葉植物，所述植物的特征在于基因組包含至少一個穩(wěn)定整合的核苷酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含實施方式的編碼序列，所述編碼序列與驅(qū)動所編碼殺蟲多肽表達的啟動子可操作地連接。因此，還提供轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物及其種子。在特定實施方式中，可以使用經(jīng)優(yōu)化而在宿主植物中提高表達的核酸來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物。例如，可以回譯(backtranslate)實施方式的一種殺蟲多肽，從而產(chǎn)生包含為在特定宿主中表達而優(yōu)化的密碼子的核酸，所述特定宿主例如諸如玉米(Zeamays)植物的農(nóng)作物植物。這種轉(zhuǎn)化的植物(例如，雙子葉或單子葉植物)表達編碼序列，從而導(dǎo)致產(chǎn)生殺蟲多肽，并賦予所述植物增加的昆蟲抗性。一些實施方式提供表達殺蟲多肽的轉(zhuǎn)基因植物，所述殺蟲多肽用于影響各種蟲害的方法。實施方式還包括含有實施方式的殺昆蟲多肽的殺蟲或殺昆蟲組合物，并且可以任選地包括另外的殺昆蟲肽。實施方式包括將該組合物應(yīng)用于蟲害環(huán)境，從而影響蟲害。發(fā)明詳述本發(fā)明的實施方式涉及影響蟲害、特別是植物疫害的組合物和方法。更為具體地，實施方式的分離的核酸及其片段和其變體包含編碼殺蟲多肽(例如蛋白)的核苷酸序列。所公開的殺蟲蛋白對諸如但不限于鞘翅目蟲害的蟲害具有生物學(xué)活性(例如殺蟲性)。目的蟲害包括但不限于西方玉米根蟲(玉米根螢葉甲)。實施方式的組合物包含分離的核酸及其片段和其變體，其編碼殺蟲多肽、包含實施方式的核苷酸序列的表達盒、分離的殺蟲蛋白和殺蟲組合物。一些實施方式提供經(jīng)修飾的殺蟲多肽，所述多肽的特征在于相對于相應(yīng)野生型蛋白的殺蟲活性具有改良的抗鞘翅目殺昆蟲活性。實施方式還提供用這些新的核酸轉(zhuǎn)化的植物和微生物，以及涉及將該核酸、殺蟲組合物、轉(zhuǎn)化生物體及其產(chǎn)物用于影響蟲害的方法。實施方式的核酸和核苷酸序列可以用于轉(zhuǎn)化任何生物體，從而產(chǎn)生所編碼的殺蟲蛋白。所提供的方法涉及將該轉(zhuǎn)化生物體用于影響或控制植物疫害。實施方式的核酸和核苷酸序列還可以用于轉(zhuǎn)化諸如葉綠體的細胞器(McBrideetal.(1995)Biotechnology13362-365；禾口Kotaetal.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA961840-1845)。實施方式還涉及鑒定編碼生物學(xué)活性殺蟲蛋白的天然存在的編碼序列片段和變體。實施方式的核苷酸序列直接用于影響疫害、特別是諸如鞘翅目疫害的蟲害的方法。因此，實施方式提供影響蟲害的新方法，所述方法不依賴傳統(tǒng)的合成的化學(xué)殺昆蟲劑的使用。實施方式涉及發(fā)現(xiàn)天然存在的、可生物降解的殺蟲劑以及編碼它們的基因。實施方式還提供同樣編碼生物學(xué)活性(例如，殺蟲)多肽的天然存在的編碼序列片段和變體。實施方式的核酸包括經(jīng)優(yōu)化用于特定生物體的細胞表達的核酸或核苷酸序列，例如使用植物偏好密碼子，以具有增強殺蟲活性的多肽氨基酸序列為基礎(chǔ)而回譯(即反向翻譯)的核酸序列。實施方式還提供突變，所述突變賦予實施方式的多肽改良的或改變的性質(zhì)。參見，例如，共同未決的2003年6月25日提交的美國申請第10/606，320號和2003年12月24日提交的第10/746，914號。在隨后的描述中，廣泛使用了大量術(shù)語。為促進對實施方式的理解，提供以下定義。可以用SI可接受的形式表示單位、前綴和符號。除非另有所指，分別地，核酸以5’至3’方向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基方向從左向右書寫。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的一字母符號來表示。同樣地，可以用通常接受的單字母碼表示核苷酸。參考說明書整體更為充分地定義以上定義的術(shù)語。如本文所用，“核酸”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。如本文所用，術(shù)語“編碼”或“所編碼的”用于特定核酸的上下文時，指該核酸包含指導(dǎo)該核苷酸序列翻譯成特定蛋白的必需信息。使用密碼子表示編碼蛋白的信息。編碼蛋白的核酸可以包含位于該核酸翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如，內(nèi)含子)或者可以缺少這樣的居間非翻譯序列(例如，如同在cDNA中)。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所編碼的蛋白的“全長序列”指具有天然(非合成)內(nèi)源序列的整個核酸序列或整個氨基酸序列。全長多核苷酸編碼該特定蛋白的全長、催化活性形式。如本文所用，用于核苷酸序列方向上下文的術(shù)語“反義”涉及二倍多核苷酸序列，所述多核苷酸序列以轉(zhuǎn)錄該反義鏈的方向與啟動子可操作地連接。該反義鏈與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物充分互補，以致該內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯通常受抑制。因而，將術(shù)語“反義”用于特定核苷酸序列的上下文時，該術(shù)語涉及該參考轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補鏈。本文可互換地使用術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”，以指氨基酸殘基的多聚物。該術(shù)語用于氨基酸多聚物，其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物。該術(shù)語還用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互換地使用術(shù)語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(統(tǒng)稱“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知類似物，所述類似物可以以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用?？梢詮谋疚墓_的核酸或者使用標準分子生物學(xué)技術(shù)制備實施方式的多肽。例如，可以通過在適當宿主細胞中表達實施方式的重組核酸，或可選擇地通過間接體內(nèi)(exvivo)方法的組合，來制備實施方式的蛋白。如本文所用，可以互換地使用術(shù)語“分離的，，和“純化的”，以涉及核酸或多肽或其生物學(xué)活性部分，其基本上或本質(zhì)上不含如在其天然存在的環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的通常伴隨或反應(yīng)于該核酸或多肽的組分。因而，用重組技術(shù)產(chǎn)生分離的或純化的核酸或多肽時，分離的或純化的核酸或多肽基本上不含其它細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者化學(xué)合成分離的或純化的核酸或多肽時，基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品?！胺蛛x的”核酸通常不含在該核酸所衍生自的生物體的基因組DNA中天然側(cè)翼于該核酸(即位于該核酸5’和3’端的序列)的序列(諸如，例如編碼蛋白的序列)。例如，在各種實施方式中，所分離的核酸可以包含少于約5kb，4kb，3kb，2kb，lkb，0.5kb或0.Ikb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在該核酸所衍生自的細胞的基因組DNA中天然側(cè)翼于該核酸。如本文所用，將術(shù)語“分離的”或“純化的”用于涉及實施方式的多肽時，指分離的蛋白基本上不含細胞物質(zhì)并且包含具有少于約30%，20%，10%或5%(干重計)的污染蛋白的蛋白制備物。當重組地產(chǎn)生實施方式的蛋白或其生物學(xué)活性部分時，培養(yǎng)基代表少于約30%，20%，10%或5%(干重計)的化學(xué)前體或非目的蛋白化學(xué)品。貫穿申請文件，將詞語“包括(comprising)”或諸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)，，的變體理解成提示包含所稱元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組，而非排除任何其它元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組。如本文所用，術(shù)語“影響蟲害”指對任何發(fā)育階段的昆蟲進食、生長和/或行為的有影響的改變，包括但不限于殺滅昆蟲、延遲生長、阻礙生殖能力、拒食素活性等等。如本文所用，將術(shù)語“殺蟲活性”和“殺昆蟲活性”同義地使用以指生物體或物質(zhì)(諸如，例如蛋白)的活性，其測量可以通過但不限于害蟲死亡率、害蟲體重減少、害蟲驅(qū)避性(r印ellency)以及進食和暴露適當長時間后害蟲的其它行為和物理變化。因而，具有殺蟲活性的生物體或物質(zhì)不利地影響至少一種可測量的害蟲健康參數(shù)。例如，“殺蟲蛋白”是自身顯示或與其它蛋白組合顯示殺蟲活性的蛋白。如本文所用，術(shù)語“殺蟲有效量”指存在于害蟲環(huán)境的具有殺蟲活性的物質(zhì)或生物體的量。對每一物質(zhì)或生物體而言，通過經(jīng)驗來確定在特定環(huán)境中受影響的每一害蟲的殺蟲有效量。類似地，當害蟲是昆蟲時，“殺昆蟲有效量”可以用于指“殺蟲有效量”。如本文所用，術(shù)語“重組工程化的”或“工程化的”指利用重組DNA技術(shù)引入(例如工程化)蛋白結(jié)構(gòu)的改變，這基于對蛋白作用機制的理解以及對被引入、被缺失或被取代的氨基酸的考慮。如本文所用，術(shù)語“突變核苷酸序列”或“突變”或“誘變的核苷酸序列”指經(jīng)誘變或改變而包含一個或多個核苷酸殘基(例如堿基對)的核苷酸序列，所述核苷酸殘基不存在于相應(yīng)的野生型序列中。這樣的誘變或改變由核酸殘基的一個或多個添加、缺失或取代或替換所組成。當通過添加、移除或替換蛋白水解位點的氨基酸來制備突變時，這樣的添加、移除或替換可以在該蛋白水解位點基序內(nèi)或鄰近該基序，只要完成了突變的目的(即只要改變了該位點的蛋白水解)。突變體核苷酸序列可以編碼突變體殺昆蟲毒素，所述毒素顯示改良的或降低的殺昆蟲活性，或者可以編碼氨基酸序列，所述氨基酸序列賦予包含它的多肽改良的或降低的殺昆蟲活性。如本文所用的，蛋白、多肽或氨基酸序列上下文的術(shù)語“突變體”或“突變”指經(jīng)突變或經(jīng)改造而包含一個或多個氨基酸殘基的序列，所述氨基酸殘基不存在于相應(yīng)的野生型序列中。這樣的突變或改變由氨基酸殘基的一個或多個添加、缺失或取代或替換所組成。突變體多肽顯示改良的或降低的殺昆蟲活性，或者代表氨基酸序列，所述氨基酸序列賦予包含它的多肽改良的殺昆蟲活性。因而，術(shù)語“突變體”或“突變”指突變體核苷酸序列和所編碼的氨基酸之一或兩者。突變體可以單獨使用或者與其它突變體或與實施方式的其它突變體相容地任意組合使用?！巴蛔凅w多肽”可以相反地顯示殺昆蟲活性的降低。將超過一個突變添加至特定核酸或蛋白時，所述突變可以同時或順序添加；如果順序添加，突變可以以任何合適的次序添加。如本文所用，術(shù)語“改良的殺昆蟲活性”或“改良的殺蟲活性”涉及實施方式的殺昆蟲多肽，所述多肽相對于其相應(yīng)的野生型蛋白具有增強的殺昆蟲活性，和/或涉及對更廣譜的昆蟲有效的殺昆蟲多肽，和/或涉及對不易受野生型蛋白毒性影響的昆蟲具有特異性的殺昆蟲多肽。改良的或增強的殺蟲活性的發(fā)現(xiàn)需要證明相對于野生型殺昆蟲多肽的殺蟲活性，對昆蟲靶標的殺蟲活性提高至少10%，或者殺蟲活性提高至少20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，60%，70%，100%，150%，200%或300%或更多，所述活性的確定是針對同樣的昆蟲。例如，提供改良的殺蟲或殺昆蟲活性，其中相對于受野生型Bt毒蛋白影響的昆蟲的范圍，受該多肽影響的昆蟲的范圍更寬或者更窄。當需要多功能性時，可能需要較寬的影響范圍，而當例如有益的昆蟲另外有可能受該毒素的使用或存在所影響時，可能需要較窄的影響范圍。雖然實施方式不受任何特別的作用機制的限制，但是也可以通過改變多肽的一個或多個特性來提供改良的殺蟲活性；例如，可以增加多肽在昆蟲腸內(nèi)的穩(wěn)定性或壽命，所述增加相對于相應(yīng)野生型蛋白的穩(wěn)定性或壽命。本文所用術(shù)語“毒素”指表現(xiàn)殺蟲活性或殺昆蟲活性或改良的殺蟲活性或改良的殺昆蟲活性的多肽?！癇t”或“蘇云金芽孢桿菌”毒素意在包括在Bt的各種菌株中發(fā)現(xiàn)的較寬種類的Cry毒素，其包括諸如例如Cryls，Cry2s或Cry3s的毒蛋白。術(shù)語“蛋白水解位點”或“切割位點”指氨基酸序列，其將敏感性賦予一類蛋白酶或特別的蛋白酶，以致包含所述氨基酸序列的多肽被該類蛋白酶或特別的蛋白酶所消化。據(jù)稱，蛋白水解位點對識別該位點的一種或多種蛋白酶“敏感”。本領(lǐng)域理解，消化效率各不相同，并且消化效率的降低可以導(dǎo)致該多肽在昆蟲腸內(nèi)穩(wěn)定性或壽命的增加。因而，蛋白水解位點可以將敏感性賦予不止一種蛋白酶或者不止一類蛋白酶，但是各種蛋白酶對該位點的消化效率可以各不相同。蛋白水解位點包括，例如，胰蛋白酶位點、糜蛋白酶位點和彈性蛋白酶位點。例如，研究已表明鱗翅目的昆蟲腸蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白醇。參見，例如，Lenzetal.(1991)Arch.InsectBiochem.Physiol.16201-212；禾口Hedegusetal.(2003)Arch.InsectBiochem.Physiol.53:30_47。例如，己在Helicoverpaarmigera幼蟲的中腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)約18種不同的胰蛋白酶(參見Gatehouseetal.(1997)8InsectBiochem.Mol.Biol.27:929_944)。已研究了這些蛋白酶所偏好的蛋白水解底物位點。參見，例如Petersonetal.(1995)InsectBiochem.Mol.Biol.25:765_774。已努力理解Bt毒蛋白的作用機制并利用改良的性質(zhì)工程化毒素。已表明昆蟲腸蛋白酶可以影響B(tài)tCry蛋白對該昆蟲的影響。一些蛋白酶通過將Cry蛋白從“毒素原(protoxin)，，形式加工至毒性形式或“毒素”，來活化Cry蛋白。參見Oppert(1999)Arch.InsectBiochem.Phys.421~12；禾口Carrolletal.(1997)J.InvertebratePathology70:41-49。該毒蛋白的活化可以包括從所述蛋白移除N末端和C末端肽，并且還可以包括從內(nèi)部切割該蛋白。其它蛋白酶可以降解所述Cry蛋白。參見Oppert，如前。不同特異性的Cry毒素的氨基酸序列的比較揭示了5個高度保守的序列單元(block)。所述毒素在結(jié)構(gòu)上包含3個不同的結(jié)構(gòu)域，從N末端到C末端為涉及孔形成的7個α螺旋的簇(稱作“結(jié)構(gòu)域1”)、涉及細胞結(jié)合的3個反平行β片層(稱作“結(jié)構(gòu)域2”)以及β三明治(稱作“結(jié)構(gòu)域3”)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些結(jié)構(gòu)域的位置和性質(zhì)。參見，例如，Lietal.(1991)Nature，305:815_821禾口Morseetal.(2001)Structure,9409-417。涉及特定結(jié)構(gòu)域，例如涉及結(jié)構(gòu)域1時，應(yīng)理解關(guān)于特定序列的結(jié)構(gòu)域的確切終點并不是關(guān)鍵的，只要該序列或其部分包含提供歸因于該特定結(jié)構(gòu)域的至少一些功能的序列。因而，例如，當提及“結(jié)構(gòu)域1”時，意在指特定序列包括7個α螺旋的簇，但所用序列或關(guān)于該簇的序列的確切終點并不關(guān)鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這類終點的確定以及對這類功能的評價。為了嘗試更好地表征和改良Bt毒蛋白，研究了Bt細菌菌株。發(fā)現(xiàn)從Bt菌株培養(yǎng)物制備的晶體制備物具有抗西方玉米根蟲的殺蟲活性(見實施例1)。嘗試鑒定來自所選菌株的編碼晶體蛋白的核苷酸序列，從這些細菌菌株分離實施方式的野生型(即天然存在的)核酸，將其克隆至表達載體并轉(zhuǎn)化進大腸桿菌。依賴給定制備物的特性，認識到殺蟲活性的證明有時需要胰蛋白酶預(yù)處理以活化該殺蟲蛋白。因而，應(yīng)理解一些殺蟲蛋白的活化需要蛋白酶消化(例如，通過胰蛋白酶、糜蛋白酶等等)，而其它蛋白在無活化作用下便是生物活性的(例如，殺蟲性)?？梢酝ㄟ^2003年6月25日提交的美國申請第10/606，320號和2003年12月24日提交的第10/746，914號所述的方法改造所述分子。此外，可以將核酸序列工程化，以編碼包含另外的突變的多肽，所述突變賦予相對于天然存在的多肽的殺蟲活性的改良的或改變的殺蟲活性。該工程化的核酸的核苷酸序列包含未在野生型序列中發(fā)現(xiàn)的突變。通常通過包括以下步驟的方法制備實施方式的突變體多肽獲得編碼Cry家族多肽的核酸序列；分析所述多肽的結(jié)構(gòu)，以鑒定特定“靶”位點的潛在基因序列的誘變，這基于對所述靶結(jié)構(gòu)域在毒素作用模式中的所提議功能的考慮；將一個或多個突變引入核酸序列以產(chǎn)生對所編碼多肽序列的一個或多個氨基酸殘基的所需改變；以及分析所產(chǎn)生多肽的殺蟲活性。Bt殺昆蟲毒素中的許多都是相關(guān)的，其氨基酸序列和三級結(jié)構(gòu)的相似程度各不相同，并且公知獲得Bt毒蛋白晶體結(jié)構(gòu)的方法。從文獻可獲得示例性的Cry3A和Cry3B多肽兩者的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)解析。解析到的Cry3A基因結(jié)構(gòu)(Lietal.(1991)Nature353815-821)提供了對該毒素結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系的深刻理解。組合考慮Bt毒素的已公開的結(jié)構(gòu)分析和所報道的與特定結(jié)構(gòu)、基序等等相關(guān)的功能，說明該毒素的特定區(qū)域與該蛋白的特定功能和特定作用模式的不連續(xù)步驟相關(guān)。例如，通常將分離自Bt的許多毒素描述為包含三個結(jié)構(gòu)域涉及孔形成的7螺旋束、涉及受體結(jié)合的3片層結(jié)構(gòu)域和β三明治基序(Lietal.(1991)Nature353:815-821)。如美國專利第7，105，332號和2003年12月24日提交的未決美國申請第10/746，914號所報道，可以通過將位于該毒素結(jié)構(gòu)域1的α螺旋3和4之間的區(qū)域作為靶標，來改良Cry蛋白的毒性。這一理論建立于關(guān)于殺昆蟲毒素的知識體系，包括1)據(jù)報道Cry3A毒素結(jié)構(gòu)域1的α螺旋4和5插入內(nèi)襯易感昆蟲中腸的細胞的脂雙分子層Gazitetal.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:12289-12294)；2)發(fā)明人了解野生型蛋白氨基酸序列內(nèi)胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位點的位置；3)觀察到在借助胰蛋白酶或糜蛋白酶處理的體外活化之后，野生型蛋白對某些昆蟲更具活性；以及4)報道從3’端消化毒素導(dǎo)致了對昆蟲毒性的降低?？梢灾苽湟幌盗型蛔?，并將其置于各種背景序列中，從而制備具有增強的或者改變的殺蟲活性的新的多肽。參見，例如，如今已放棄的、2003年6月25日提交的美國申請第10/606，320號以及2003年12月24日提交的第10/746，914號。這些突變體包括但不限于在位于結(jié)構(gòu)域1的螺旋3和4之間的區(qū)域另外添加至少一個蛋白酶敏感的位點(例如胰蛋白酶切割位點)；用不同蛋白酶敏感的位點替換野生型序列的原始蛋白酶敏感的位點；在特定位置添加多蛋白酶敏感位點；在一個或多個蛋白酶敏感的位點附近添加氨基酸殘基，從而改變所述多肽的折疊并因而增強在該一個或多個蛋白酶敏感的位點處的多肽消化；和添加突變以保護該多肽免受使毒性降低的降解性消化(例如，制備一系列突變，其中用纈氨酸替換野生型氨基酸以保護所述多肽免于消化)。可以單獨或以任意組合使用突變，從而提供實施方式的多肽。實施方式以這種方式提供包含各種突變的序列，所述突變諸如，例如包含位于所編碼多肽結(jié)構(gòu)域1的α螺旋3和4之間的另外的或可選擇的蛋白酶敏感位點的突變。另外的或可選擇的蛋白酶敏感位點的突變可以對諸如絲氨酸蛋白酶的數(shù)種蛋白酶或者諸如彈性蛋白酶的酶敏感，所述絲氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶和糜蛋白酶。因而，另外的或者可選擇的蛋白酶敏感位點的突變可以經(jīng)設(shè)計以致該位點被蛋白酶類容易地識別和/或切割，所述蛋白酶諸如哺乳動物蛋白酶或昆蟲蛋白酶。還可以將蛋白酶敏感的位點設(shè)計為被已知產(chǎn)生于生物體的特定種類的酶或特定酶切割，所述酶諸如，例如棉鈴蟲Heliothiszea產(chǎn)生的糜蛋白酶(Lenzetal.(1991)Arch.InsectBiochem.Physiol.16:201_212)。突變還可以賦予對蛋白水解消化的抗性，例如對糜蛋白酶在所述肽的C末端的消化的抗性。所編碼多肽的氨基酸序列存在另外的和/或可選擇的蛋白酶敏感位點，這可以提高實施方式的核酸編碼的多肽的殺蟲活性和/或殺蟲特異性。因此，實施方式的核苷酸序列可以被重組工程化或者被操作以產(chǎn)生具有改良的或改變的殺蟲活性和/或特異性的多肽，所述改良或改變相對于未經(jīng)修飾的野生型毒蛋白。另外，本文公開的突變可以被置于其它核苷酸序列或與其它核苷酸序列聯(lián)用，從而提供改良的性質(zhì)。例如，昆蟲糜蛋白酶容易切割的蛋白酶敏感位點可以被置于Cry背景序列，以提供針對該序列的改良的毒性，所述昆蟲糜蛋白酶例如在花邊粘蟲(berthaarmyworm)或棉鈴蟲中發(fā)現(xiàn)的糜蛋白酶(Hegedusetal.(2003)Arch.InsectBiochem.Physiol.5330-47；禾口Lenzetal.(1991)Arch.InsectBiochem.Physiol.16=201-212)。實施方式以這種方式提供具有改良性質(zhì)的毒性多肽。例如，突變的Cry核苷酸序列可以包含另外的突變體，所述突變體包含將第二胰蛋白酶敏感的氨基酸序列(除開天然存在的胰蛋白酶位點)引入所編碼多肽的另外的密碼子。實施方式的可選擇的添加突變體包含另外的密碼子，所述密碼子經(jīng)設(shè)計以將至少一個另外的不同的蛋白酶敏感的位點引入該多肽，例如，緊靠天然存在的胰蛋白酶位點5’或3’的糜蛋白酶敏感的位點?？蛇x擇地，可以制備取代突變體，其中破壞編碼天然存在的蛋白酶敏感位點的核酸的至少一個密碼子，并且將可選擇的密碼子引入核酸序列，從而提供不同的(例如取代的)蛋白酶敏感的位點。還可以將替換突變體添加至Cry序列，其中破壞所編碼多肽中存在的天然存在的胰蛋白酶切割位點，并且將糜蛋白酶或彈性蛋白酶切割位點引入它的位置。認識到可以使用編碼蛋白水解位點或推定的蛋白水解位點(例如諸如NGSR、RR或LKM的序列)氨基酸序列的任何核苷酸序列，并且用于將這些切割位點中的任何位點引入變體多肽的密碼子的確切身份可以根據(jù)用途而不同，所述用途即在特定植物物種中的表達。還認識到所公開突變中的任何突變可以被引入實施方式的任一多核苷酸序列，所述序列包含提供天然胰蛋白酶切割位點的氨基酸殘基的密碼子，所述切割位點是修飾的靶標。因此，可以修飾全長毒素或其片段的變體，以包含另外的或可選擇的切割位點，并且這些實施方式意在為本文公開的實施方式的范圍所包括。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，只要所編碼多肽保留殺蟲活性，任何有用的突變可以被添加至實施方式的序列。因而，也可以突變序列，以致所編碼多肽對糜蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性。可以以任何組合在特定位置添加超過一個的識別位點，并且可以向所述毒素添加或從所述毒素移除多識別位點。因而，另外的突變可以包括3個、4個或更多個識別位點。將認識到可以在任一合適的多核苷酸序列中工程化多突變；因此，可以修飾全長序列或其片段，以包含另外的或可選擇的切割位點以及對蛋白水解消化具有抗性。如此，實施方式提供包含突變的Cry毒素，所述突變改善殺蟲活性，實施方式還提供改良的組合物以及使用其它Bt毒素影響害蟲的方法。突變可以保護該多肽免于蛋白酶降解，所述保護例如是通過從不同區(qū)域移除諸如推定的絲氨酸蛋白酶位點和彈性蛋白酶識別位點的推定的蛋白水解位點?？梢砸瞥蚋脑爝@些推定位點的一些或全部，以致原始位點位置的蛋白水解被降低?？梢酝ㄟ^比較突變體多肽和野生型毒素或者通過比較氨基酸序列各不相同的突變體毒素，來評價蛋白水解的變化。蛋白水解位點和推定的蛋白水解位點包括但不限于以下序列RR，胰蛋白酶切割位點；LKM，糜蛋白酶位點；和NGSR，胰蛋白酶位點。只要所述多肽的殺蟲活性被提高，可以通過添加或缺失任意數(shù)目和種類的氨基酸殘基來改造這些位點。因而，相對于天然序列或背景序列，由包含突變的核苷酸序列編碼的多肽將包含至少一個氨基酸改變或添加，或者2，3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，32，35，38，40，45，47，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190,200，210，220，230，240，250，260，270或280或更多個氨基酸改變或添加。如本領(lǐng)域所知，還可以通過截短天然或全長序列來提高多肽的殺蟲活性。實施方式的組合物包括核酸及其片段和其變體，其編碼殺蟲多肽。特別地，實施方式提供分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼SEQIDNO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者包含編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，及其片段和其變體。另外受到關(guān)注的是編碼實施方式的殺蟲蛋白的優(yōu)化核苷酸序列。如本文所用，短語“優(yōu)化核苷酸序列”指為在特定生物體表達而優(yōu)化的核酸，所述特定生物體例如是植物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知方法制備用于任何目的生物體的優(yōu)化核苷酸序列。參見，例如，如今已放棄的、2003年6月25日提交的美國申請第10/606，320號以及2003年12月24日提交的第10/746，914號，它們描述了編碼所公開殺蟲蛋白的優(yōu)化核苷酸序列。在本實施例中，所述核苷酸序列的制備是通過反向翻譯蛋白的氨基酸序列，并改變核苷酸序列以致包含玉米偏好密碼子但仍編碼相同的氨基酸序列。該方法的更多細節(jié)描述于Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:477_498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高殺蟲蛋白在植物中的表達，所述植物例如禾本科(Gramineae)(Poaceae)單子葉植物，例如玉米(maize或corn)植物。實施方式還提供分離的殺蟲(例如殺昆蟲)多肽，其由實施方式的天然存在的或修飾的核酸所編碼。更為具體地，實施方式提供包括SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽，以及本文所述核酸編碼的多肽，本文所述核酸例如SEQIDNO:1所示的核酸，及其片段和其變體。在特定實施方式中，實施方式的殺蟲蛋白提供全長殺昆蟲多肽、全長殺昆蟲多肽的片段以及由突變核酸產(chǎn)生的變體多肽，所述突變核酸經(jīng)設(shè)計將特定氨基酸序列引入實施方式的多肽。在特定實施方式中，被引入所述多肽的氨基酸序列包括提供諸如蛋白酶的酶的切割位點的序列。本領(lǐng)域已知Bt毒素的殺蟲活性通常通過各種蛋白酶在昆蟲腸內(nèi)對所述肽的切割被活化。因為肽在昆蟲腸內(nèi)不總是以全效切割，所以全長毒素的片段相對于全長毒素自身可以具有增強的殺蟲活性。因而，實施方式的多肽中的一些包括全長殺昆蟲多肽的片段，并且多肽片段、變異體和突變中的一些將相對于其衍生自的天然存在的殺昆蟲多肽的活性，具有增強的殺蟲活性，特別是如果天然存在的殺昆蟲多肽在篩選活性前未用蛋白酶進行體外活化。因而，本申請包括所述序列的截短形式或片段?？梢詫⑼蛔冎萌氚ㄋ霰唤囟潭嚯牡娜我槐尘靶蛄校灰龆嚯谋Ａ魵⑾x活性。使用本領(lǐng)域已知的分析或本文他處描述的分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地比較兩種或更多種蛋白的殺蟲活性。將理解實施方式的多肽可以通過表達本文所公開的核酸或通過使用標準分子生物學(xué)技術(shù)而產(chǎn)生。認識到所述殺蟲蛋白可以是寡聚的并且會在分子量、殘基數(shù)目、組分多肽、抗特定害蟲活性以及其它特性上各不相同。然而，通過本文所述方法，可以分離并表征對各種害蟲有活性的蛋白。實施方式的殺蟲蛋白可以與其它Bt毒素或其它殺昆蟲蛋白組合使用，從而提高靶昆蟲范圍。此外，實施方式的殺蟲蛋白與其它Bt毒素或不同性質(zhì)的其它殺昆蟲原則的組合使用具有預(yù)防和/或處理昆蟲抗性的特定功效。其它殺昆蟲劑包括蛋白酶抑制劑(絲氨酸和半胱氨酸類型)、α淀粉酶以及過氧化物酶。實施方式還包括核苷酸及其編碼的氨基酸序列和多肽的片段和變體。如本文所用，術(shù)語“片段”指實施方式的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以編碼蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相應(yīng)全長蛋白的生物學(xué)活性，并因而具有殺蟲活性。因而，已知實施方式的多核苷酸和氨基酸序列中的一些可以正確地稱為片段和突變體。應(yīng)理解如術(shù)語“片段”用于提及實施方式的核酸序列時，該術(shù)語還包括可用作雜交探針的序列。這類核苷酸序列通常不編碼保留生物學(xué)活性的片段蛋白。因而，核苷酸序列的片段的范圍可以從至少約20個核苷酸，約50個核苷酸，約100個核苷酸到編碼實施方式的蛋白的全長核苷酸序列。編碼實施方式的殺蟲蛋白生物學(xué)活性部分的實施方式的核苷酸序列片段將編碼至少15,25,30,50,100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100或1200個連續(xù)的氨基酸，或者編碼多達實施方式的殺蟲多肽中存在的全部數(shù)量的氨基酸(例如SEQIDNO2的1163個氨基酸)。因而，應(yīng)理解實施方式還包括多肽，所述多肽是實施方式的示例性殺蟲蛋白的片段并且具有至少長15，25，30，50，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000,1100或1200個連續(xù)氨基酸或者多達實施方式的殺蟲多肽中存在的全部數(shù)量的氨基酸(例如SEQIDNO:2的1163個氨基酸)。可以用作雜交探針或PCR引物的實施方式的核苷酸序列片段通常不需要編碼殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分。因而，實施方式的核酸片段可以編碼殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分，或者它可以是能夠用作使用本文所公開方法的雜交探針或PCR引物的片段。殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分的制備可以通過分離實施方式的核苷酸序列中的一種的一部分，表達殺蟲蛋白的所編碼部分(例如通過體外重組表達)，和分析所述殺蟲蛋白所編碼部分的活性。作為實施方式核苷酸序列片段的核酸包括至少16，20，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，1000，1200，1400，1600，1800或2000個核苷酸，或者多達本文公開的核苷酸序列中所存在數(shù)量的核苷酸(例如SEQIDN0:1的3491個核苷酸)。特定實施方式涉及衍生自(例如產(chǎn)生自)實施方式的第一核酸的片段，其中所述片段編碼以殺蟲活性為特征的截短的毒素。實施方式的多核苷酸片段所編碼的截短的多肽的特征在于等價或改良的殺蟲活性，所述等價或改良是相對于該片段衍生自的第一核酸所編碼的相應(yīng)全長多肽的活性。所涉及的是實施方式的該核酸片段可以在天然或相應(yīng)全長編碼序列的3’端被截短。核酸片段還可以在天然或相應(yīng)全長編碼序列的5’和3’端均被截短。本文所用術(shù)語“變體”指基本上相似的序列。對于核苷酸序列，保守變體包括由于遺傳密碼子簡并性而編碼實施方式的殺蟲多肽中的一種的氨基酸序列的那些序列。諸如這些的天然存在的等位基因變體可以使用公知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，所述技術(shù)諸如，例如本文所列的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體核苷酸序列還包括合成衍生的核苷酸序列，諸如使用例如位點定向誘變而產(chǎn)生的仍編碼實施方式的殺蟲蛋白的那些，諸如突變體毒素。一般來講，實施方式的特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的序列一致性，一致性的確定是通過本文他處所述的序列比對程序，所述程序使用默認參數(shù)。實施方式的核苷酸序列變體與該序列的差異可以少至1-15個核苷酸、少至1-10個(例如6-10個)，少至5個，少至4，3，2或甚至1個核苷酸。評價實施方式的特定核苷酸序列(即示例性核苷酸序列)的變體還可以通過比較變體核苷酸序列所編碼多肽和該參考核苷酸序列所編碼多肽的序列一致性百分比。因而，例如，公開了編碼與SEQIDNO:2的多肽具有給定序列一致性百分比的多肽的分離的核酸?？梢允褂帽疚乃幩鲂蛄斜葘Τ绦蛴嬎闳蝺蓚€多肽之間的序列一致性百分比，所述程序使用默認參數(shù)。如果通過比較實施方式的任意給定對多核苷酸所編碼的兩個多肽所享有的序列一致性百分比，來評價所述任意給定對，那么該兩個所編碼多肽之間的序列一致性百分比為至少約40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，一般至少約75%，80%，85%，至少約90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，或者至少約98%，99%或更高的序列一致性。如本文所用，術(shù)語“變體蛋白，，包括衍生自天然蛋白的多肽，所述衍生是通過缺失(所謂的截短)天然蛋白N末端和/或C末端的一個或多個氨基酸或?qū)⒁粋€或多個氨基酸添加至所述天然蛋白的N末端和/或C末端；在天然蛋白的一個或多個位點缺失或添加一個或多個氨基酸；或者在天然蛋白的一個或多個位點取代一個或多個氨基酸。因而，術(shù)語“變體蛋白”包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天熱蛋白生物學(xué)活性，即具有殺蟲活性的足夠數(shù)目的連續(xù)氨基酸殘基。這樣的殺蟲活性相對天然蛋白可以是不同的或者是改良的，或者它可以是不變的，只要保留了殺蟲活性。實施方式包括的變體蛋白具有生物學(xué)活性，即它們繼續(xù)具有天然蛋白的所需的生物學(xué)活性，所述活性即本文所述的殺蟲活性。所述變體可以得自例如基因多態(tài)性或人類的操作。實施方式的天然殺蟲蛋白的生物學(xué)活性變體將與天然蛋白氨基酸序列具有至少約60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%,96%,97%,98%,99%或更高的序列一致性，一致性的確定是通過本文他處描述的序列比對程序，所述程序使用默認參數(shù)。實施方式的蛋白的生物學(xué)活性變體與該蛋白的差異可以少至1-15個氨基酸殘基、少至1-10個(例如6-10個)，少至5個，少至4，3，2或甚至1個氨基酸殘基。實施方式還包括轉(zhuǎn)化的微生物，所述轉(zhuǎn)化使用至少一種實施方式的核酸、包含所述核酸的表達盒或者包含所述表達盒的載體。在一些實施方式中，所述微生物是依靠植物增殖的微生物。本發(fā)明的實施方式涉及封裝的殺蟲蛋白，所述蛋白包括能夠表達至少一種實施方式的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)化的微生物。實施方式提供殺蟲組合物，包括實施方式的轉(zhuǎn)化的微生物。在該實施方式中，所述轉(zhuǎn)化的微生物通常以殺蟲有效量與適當?shù)妮d體共同存在于所述殺蟲組合物中。實施方式還包括殺蟲組合物，所述組合物包括殺昆蟲有效量的實施方式的分離的蛋白，以及適當?shù)妮d體，所述分離的蛋白單獨存在或者與實施方式的轉(zhuǎn)化的生物體和/或?qū)嵤┓绞降姆庋b的殺蟲蛋白組合。實施方式還提供使用實施方式的殺蟲蛋白與至少一種其它的或“第二”殺蟲蛋白的組合，來增加昆蟲靶范圍的方法?？梢詫⒈绢I(lǐng)域已知的任意殺蟲蛋白用于實施方式的方法。所述殺蟲蛋白包括但不限于Bt毒素、蛋白酶抑制劑、α淀粉酶以及過氧化物酶。實施方式還包括轉(zhuǎn)化的植物或轉(zhuǎn)基因植物，其包含至少一種實施方式的核苷酸序列。在一些實施方式中，使用核苷酸構(gòu)建體穩(wěn)定地構(gòu)建植物，所述構(gòu)建體包含與在植物細胞中驅(qū)動表達的啟動子可操作地連接的至少一種實施方式的核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化的植物”和“轉(zhuǎn)基因植物”表示基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。一般來說，所述異源多核苷酸在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化的植物的基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合，以致將所述多核苷酸傳遞給后代?？梢詫⑺霎愒炊嗪塑账釂为毜鼗蜃鳛橹亟M表達盒的一部分整合進基因組。應(yīng)理解如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”包括基因型已通過異源核酸的存在而被改14變的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或者植物，包括最初如此改變的那些轉(zhuǎn)基因，以及通過有性雜交或無性繁殖從所述最初的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的那些。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”不包括借助常規(guī)植物育種方法或者借助天然發(fā)生的事件對基因組(染色體或染色體外)的改變，所述天然發(fā)生的事件諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或者自發(fā)突變。如本文所用，術(shù)語“植物”包括整體植物、植物器官(例如葉、莖、根等等)、種子、植物細胞及其子代。轉(zhuǎn)基因植物的部分屬于實施方式的范圍，包括，例如，源于轉(zhuǎn)基因植物或其子代并因而至少部分由轉(zhuǎn)基因細胞組成的植物細胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚胎以及花、莖、果實、葉以及根，所述轉(zhuǎn)基因植物先用實施方式的DNA分子轉(zhuǎn)化。如本文所用，術(shù)語植物包括植物細胞、植物原生質(zhì)體、可以再生出植物的植物細胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物團塊和植物細胞，其為完整的植物或者植物的部分，諸如胚胎，花粉，胚珠，種子，葉，花，枝，果實，果仁，穗，穗軸，殼，秸稈，根，根尖，花藥等等。可以用于實施方式的方法的植物種類通常與適于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物種類一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物兩者。所述植物包括例如馬鈴薯(Solanumtuberosum)和玉米(Zeamays)。雖然實施方式不依賴特定生物學(xué)機制來增加植物對植物害蟲的抗性，但是實施方式的核苷酸序列在植物中的表達可以導(dǎo)致產(chǎn)生實施方式的殺蟲蛋白以及提高所述植物對植物害蟲的抗性。實施方式的植物可以用于農(nóng)業(yè)上影響蟲害的方法。某些實施方式提供轉(zhuǎn)化的農(nóng)作物植物，諸如例如玉米植物，其可以用于影響該植物的蟲害的方法，所述蟲害諸如例如西方玉米根蟲?！笆茉囍参锘蛑参锛毎笔菍δ康幕虻闹T如轉(zhuǎn)化的遺傳改造已經(jīng)生效的植物或植物細胞，或者是傳自如此改造的植物或細胞并且包含所述改造的植物或植物細胞?！皩φ铡被颉皩φ罩参铩被颉皩φ罩参锛毎碧峁┯糜跍y量受試植物或植物細胞表型改變的參考點ο對照植物或植物細胞可以包括，例如(a)野生型植物或細胞，即與遺傳改造起始材料具有相同基因型的植物或細胞，所述遺傳改造產(chǎn)生受試植物或細胞；(b)與所述起始材料具有相同基因型但已用空構(gòu)建體(即用對目的性狀無已知效果的構(gòu)建體，諸如包含標志物基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞；(c)是受試植物或植物細胞的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細胞；(d)與所述受試植物或植物細胞在遺傳上一致但未暴露于會誘導(dǎo)目的基因表達的條件或刺激物的植物或植物細胞；或(e)受試植物或植物細胞自身，其處于目的基因不被表達的條件下。本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地認同，諸如位點特異性誘變和隨機誘變、聚合酶鏈式反應(yīng)方法和蛋白工程化技術(shù)的分子生物學(xué)領(lǐng)域的進步提供了廣泛的適當?shù)墓ぞ吆筒僮鞑襟E，以用于改造或者工程化農(nóng)業(yè)上感興趣的蛋白的氨基酸序列和潛在的基因序列。因而，實施方式的蛋白可以以各種方式被改造，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于所述操作的方法為本領(lǐng)域所公知。例如，可以通過將突變引入合成核酸(例如DNA分子)制備殺蟲蛋白的氨基酸序列變體。用于誘變和核酸改變的方法為本領(lǐng)域所公知。例如，可以使用寡核苷酸介導(dǎo)的位點定向誘變技術(shù)，引入經(jīng)設(shè)計的改變。參見，例tUKunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492；Kunkeletal.(1987)MethodsinEnzymo1.154:367_382；美國專利第4，873，192號；WalkerandGaastra,eds.(1983)TechniquesinMolecularBiology(分子生物學(xué)技術(shù))(MacMillanPublishingCompany,NewYork)，以及本文所引用的文獻。可以修飾實施方式的突變的核苷酸序列，從而改變約1，2，3，4，5，6，8，10，12或更多個存在于所編碼多肽一級序列的氨基酸。可選擇地，可以引入更多的對天然序列的改變，以致所編碼蛋白可以具有至少約或2%，或者約3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，或者約13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，或20%，21%，22%，23%，24%，或25%，30%，35%，或40%或更多的相對于對應(yīng)的野生型蛋白而改變或者另外修飾的密碼子。以同樣的方式，所編碼蛋白可以具有至少約或2%，或者約3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，或者約13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,或20%，21%，22%，23%，24%，或25%，30%，35%，或40%或更多的相對于對應(yīng)的野生型蛋白而添加的密碼子。應(yīng)理解，實施方式的突變的核苷酸序列意在包括具有殺蟲活性的生物學(xué)功能的、等同的肽，所述殺蟲活性諸如改良的殺蟲活性，其通過抗西方玉米根蟲幼蟲的拒食素性質(zhì)來確定。所述序列的出現(xiàn)可以是因為密碼子冗余性和功能性等同，已知其天然地存在在核酸序列和如此編碼的蛋白內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到氨基酸添加和/或取代通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對相似性，例如，所述取代基的疏水性、電荷、大小等等。具有各種前述所考慮性質(zhì)的示例性氨基酸取代基團為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且包括精氨酸與賴氨酸；谷氨酸和天門冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。關(guān)于不影響目的蛋白生物學(xué)活性的適當氨基酸取代的指南可以在Dayhoffetal.(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(蛋白序列禾口結(jié)構(gòu)圖集)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C)(通過引用并入本文)的模型中找到?？梢赃M行諸如將一個氨基酸換作具有相似性質(zhì)的另一個氨基酸的保守性取代。實施方式的基因和核苷酸序列因而包括天然存在的序列和突變體形式兩者。同樣地，實施方式的蛋白包括天然存在的蛋白及其變體(例如截短的多肽)和其經(jīng)修飾的(例如突變體)形式。所述變體將繼續(xù)具有所需殺蟲活性。顯然，將在編碼所述變體的核苷酸序列中產(chǎn)生的突變絕不能使所述序列不符合讀框，并且所述突變通常不會產(chǎn)生能夠產(chǎn)生mRNA二級結(jié)構(gòu)的互補區(qū)。參見，歐洲專利申請公開文本第75，444號。本文所包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不應(yīng)對所述蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生劇烈改變。然而，當在進行取代、缺失或插入前，難以預(yù)測其確切效果時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解所述效果將通過諸如昆蟲進食分析的常規(guī)篩選分析來評價。參見，例如，通過引用并入本文的Marroneetal.(1985)J.Econ.Entomol.78:290_293禾口CzaplaandLang(1990)J.Econ.Entomo1.83:2480_2485ο變體核苷酸序列和蛋白還包括衍生自諸如DNA重排的誘變和重組方法的序列和蛋白。利用該方法，可以操作一個或多個不同的編碼序列，從而產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的新的殺蟲蛋白。如此，可以從相關(guān)序列多核苷酸群產(chǎn)生重組多核苷酸文庫，所述相關(guān)序列多核苷酸包含具有基本的序列一致性的序列區(qū)域，并且可以在體內(nèi)或體外被同源重組。例如，使用該方法，可以在實施方式的核苷酸序列和其它已知的Cry核苷酸序列的對應(yīng)部分之間重組全長編碼序列、編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序或者實施方式的核苷酸序列的任意片段，從而獲得新基因，所述新基因編碼具有改良的目的性質(zhì)的蛋白。受到關(guān)注的性質(zhì)包括但不限于每單位殺蟲蛋白的殺蟲活性、蛋白穩(wěn)定性、對非靶物種、特別是對人類、家畜以及表達實施方式的殺蟲多肽的植物和微生物的毒性。實施方式不受特定重排策略的限制，除開所述重排策略涉及至少一種實施方式的核苷酸序列或其部分。重排可以僅涉及本文所公開的核苷酸序列，或者可以另外涉及重排本領(lǐng)域已知的其它核苷酸序列。DNA重排策略為本領(lǐng)域所已知。參見，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9110747-10751；Stemmer(1994)Nature370389-391；Cramerietal.(1997)NatureBiotech.15436-438；Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.272336-347；Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA944504-4509；Cramerietal.(1998)Nature391288-291；以及美國專利第5，605，793號和第5，837，458號。還可以將實施方式的核苷酸序列用于從其它生物體分離相應(yīng)的序列，所述其它生物體特別是其它細菌，更為特別地是其它芽孢桿菌菌株。如此，可以使用諸如PCR、雜交等等的方法來鑒定這些序列，所述鑒定基于其與本文所述序列的序列同源性?；谄渑c本文所述完整序列或其片段的序列一致性而選擇的序列也為實施方式所包括。這些序列包括作為所公開序列同源物的序列。術(shù)語“同源物”指衍生自共同祖先基因并且因物種形成而在不同物種中所發(fā)現(xiàn)的基因。對于在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因，如果其核苷酸序列和/或其所編碼的蛋白序列如本文他處所定義而享有基本的序列一致性，則被認為是同源物。同源物的功能在物種間常常高度保守。在PCR方法中，可以設(shè)計用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸引物，以從提取自任何目的生物體的cDNA或基因組DNA擴增相應(yīng)的DNA序列。設(shè)計PCR引物和PCR克隆的方法通常為本領(lǐng)域己知，并且公開于Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)，下文稱"Sambrook"。另參見Innisetal.，eds.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(PCR操作步驟方法及應(yīng)用指南)(AcademicPress,NewYork)；lnnisandGelfand,eds.(1995)PCRStrategies(PCR策)(AcademicPress,NewYork)；VXRInnisandGelfand,eds.(1999)PCRMethodsManual(PCR方法手冊)(AcademicPress,NewYork)。PCR的已知方法包括但不限于如下方法，所述方法使用成對引物、巢式引物、單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等等。在雜交技術(shù)中，將已知核苷酸序列的全部或部分用作與其它相應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交的探針，所述其它相應(yīng)核苷酸序列存在于來自所選生物體的已克隆基因組DNA片段或cDNA片段群(即基因組文庫或cDNA文庫)。所述雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用諸如32P的可檢測基團或其它可檢測標志物來標記。因而，例如，可以通過標記基于實施方式序列的合成寡核苷酸制備雜交探針。制備雜交探針和構(gòu)建cDNA及基因組文庫的方法通常為本領(lǐng)域已知，并且公開于Sambrook。例如，可以將本文公開的完整序列或者其一個或多個部分用作能夠與對應(yīng)序列和信使RNA特異性雜交的探針。為在各種條件下完成特異性雜交，所述探針包含獨特于實施方式序列并且通常長至少約10或20個核苷酸的序列。可以使用所述探針，以通過PCR從所選生物體擴增相應(yīng)的Cry序列。可以使用該技術(shù)，以從所需生物體分離其它編碼序列，或?qū)⒃摷夹g(shù)用作診斷分析，以確定生物體是否存在編碼序列。雜交技術(shù)包括雜交篩選所接種的DNA文庫(噬菌斑或菌落；參見，例如，Sambrook)。可以在嚴緊條件下進行所述序列的雜交。如本文所用，術(shù)語“嚴緊條件”或“嚴緊雜交條件”表示如下條件，即在該條件下，相對于與其它序列雜交，探針將以可檢測的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)與其靶序列雜交。嚴緊條件是序列依賴性的并且在不同環(huán)境中有所不同。通過控制雜交嚴緊性和/或控制清洗條件，可以鑒定與所述探針100%互補的靶序列(同源探針法)。可選擇地，可以調(diào)節(jié)嚴緊條件，以允許一些序列錯配，以便檢測較低的相似度(異源探針法)。通常，探針長度少于約1000或500個核苷酸。通常，嚴緊條件是如下的條件，即在該條件中，鹽濃度為PH7.0至8.3下，少于約1.5MNa離子，通常約0.OlM至1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，并且溫度為用于短探針(例如10到50個核苷酸)的至少約30°C，和用于長探針(例如大于50個核苷酸)的至少約60°C。還可以通過添加諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)嚴緊條件。示例性的低嚴緊條件包括37°C下使用30%至35%的甲酰胺緩沖液、IMNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)雜交，50°C至55°C下在IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中清洗。示例性的中度嚴緊條件包括37°C下在40%至45%甲酰胺、1.0MNaClU%SDS中雜交，55°C至60°C下在0.5X至IXSSC中清洗。示例性的高嚴緊條件包括37°C下在50%甲酰胺、IMNaClU%SDS中雜交，60°C至65°C下在0.IXSSC中最后清洗至少約20分鐘。任選地，清洗緩沖液可以包含約0.至約SDS0雜交持續(xù)時間通常少于約24小時，通常為約4小時至約12小時。特異性通常依賴雜交后的清洗，關(guān)鍵因素在于最后清洗溶液的離子強度和溫度。DNA-DNA雜合體的Tm(熱力學(xué)熔點)可以近似自MeinkothandWahl(1984)Anal.Biochem.138:267_284的公式Tm=81.5"C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)_0·61(%甲酰胺)-500/L；其中M是一價陽離子的克分子濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分數(shù)，“％甲酰胺”是雜交溶液的甲酰胺百分數(shù)，而L是雜合體的堿基對長度。Tm是(確定的離子強度和PH下)50%的互補靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。通常將清洗至少進行至達到平衡，并且達到低的雜交背景水平，諸如進行2小時、1小時或30分鐘。每的錯配對應(yīng)使Tm降低約1°C;因而，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或清洗條件，從而與所需一致性的序列雜交。例如，如果需要>90%—致性的序列，可以將Tm降低10°C。通常，將嚴緊條件選擇為比確定離子強度和PH下的特異序列及其互補序列的Tm低約5°C。然而，在非常嚴緊的條件下，可以在比所述Tm低1°C、2°C、3°C或4°C下進行雜交和/或清洗；在中度嚴緊條件下，可以在比所述Tm低6°C、7°C、8°C、9°C或10°C下進行雜交和/或清洗；在低嚴緊條件下，可以在比所述Tm低11°C、12°C、13°C、14°C、15°C或20°C下進行雜交和/或清洗。使用所述公式、雜交和清洗組合物，以及所需Tm，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，實質(zhì)上描述了雜交和/或清洗溶液嚴緊性的變化。如果所需程度的錯配導(dǎo)致低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)的Tm，那么可以提高SSC濃度以致能夠使用更高的溫度。對核酸雜交的一般性指南參見Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes(驗技術(shù)-核酸探針的雜交)，PartI，Chapter2(Elsevier,NewYork)；以及Ausubeletal.，eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新實驗指南)，Chapter2(GreenePublishingandffiley-lnterscience,NewYork)。另見Sambrook。因而，實施方式包括分離的序列，所述分離的序列編碼實施方式的Cry蛋白并且在嚴緊條件下與本文公開的Cry序列或與其片段雜交。用以下術(shù)語描述兩個或更多個核酸或多核苷酸之間的序列關(guān)系(a)“參考序列”，(b)“比較窗口(comparisonwindow)(c)“序列一致性”，(d)“序列一致性百分比”和(e)“基本一致性”。(a)如本文所用，“參考序列”是用作序列比較基礎(chǔ)的確定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或整體；例如，作為全長cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。(b)如本文所用，“比較窗口”涉及多核苷酸序列的連續(xù)且指定的片段，其中比較窗口的多核苷酸序列可以包括相比于參考序列(其不包含添加或缺失)的添加或缺失(即間隔)，以對兩個序列進行最適比對。通常，比較窗口長至少20個連續(xù)核苷酸，并且任選地可以長30，40，50，100或更長。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，為避免由多核苷酸序列包含間隔而造成的與參考序列的高相似性，通常引入間隔罰分，并將其從匹配數(shù)中減去。用于比較序列的比對方法為本領(lǐng)域已知。因而，可以使用數(shù)學(xué)算法完成對任意兩序列之間序列一致性百分比的確定。所述數(shù)學(xué)算法的非限制性實例為Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法；Smithetal.(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比對算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443_453的全局比對算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448的局部搜索比對方法；如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873_5877所改進的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法?？梢岳眠@些數(shù)學(xué)算法的計算機工具，以比較序列，從而確定序列一致性。所述工具包括但不限于，PC/基因程序的CLUSTAL(可獲得自Intelligenetics，MountainView,California)；ALIGN程序(2·O版)以及GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包(第10版)的GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA禾口TFASTA(可獲得自AccelrysInc.，9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA)。可以使用默認參數(shù)利用這些程序進行比對。CLUSTAL程序詳述于Higginsetal.(1988)Gene73:237-244(1988)；Higginsetal.(1989)CABIOS5151-153；Corpetetal.(1988)NucleicAcidsRes.1610881-90；Huangetal.(1992)CABIOS8155-65；以及Pearsonetal.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307_331。ALIGN程序基于上述Myers和Miller(1988)的算法。使用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可以采用PAM120權(quán)重殘基表、12的間隔長度罰分以及4的間隔罰分。Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215403的BLAST程序基于上述Karlin和Altschul(1990)的算法?？梢允褂肂LASTN程序、分值=100、字長=12來進行BLAST核苷酸搜索，從而獲得與編碼實施方式的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列?？梢允褂肂LASTX程序、分值=50、字長=3來進行BLAST蛋白搜索，從而獲得與實施方式的蛋白或多肽同源的氨基酸序列?？梢匀鏏ltschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389所述，使用(BLAST2.O的)間隔BLAST來獲得以比較為目的的間隔比對。可選擇地，可以使用(BLAST2.O的)PSI-BLAST來進行檢測分子間遠源關(guān)系的迭代搜索。參見上述Altschuletal.。使用BLAST、間隔BLAST、PSI_BLAST時，可以使用各自程序(例如，用于核苷酸序列的BLASTN、用于蛋白的BLASTX)的默認參數(shù)。參見萬維網(wǎng)ncbi.him.nih.gov下的國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站。還可以通過檢查進行手工比對。除非另有說明，本文提供的序列一致性/相似性值表示使用GAP第10版所獲得的值，其使用下列參數(shù)用于核苷酸序列的％—致性和％相似性，其使用50的GAP權(quán)重和3的長度權(quán)重，以及nwsgapdna.cmp評分矩陣；用于氨基酸序列的％—致性和％相似性，其使用8的GAP權(quán)重和2的長度權(quán)重，以及BL0SUM62評分矩陣；或者其任意等價程序。如本文所用，術(shù)語”等價程序”指任意序列比較程序，其為所討論的任意兩個序列而生成比對，所述比對具有與GAP第10版所生成的相應(yīng)比對相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列一致性百分比。GAP使用上述Needleman和Wunsch(1970)的算法，以尋找最大化匹配數(shù)且最小化間隔數(shù)的對兩條完整序列的比對。GAP考慮了所有可能的比對和間隔位置，并生成具有最大匹配堿基數(shù)和最少間隔的比對。它允許提供匹配堿基單元的間隔生成罰分和間隔延伸罰分。對于其插入的每一間隔，GAP必須利用匹配的間隔生成罰分數(shù)。如果選擇大于0的間隔延伸罰分，則對于每一插入的間隔，GAP必須另外利用間隔長度乘間隔延伸罰分。對于蛋白序列，GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包(第10版)的默認間隔生成罰分值和間隔延伸罰分值分別是8和2。對于核苷酸序列，該默認間隔生成罰分是50，而默認間隔延伸罰分是3。間隔生成罰分和間隔延伸罰分可以表示為選自0至200的整數(shù)。因而，例如，間隔生成罰分和間隔延伸罰分可以是0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或更大。GAP代表最佳比對家族中的一個成員。該家族可能有許多成員，但其他成員的質(zhì)量都不如GAP。GAP顯示比對的4個價值數(shù)字品質(zhì)(Quality)、比率(Ratio)、一致性和相似性。品質(zhì)是為了比對序列而最大化的度量。比率是品質(zhì)除以較短片段中堿基的數(shù)目。一致性百分比是實際匹配的符號的百分比。相似性百分比是相似符號的百分比。忽略跨越間隔的符號。當符號對的評分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時，對相似性進行評分。GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包第10版所用的得分矩陣是BL0SUM62(參見HenikoffandHenikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915)。(c)如本文所用，兩條核酸或多肽序列上下文中的“序列一致性”或“一致性”指當在指定的比較窗口內(nèi)比對最大對應(yīng)性時，兩條序列中相同的殘基。對于蛋白，當使用序列一致性百分比時，應(yīng)認識到不一致的殘基位置經(jīng)常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被用于取代具有相似化學(xué)性質(zhì)(如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基，并因此不改變該分子的功能性質(zhì)。當序列在保守取代方面不同時，可上調(diào)序列一致性百分比，以校正取代的保守特性。由這類保守性取代而不同的序列被認為具有“序列相似性”或“相似性”。進行這種調(diào)整的手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。通常，這涉及將保守性取代評分為部分而不是完全的錯配，從而提高序列一致性百分比。因此，例如，如果將一致的氨基酸的得分給定為1，而將非保守性取代的得分給定為0，則將保守性取代的得分給定為0至1。如在程序PC/GENEdntelligenetics,MountainView,California)中所執(zhí)行的,計算保守性取代得分。(d)如本文所用，“序列一致性百分比”表示通過相對于比較窗口而比較兩條最適比對的序列而確定的值，其中，為了最適比對兩條序列，比較窗口中多核苷酸序列的部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(即間隔)。百分比通過以下計算確定兩條序列中一致的核酸堿基或氨基酸殘基均存在的位置的數(shù)目，從而得出匹配位置的數(shù)目，用比較窗口中位置總數(shù)除匹配位置的數(shù)目，并且將結(jié)果乘以100，從而得出序列一致性百分比。(e)(i)術(shù)語多核苷酸序列的“基本一致性”表示多核苷酸包含利用使用標準參數(shù)的所述比對程序之一時，與參考序列具有至少70%、80%、90%或95%或更高的序列一致性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到可以適當?shù)卣{(diào)整這些值，以確定兩個核苷酸序列所編碼蛋白的相應(yīng)的一致性，所述確定考慮了密碼子簡并性、氨基酸相似性、讀框定位(readingframepositioning)等等。用于這些目的的氨基酸序列基本一致性通常表示具有至少60%、70%、80%、90%或95%的序列一致性或更高的序列一致性。如果兩個分子在嚴緊條件下相互雜交，也說明核苷酸序列基本一致。通常，在確定的離子強度和PH下，選擇嚴緊條件，使其比特定序列的Tm低約5°C。然而，嚴緊條件包括比Tm低約1°C至20°C范圍的溫度，這取決于如本文另外所定性的所需嚴緊度。如果嚴緊條件下不相互雜交的核酸所編碼的多肽是基本一致的，所述核酸則仍是基本一致的。這可以出現(xiàn)在，例如，當使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性而產(chǎn)生的核酸拷貝時。如果第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽具有免疫交叉反應(yīng)性，那么說明兩個核酸序列基本一致。(e)(ii)肽上下文的術(shù)語“基本一致性”表示在指定的比較窗口，肽包含與參考序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%或更高序列一致性的序列。使用上述Needleman和Wunsch(1970)的全局比對算法，能進行用于這些目的的最適比對。一個肽與針對另一肽制備的抗體具有免疫反應(yīng)性，說明兩個肽序列基本一致。因而，肽與另一肽基本一致，例如，其中該兩個肽僅因保守取代而不同?！盎鞠嗨频摹彪墓灿腥缟纤龅男蛄?，除不一致的殘基位置可以因保守氨基酸改變而不同。術(shù)語“核苷酸構(gòu)建體”在本文的使用并非意在將實施方式限于包含DNA的核苷酸構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，核苷酸構(gòu)建體、特別是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合所構(gòu)成的多核苷酸和寡核苷酸也可以用于本文所公開的方法。實施方式的核苷酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列另外包括所述構(gòu)建體、分子和序列的所有互補形式。此外，實施方式的核苷酸構(gòu)建體、核苷酸分子和核苷酸序列包括能用于實施方式的轉(zhuǎn)化植物方法的所有核苷酸構(gòu)建體、分子和序列，包括但不限于由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其組合所構(gòu)成的那些。所述脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物兩者。實施方式的核苷酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列還包括核苷酸構(gòu)建體的所有形式，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等等。另一實施方式涉及轉(zhuǎn)化的生物體，諸如選自植物和昆蟲細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、原生動物、線蟲和藻的生物體。轉(zhuǎn)化的生物體包含實施方式的DNA分子、包含所述DNA分子的表達盒或包含所述表達盒的載體，其可以穩(wěn)定地整合進所轉(zhuǎn)化生物體的基因組。在DNA構(gòu)建體中提供實施方式的序列，所述構(gòu)建體用于在目的生物體中表達。所述構(gòu)建體包括與實施方式的序列可操作連接的5’和3’調(diào)節(jié)性序列。本文所用術(shù)語“可操作連接”表示啟動子和另一序列之間的功能性連接，其中所述啟動子序列起始并介導(dǎo)對應(yīng)于所述另一序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通常，可操作連接表示被連接的核酸序列是鄰接的，并21且當需要連接兩個蛋白編碼區(qū)時，是鄰接且在相同讀框內(nèi)的。所述構(gòu)建體可以另外包含至少一個被共轉(zhuǎn)化進生物體的另外的基因?？蛇x擇地，可以在多DNA構(gòu)建體上提供另外的一個或多個基因。所述DNA構(gòu)建體具有多個用于插入Cry毒蛋白序列的限制性位點，所述Cry毒蛋白序列將位于調(diào)節(jié)性區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。所述DNA構(gòu)建體可以另外包含可選擇的標志物基因。按5’到3’的轉(zhuǎn)錄方向，DNA構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動子)、實施方式的DNA序列以及在用作宿主的生物體內(nèi)具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即啟動子)相對于宿主生物體和/或?qū)嵤┓绞降男蛄?，可以是同源的、類似物的、外源的或異源的。另外，所述啟動子可以是天然序列或者可選擇地是合成序列。本文所用術(shù)語“外源的”表示在導(dǎo)入啟動子的同源生物體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)該啟動子。當所述啟動子相對于實施方式的序列是“外源的”或“異源的”時，意在表明該啟動子不是實施方式中可操作連接的序列的同源的或天然存在的啟動子。如本文所用，嵌合基因包含與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可操作連接的編碼序列，所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對于所述編碼序列是異源的。當啟動子是同源或天然的序列時，可操作連接的序列的表達改造自野生型表達，這導(dǎo)致表型的改變。終止區(qū)可以與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是同源的，可以與可操作連接的目的DNA序列是同源的，可以與植物宿主是同源的，或者可以得自另一來源(即，相對于啟動子、目的序列、植物宿主或其任一組合是外源的或異源的)?？梢詮母┺r(nóng)桿菌(A.tumefaciens)Ti質(zhì)粒獲得方便的終止區(qū)，諸如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。另見Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262141-144；Proudfoot(1991)Cell64671-674；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5141-149；Mogenetal.(1990)PlantCell21261-1272；Munroeetal.(1990)Gene91151-158；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891_7903；和Joshietal.(1987)NucleicAcidRes.15:9627-9639。適當時可以優(yōu)化核酸以提高在宿主生物體中的表達。因而，如果宿主生物體是植物，可以使用植物偏好密碼子來合成合成的核酸，從而改良表達。參見，例如，CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.921-11，對宿主偏好密碼子使用的討論。例如，雖然在單子葉植物和雙子葉植物物種中均可以表達實施方式的核酸序列，但是可以修飾序列，以解決單子葉植物或雙子葉植物特異的密碼子偏好和GC含量偏好，這是因為這些偏好已經(jīng)表現(xiàn)出了差異(Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:477_498)。因而，特定氨基酸的玉米偏好密碼子可以衍生自玉米的已知基因序列。28條玉米植物基因的玉米密碼子使用列于上文Murrayetal.的表4。本領(lǐng)域可以獲得合成植物偏好基因的方法。參見，例如，美國專利第5，380，831號和第5，436，391號，和Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17477-498，其通過引用并入本文。已知另外的序列修飾來增強細胞宿主的基因表達。這些包括清除序列，所述序列編碼假的多聚腺苷化信號、外顯子_內(nèi)含子剪接位點信號、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)和可能不利于基因表達的其它良好表征的序列?？梢詫⑿蛄械腉C含量調(diào)節(jié)至給定細胞宿主的平均水平，其參考在該宿主細胞表達的已知基因而計算。本文所用術(shù)語“宿主細胞”指包含載體且支持該表達載體復(fù)制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是諸如大腸桿菌的原核細胞，或者是諸如酵母、昆蟲、兩棲類或哺乳動物細胞、或者單子葉植物或雙子葉植物細胞的真核細胞。單子葉植物宿主細胞的實例是玉米宿主細胞。如果可能，則修飾序列以避免預(yù)期的發(fā)夾mRNA二級結(jié)構(gòu)。表達盒可以另外包含5’前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列能發(fā)揮增強翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域已知并且包括小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5’非編碼區(qū))(Elroy-Steinetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6126-6130)；馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕刻病毒)(Gallieetal.(1995)Gene165(2):233_238)，MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮小花葉病毒)，人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejaketal.(1991)Nature353:90-94)；苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻譯前導(dǎo)序列(Joblingetal.(1987)Nature325:622-625)；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV)(Gallieetal.(1989)inMolecularBiologyofRNA(RNA的分子生物學(xué))，ed.Cech(Liss,NewYork)，pp.237-256)；以及玉米萎黃斑點病毒前導(dǎo)序列(MCMV)(Lommeletal.(1991)Virology81:382—385)。另見Della—Cioppaetal.(1987)PlantPhysiol.84:965_968。在制備表達盒時，可以操作各種DNA片段以提供合適方向的和適當時合適讀框的DNA序列。為達到這一目的，可以采用接頭或連接子來連接DNA片段，或者可以涉及其它操作來提供方便的限制性位點、移除多余DNA、移除限制性位點等等。為了這一目的，可以涉及體外誘變，引物修復(fù)，限制性，退火，再取代，例如轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)0在實踐實施方式時可以使用大量啟動子?？梢曰谒杞Y(jié)果選擇啟動子?？梢允购怂崤c組成型、組織偏好型、誘導(dǎo)型或用于在宿主生物體中表達的其它啟動子組合。用于植物宿主細胞的合適的組成型啟動子包括，例如，Rsyn7啟動子的核心啟動子和WO99/43838及美國專利第6，072，050號所公開的其它組成型啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odelletal.(1985)Nature313:810-812)；水稻肌動蛋白(McElroyetal.(1990)PlantCell2:163-171)；泛素(Christensenetal.(1989)PlantMol.Biol.12:619_632andChristensenetal.(1992)PlantMol.Biol.18675-689)；pEMU(Lastetal.(1991)Theor.Appl.Genet.81581-588)；MAS(Veltenetal.(1984)EMBOJ.3:2723_2730)；ALS啟動子(美國專利第5，659，026號)等等。其它組成型啟動子包括，例如，公開于美國專利第5，608，149號；第5，608，144號；第5，604，121號；第5，569，597號；第5，466，785號；第5，399，680號；第5，268，463號；第5，608，142號；和第6，177，611號的那些。從誘導(dǎo)型啟動子表達基因可以是有益的，這取決于所需結(jié)果。對于調(diào)節(jié)實施方式的核苷酸序列在植物中的表達，傷口誘導(dǎo)型(wound-inducible)啟動子有特別的好處。所述傷口誘導(dǎo)型啟動子可以對昆蟲取食造成的損傷產(chǎn)生反應(yīng)，并且包括馬鈴薯蛋白酶抑制齊[J(pinII)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28425-449；Duanetal.(1996)NatureBiotechnology14:494_498)；wunl和wun2,美國專利第5，428，148號；winl禾口win2(Stanfordetal.(1989)Mol.Gen.Genet.215200-208)；systemin(McGurletal.(1992)Science225:1570-1573)；WIPl(Rohmeieretal.(1993)PlantMol.Biol.22783-792；Eckelkampetal.(1993)FEBSLetters323:73-76)；MPI基因(Corderoketal.(1994)PlantJ.6(2):141_150)；等等，其通過引用并入本文。此外，可以在實施方式的方法和核苷酸構(gòu)建體中采用病原體誘導(dǎo)型啟動子。所述病原體誘導(dǎo)型啟動子包括來自致病相關(guān)蛋白(I3R蛋白)的那些，其在受病原體感染后被誘導(dǎo)；例如，I3R蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等等。參見，例如，Redolfietal.(1983)Neth.J.PlantPathol.89245-254；Uknesetal.(1992)PlantCell4645-656；和VanLoon(1985)PlantMol.Virol.4:111_116。另見WO99/43819，其通過引用并入本文。在病原體感染部位或在該部位附近局部表達的啟動子引人注目。參見，例如Marineauetal.(1987)PlantMol.Biol.9335-342；Mattonetal.(1989)MolecularPlant-MicrobeInteractions(植物-微生物的分子水平的相互作用)2325-331；Somsischetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA832427-2430；Somsischetal.(1988)Mol.Gen.Genet.293-98；禾口Yan(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:14972-14977。另見Chenetal.(1996)PlantJ.10955-966；Zhangetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:2507_2511；Warneretal.(1993)PlantJ.3:191-201；Siebertzetal.(1989)PlantCell1:961_968；美國專利第5，750，386號(線蟲誘導(dǎo)型)；并且這些參考文獻為本文所引用。玉米PRms基因的誘導(dǎo)型啟動子特別引人注目，其表達受病原體串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)誘導(dǎo)(參見，例如，Corderoetal.(1992)Physiol.Mol.PlantPath.41189-200)。可以使用化學(xué)品調(diào)節(jié)啟動子，通過應(yīng)用外源化學(xué)調(diào)節(jié)物來調(diào)節(jié)基因在植物中的表達。依目的而定，啟動子可以是化學(xué)品誘導(dǎo)型啟動子，其中化學(xué)品的應(yīng)用誘導(dǎo)基因表達，或者化學(xué)品阻遏啟動子，其中化學(xué)品的應(yīng)用阻遏基因表達?；瘜W(xué)品誘導(dǎo)型啟動子為本領(lǐng)域已知，并且包括，但不限于，玉米In2-2啟動子，其為苯磺酰胺除草劑安全劑所激活，玉米GST啟動子，其為用作萌前型除草劑的疏水親電子化合物所激活，以及煙草PR-Ia啟動子，其為水楊酸所激活。其它所關(guān)注的化學(xué)品調(diào)節(jié)啟動子包括類固醇反應(yīng)性啟動子(參見，例如，Sehenaetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10421_10425和McNellisetal.(1998)PlantJ.14(2):247_257中的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子)以及四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素阻遏型啟動子(參見，例如，Gatzetal.(1991)Mol.Gen.Genet.227:229_237和美國專利第5，814，618號和第5，789，156號)，其通過引用并入本文?？梢岳媒M織偏好啟動子將增強的殺蟲蛋白表達靶定在特定植物組織內(nèi)。組織偏好啟動子包括以下所討論的那些，Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2)255-265；Kawamataetal.(1997)PlantCellPhysiol.38(7):792_803；Hansenetal.(1997)Mol.GenGenet.254(3)337-343；Russelletal.(1997)TransgenicRes.6(2):157_168;Rinehartetal.(1996)PlantPhysiol.112(3):1331_1341；VanCampetal.(1996)PlantPhysiol.112(2)525-535；Canevascinietal.(1996)PlantPhysiol.112(2):513_524;Yamamotoetal.(1994)PlantCellPhysiol.35(5)773~778；Lam(1994)ResultsProb1.CellDiffer.20181-196；Orozcoetal.(1993)PlantMolBiol.23(6):1129_1138;Matsuokaetal.(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20):9586_9590；禾口Guevara—Garciaetal.(1993)PlantJ.4(3):495_505。如有必要，可以為弱表達修飾這些啟動子。葉偏好啟動子為本領(lǐng)域已知。參見，例如，Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2)255-265；Kwonetal.(1994)PlantPhysiol.105357-67；Yamamotoetal.(1994)24PlantCellPhysiol.35(5)773-778；Gotoretal.(1993)PlantJ.3509-18；Orozcoetal.(1993)PlantMol.Biol.23(6)1129-1138；和Matsuokaetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586_9590。根偏好或根特異性啟動子是已知的，并且可以選自可由文獻獲得的許多啟動子，或者從各種可相容物種重新分離。參見，例如，Hireetal.(1992)PlantMol.Biol.20(2)207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；KellerandBaumgartner(1991)PlantCell3(10):1051-1061(法國菜豆GRP1.8基因的根特異性控制元件)；Sangeretal.(1990)PlantMol.Biol.14(3):433_443(根癌農(nóng)桿菌甘露堿合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；和Miaoetal.(1991)PlantCell3(1):11_22(編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆根和根瘤中表達)。另見Boguszetal.(1990)PlantCell2(7):633-641，其中描述了分離自血色素基因的兩種根特異性啟動子，所述基因來自固氮的非豆科糙葉山黃麻(Parasponiaandersonii)和相關(guān)的非固氮的非豆科山黃麻(Trematomentosa)0使這些基因的啟動子與β-葡糖苷酸酶報告基因相連，并被導(dǎo)入非豆科煙草(Nicotianatabacum)和豆科百脈根(Lotuscorniculatus)兩者，并且在兩例中均保留了根特異性啟動子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們對發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的高表達rolC和rolD根誘導(dǎo)基因的啟動子的分析(參見PlantScience(Limerick)79(1):69_76)。他們的結(jié)論是增強子和組織偏好DNA決定子在這些啟動子中分離。Teerietal.(1989)使用與IacZ的基因融合，來表明編碼章魚堿合酶的農(nóng)桿菌T-DNA基因在根尖表皮尤其活躍，并且TR2’基因在完整植物中是根特異性的，且因葉組織受傷而被刺激，這是與殺昆蟲或殺幼蟲基因聯(lián)用所尤其需要的特征組合(參見EMBOJ.8(2):343-350)。與nptll(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TR1，基因表現(xiàn)類似的特征。另外的根偏好啟動子包括VfEN0D-GRP3基因啟動子(Kusteretal.(1995)PlantMol.Biol.29(4)759-772)；以及rolB啟動子(Capanaetal.(1994)PlantMol.Biol.25(4)681-691。另見美國專利號5，837，876；5，750，386；5，633，363；5，459，252；5，401，836；5，110，732；和5，023，179?！胺N子偏好”啟動子包括“種子特異性”啟動子(在種子發(fā)育中具有活性的那些啟動子，諸如種子貯藏蛋白的啟動子)和“種子萌發(fā)”啟動子(在種子萌發(fā)中具有活性的那些啟動子)兩者。參見Thompsonetal.(1989)BioEssays10108，其通過引用并入本文。所述種子偏好啟動子包括，但不限于，Ciml(細胞分裂素誘導(dǎo)的信息)；CZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；以及milps(肌-肌醇-1-磷酸合酶)(參見美國專利第6，225，529號，其通過引用并入本文)。Y-玉米蛋白和Glob-I是胚乳特異性啟動子。對于雙子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限于，豆β-菜豆蛋白、napin、β-伴球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等等。對于單子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限于玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、waxy、shrunken1、shrunken2、球蛋白1等等。另見W000/12733，其中公開了來自endl和end2基因的種子偏好啟動子；其通過引用并入本文。具有特定組織“偏好”表達的啟動子在該組織的表達的程度比在至少一種其它植物組織中的表達程度高。一些組織偏好的啟動子表現(xiàn)幾乎專門在特定組織中表達。當需要低水平表達時，可以使用弱啟動子。通常，如本文所用的術(shù)語”弱啟動子”指驅(qū)動編碼序列低水平表達的啟動子。低水平表達意指約1/1000轉(zhuǎn)錄本至約1/100，000轉(zhuǎn)錄本至約1/500，000轉(zhuǎn)錄本的水平?？蛇x擇地，應(yīng)認識到術(shù)語”弱啟動子”還包括僅在少數(shù)細胞而不在其它細胞中驅(qū)動表達從而造成總的低水平表達的啟動子。當啟動子以不可接受的高水平驅(qū)動表達時，可以缺失或修飾該啟動子序列的部分從而降低表達水平。所述弱組成型啟動子包括，例如Rsyn7啟動子的核心啟動子(W099/43838和美國專利第6，072，050號)、353CaMV核心啟動子等等。其它的組成型啟動子包括，例如，公開于美國專利號5，608，149；5，608，144；5，604，121；5，569，597；5，466，785；5，399，680；5，268，463；5,608，142；和6，177，611的那些；其通過引用并入本文。通常，表達盒會包括用于選擇所轉(zhuǎn)化細胞的可選擇標志物基因。利用可選擇標志物基因選擇所轉(zhuǎn)化細胞或組織。標志物基因包括編碼抗生素抗性的基因，諸如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的那些，以及賦予除草劑化合物抗性的基因，所述化合物諸如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4_二氯苯氧乙酸(2，4-D)。適當?shù)目蛇x擇標志物基因的另外實例包括但不限于，編碼對以下物質(zhì)的抗性的基因，所述物質(zhì)為氯霉素(HerreraEstrellaetal.(1983)EMBOJ.2:987_992)；甲氨蝶吟(HerreraEstrellaetal.(1983)Nature303:209—213;禾口Meijeretal.(1991)PlantMol.Biol.16:807-820)；鏈霉素(Jonesetal.(1987)Mol.Gen.Genet.21086-91)；壯觀霉素(Bretagne-Sagnardetal.(1996)TransgenicRes.5131-137)；博來霉素(Hilleetal.(1990)PlantMol.Biol.7171-176)；磺胺藥物(Guerineauetal.(1990)PlantMol.Biol.15127-136)；溴苯腈(Stalkeretal.(1988)Science242:419-423)；草甘膦(Shawetal.(1986)Science233:478_481；和美國申請序列號10/004，357和10/427,692)；草銨膦(DeBlocketal.(1987)EMBOJ.6:2513_2518)。通常參見，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3506-511；Christophersonetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA896314-6318；Yaoetal.(1992)Cell7163-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419_2422；Barkleyetal.(1980)inTheOperon,pp.177—220；Huetal.(1987)Cell48555-566；Brownetal.(1987)Cell49603-612；Figgeetal.(1988)Cell52713-722；Deuschleetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5400-5404;Fuerstetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA862549-2553；Deuschleetal.(1990)Science248480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg(M大學(xué)博士論文)；Reinesetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921；Labowetal.(1990)Mol.Cell.Biol.103343-3356；Zambrettietal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA893952-3956；Baimetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076;Wyborskietal.(1991)NucleicAcidsRes.194647-4653；Hillenand-ffissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10143-162；Degenkolbetal.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.351591-1595；Kleinschnidtetal.(1988)Biochemistry27:1094—1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg(^ilig^^ffii^^；)；Gossenetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551；Olivaetal.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36913-919；Hlavkaetal.(1985)HandbookofExperimentalPharmacology(實驗藥理學(xué)手冊)，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；和Gilletal.(1988)Nature334:721-724。所述公開通過引用并入本文。26以上所列可選擇標志物基因并非意在限制。實施方式可以使用任一可選擇標志物基因。實施方式的方法涉及將多肽或多核苷酸導(dǎo)入植物?！睂?dǎo)入”意在表示向植物呈遞多核苷酸或多肽，以致該序列進入所述植物的細胞內(nèi)部。實施方式的方法不依賴將多核苷酸或多肽導(dǎo)入植物的特定的方法，只要所述多核苷酸或多肽進入所述植物的至少一個細胞的內(nèi)部。將多核苷酸或多肽導(dǎo)入植物的方法為本領(lǐng)域已知，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”意在表示導(dǎo)入植物的核苷酸構(gòu)建體整合進植物基因組，并且能夠遺傳給其子代?！彼矔r轉(zhuǎn)化”意在表示多核苷酸被導(dǎo)入植物但不整合進植物基因組，或者多肽被導(dǎo)入植物。轉(zhuǎn)化操作步驟和將核苷酸序列導(dǎo)入植物的操作步驟可以因作為轉(zhuǎn)化靶標的植物或植物細胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)而不同。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞繼而插入該植物基因組的適當方法包括顯微注射(Crosswayetal.(1986)Biotechniques4:320_334)，電穿孑L(Riggsetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利第5，563，055號和第5，981，840號)，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowskietal.(1984)EMBOJ.3:2717_2722)，和彈道顆粒加速(參見，例如，美國專利號4,945,050；5，879，918；5，886，244；和5，932，782；Tomesetal.(1995)inPlantCell,Tissue,andOrganCulturefundamentalMethods(^^ffl^和器官培養(yǎng)基礎(chǔ)方法)，ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin)；和McCabeetal.(1988)Biotechnology6:923_926)；和Lecl轉(zhuǎn)化(W000/28058)。對于馬鈴薯轉(zhuǎn)化，參見Tuetal.(1998)PlantMolecularBiology37:829_838和Chongetal.(2000)TransgenicResearch9:71-78。另外的轉(zhuǎn)化方法可以在以下文獻中找至lj，Weissingeretal.(1988)Ann.Rev.Genet.22421-477；Sanfordetal.(1987)ParticulateScienceandTechnology5:27_37(洋蔥)；Christouetal.(1988)PlantPhysiol.87:671_674(大豆)；McCabeetal.(1988)Bio/Technology6:923_926(大豆)；FinerandMcMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.27P175-182(大豆)；Singhetal.(1998)Theor.Appl.Genet.96319-324(大豆)；Dattaetal.(1990)Biotechnology8736-740(7jCM)；Kleinetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305_4309(玉米)；Kleinetal.(1988)Biotechnology6^59-563(玉米)；美國專利號5，240，855；5,322,783和5，324，646;Kleinetal.(1988)PlantPhysiol.91440-444(玉米)；Frommetal.(1990)Biotechnology8:833_839(玉米)；Hooykaas-VanSlogterenetal.(1984)Nature(London)311:763-764；美國專利第5,736,369號(谷類)；Bytebieretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345_5349(百合科)；DeWetetal.(1985)inTheExperimentalManipulationofOvuleTissues(胚珠組織的實驗操作)，ed.Chapmanetal.(Longman,NewYork),pp.197-209(花粉)；Kaeppleretal.(1990)PlantCellReports9:415_418禾口Kaeppleretal.(1992)Theor.Appl.Genet.84560-566(whisker介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D'Halluinetal.(1992)PlantCell4:1495-1505(電穿孔)；Lietal.(1993)PlantCellReports12:250_255和ChristouandFord(1995)AnnalsofBotany75:407_413(7jC稻)；Osjodaetal.(1996)NatureBiotechnology14:745-750(玉米，通過根癌農(nóng)桿菌)；以上所有均通過引用并入本文。在具體實施方式中，可以使用各種瞬時轉(zhuǎn)化方法向植物提供實施方式的序列。所述瞬時轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，將Cry毒素蛋白或其變體和其片段直接導(dǎo)入植物，或者將Cry毒素轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)入所述植物。所述方法包括，例如，顯微注射或顆粒轟擊。參見，例如，Crosswayetal.(1986)MolGen.Genet.202179-185；Nomuraetal.(1986)PlantSci.4453-58；Hepleretal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:2176_2180和Hushetal.(1994)TheJournalofCellScience107:775_784，以上所有均通過引用并入本文?？蛇x擇地，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)能將Cry毒素的多核苷酸瞬時轉(zhuǎn)化進植物。所述技術(shù)包括病毒載體系統(tǒng)以及對多核苷酸的沉淀以致阻止DNA隨后的釋放。因而，可以發(fā)生從顆粒結(jié)合的DNA的轉(zhuǎn)錄，但是它被釋放而整合進基因組的頻率大大降低。所述方法包括使用聚乙亞胺包被的顆粒(PEI；Sigma#P3143)。本領(lǐng)域已知在植物基因組特定位置靶向插入多核苷酸的方法。在一個實施方式中，使用位點特異性重組系統(tǒng)實現(xiàn)在所需基因組位置插入多核苷酸。參見，例如，W099/25821,W099/25854,W099/25840,W099/25855和W099/25853，以上所有均通過引用并入本文。簡言之，實施方式的多核苷酸可以包含在轉(zhuǎn)移盒內(nèi)，所述轉(zhuǎn)移盒側(cè)翼連接兩個非一致的重組位點。將該轉(zhuǎn)移盒導(dǎo)入植物，于靶位點穩(wěn)定整合進其基因組，所述靶位點側(cè)翼連接對應(yīng)于轉(zhuǎn)移盒位點的兩個非一致的重組位點。提供合適的重組酶，轉(zhuǎn)移盒于靶位點被整合。因而，目的多核苷酸于植物基因組中特定的染色體位置被整合。依照常規(guī)方式，可以使已被轉(zhuǎn)化的細胞生長成植物。參見，例如，McCormicketal.(1986)PlantCellReports5:81_84。隨后可以使這些植物生長，并且用相同的轉(zhuǎn)化品系或不同品系授粉，鑒定具有所需表型特征的組成型或誘導(dǎo)型表達的所得雜合體。可以生長兩代或更多代，從而保證所需表型特征的表達保持穩(wěn)定并被遺傳，隨后收獲種子，以確保已經(jīng)實現(xiàn)所需表型特征的表達?？梢酝ㄟ^使植物與病毒或病毒核酸接觸，向植物提供實施方式的核苷酸序列。通常，所述方法涉及在病毒DNA或RNA分子內(nèi)并入目的核苷酸構(gòu)建體。應(yīng)認識到，可以最初將實施方式的重組蛋白作為病毒聚合蛋白的部分來合成，隨后可以通過體內(nèi)或體外的蛋白水解來處理所述聚合蛋白，從而產(chǎn)生所需殺蟲蛋白。還應(yīng)認識到包含實施方式殺蟲蛋白的氨基酸序列的至少一部分的這種病毒聚合蛋白可以具有所需的殺蟲活性。實施方式包括所述病毒聚合蛋白以及編碼它們的核苷酸序列。向植物提供核苷酸構(gòu)建體并在植物中產(chǎn)生所編碼蛋白的方法為本領(lǐng)域已知，其涉及病毒DNA或RNA分子。參見，例如，美國專利號5，889，191；5，889，190；5，866，785；5，589，367；和5，316，931；其通過引用并入本文。實施方式還涉及實施方式的所轉(zhuǎn)化植物的植物繁殖材料，包括但不限于種子，塊莖，球莖，鱗莖，葉，和根與芽的插條。實施方式可以用于轉(zhuǎn)化任意植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。所關(guān)注植物的實例包括但不限于玉米(Zeamays)、蕓苔屬(Brassica)的種(如油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.jimcea))，特別是可用作籽油來源的那些蕓苔屬白勺禾中、胃H(Medicagosativa)、/K禾g(Oryzasativa)、H轟(Secalecereale)、^梁(Sorghumbicolor>Sorghumvulgare)、粟(女口良尾草(Pennisetumglaucum)(Panicummiliaceum)(Setariaitalica)(Eleusinecoracana))>(π|H^(Helianthusannuus)、紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉(海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑桔(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、荼(Camelliasinensis)、香蕉(Musaspp·)、魚萼梨(Perseaamericana)、無花果(Ficuscasica)、番石^(Psidiumguajava)λ^^(Mangiferaindica)λ^(Oleaeuropaea)(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、堅果(Macadamiaintegrifolia)、杏(Prunusamygdalus)、舌甘胃(Betavulgaris)^M(Saccharumspp.)、？以及針葉樹。蔬菜包括番爺(Lycopersiconesculentum)、萵苣(Lactucasativa)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、禾1J馬豆(Phaseoluslimensis)、豆豆(Lathyrusspp.)、以及黃瓜屬(Cucumis)的成員如黃瓜(C.sativus)、羅馬甜瓜(C.cantalupensis)以及甜瓜(C.melo)。觀賞植物包括杜鵑花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、木槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosaspp.)、郁金香(Tulipaspp.)、/K仙花(Narcissusspp.)(Petuniahybrida)(Dianthuscaryophyllus)^MM木(Euphorbiapulcherrima)以及菊花?？捎糜趯嵺`實施方式的針葉樹包括例如松，諸如火炬松(Pinustaeda)、濕地松(Pinuselliotii)、西黃松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)以及福射松(Pinusradiata)；花旗松(Pseudotsugamenziesii)；力口拿大鐵杉(Tsugacanadensis)；白云杉(Piceaglauca)；紅杉(Sequoiasempervirens)；真冷杉，諸如銀冷杉(Abiesamabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；以及雪松，諸如西方紅色雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黃柏(Chamaecyparisnootkatensis)。實施方式的植物包括農(nóng)作物(例如玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔屬、大豆、棉、紅花、花生、高粱、小麥、粟、煙草等)，諸如玉米和大豆植物。草坪草包括但不限于一年生早熟禾(Poaannua)；—年生黑麥草(Loliummultiflorum)；力口拿大早熟禾(Poacompressa)；邱氏羊茅(Festucarubra)；細弱曹股穎(Agrostistenuis)；匍匍剪股穎(Agrostispalustris)；麥穗草(Agropyrondesertorum)；扁穗冰草(Agropyroncristatum)；硬羊茅(Festucalongifolia)；草地早熟禾(Poapratensis)；野茅(Dactylisglomerata)；多年生黑麥草(Loliumperenne)；紫羊茅(Festucarubra)；小糠草(Agrostisalba)；粗莖早熟禾(Poatrivialis)；羊茅(Festucaovina)；無芒雀麥(Bromusinermis)；高羊茅(Festucaarundinacea)；梯牧(Phleumpratense)；M毛M股穎(Agrostiscanina)；if^^(Puccinelliadistans)；藍蓮冰草(Agropyronsmithii)；狗牙草(Cynodonspp.)；圣奧古斯丁草(Stenotaphrumsecundatum)；結(jié)縷草(Zoysiaspp.)；巴哈雀稗(Paspalumnotatum)；地毪草(Axonopusaffinis)；{段^[金草(Eremochloaophiuroides)；各良H1草(Pennisetumclandesinum)；海賓雀稗(Paspalumvaginatum)；格蘭馬草(Boutelouagracilis)；7jC牛草(Buchloedactyloids)；偵Ij種格蘭馬草(Boutelouacurtipendula).所關(guān)注的植物包括提供所關(guān)注的種子的谷類植物、含油種子植物以及豆科植物。所關(guān)注的種子包括谷類種子，如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥、黍等。含油種子植物包括棉、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子、亞麻、蓖麻、橄欖等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜爾豆、刺槐豆、胡蘆巴、大豆、青刀豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。在某些實施方式中，實施方式的核酸序列可以與任意組合的目的多核苷酸序列堆疊，從而產(chǎn)生具有所需表型的植物。例如，實施方式的多核苷酸可以與編碼具有殺蟲和/或殺昆蟲活性的多肽的其它任何多核苷酸堆疊，所述多肽諸如其它Bt毒素蛋白(描述于美國專利號5，366，892；5，747，450；5，736，514；5，723，756；5，593，881；禾口Geiseretal.(1986)Gene48109)、pentin(描述于美國專利第5，981，722號)等等。生成的組合還可以包含多拷貝的任一目的多核苷酸。也可以將實施方式的多核苷酸與其它任一基因或基因的組合相堆疊，從而產(chǎn)生具有各種所需性狀組合的植物，其包括但不限于動物取食所需的性狀，諸如高油基因(例如，美國專利第6，232，529號)；平衡型氨基酸(例如，hordothionins(美國專利號5，990，389；5，885，801；5，885，802；和5，703，049)；大麥高賴氨酸(Williamsonetal.(1987)Eur.J.Biochem.165:99_106；和WO98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersenetal.(1986)J.Biol.Chem.2616279；Kiriharaetal.(1988)Gene71359；和Musumuraetal.(1989)PlantMol.Biol.12123))；增強的消化性(例如，修飾的貯藏蛋白(2001年11月7日提交的美國申請序列號10/053,410)；和硫氧還蛋白(2001年12月3日提交的美國申請序列號10/005，429)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。還可以將實施方式的多核苷酸與疾病或除草劑抗性所需的性狀相堆疊(例如，煙曲霉毒素去毒基因(美國專利第5，792，931號)；無毒性和疾病抗性基因(Jonesetal.(1994)Science266789；Martinetal.(1993)Science2621432；禾口Mindrinosetal.(1994)Cell78:1089)；導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體，諸如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶抑制劑，諸如草銨膦或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因和GAT基因，如美國申請序列號10/004，357；和10/427，692所公開)；以及與加工或加工產(chǎn)物所需的性狀相堆疊，諸如高油(例如，美國專利第6，232，529號)；修飾的油(例如，脂肪酸去飽和酶基因(美國專利第5，952，544號；WO94/11516))；修飾的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉支化酶(SBE)和淀粉去支化酶(SDBE))；以及多聚物或生物塑料(例如，美國專利第5.602，321號；β-酮硫解酶，聚羥基丁酯合酶，和乙酰乙?；?CoA還原酶(Schubertetal.(1988)J.Bacteriol.1705837-5847)促進聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。也可以將實施方式的多核苷酸與提供農(nóng)藝學(xué)性狀或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀的多核苷酸組合，所述農(nóng)藝學(xué)性狀諸如雄性不育(例如，參見美國專利第5.583，210號)、莖強度、開花時間，所述轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀諸如細胞周期調(diào)節(jié)或基因打靶(例如，WO99/61619；WO00/17364；WO99/25821),Jt公開內(nèi)容通過引用并入本文?？梢酝ㄟ^包括但不限于雜交育種植物或遺傳轉(zhuǎn)化的任何方法來產(chǎn)生這些堆疊的組合物，所述雜交育種植物通過任何常規(guī)方法或TOPCROSS方法。如果通過遺傳轉(zhuǎn)化植物來堆疊性狀，那么可以在任意時間以任意順序組合目的多核苷酸序列。例如，可以將包含一種或多種所需性狀的轉(zhuǎn)基因植物用作靶標，從而通過隨后的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入其它性狀?？梢允褂棉D(zhuǎn)化盒的任意組合所提供的目的多核苷酸，以共轉(zhuǎn)化操作步驟同時導(dǎo)入所述性狀。例如，如果要導(dǎo)入兩條序列，那么所述兩條序列可以包含在分開的轉(zhuǎn)化盒(反式)或包含在相同的轉(zhuǎn)化盒(順式)中?？梢越柚嗤膯幼踊蚪柚煌膯幼域?qū)動序列的表達。在某些情況下，需要導(dǎo)入抑制目的多核苷酸表達的轉(zhuǎn)化盒?？梢詫⑵渑c其它抑制盒或過表達盒的任意組合相組合，從而在植物中生成所需的性狀組合。還認識到可以使用位點特異性重組系統(tǒng)，將多核苷酸序列在所需基因組位置堆疊。參見，例如，W099/25821,W099/25854,W099/25840,W099/25855和W099/25853，所有這些都通過引用并入本文?？梢詫嵤┓绞降慕M合物用于保護植物、種子和各種方式的植物產(chǎn)物。例如，組合物能用于下述方法，該方法涉及將有效量的殺蟲組合物通過操作置于害蟲環(huán)境，所述操作選自噴灑(spraying)、撒粉(dusting)、撒播(broadcasting)或種子包被。在將植物繁殖材料(果實、塊莖、鱗莖、球莖、谷物、種子)、尤其是種子作為商品銷售時，通常用保護劑包被將其處理，所述保護劑包被包括除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑，或這些制備物中的幾種的混合物，如有需要，以及用另外的載體、表面活性劑或者通常用于制劑領(lǐng)域的促應(yīng)用佐劑處理，從而提供對細菌、真菌或動物害蟲造成的損害的保護。為了處理種子，可以通過用液體制劑浸漬塊根或谷物，或者通過用組合的濕性或干性制劑將其包被，來將保護劑包被用于種子。另外，在特殊情況下，應(yīng)用于植物的其它方法是可行的，例如針對芽或果實的處理。可以用種子保護劑包被處理實施方式的植物種子，所述植物種子包含編碼實施方式的殺蟲蛋白的核苷酸序列，并且所述種子保護劑包被包含種子處理化合物，諸如，例如，克菌丹、萎銹靈、福美雙、methalaxyl、安定磷和通常用于種子處理的其它化合物。在一個實施方式中，包含實施方式的殺蟲組合物的種子保護劑包被單獨使用，或與通常用于種子處理的種子保護劑包被中的一種組合使用。認識到可以使用編碼殺蟲蛋白的基因來轉(zhuǎn)化昆蟲致病生物體。所述生物體包括桿狀病毒、真菌、原生動物、細菌和線蟲?？梢酝ㄟ^合適的載體將編碼實施方式的殺蟲蛋白的基因?qū)胛⑸锼拗?，將所述宿主?yīng)用于環(huán)境、或者植物或動物。在將核酸插入細胞的上下文中的術(shù)語“導(dǎo)入的”指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括涉及將核酸并入真核或原核細胞，其中可以將核酸整合進細胞基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子，或瞬時表達(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。可以選擇已知占據(jù)一種或多種目的作物“植物圈”(葉面、葉圍、根際和/或根面)的微生物宿主。選擇這些微生物，使其能夠在特定環(huán)境中與野生型微生物成功競爭，使表達殺蟲蛋白的基因穩(wěn)定地維持和表達，以及令人滿意地，提高對環(huán)境降解和失活殺蟲劑的防護。所述微生物包括細菌、藻類和真菌。特別引人注目關(guān)注的微生物諸如是細菌，例如，假單孢菌屬(Pseudomonas)，歐文氏菌屬(Erwinia)，沙雷氏菌屬(Serratia)，克雷伯菌屬(Klebsiella)，黃單胞菌屬(Xanthomonas)，鏈霉菌屬(Str印tomyces)，根瘤菌屬(Rhizobium)，紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas),Methylius,農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium),醋桿菌屬(Acetobacter),乳酸桿菌屬(Lactobacillus),節(jié)細菌屬(Arthrobacter),固氮菌屬(Azotobacter),明串珠菌屬(Leuconostoc)禾口產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)；是真菌，特別地是酵母，例如酵母屬(Saccharomyces)，隱球菌屬(Cryptococcus)，克魯維斯酵母屬(Kluyveromyces)，擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，紅酵母屬(Rhodotorula)和黑酵母屬(Aureobasidium)。特別關(guān)注的是植物圈細菌物種，諸如丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)，焚光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，木醋酸菌(Acetobacterxylinum)，農(nóng)桿菌屬(Agrobacteria),球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonasspheroids)，野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)，苜猜根瘤菌(Rhizobiummelioti),真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesentrophus),木質(zhì)棍狀桿菌(Clavibacterxyli)和維涅蘭德固氮菌(Azotobactervinlandir)和植物圈酵母物種，諸如深紅酵母(Rhodotorularubra)，粘紅酵母(R.glutinis)，海濱紅酵母(R.marina)，橙紅酵母(R.aurantiaca)，淺白隱球菌(Cryptococcusalbidus)，流散隱球酵母(C.diffluens)，羅倫隱球菌(C.Iaurentii)，玫瑰酵母(Saccharomycesrosei)，S.pretoriensis,酉良酒酵母(S.cerevisiae),玫瑰色擲孢酵母(Sporobolomycesroseus),香氣擲抱酵母(S.odorus)，Kluyveromycesveronae禾口出芽短梗霉(Aureobasidiumpollulans)。特別關(guān)注的是色素性微生物?？梢允褂矛F(xiàn)有的許多方式，在允許穩(wěn)定地維持和表達基因的條件下，將表達殺蟲蛋白的基因?qū)胛⑸锼拗?。例如，能?gòu)建表達盒，所述表達盒包括目的核苷酸構(gòu)建體以及與宿主生物體中的序列同源的核苷酸序列和/或在該宿主中具有功能的復(fù)制系統(tǒng)，所述核苷酸構(gòu)建體與用于表達該核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)性信號可操作連接，借助所述核苷酸序列，發(fā)生整合，借助所述復(fù)制系統(tǒng)，發(fā)生整合或穩(wěn)定的維持。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)性信號包括但不限于，啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點、操作基因、活化子(activator)、增強子、其它調(diào)節(jié)性元件、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、終止信號等等。參見，例如，美國專利第5，039，523號和第4，853，331號；EPO0480762A2；Sambrooketal.(1992)MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)，ed.Maniatisetal.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork),下稱“SambrookII“；Davisetal.,eds.(1980)AdvancedBacterialGenetics(高級細菌遺傳學(xué))(ColdSpringHarborLaboratoryPress),ColdSpringHarbor,NewYork；并且所述參考文獻為本文所引用。合適的宿主細胞可以包括原核細胞或真核細胞，其通常限于不產(chǎn)生對諸如哺乳動物的高等生物體有毒性的物質(zhì)的那些細胞，其中處理含殺蟲蛋白的細胞，從而在將受處理細胞應(yīng)用于具有一種或多種靶害蟲的環(huán)境時，延長殺蟲蛋白在所述細胞中的活性。然而，能使用產(chǎn)生對高等生物體具有毒性的物質(zhì)的生物體，其中所述毒素不穩(wěn)定或者應(yīng)用水平足夠低，以致避免對哺乳動物宿主存在毒性的任何可能。作為宿主，特別關(guān)注的是原核細胞和低等真核細胞，諸如真菌。示例性的原核細胞(革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌)包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)，歐文氏菌屬，志賀氏菌屬(Shigella)，沙門氏菌屬(Salmonella)和變形桿菌屬(Proteus)；芽胞桿菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)，諸如根瘤菌屬(Rhizobium)；螺菌科(Spirillaceae)，諸如發(fā)光菌，酵單胞菌屬(Zymomonas)，沙雷氏菌屬，氣單胞菌屬(Aeromonas)，弧菌屬(Vibrio)，脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)，螺旋菌屬(Spirillum)；乳桿菌科(Lactobacillaceae)；假單胞菌科(Pseudomonadaceae)諸如假單胞菌屬和醋桿菌；固氣菌科(Azotobacteraceae)禾口銷化桿菌科(Nitrobacteraceae)。真核細胞有真菌，諸如藻狀菌綱(Phycomycetes)和子囊菌綱(Ascomycetes)，其包括酵母，諸如酵母屬和裂殖酵32母屬(Schizosaccharomyces)；以及擔(dān)子菌(Basidiomycetes)酵母，諸如紅酵母屬，短梗霉屬(Aureobasidium)，擲孢酵母屬等。在為產(chǎn)生殺蟲蛋白而選擇宿主細胞方面特別關(guān)注的特征包括將殺蟲蛋白基因?qū)胨拗鞯谋憬?、表達系統(tǒng)的可獲得性、表達的效率、蛋白在宿主中的穩(wěn)定性以及輔助遺傳能力的存在。用作殺蟲劑微膠囊的所關(guān)注的特征包括對于殺蟲劑的保護性特性，諸如厚的細胞壁、色素沉著和胞內(nèi)包裝或包涵體形成；葉親和性；哺乳動物毒性的缺乏；對昆蟲食入的吸引；殺死和固定且不損害毒蛋白的便捷；等等。其它考慮包括制劑和處理的便捷，經(jīng)濟，儲藏穩(wěn)定性等等。特別關(guān)注的宿主生物體包括酵母，諸如紅酵母(Rhodotorulaspp.)，短梗霉(Aureobasidiumspp.)，酵母(Saccharomycesspp.)(諸如，釀酒酵母)，擲孢酵母(Sporobolomycesspp.)；葉面生物體，諸如假單胞菌(Pseudomonasspp.)(諸如綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)，熒光假單胞菌)，歐文氏菌(Erwiniaspp.)以及黃質(zhì)菌(Flavobacteriumspp.)；以及其它此類生物體，包括Bt、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)等等。編碼實施方式的殺蟲蛋白的基因能導(dǎo)入依靠植物倍增的微生物(附生植物)，從而將殺蟲蛋白遞送至潛在的靶害蟲。附生植物，例如，可以是革蘭氏陽性菌或革蘭氏陽性菌。根定殖(root-colonizing)的細菌，例如，可以通過本領(lǐng)域已知方法分離自所關(guān)注的植物。具體地，定殖根的蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)菌株可以分離自植物根(參見，例如，Handelsmanetal.(1991)Appl.Environ.Microbiol.56:713_718)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標準方法，將編碼實施方式的殺蟲蛋白的基因?qū)敫ㄖ车南灎钛堪麠U菌。借助電轉(zhuǎn)化能將編碼殺蟲蛋白的基因?qū)耄?，根定殖的芽孢桿菌。具體地，編碼殺蟲蛋白的基因能克隆至穿梭載體，例如，pHT3101(Lereciusetal.(1989)FEMSMicrobiol.Letts.60=211-218)。包含特定殺蟲蛋白基因的編碼序列的穿梭載體pHT3101，例如，借助電穿孔能轉(zhuǎn)化至根定殖的芽孢桿菌(Lereciusetal.(1989)FEMSMicrobiol.Letts.60211-218)?？梢栽O(shè)計表達系統(tǒng)，以致，例如將殺蟲蛋白分泌至諸如大腸桿菌的革蘭氏陰性菌的胞質(zhì)外。使殺蟲蛋白分泌的優(yōu)點在于(1)避免所表達殺蟲蛋白的潛在細胞毒性作用；以及(2)改善殺蟲蛋白的純化效率，包括但不限于，提高每體積細胞肉湯的蛋白復(fù)性和純化效率，縮短每單位蛋白復(fù)性和純化的時間和/或減少其成本?？梢灾苽浯竽c桿菌分泌的殺蟲蛋白，例如，通過將合適的大腸桿菌信號肽融合至殺蟲蛋白的氨基端末端?？梢栽诖竽c桿菌已知分泌的蛋白中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌識別的信號肽，例如OmpA蛋白(Ghrayebetal.(1984)EMBOJ，3:2437_2442)。OmpA是大腸桿菌外膜的主要蛋白，它的信號肽因而被認為在轉(zhuǎn)位過程中有效。另外，加工前，OmpA信號肽不需要被修飾，例如脂蛋白信號肽的其它信號肽可能如此(Duffaudetal.(1987)Meth.Enzymol.153492)。實施方式的殺蟲蛋白在細菌宿主中能發(fā)酵，加工所得細菌并將其以與將Bt菌株用作殺昆蟲噴霧劑的相同方式用作微生物噴霧劑。在芽孢桿菌分泌一種或多種殺蟲蛋白的情況下，使用本領(lǐng)域已知方法去除或突變分泌信號。所述突變和/或缺失阻止在發(fā)酵過程中將一種或多種殺蟲蛋白分泌至生長培養(yǎng)基。在細胞內(nèi)保留殺蟲蛋白，隨后加工所述細胞以產(chǎn)生封裝的殺蟲蛋白。為該目的可以使用任意合適的微生物。假單胞菌已被用于將Bt毒素表達為封裝的蛋白，加工所得細胞，并將其作為殺昆蟲劑噴灑(Gaertneretal.(1993)，in:AdvancedEngineeredPesticides(高級工禾呈化殺蟲劑),ed.Kim)。可選擇地，通過將異源基因?qū)爰毎拗鱽懋a(chǎn)生殺蟲蛋白。異源基因的表達直接或間接地導(dǎo)致殺蟲劑的胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。隨后將細胞應(yīng)用于具有一種或多種靶害蟲的環(huán)境時，在延長細胞所產(chǎn)生毒素活性的條件下處理這些細胞。所得產(chǎn)物保留毒蛋白的毒性。隨后可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)配制這些天然封裝的殺蟲蛋白，以將其應(yīng)用于具有靶害蟲的環(huán)境，例如土壤、水和植物的葉子。參見，例如EPA0192319，所述參考文獻為本文所引用。在實施方式中，可接受的載體能將轉(zhuǎn)化的微生物(其包括整個生物體、細胞、一種或多種孢子、一種或多種殺蟲蛋白、一種或多種殺蟲組分、一種或多種影響害蟲的組分、一種或多種突變體、活細胞或死細胞和細胞組分，包括活細胞和死細胞和細胞組分的混合物，并且包括破損的細胞和細胞組分)或分離的殺蟲蛋白配制成一種或多種殺蟲組合物，所述殺蟲組合物，例如是懸浮液、溶液、乳劑、粉劑、可分散顆?；蛐∏?、可濕性粉劑和可乳化濃縮物、煙霧劑或噴霧劑、浸漬顆粒、佐劑、可包被糊劑、膠體，以及另外用例如多聚物物質(zhì)封裝?？梢酝ㄟ^常規(guī)手段制備所述配制的組合物，所述手段諸如干燥、凍干、均質(zhì)化、萃取、過濾、離心、沉降或濃縮包含所述多肽的細胞培養(yǎng)物?？梢酝ㄟ^添加表面活性劑、惰性載體、防腐劑、濕潤劑、取食刺激劑、引誘劑、封裝劑、黏合劑、乳化劑、染料、UV保護劑、緩沖液、流平劑或肥料、微營養(yǎng)供體或者影響植物生長的其它制備物，來獲得以上公開的所述組合物。可以將一種或多種農(nóng)用化學(xué)品與通常用于制劑領(lǐng)域的載體、表面活性劑或佐劑或者其它組分組合，以促進為特定靶害蟲的產(chǎn)物處理和應(yīng)用。適當?shù)妮d體和佐劑可以是固體的或液體的，并且對應(yīng)于通常用于制劑技術(shù)的物質(zhì)，例如，天然的或再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、潤濕劑、增粘劑、黏合劑或肥料。實施方式的活性成分通常以組合物形式應(yīng)用，并且可以應(yīng)用于待處理的作物區(qū)域、植物或種子。例如，可以在制備糧倉或筒倉等時，或者在糧倉或筒倉等儲藏時，將實施方式的組合物應(yīng)用于谷物?？梢耘c其它化合物同時或連續(xù)應(yīng)用實施方式的組合物。應(yīng)用實施方式的活性成分或?qū)嵤┓绞降霓r(nóng)用化學(xué)品組合物的方法包括但不限于葉敷、種子包被和土壤施用，所述活性成分或農(nóng)用化學(xué)品組合物包含實施方式的細菌菌株產(chǎn)生的至少一種殺蟲蛋白。應(yīng)用的數(shù)量和速率取決于對應(yīng)害蟲群襲的強度。合適的表面活性劑包括但不限于陰離子化合物，諸如，例如金屬羧酸鹽；長鏈脂肪酸羧酸鹽；N-酰基肌氨酸鹽；磷酸和脂肪醇乙氧基化物的一元或二元酯或者所述酯的鹽；脂肪醇硫酸鹽，諸如十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉或十六烷基硫酸鈉；乙氧基脂肪醇硫酸鹽；乙氧基烷基苯酚硫酸鹽；木質(zhì)素磺酸鹽；石油磺酸鹽；烷基芳基磺酸鹽，諸如烷基-苯磺酸鹽或低級烷基萘磺酸鹽，例如，丁基-萘磺酸鹽；磺化萘-甲醛縮合物的鹽；磺化苯酚-甲醛縮合物的鹽；更為復(fù)雜的磺酸鹽，諸如，酰胺磺酸鹽，例如油酸和N-甲基牛膽堿的磺化縮合產(chǎn)物；或二烷基磺基琥珀酸鹽，例如二辛基琥珀酸酯的磺酸鈉。非離子試劑包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪_烷基或烯基取代的苯酚與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、多元醇醚的脂肪酯，例如，山梨聚糖脂肪酸酯，所述酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷、炔二醇諸如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或乙氧基炔二醇的嵌段共聚物。陽離子表面活性劑的實例包括，例如，脂肪族一元胺、二元胺或多聚胺的諸如醋酸鹽、環(huán)烷酸鹽或油酸鹽；或者含氧胺，諸如聚氧乙烯烷基胺的胺氧化物；通過縮合羧酸和二元或多聚胺制備的酰胺鍵合的胺；或者季銨鹽。惰性材料的實例包括但不限于無機礦物質(zhì)諸如高嶺土、頁硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或者植物材料諸如軟木、粉狀玉米穗軸、花生殼、稻殼和胡桃殼。實施方式的組合物能是用于直接應(yīng)用或作為初始組合物濃縮物的適當形式，所述濃縮物在應(yīng)用前需要用適量的水或其它稀釋劑稀釋。殺蟲劑濃度依特定制劑的性質(zhì)而變化，具體地，依它是濃縮物還是要直接使用而變化。所述組合物包含至98%的固體或液體惰性載體，以及0%至50%或0.至50%的表面活性劑。以商品標簽上的比率施用所述組合物，例如干燥形式時每英畝約0.011b-5.01b，液體形式時每英畝約0.Olpts.-IOpts.。在另一實施方式中，配制前能處理實施方式的組合物和轉(zhuǎn)化的微生物及殺蟲蛋白，從而在將其應(yīng)用至靶害蟲的環(huán)境時，延長殺蟲活性，只要預(yù)處理對殺蟲活性沒有害處?？梢酝ㄟ^化學(xué)和/或物理手段進行所述處理，只要所述處理不有害地影響一種或多種組合物的性質(zhì)?；瘜W(xué)試劑的實例包括但不限于鹵化劑；諸如甲醛和戊二醛的醛；抗感染劑，諸如氯化芐烷氨；醇，諸如異丙醇和乙醇；以及組織學(xué)固定劑，諸如布安固定劑(Bouin’sfixative)和海利氏固定劑(Helly，sfixative)(參見，例如Humason(1967)AnimalTissueTechniques(動物組織技術(shù))(W.H.FreemanandCo.)。在其它實施方式中，可以有利地用例如胰蛋白酶的蛋白酶處理Cry毒素多肽，從而在將實施方式的殺蟲蛋白組合物應(yīng)用至靶害蟲環(huán)境之前活化所述蛋白。本領(lǐng)域公知通過絲氨酸蛋白酶活化毒素原的方法。參見，例如，Cooksey(1968)Biochem.J.6:445-454和CarrollandEllar(1989)Biochem.J.261:99_105，通過引用將其教導(dǎo)并入本文。例如，適當?shù)幕罨僮鞑襟E包括但不限于將待活化多肽，例如純化的新的Cry多肽(例如，具有如SEQID而2所述的氨基酸序列)，與胰蛋白酶在20碰NaHCO3,pH8中，以蛋白/胰蛋白酶重量比1/100相組合，并且將所述樣品在36C消化3小時?？梢栽诤οx開始出現(xiàn)或在害蟲出現(xiàn)前，將組合物(包含實施方式的所轉(zhuǎn)化微生物和殺蟲蛋白)作為保護措施應(yīng)用于昆蟲害蟲環(huán)境，所述應(yīng)用通過例如，噴灑、霧化、粉化、散布、包被或傾倒、引入土壤或引至土壤表面、引入灌溉水，其通過種子處理或通常的應(yīng)用或粉化。例如，可以將實施方式的殺蟲蛋白和/或轉(zhuǎn)化的微生物與谷物混合，從而保護儲藏期的谷物。通常重要的是在植物生長早期獲得對害蟲的良好控制，因為此時植物可以受到最為嚴重的損害。如認為有必要，實施方式的組合物可以方便地包含另一殺昆蟲劑。在一個實施方式中，在種植時，將組合物直接應(yīng)用至土壤，所述應(yīng)用是以載體和芽孢桿菌菌株或?qū)嵤┓绞剿D(zhuǎn)化微生物的死細胞的組合的顆粒形式。另一實施方式是組合物的顆粒形式，所述組合物包含農(nóng)用化學(xué)品，諸如，例如，除草劑、殺昆蟲劑、肥料、惰性載體和芽孢桿菌菌株或?qū)嵤┓绞降乃D(zhuǎn)化微生物的死細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，不是所有化合物對全部害蟲都具有同樣效果。實施方式的化合物顯示抗昆蟲害蟲的活性，所述害蟲可以包括經(jīng)濟上重要的農(nóng)藝學(xué)害蟲、林業(yè)害蟲、溫室害蟲、苗圃害蟲、觀賞品害蟲、食物和纖維害蟲、公眾和動物健康害蟲、家用和商用建筑害蟲、家用品害蟲和儲物害蟲。昆蟲害蟲包括選自鞘翅目、雙翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等、特別是鱗翅目的昆蟲。鞘翅目的幼蟲和成蟲包括長角象鼻蟲科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)以及象甲科(Curculionidae)的象鼻蟲(包括但不限于棉鈴象甲(AnthonomusgrandisBoheman,bollweevil)；禾§水象甲(LissorhoptrusoryzophilusKuschel,ricewaterweevil)；谷象(SitophilusgranariusLinnaeus，granaryweevil)；米象(S.oryzaeLinnaeus，riceweevil)；三葉草葉象(HyperapunctataFabricius，cloverleafweevil)；向日葵蓮象甲(CylindrocopturusadspersusLeConte,sunflowerstemweevil)；紅色禾中子象甲(SmicronyxfulvusLeConte，redsunflowerseedweevil)；灰色禾中子象甲(S.sordidusLeConte,graysunflowerseedweevil)；玉米象甲(SphenophorusmaidisChittenden，maizebillbug)；葉甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黃瓜葉甲、根蟲、葉甲、馬鈴薯葉甲以及潛葉蟲(包括但不限于科羅拉多州馬鈴薯甲蟲(L印tinotarsadecemlineataSay,Coloradopotatobeetle)；玉米根螢葉甲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte,westerncornrootworm)；巴氏根葉甲(D.barberiSmith&Lawrence,northerncornrootworm)；黃瓜十一星葉甲(D.undecimpunctatahowardiBarber，southerncornrootworm)；玉米跳甲(ChaetocnemapulicariaMelsheimer，cornfleabeetle)；十字花禾斗跳甲(PhyllotretacruciferaeGoeze,cornfleabeetle)；葡萄肖葉甲(ColaspisbrunneaFabricius，grapecolaspis)；漂角負泥蟲(OulemamelanopusLinnaeus，cerealleafbeetle)；向日奏葉甲(ZygogrammaexclamationisFabricius，sunflowerbeetle))；瓢蟲科(Coccinellidae)的甲蟲(包括但不限于墨西哥豆瓢蟲(EpilachnavarivestisMulsant,Mexicanbeanbeetle)；(Scarabaeidae)龜子和其他的甲蟲(包括但不限于日本金龜子(popilliajaponicaNewman,Japanesebeetle)；北方圓頭庫金龜(CyclocephalaborealisArrow,northernmaskedchafer，whitegrub)；南方圓頭犀金龜(C.immaculataOlivier,southernmaskedchafer，whitegrub)；歐洲金龜(RhizotrogusmajalisRazoumowsky,Europeanchafer)；擠贈(PhyllophagacrinitaBurmeister,whitegrub)；古月蘿卜甲蟲(LigyrusgibbosusDeGeer,carrotbeetle))；皮蠹科(Dermestidae)的地毬圓皮蠹；叩甲科(Elateridae)的線蟲偽金針蟲(Eleodesspp.)、金針蟲(Melanotusspp.)、單葉口口甲(Conoderusspp.)、Limoniusspp.、維尾口口甲(Agriotesspp.)、Cteniceraspp.、Aeolusspp.；小蠹禾斗(Scolytidae)的小蠹蟲以及擬步甲科(Tenebrionidae)的甲蟲。鱗翅目的幼蟲包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘蟲、切根蟲、尺蠖和heliothine秋粘蟲(SpodopterafrugiperdaJESmith，fallarmyworm)；舌甘菜夜蛾(S.exiguaHiibner,beetarmyworm)；斜紋夜蛾(S.IituraFabhcius，tobaccocutworm,clustercaterpillar)；稽帶夜蛾(MamestraconfigurataWalker,berthaarmyworm)；甘藍夜蛾(Μ.brassicaeLinnaeus，cabbagemoth)；漂切根蟲(AgrotisipsilonHufnage1,blackcutworm)；西部切根蟲(A.orthogoniaMorrison,westerncutworm)；顆粒夜蛾(A.subterraneaFabricius，granulatecutworm)，木棉蟲(AlabamaargillaceaHiibner,cottonleafworm)；粉紋夜蛾(TrichoplusianiHiibner,cabbagelooper)；大豆夜蛾(PseudoplusiaincludensWalker,soybeanlooper)；黎豆夜蛾(AnticarsiagemmatalisHiibner,velvetbeancaterpillar)；苜猜綠夜蛾(HypenascabraFabricius,greencloverworm)；煙芽夜蛾(HeliothisvirescensFabricius，tobaccobudworm)；一星粘蟲(PseudaletiaunipunctaHaworth,armyworm)；粗皮夜蛾(AthetismindaraBarnesandMcdunnough,roughskinnedcutworm)；暗緣地老虎(EuxoamessoriaHarris，darksidedcutworm)；埃及金鋼鉆(EariasinsulanaBoisduval,spinybo11worm)；Ψ-^C^^(Ε.vittellaFabricius,spottedbo11worm)；^MiS#^(HelicoverpaarmigeraHiibner,Americanbo11worm)；谷實夜娥(H.zeaBoddie，cornearworm或cottonbo11worm)；紋蝶毛蟲(MelanchrapictaHarris，zebracaterpillar)；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialisGrote,citruscutworm)；螟蛾禾斗(Pyralidae)的鉆孔蟲、鞘蛾、結(jié)網(wǎng)毛蟲、球果蛾以及斑蛾歐洲玉米螟(OstrinianubilalisHubner,Europeancornborer)；贓禮蟲冥(AmyeIoistransitellaWalker,navalorangeworm)；地中海粉斑螟(AnagastakuehniellaZeller,Mediterraneanflourmoth)；干果斑螟(CadracautellaWalker,almondmoth)；二化螟(ChiIosuppressalisWalker,ricestemborer)；斑禾草蟲冥(C.partellus,sorghumborer)；米娥(CorcyracephalonicaStainton，ricemoth)；玉米根結(jié)網(wǎng)毛蟲(CrambuscaliginosellusClemens，cornrootwebworm)；藍草結(jié)網(wǎng)毛蟲(C.teterrellusZincken，bluegrasswebworm)；稻縱卷葉里予螟(CnaphalocrocismedinalisGuenee，riceleafroller)；葡萄卷葉蟲(DesmiafuneralisHiibner,grapeleaffolder)；舌甘瓜野螟(DiaphaniahyalinataLinnaeus，melonworm)；^包胃&(D.nitidalisStoll,pickleworm)；胃(DiatraeagrandiosellaDyar,southwesterncornborer)；小庶蟲冥(D.saccharalisFabricius，surgarcaneborer)；墨西哥水稻螟(EoreumaloftiniDyar，Mexicanriceborer)；煙草粉螟(EphestiaelutellaHiibner,tobacco(cacao)moth)；錯蟲冥(GalleriamellonellaLinnaeus，greaterwaxmoth)；野螟(HerpetogrammalicarsisalisWalker,sodwebworm)；向曰葵斑螟(HomoeosomaelectellumHulst，sunflowermoth)；南美玉米苗斑螟(ElasmopalpuslignosellusZeller，lessercornstalkborer)；小錯螟(AchroiagrisellaFabricius，lesserwaxmoth)；草地蟲冥(LoxostegesticticalisLinnaeus，beetwebworm)；茶樹蟲冥(OrthagathyrisalisWalker,teatreewebmoth)；豆野螟(MarucatestulalisGeyer,beanpodborer)；印度谷螟(PlodiainterpunctellaHiibner,Indianmealmoth)；三化螟(ScirpophagaincertulasWalker，yellowstemborer)；溫室螟(UdearubigalisGuenee,celeryleaftier)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷葉蟲、蚜蟲、種實蟲以及果實蟲漂頭卷葉蛾(AclerisgloveranaWalsingham，Westernblackheadedbudworm)；漂頭長翅卷蛾(A.varianaFernald，Easternblackheadedbudworm)；果樹黃卷蛾(ArchipsargyrospilaWalker，fruittreeleafroller)；歐洲卷葉蛾(A.rosanaLinnaeus，Europemleafroller)；以及其他的黃卷蛾屬(Archips)物種棉褐帶卷蛾(AdoxophyesoranaFischervonRosslerstamm>summerfruittortrixmoth)；條紋向曰葵螟(CochylishospesWalsingham,bandedsunflowermoth)；棒小卷娥(CydialatiferreanaWalsingham,filbertworm)；蘋果蠹蛾(C.pomonellaLinnaeus，codingmoth)；雜色卷葉蛾(PlatynotaflavedanaClemens,variegatedleafroller)；荷蘭石竹小卷蛾(P·stultanaWalsingham，omnivorousleafroller)；歐洲葡萄小卷葉蛾(LobesiabotranaDenis&37Schiffermiiller,Europeangrapevinemoth)；蘋白小卷蛾(SpilonotaocellanaDenis&Schiffermiiller,eyespottedbudmoth)；萄果實蟲主蟲(EndopizaviteanaClemens，grapeberrymoth)；女貞細卷蛾(EupoeciliaambiguellaHiibner,vinemoth)；巴西蘋果卷葉蛾(BonagotasalubricolaMeyrick，Brazilianappleleafroller)；梨小食心蟲(GrapholitamolestaBusck，orientalfruitmoth)；向日葵芽蛾(SuleimahelianthanaRiley,sunflowerbudmoth)；條卷蛾(Argyrotaeniaspp.)；尾蛺蝶(Choristoneuraspp.)ο鱗翅目的所選其它農(nóng)藝害蟲包括但不限于秋星尺蠖(AlsophilapometariaHarris,fallcankerworm)；桃枝麥娥(AnarsialineatellaZeller,peachtwigborer)；犀客頁蛾(AnisotasenatoriaJ.Ε.Smith,orangestripedoakworm)；昨香(AntheraeapernyiGuerin-Menevi1Ie,ChineseOakSiIkmoth)；家香(BombyxmoriLinnaeus，Silkworm)；豐帛潛娥(BucculatrixthurberiellaBusck,cottonleafperforator)；胃■胃蟲I(ColiaseurythemeBoisduval,alfalfacaterpillar)；古月相區(qū)胃蟲|(DatanaintegerrimaGrote&Robinson,walnutcaterpillar)；落葉松毛蟲(DendrolimussibiricusTschetwerikov,Siberiansilkmoth)；白尺蟲蒦(EnnomossubsignariaHiibner,elmspanworm)；菩提尺蠖(ErannistiliariaHarris，lindenlooper)；黃毒蛾(EuproctischrysorrhoeaLinnaeus，browntailmoth)；漂擬齡蛾(HarrisinaamericanaGuerin-Menevi1Ie,grapeleafskeletonizer)；范圍毛蟲飛蛾(HemileucaoliviaeCockrel1,rangecaterpillar);_15白_(HyphantriacuneaDrury,fallwebworm)；番前蠹娥(KeiferialycopersicellaWalsingham,tomatopinworm)；二尾蛺蝶(LambdinafiseellariafiseellariaHulst，Easternhemlocklooper)；西部鐵杉尺蠖(LfiscellarialugubrosaHulst,Westernhemlocklooper)；柳毒蛾(LeucomasalicisLinnaeus，satinmoth)；舞毒娥(LymantriadisparLinnaeus，gypsymoth)；番前天娥(MandueaquinquemaculataHaworth,fivespottedhawkmoth，tomatohornworm)；煙草天(Μ.sextaHaworth,tomatohomworm,tobaccohornworm)；冬尺蟲蒦(OperophterabrumataLinnaeus，wintermoth)；春尺蠖(PaleacritavernataPeck，springcankerworm)；大鳳蝶(PapiliocresphontesCramer，giantswallowtail,orangedog)；力口州株蟲(PhryganidiacalifornicaPackard,Californiaoakworm)；柑橘潛葉蛾(PhyllocnistiscitrellaStainton，citrusleafminer)；斑幕潛葉蛾(PhyllonorycterblancardellaFabricius，spottedtentiformleafminer)；大菜粉蝶(PierisbrassicaeLinnaeus，largewhitebutterfly)；小菜粉蝶(P.rapaeLinnaeus，smallwhitebutterfly)；暗脈菜粉蝶(P.napiLinnaeus，greenveinedwhitebutterfly)；洋薊習(xí)習(xí)蛾(PlatyptiliacarduidactylaRiley,artichokeplumemoth)；菱斑餓(PlutellaxylostellaLinnaeus，diamondbackmoth)；棉紅鈴蟲(PectinophoragossypiellaSaunders，pinkbo11worm)；南方菜蛾(PontiaprotodiceBoisduval&Leconte，Southerncabbageworm)；雜食尺蟲蒦(SabulodesaegrotataGuenee,omnivorouslooper)；康辛tt(SchizuraconcinnaJ.E.Smith,redhumpedcaterpillar)；麥娥(SitotrogacerealellaOlivier,Angoumoisgrainmoth)；松異帶蛾(ThaumetopoeapityocampaSchiffermuller,pineprocessionarycaterpiliar)；結(jié)網(wǎng)衣娥(Tineola38bisselliellaHummel,webbingclothesmoth)；番爺斑潛妮(TutaaabolutaMeyrick,tomatoIeafminer)；蘋果巢蛾(YponomeutapadellaLinnaeus,erminemoth)；HeliothissubfIexaGuenee；天幕毛蟲(Malacosomaspp)；以及毒蛾(Orgyiaspp)。雙翅目的成蟲和幼蟲包括諸如玉米斑潛葉蠅(AgromyzaparvicornisLoew,cornblotchleafminer)的潛葉蠅；蚊(包括但不限于高粱癭蚊(ContariniasorghicolaCoquillett,sorghummidge)；H^K(MayetioladestructorSay,Hessianfly)；麥紅吸菜蟲(SitodiplosismosellanaGehin,wheatmidge)；葵花軒岐(NeolasiopteramurtfeldtianaFelt,sunflowerseedmidge))；果實妮(實妮禾斗(Τ印hritidae))，瑞典稈蠅(OscinellafritLinnaeus,fritflies)；蛆(包括但不限于灰地禾中妮(DeliaplaturaMeigen,seedcommaggot)；麥禾中妮(D.coarctataFallen,wheatbulbfly)；以及其它地種蠅(Deliaspp.),美洲稈蠅(MeromyzaamericanaFitch,wheatstemmaggot)；舍妮(MuscadomesticaLinnaeus,houseflies)；夏廁妮(FanniacanicularisLinnaeus),小舍妮(F.femoralisStein,lesserhouseflies)；廄螫妮(StomoxyscalcitransLinnaeus,stableflies))；秋家#1、角#1、HI3#|、金(Chrysomyaspp.)；伏蠅(Phormiaspp.)；以及其他的苔蘚蠅害蟲，馬蠅，虻(Tabanusspp.)；胃蠅，胃蠅(Gastrophilusspp.)；狂蠅(Oestrusspp.)；牛皮蠅，皮蠅(Hypodermaspp.)；斑it,斑it(Chrysopsspp.)；綿羊風(fēng)蠅(MelophagusovinusLinnaeus,keds)；以及其他的短角亞目(Brachycera),岐子，伊岐(Aedesspp.)；按岐(Anophelesspp.)；庫岐(Culexspp.)；黑蠅，原蚋(Prosimuliumspp.)；蚋(Simuliumspp.)；咬蠓、白蛉、尖眼蕈蚊和其他長角亞目(Nematocera)。半翅目和同翅目的成蟲和若蟲包括昆蟲，諸如但不限于球蚜科(Adelgidae)的球蚜、盲蝽科(Miridae)的盲蝽、蟬科(Cicadidae)的蟬、葉蟬科(Cicadellidae)的葉蟬、小綠葉蟬(Empoascaspp.)；菱飛虱科(Cixiidae)、蛾蠟蟬科(Flatidae)、蠟蟬總科(Fulgoroidea)、圓飛虱科(Issidae)以及稻虱科(Delphacidae)的飛虱；角蟬科(Membracidae)的角蟬；木虱科(Psyllidae)的木虱；粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱；蚜科(Aphididae)的蚜蟲；根瘤蚜科(Phylloxeridae)的根瘤蚜；粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧；鏈介殼蟲科(Asterolecanidae)、軟介殼蟲科(Coccidae)、洋紅蚧科(Dactylopiidae)、盾介殼蟲科(Diaspididae)、絨蚧科(Eriococcidae)、旌介殼蟲科(Ortheziidae)、刺葵介殼蟲科(Phoenicococcidae)以及碩介殼蟲科(Margarodidae)的介殼蟲；網(wǎng)蝽科(Tingidae)的網(wǎng)蝽；蝽科(Pentatomidae)的九香蟲；長蝽科(Lygaeidae)的麥長蝽，長椿(Blissusspp.)；以及其他的蝽類(seedbugs)，沫蟬科(Cercopidae)的沫蟬、緣蝽科(Coreidae)的南瓜緣蝽、以及紅蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。同翅目中農(nóng)藝上重要的成員還包括但不限于豌豆蚜(AcyrthisiphonpisumHarris,peaaphid)；豆工豆蟲牙(AphiscraccivoraKoch,cowpeaaphid)；黑豆蟲牙(A.fabaeScopoli,blackbeanaphid)；棉蟲牙(A.gossypiiGlover,cottonaphid,melonaphid)；玉米根蟲牙(A.maidiradicisForbes,cornrootaphid)；蘋果黃蟲牙(A.pomiDeGeer,appleaphid)；繡線菊蟲牙(A.spiraecolaPatch,spireaaphid)；爺溝無網(wǎng)蟲牙(AulacorthumsolaniKaltenbach,foxgloveaphid)；草莓釘蟲牙(ChaetosiphonfragaefoliiCockerel1,strawberryaphid)；麥雙H1蟲牙(DiuraphisnoxiaKurdjumov/Mordvilko,Russianwheataphid)；攻瑰蘋果蟲牙(DysaphisplantagineaPaaserini,rosyappleaphid)；蘋果綿蟲牙(EriοsomalanigerumHausmann，woollyappleaphid)；甘藍蟲牙(BrevicorynebrassicaeLinnaeus,cabbageaphid)；相區(qū)粉大尾蟲牙(HyalopteruspruniGeoffroy,mealyplumaphid)；蘿卜蟲牙(LipaphiserysimiKaltenbach，turnipaphid)；麥無網(wǎng)長管蟲牙(MetopolophiumdirrhodumWalker,cerealaphid)；大卓戈長管蟲牙(MacrosiphumeuphorbiaeThomas，potatoaphid)；煙桃蟲牙(MyzuspersicaeSulzer,peach-potatoaphid，greenpeachaphid)；萬苣蟲牙(NasonoviaribisnigriMosley,lettuceaphid)；癭綿蟲牙(Pemphigusspp.，rootaphids禾口gallaphids)；玉米蟲牙(RhopalosiphummaidisFitch,cornleafaphid)；禾谷溢管蟲牙(R.padiLinnaeus，birdcherry-oataphid)；麥二叉蟲牙(SchizaphisgraminumRondani,greenbug)；黃色甘蔴蟲牙(SiphaflavaForbes，yellowsugarcaneaphid)；麥長管蟲牙(SitobionavenaeFabricius，Englishgrainaphid)；苜猜斑蟲牙(TherioaphismaculataBuckton，spottedalfalfaaphid)；漂色柑橘蟲牙(ToxopteraaurantiiBoyerdeFonscolombe,blackcitrusaphid)以及褐色桔蟲牙(Τ.citricidaKirkaldy,browncitrusaphid)；球蟲牙(Adelgesspp.，adelgids)；長山豐亥相區(qū)豐艮瘤蟲牙(PhylloxeradevastatrixPergande,pecanphylloxera)；甘暮粉風(fēng)(BemisiatabaciGennadius，tobaccowhitefly,sweetpotatowhitefly)；銀葉粉風(fēng)(B.argentifoliiBellows&Perring，silverleafwhitefly)；柑桔粉風(fēng)(DialeurodescitriAshmead，citruswhitefly)；煙粉風(fēng)(Trialeurodesabutiloneus,bandedwingedwhitefly)以及溫室白粉風(fēng)(Τ.vaporariorumWestwood,greenhousewhitefly)；馬鈴薯小綠葉蝶(EmpoascafabaeHarris,potatoleafhopper)；灰飛風(fēng)(LaodelphaxstriatellusFallen，smallerbrownplanthopper)；紫■葉蝶(MacrolestesquadrilineatusForbes，asterleafhopper)；漂尾葉蝶(NephotettixcinticepsUhler,greenleafhopper)；二條漂尾葉蝶(N.nigropictusStal,riceleafhopper)；褐飛風(fēng)(NilaparvatalugensStal，brownplanthopper)；玉米飛風(fēng)(PeregrinusmaidisAshmead,cornplanthopper)；白背飛風(fēng)(SogatellafurciferaHorvath,white-backedplanthopper)；禾苗飛風(fēng)(SogatodesorizicolaMuir，ricedelphacid)；蘋果白葉蝶(TyphlocybapomariaMcAtee,whiteappleleafhopper)；葡萄葉蝶(Erythroneouraspp.，grapeleafhoppers)；十七年蝶(MagicicadaseptendecimLinnaeus,periodicalcicada)；吹帛_(IceryapurchasiMaskel1,cottonycushionscale)；梨園盾階(QuadraspidiotusperniciosusComstock,SanJosescale)；柑桔醫(yī)紋粉階(PlanococcuscitriRisso，citrusmealybug)；粉階的禾中(Pseudococcusspp.)(其他的粉階系群)；梨木風(fēng)(CacopsyllapyricolaFoerster,pearpsylla)；棉木風(fēng)(TriozadiospyriAshmead,persimmonpsylla)0半翅目中農(nóng)藝上重要的物種包括但不限于稻綠蝽(AcrosternumhilareSay,greenstinkbug)；南瓜緣蟲舂(AnasatristisDeGeer,squashbug)；麥長蟲舂(BlissusleucopterusleucopterusSay,chinchbug)；方翅網(wǎng)蟲春(CorythucagossypiiFabricius，cottonlacebug)；番前蟲舂(CyrtopeltismodestaDistant，tomatobug)；棉蟲春(DysdercussuturellusHerrich-Schaffer,cottonstainer)；揭臭蟲春(EuschistusservusSay,brownstinkbug)；一斑I_(E.variolariusPalisotdeBeauvois,one-spottedstinkbug)；長蟲舂(Graptostethusspp.)(果實蟲舂系群(complexofseedbugs))；豐公0十豐艮蟲春(LeptoglossuscorculusSay,leaf-footedpineseedbug)；美國㈱胃盲_(LyguslineolarisPalisotdeBeauvois,tarnishedplantbug)；豆英胃盲蟲舂(LHesperusKnight，Westerntarnishedplantbug)；牧草盲蟲舂(LpratensisLinnaeus，commonmeadowbug)；長毛草盲蟲舂(LrugulipennisPoppius，Europeantarnishedplantbug)；長參錄盲蟲春(LygocorispabulinusLinnaeus,commongreencapsid)；水稻稻參錄_(NezaraviridulaLinnaeus,southerngreenstinkbug)；稻蟲舂(OebaluspugnaxFabricius，ricestinkbug)；突角長蟲舂(OncopeltusfasciatusDallas，largemilkweedbug)；棉盲蟲舂(PseudatomoscelisseriatusReuter,cottonfleahopper)。@(CalocorisnorvegicusGmelin,strawberrybug)；OrthopscampestrisLinnaeus；蘋盲蟲舂(PlesiocorisrugicollisFallen，applecapsid)；番前蟲舂(CyrtopeltismodestusDistant，tomatobug)；煙草小盲蟲舂(CyrtopeltisnotatusDistant,suckfly)；白■|_(SpanagonicusalbofasciatusReuter,whitemarkedfleahopper)；阜英蟲舂(DiaphnocorischlorionisSay,honeylocustplantbug)；洋蔥蟲舂(LabopidicolaalliiKnight，onionplantbug)；棉盲蟲舂(PseudatomoscelisseriatusReuter,cottonfleahopper)；苜猜褐盲蟲舂(AdelphocorisrapidusSay,rapidplantbug)；四線盲蟲舂(PoecilocapsuslineatusFabricius，four-linedplantbug)；擬麥長蟲春(NysiusericaeSchilling,falsechinchbug)；荼黃薊馬(NysiusraphanusHoward,falsechinchbug)；禾S青蟲舂(NezaraviridulaLinnaeus,Southerngreenstinkbug)；扁盾蟲春(Eurygasterspp.)；緣蟲春(Coreidaespp.)；紅蟲舂(Pyrrhocoridaespp.)；谷蛾(Tinidaespp.)；負子蟲舂(Blostomatidaespp.)；獵蟲舂(Reduviidaespp.)；以及臭蟲舂(Cimicidaespp·)。螨(Acari)(螨(mites))目的成蟲和幼蟲包括小麥卷葉螨(AceriatosichellaKeifer,wheatcurlmite)；褐色小麥螨(PetrobialatensMiiller,brownwheatmite)；葉鋼科(Tetranychidae)的蟲朱鋼禾口恙鋼，歐洲葉鋼(PanonychusulmiKoch，Europeanredmite)；二斑葉螨(TetranychusurticaeKoch,twospottedspidermite)；邁葉螨(Τ.mcdanieliMcGregor，McDanielmite)；朱砂葉螨(Τ.cinnabarinusBoisduval,carminespidermite)；土耳其斯坦葉螨(Τ.turkestaniUgarov&Nikolski,strawberryspidermite)；細須螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨，葡萄短須螨(BrevipalpusIewisiMcGregor，citrusflatmite)；癭螨科(Eriophyidae)的銹螨和芽癭螨以及其他的食葉螨和對人類和動物健康重要的螨，即蜻科(Epidermoptidae)中的銹螨，蠕形螨科(Demodicidae)中的毛囊蟲，食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的扁風(fēng)，漂腳硬蝶(IxodesscapularisSay,deertick)；全環(huán)硬蝶(I.holocyclusNeumann，Australianparalysistick)；美國狗壁風(fēng)(DermacentorvariabilisSay,Americandogtick)；美州壁Ml(AmblyommaamericanumLinnaeus,lonestartick)；以及__禾斗(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的癢螨和疥螨?！?Thysanura)(LepismasaccharinaLinnaeus,silverfish)；小灶衣魚(ThermobiadomesticaPackard，firebrat)。其他的節(jié)肢害41蟲包括卿蛛目(Araneae)中的蜘蛛，如棕色隱遁蜘蛛(LoxoscelesreclusaGertsch&Mulaik,brownreclusespider)；禾口黑寡婦_妹(LatrodectusmactansFabricius,blackwidowspider)；禾口蟲由艇目(Scutigeromorpha)中的娛蟲公，如蟲由艇(ScutigeracoleoptrataLinnaeus,housecentipede)?？梢栽诎l(fā)育早期，例如，如幼蟲或其它未成熟形式，測試實施方式的組合物對蟲害的殺蟲活性?？梢栽谕耆诎禇l件下，于約20°C至約30°C，在約30%至約70%的相對濕度中培養(yǎng)昆蟲。可以如CzaplaandLang(1990)J.Econ.Entomol.83(6):2480_2485所述進行生物分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知培養(yǎng)昆蟲幼蟲和進行生物分析的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種生物分析技術(shù)。通常的程序包括向封口容器中的飲食來源添加實驗化合物或生物體。可以通過但不限于取食和暴露適當長時間后的死亡率變化、體重減少、吸引、驅(qū)性和其它行為和物理變化，來測量殺蟲活性?？梢詫τ紫x期或成蟲期的任何取食蟲害使用本文所述的生物分析。通過說明而非限制的方式陳述下列實施例。實施例實施例1測試蘇云金芽孢桿菌毒素對所選昆蟲的殺蟲活性的生物分析進行生物分析以評價如SEQIDNO2所述的Bt殺昆蟲毒素肽對西方玉米根蟲的作用。對包含殺昆蟲蛋白的人工飲食進行取食分析。使用鞘翅目特異性人工飲食來局部應(yīng)用殺昆蟲蛋白。以每容器每25μ1樣品l.Oyg的比例應(yīng)用毒素，并將其干燥。該蛋白包含在pH10的IOmM碳酸鹽緩沖液中。每一容器放置一個新生幼蟲，以隨意取食5天。如果有諸如萎縮和或死亡的幼蟲反應(yīng)，則結(jié)果為陽性。如果幼蟲與食用僅應(yīng)用上述緩沖液的飲食的陰性對照相似，則結(jié)果為陰性。表1=SEQIDNO2的取食生物分析結(jié)果所測試昆蟲結(jié)果西方玉米才艮蟲(玉米才良螢葉曱virgifera))+實施例2確定LC5tl和EC50進行生物分析以確定如SEQIDNO:2所述的殺昆蟲毒素肽對西方玉米根蟲(玉米根螢葉甲)的LC5tl和EC5tlt5對包含殺昆蟲蛋白的人工飲食進行取食分析。殺昆蟲蛋白用pH10的IOmM碳酸鹽緩沖液和昆蟲飲食稀釋，以達到50000，5000，500，50和5ppm的毒素終濃度。每一容器放置一個新生幼蟲，以隨意取食5天。在每一劑量下，一式八份進行每一生物分析，將所述生物分析重復(fù)三次。通過死亡率將結(jié)果示作LC5tl和/或通過稱量每一毒素濃度下的存活幼蟲將其示作EC5。。實施例3通過粒子轟擊和再生轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化玉米用含有毒素核苷酸序列(例如，SEQIDN0:1)的DNA分子轟擊來自溫室供體植物的未成熟玉米胚，所述毒素核苷酸序列與泛素啟動子和可選擇的標志物基因PAT(ffohllebenetal.(1988)Gene70:25_37)可操作連接，其賦予對雙丙氨磷除草劑的抗性?？蛇x擇地，在單獨的DNA分子上提供可選擇標志物基因。如下進行轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基配方如下。靶組織的制備給穗去皮，用30%CL0R0X漂白劑加0.5%微去垢劑將其表面殺菌20分鐘，用蒸餾水漂洗兩次。切下并放置未成熟胚，胚軸一側(cè)向下(子葉盤一側(cè)向上)，每板25個胚，于560Y培養(yǎng)基放置4小時，隨后將其在2.5cm的靶區(qū)域內(nèi)排列，以備轟擊。DNA的制備制備包含與泛素啟動子可操作連接的毒素核苷酸序列(例如SEQIDNO1)的質(zhì)粒載體。例如，適當?shù)霓D(zhuǎn)化載體包含與PinII終止子組合的玉米UBIl啟動子、UBIl的5’UTR和UBIl內(nèi)含子。該載體另外包含CAMV35S啟動子驅(qū)動的PAT可選擇標志物基因，并包含CAMV35S終止子。任選地，可選擇標志物可以位于單獨的質(zhì)粒上。使用如下的CaC12沉淀程序，將包含毒素核苷酸序列和PAT可選擇標志物的DNA分子沉淀至1.1μm(平均直徑)鎢球100μL含所制備鎢粒的水10μL(1μg)溶于TrisEDTA緩沖液的DNA(1μg總DNA)100UL2.5MCaCl2IOyLO.IM亞精胺將每一試劑順次加入鎢粒懸浮液，同時置于多管渦旋器上。將最終混合物短暫超聲破碎，并使其在持續(xù)渦旋下孵育10分鐘。在沉淀期后，短暫離心所述管，移除液體，用500mL100%乙醇清洗，離心30秒。再移除液體，將105μL100%乙醇添加至最終鎢粒小球。為粒子槍轟擊，將該鎢/DNA粒短暫超聲處理，并將10μL點至每一大載體(macrocarrier)中心，并使其干燥約2分鐘，隨后進行轟擊。粒子槍處理用粒子槍#HE34-1或#HE34_2在水平#4下轟擊樣品板。所有樣品接受650PSI下的單次射擊，總共一式十份，其取自具有所制備粒/DNA的每一管。隨后的處理轟擊后，將胚置于560Y培養(yǎng)基2天，隨后將其轉(zhuǎn)至含有3mg/升雙丙氨磷的560R選擇培養(yǎng)基，每2周傳代培養(yǎng)。選擇約10周后，將抗選擇的愈傷克隆轉(zhuǎn)至288J培養(yǎng)基，以起始植物再生。在體細胞胚成熟(2-4周)后，將發(fā)育良好的體細胞胚轉(zhuǎn)至出芽培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)室。約7-10天后，將發(fā)育中的苗轉(zhuǎn)至管中的272V無激素培養(yǎng)基，培養(yǎng)7-10天，直至苗得到良好建成。隨后將植物轉(zhuǎn)至含有盆栽土的淺箱(等同于2.5"盆)的墊子上，使其在生長室內(nèi)生長1周，隨后再在溫室中生長1-2周，接著將其轉(zhuǎn)移至典型的600盆(1.6加侖)，并使其生長至成熟。通過本領(lǐng)域已知的或如上所述的分析，監(jiān)測并評分植物的毒素表達。轟擊禾Πi吝養(yǎng)的培養(yǎng)基轟擊培養(yǎng)基(560Y)包含4.Og/LN6基本鹽(SIGMAC-1416)，1.OmL/LEriksson維生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)，0.5mg/L硫胺HC1，120.Og/L蔗糖，1.0mg/L2，4_D和2.88g/LL-脯氨酸(用KOH調(diào)至ρΗ5·8后，用dlH2O定容)；2.0g/LGelrite(用dlH2O定容后添加)；和8.5mg/L硝酸銀(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后添加)。選擇培養(yǎng)基(560R)包含4.0g/LN6基本鹽(SIGMAC-1416)，1.0mL/LEriksson維生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)，0.5mg/L硫胺HCl，30.Og/L蔗糖，和2.Omg/L2，4_D(用KOH調(diào)至pH5.8后，用dlH2O定容)；3-Og/LGelrite(用dlH2O定容后添加)；和0.85mg/L硝酸銀和3.Omg/L雙丙氨磷(均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后添加)。植物再生培養(yǎng)基(288J)包含4.3g/LMS鹽(GIBC011117-074)，5.OmL/LMS維生素母液(O.IOOg煙酸，0.02g/L硫胺HCl,0.10g/L吡哆醇HCl和0.40g/L甘氨酸，用精制D-IH2O定容)(MurashigeandSkoog(1962)Physiol.Plant.15:473)，100mg/L肌-肌醇，0.5mg/L玉米素，60g/L蔗糖，和1.0mL/L的0.ImM脫落酸(調(diào)至pH5.6后，用精制dlH2O定容)；3.0g/LGelrite(用dlH2O定容后添加)；和1.0mg/L吲哚乙酸和3.Omg/L雙丙氨磷(均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至60°C后添加)。無激素培養(yǎng)基(272V)包含4.3g/LMS鹽(GIBC011117-074)，5.OmL/LMS維生素母液(0.IOOg煙酸，0.02g/L硫胺HCl,0.10g/L吡哆醇HCl，和0.40g/L甘氨酸，用精制dlH2O定容)，0·lg/L肌-肌醇，和40.0g/L蔗糖(調(diào)pH至5.6后，用精制(11H2O定容)；和6g/L細菌瓊脂粉(用精制dlH2O定容后添加)，將其滅菌并冷卻至60°C。實施例4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物再生對于用毒素核苷酸序列(例如，SEQIDN0:1)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，可以使用Zhao的方法(美國專利第5，981，840號和PCT專利公開W098/32326；其內(nèi)容通過引用并入本文)。簡言之，從玉米分離未成熟胚，使該胚與農(nóng)桿菌懸浮液接觸，所述接觸在所述細菌能夠?qū)⒍舅睾塑账嵝蛄?SEQIDNO:1)轉(zhuǎn)移至至少一個未成熟胚的至少一個細胞的條件下進行(步驟1感染步驟)。在該步驟中，可以將未成熟胚浸入農(nóng)桿菌懸浮液以起始接種。將胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一定時間(步驟2共培養(yǎng)步驟)。在感染步驟之后，將未成熟胚在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在該共培養(yǎng)期后，涉及任選的“靜息”步驟。在該靜息步驟中，在存在至少一種已知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素但不添加用于植物轉(zhuǎn)化體的選擇試劑下，孵育所述胚(步驟3靜息步驟)。為清除農(nóng)桿菌和為所感染細胞的靜息期，將未成熟胚在具有抗生素但無選擇試劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。接下來，將所接種胚在含有選擇性試劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并將生長中的轉(zhuǎn)化愈傷組織恢復(fù)(步驟4選擇步驟)。將未成熟胚在具有選擇性試劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化細胞的選擇性生長。隨后使愈傷組織再生成植物(步驟5再生步驟)，將在選擇性培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以再生植物。實施例5轉(zhuǎn)化大豆胚如下用含有與PinII啟動子可操作連接的SEQIDNO1毒素核苷酸序列的質(zhì)粒轟擊大豆胚。為誘導(dǎo)體細胞胚，將從適當大豆栽培種的表面殺菌的未成熟種子所切割的長3-5mm的子葉在光照或黑暗中于26°C在適當?shù)沫傊囵B(yǎng)基培養(yǎng)6_10周。隨后切下產(chǎn)生次級胚的體細胞胚，并將其置入合適的液體培養(yǎng)基中。在重復(fù)選擇如早期、球形期胚倍增的體細胞胚細胞團后，如下維持所述懸浮液。將大豆胚發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物在150rpm旋轉(zhuǎn)振搖器上的35mL液體培養(yǎng)基中于26°C維持，所述維持在16:8小時的晝/夜時間表的熒光下進行。通過將約35mg的組織接種至35mL液體培養(yǎng)基，每兩周傳代培養(yǎng)培養(yǎng)物。隨后通過粒子槍轟擊方法(Kleinetal.(1987)Nature(London)327:70_73，美國專利第4，945，050號)，轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物。可以將杜邦基因槍PDS1000/HE設(shè)備(氦加裝)用于這些轉(zhuǎn)化。可以用于促進大豆轉(zhuǎn)化的可選擇標志物基因是由如下所構(gòu)成的轉(zhuǎn)基因花椰菜花葉病毒35S啟動子(Odelletal.(1985)Nature313:810_812)、質(zhì)粒pJR225(來自大腸桿M；Gritzetal.(1983)Gene25179-188)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA的胭脂堿合酶基因3’區(qū)?？梢詫cpinll啟動子可操作連接的毒素核苷酸序列(例如，SEQIDNO1)的表達盒作為限制性片段分離。隨后可以將該片段插入攜帶標志物基因的載體的獨特限制性位點。向50μL的60mg/mL1μm金粒懸浮液(依次)加入5μLDNA(1μg/μL)，20μL亞精胺(0.1Μ)和50μLCaCl2(2.5Μ)。隨后將該粒制備物振搖3分鐘，在微型離心機中旋轉(zhuǎn)10秒，將上清液移除。隨后用400yL70%乙醇將DNA包被的粒子清洗一次，并將其在40μL的無水乙醇中重懸?？梢詫NA/粒懸浮液超聲破碎3次，每次1秒。隨后將5微升DNA包被的金粒上樣至每一大載體盤。將約300-400mg的兩周齡懸浮液培養(yǎng)物置于空的60X15mm陪替氏培養(yǎng)皿，并用移液器將殘留液體從組織中移除。對每一轉(zhuǎn)化實驗，通常轟擊約5-10個板的組織。將膜破壞壓力設(shè)在llOOpsi，將該室抽真空至28英寸水銀真空。在離阻滯篩約3.5英寸遠處放置組織，將其轟擊三次。在轟擊后，將組織切成兩半，并將其放回液體，并如上所述進行培養(yǎng)。在轟擊后5-7天，可以用新鮮培養(yǎng)基更換液體培養(yǎng)基，在轟擊后11-12天，可以用含有50mg/mL潮霉素的新鮮培養(yǎng)基來更換?？梢悦恐芨略撨x擇性培養(yǎng)基。轟擊后7_8周，可以觀察自未轉(zhuǎn)化的壞死胚性細胞團生長的綠色轉(zhuǎn)化組織?？梢砸瞥蛛x的綠色組織，并將其接種至單個燒瓶，以生成新的、克隆增殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物?？梢詫⒚恳恍孪底鳛楠毩⒌霓D(zhuǎn)化事件來處理。隨后可以傳代培養(yǎng)這些懸浮液，并將其作為未成熟胚的細胞團來維持，或者通過個體體細胞胚的成熟和萌發(fā)，將其再生成整體植物。本申請文件提及的所有出版物、專利和專利申請表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。通過引用將所有出版物、專利和專利申請并入本文，以達到如同每一單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埍痪唧w且單獨地指明為通過引用而并入的程度。雖然為清楚理解的目的，已經(jīng)通過說明和實例在一定細節(jié)上描述了上文的發(fā)明，但是很明顯可以在實施方式的范圍內(nèi)實踐某些變化和修飾。權(quán)利要求分離的核酸分子，選自a)包含SEQIDNO1核苷酸序列的核酸分子或其全長互補體；b)與SEQIDNO1核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核酸分子或其互補體；c)編碼包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽的核酸分子；和d)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQIDNO2氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列是設(shè)計為在植物中表達的合成序列。3.DNA構(gòu)建體，包含如權(quán)利要求1所述的核酸分子。4.如權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體，還包含編碼異源多肽的核酸分子。5.宿主細胞，包含如權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體。6.如權(quán)利要求5所述的宿主細胞，所述細胞是細菌細胞。7.如權(quán)利要求5所述的宿主細胞，所述細胞是植物細胞。8.轉(zhuǎn)基因植物，包含如權(quán)利要求7所述的宿主細胞。9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、高粱、小麥、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜。10.如權(quán)利要求9所述的植物的轉(zhuǎn)化的種子，其中所述種子包含所述DNA構(gòu)建體。11.具有殺蟲活性的分離的多肽，選自a)包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽；b)包含與SEQIDNO2具有至少80%序列一致性的氨基酸序列的多肽；c)由SEQIDNO1核苷酸序列編碼的多肽；和d)由與SEQIDNO:1核苷酸序列至少80%—致的核苷酸序列編碼的多肽。12.如權(quán)利要求11所述的多肽，還包含異源氨基酸序列。13.組合物，包含如權(quán)利要求11所述的多肽。14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述組合物選自粉末、粉劑、小球、顆粒、噴霧劑、乳劑、膠體和溶液。15.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中通過干燥、凍干、勻漿、萃取、過濾、離心、沉降或濃縮蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)細胞培養(yǎng)物來制備所述組合物。16.如權(quán)利要求13所述的組合物，包括以重量計約至約99%的所述多肽。17.控制鞘翅目害蟲群體的方法，包括使所述群體與殺蟲有效量的如權(quán)利要求11所述的多肽接觸。18.殺死鞘翅目害蟲的方法，包括使所述害蟲與殺蟲有效量的如權(quán)利要求11所述的多肽接觸，或向所述害蟲喂食殺蟲有效量的如權(quán)利要求11所述的多肽。19.產(chǎn)生具有殺蟲活性的多肽的方法，包括將如權(quán)利要求4所述的宿主細胞在表達編碼所述多肽的核酸分子的條件下培養(yǎng)，所述多肽選自a)包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽；b)包含與SEQIDNO2具有至少80%序列一致性的氨基酸序列的多肽；c)由SEQIDNO1核苷酸序列編碼的多肽；和d)由與SEQIDNO1核苷酸序列至少80%—致的核苷酸序列編碼的多肽。20.植物，所述植物使DNA構(gòu)建體穩(wěn)定整合至其基因組，所述DNA構(gòu)建體包含編碼具有殺蟲活性的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自a)包含SEQIDNO1核苷酸序列的核酸分子或其全長互補體；b)與SEQIDNO1核苷酸序列具有至少80%序列一致性的核酸分子或其互補體；c)編碼包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽的核酸分子；和d)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQIDNO:2氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；其中所述核苷酸序列與驅(qū)動編碼序列在植物細胞中表達的啟動子可操作連接。21.如權(quán)利要求20所述的植物，其中所述植物是植物細胞。22.保護植物免于害蟲的方法，包括將至少一種包含編碼殺蟲多肽的核苷酸序列的表達載體引入所述植物或其細胞，其中所述核苷酸序列選自a)包含SEQIDNO1核苷酸序列的核酸分子或其全長互補體；b)與SEQIDNO1核苷酸序列具有至少80%序列一致性的核酸分子或其互補體；c)編碼包含SEQIDNO2氨基酸序列的多肽的核酸分子；和d)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQIDNO:2氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述植物產(chǎn)生具有針對鞘翅目害蟲的殺蟲活性的殺蟲多肽。全文摘要本發(fā)明提供獲自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)菌株的核酸，及其變體和其片段，其編碼具有針對包括鞘翅目的蟲害的殺蟲活性多肽。本發(fā)明的特定實施方式提供編碼殺蟲蛋白的分離的核酸、殺蟲組合物、DNA構(gòu)建體，和包含實施方式的核酸的轉(zhuǎn)化的微生物和植物。所述組合物用于控制害蟲尤其是植物害蟲的方法。文檔編號C07K14/325GK101959419SQ200880127784公開日2011年1月26日申請日期2008年12月22日優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日發(fā)明者休·B·羅,安德烈·R·阿貝德,施曉梅,董華申請人:先鋒國際良種公司