專利名稱：抗汞螯合物單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重金屬免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抗汞螯合物單克隆抗 體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
重金屬污染給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來嚴(yán)重的危害，特別是汞，因其復(fù)雜 性和毒性，引起了廣泛關(guān)注，汞及其化合物所造成的污染問題日益嚴(yán)重，并通 過多種途徑對(duì)人體呼吸系統(tǒng)、皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟和眼睛等造成嚴(yán)重傷
害。早在20世紀(jì)50年代日本熊本水俁病爆發(fā)之后，汞的污染問題就引起了人 們的關(guān)注。近年來，隨著城市化進(jìn)程的不斷加快和工業(yè)化水平的迅速提升，由 于生產(chǎn)、生活所致的示及其化合物污染日趨嚴(yán)重并再度成為全球熱點(diǎn)問題之 一。因此，有關(guān)汞的排放、遷移、沉降以及控制研究已成為環(huán)境污染防治的新 興領(lǐng)域之一。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織已1963年規(guī)定了食品中汞的最 大允許濃度為0.05mg/Kg(鮮重)，美國為0.5mg/Kg，我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的 極限值為0.02mg/Kg。
傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)方法多采用化學(xué)儀器檢測(cè)，例如原子吸收光譜分析 (atomic absorption spectroscopy, AAS)、電感誄禺合等離子發(fā)射光^普(inductively coupledplasma atomic emission spectroscopy , ICP-AES)等，這些方法需要對(duì)大 量的樣品進(jìn)行預(yù)處理，并且檢測(cè)過程必須在集中大型分析儀器的室內(nèi)進(jìn)行，無 法用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有費(fèi)用高、處理量有限、檢測(cè)時(shí)間長等缺陷。
因此，需要發(fā)明一種新的抗汞螯合物單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用以解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的之一在于基于現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種滴度高、特異 性強(qiáng)的抗汞螯合物單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備滴度高、特異性強(qiáng)的抗汞螯合物單 克隆抗體的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)速度快、費(fèi)用低廉、靈敏度高和選擇 性強(qiáng)的檢測(cè)汞離子濃度的檢測(cè)方法。
本發(fā)明提供一種單克隆抗體，所述單克隆抗體對(duì)汞螯合物具有特異性，所
述的汞螯合物為汞-l- (4-異硫氨酸芐基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物 和汞-乙二胺四乙酸。
作為本發(fā)明單克隆抗體的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的單克隆抗體與汞-l- (4-
異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的反應(yīng)的OD450值為
2.4651-2.4691,與1- (4-異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白反應(yīng)的 OD4so值為0.056-0.0057,與BSA反應(yīng)的00450值為0-0.005;對(duì)汞-乙二胺四乙 酸的交叉反應(yīng)性為100%,對(duì)鉛-乙二胺四乙酸、鋅-乙二胺四乙酸、鎘-乙二胺 四乙酸、鎂-乙二胺四乙酸、銅-乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸的交叉反應(yīng)性均 <10%。
本發(fā)明的單克隆抗體滴度高、特異性強(qiáng)，能特異性識(shí)別汞-l-(4-異硫氨酸 節(jié)基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和汞-乙二胺四乙酸。
本發(fā)明還提供一種制備抗汞螯合物單克隆抗體的方法，所述方法包括下述
6步驟
(1) 制備免疫抗原汞-l- (4-異硫氨酸卡基)-乙二胺四乙酸-鑰孔戚血藍(lán)素 和包被抗原汞-l- (4-異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白；
(2) 將步驟(1)制備的免疫抗原免疫小鼠；
(3 )將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合并培養(yǎng)； (4)采用竟?fàn)幰种品ê桶黕C抗原篩選陽性克隆的雜交瘤細(xì)胞； (5 )鑒定上述步驟得到的雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體。 由于汞離子毒性較強(qiáng)而不能直接用作免疫原，所以制備抗汞離子的單克隆 抗體難以制備。本發(fā)明制備抗汞螯合物單克隆抗體的方法利用特異性的雙功能 螯合劑螯合汞離子，成為能被動(dòng)物免疫系統(tǒng)識(shí)別的汞-螯合劑復(fù)合物，再將之 與載體蛋白偶聯(lián)，形成完整的免疫抗原。將免疫抗原用于制備單克隆抗體，得 到滴度高、特異性強(qiáng)的抗汞螯合物單克隆抗體。
作為本發(fā)明制備抗汞螯合物單克隆抗體的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟 (1)包括下述步驟
A、 將牛血清白蛋白、鑰孔戚血藍(lán)素分別溶于pH9.5的磷酸鹽緩沖液，濃 度為4 ~ 6mg/mL;
B、 將10mg螯合劑溶于0.1mol/L， pH9.5的磷酸鈉緩沖溶液，濃度為 18-22mg/mL,所述螯合劑為1- (4-異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸；
C、 按照1: 1的摩爾比，將螯合劑和Hg、容液混合，用氨水調(diào)節(jié)pH至 7.0-8.0,在20-30。C下攪拌反應(yīng)12-36小時(shí)，合成半抗原；
D、 取步驟C得到的2-4mg半抗原分別與等質(zhì)量的步驟A得到的牛血清白 蛋白和鑰孔戚血藍(lán)素混合，分別用氨水調(diào)pH至8.5-9.5,在20-30。C下攪拌反 應(yīng)12-36小時(shí)，分別合成包被抗原汞-l- (4-異硫氨酸芐基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白和免疫抗原汞-l- (4-異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-鑰孔戚血藍(lán)素。 抗原的制備中，控制各種溶液的濃度配比是關(guān)鍵，合適的方法可以達(dá)到提 高偶聯(lián)率的作用。
作為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式，制備抗汞螯合物單克隆抗體的方法所述步驟 (3)中，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以5~12: l混合，l分鐘內(nèi)加入 50%聚乙二醇融合，然后在120秒之內(nèi)緩慢加入培養(yǎng)液，靜置10分鐘，離心， 采用常規(guī)方法培養(yǎng)。作為本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方式，所述免疫小鼠的脾細(xì) 胞與骨髓瘤細(xì)胞以12: 1混合。
在本發(fā)明抗汞螯合物單克隆抗體的制備方法中，細(xì)胞融合的操作也是一個(gè) 關(guān)4走點(diǎn)。發(fā)明人還意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以12: 1 混合時(shí)，其融合率有大的提高。
本發(fā)明還提供了 一種檢測(cè)汞離子濃度的方法，其包括如下步驟 (1 )以抗汞螯合物單克隆抗體與抗原反應(yīng)后在450nm的OD值為縱坐標(biāo)
Y，以汞離子的濃度為橫坐標(biāo)X,建立檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=-0.0118x
+ 0.7981，線性相關(guān)系數(shù)R^0.9941;
(2 )將待測(cè)樣品螯合螯合劑，所述螯合劑為l-(4-異硫氨酸芐基)-乙二胺
四乙酸；
(3) 將抗汞螯合物單克隆抗體與檢測(cè)樣品反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液在450nm的 OD值；
(4) 將步驟(3)得到的OD值代入步驟(1)的方程式中，得到檢測(cè)樣 品的汞離子濃度。
汞離子能與蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的不可逆反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，因此，利用單克隆抗體無法直接識(shí)別并檢測(cè)樣品中的汞離子。本發(fā)明先利用螯合劑將汞離 子螯合，形成能被特異性單克隆抗體識(shí)別的汞螯合物，建立汞離子螯合物免疫 學(xué)檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)速度快、費(fèi)用低廉、靈敏度高并且選擇性強(qiáng)。本發(fā)明 檢測(cè)汞離子濃度的方法不僅能為食品安全檢測(cè)，還能為我國農(nóng)產(chǎn)品等的出入境 檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)提供有效的技術(shù)手段和檢測(cè)方法。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中牛血清白蛋白、半抗原Hg-ITCBE及偶聯(lián)物的紫 外掃描圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中鑰孔戚血藍(lán)索、半抗原Hg-ITCBE及偶聯(lián)物的紫 外掃描圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中利用Hg-ITCBE-BSA、 ITCBE-BSA包被的一次 陽性克隆的篩選結(jié)果；
圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中陽性細(xì)胞林3C9G12的竟?fàn)幰种平Y(jié)合曲線；
具體實(shí)施例方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一 步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。 Hg"標(biāo)準(zhǔn)溶液[Hg(NOs)2]，購于中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；l-(4-異硫 氰酸千基)乙二胺四乙酸[l-(4畫isothiocyatiobetmyl)-elhylenediamine-N， N， N，， N，-tetraacetic acid , ITCBE]，購于上海同仁化學(xué)研究所；羥乙基派溱乙磺酸 (hydroxyethylpi perazine ethanesufonic acid, Hepes),牛血5青白蛋白(bovine serum abumin, BSA),鑰孑L戚血藍(lán)素(keyhole limpet hemocyanin, KLH)均為Sigma產(chǎn)
口P o實(shí)施例1
(1) 將BSA (牛血清白蛋白)、KLH (鑰孔戚血藍(lán)素)分別溶于pH9.5的PBS (磷酸鹽緩沖液)，濃度均為4mg/mL;
(2) 將10mg螯合劑ITCBE溶于0.1mol/L， pH9.5的磷酸納緩沖溶液，濃度 為 18mg/mLj
(3) 半抗原Hg-ITCBE的合成將lOOOjaL lmg/mLHg"標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至 2000nL 4.6mM螯合劑溶液中，用氨水調(diào)節(jié)pH至7.0,在20°C下，攪拌反應(yīng) 12h;
(4) 免疫原Hg-ITCBE-KLH的合成取2mg半抗原，再加入2mgKLH，并 用氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，在20。C攪拌反應(yīng)12h。
(5) 包被抗原Hg-ITCBE-BSA的合成取2mg半抗原，再加入2mg BSA， 并用氨水調(diào)節(jié)pH至8.5,在20。C攪拌反應(yīng)12h。
(6) 免疫原及抗原的純化偶聯(lián)反應(yīng)后，在4。C下使用centeicon-30超濾離 心管離心除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。Centeicon-30超濾離心管在使用前，用 100mmol/LEDTA和pH7.4的HEPES各清洗3次。順式離心6次，離心力4500g, 每次離心IOmin，每次添加0. ImolI/LpH 9.0HEPES的體積依次為2mL:反轉(zhuǎn)離 心3次，離心力為800g，每次離心2min，每次添加0.1 mol/L， pH 7.4HEPES 的體積依次為200pL。
(7) 免疫原及抗原的鑒定將純化后的免疫原及抗原稀釋100倍，用BCA 法測(cè)濃度。對(duì)于BSA及其相應(yīng)的抗原，用0.1 mol/L， pH 7.4HEPES稀釋 lmg/mL，對(duì)于KLH及其相應(yīng)的抗原，用0.1 mol/L， pH 7.4HEPES稀釋 0.5mg/mL,將合成后的半抗原稀釋20倍，在220-310nm的波長下分別對(duì)Hg-ITCBE、載體蛋白以及偶聯(lián)物進(jìn)行掃描，以定性證明抗原合成是否成功用 0.1 mol/L、 pH8.5 NaHC03溶液將偶聯(lián)物稀釋80倍，用三硝基苯磺酸法(TS)檢 測(cè)偶聯(lián)物和載體蛋白中氨基含量，通過對(duì)比，以制定Hg-ITCBE(ITCBE)與載體 蛋白的偶聯(lián)比用0.1mol/L, pH 7.4 HEPES將偶聯(lián)物稀釋200倍，用石墨爐 原子分光吸收法檢測(cè)偶聯(lián)物中Hg"的含量。
(8)動(dòng)物免疫選擇6-8周齡，30g左右的BALB/c小鼠8只，首免用0.9% 氯化鈾注射液稀釋Hg-ITCBE-KLH至lmg/mL,與等體積的完全福氏佐劑混勻， 50嗎Hg-ITCBE-KLH /鼠。3周后，用Hg-ITCBE-KLH加等體積的不完全福氏 佐劑混勻，50昭Hg-ITCBE-KLH /鼠。再過3周，用0.9%氯化鈾注射液等體積 混勻，50昭Hg-ITCBE-KLH/鼠。第四次，用0.9%氯化鈾注射液等體積混勻， 50)ig Hg-ITCBE-KLH /鼠。
單抗制備過程無菌取BALB / c鼠脾細(xì)胞與SP20骨髓瘤細(xì)胞，以5: 1 混合，1分鐘內(nèi)加入50%PEG融合，90秒內(nèi)加入30 ml 1640培養(yǎng)液靜置10 分鐘，離心，離心沉淀物加入含HAT和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的1640培養(yǎng)液，96 孔培養(yǎng)，Hg-ITCBE-BSA、 ITCBE-BSA包被酶標(biāo)板，初步篩選陽性克隆，然后 利用各種金屬螯合物對(duì)陽性克隆孔進(jìn)一步篩選，移植降植烷處理的BAB/c鼠制 備抗體、鑒定。
采用二步篩選法對(duì)細(xì)胞融合和陽性克隆的篩選，包被Hg-ICBE-BSA、 ITCBE-BSA、 BSA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)，篩選出對(duì)Hg-ITCBE-BSA呈 強(qiáng)陽性反應(yīng)，對(duì)ITCBE-BSA、 BSA呈陰性反應(yīng)的陽性孔然后用EDTA、 Hg-EDTA、 Pb-EDTA、 Zn-EDTA、 Mn-EDTA、 Fe-EDTA、 Cd-EDTA等金屬螯 合物竟?fàn)幰种艸g-ITCBE-BSA與陽性孔上清液所含抗體的結(jié)合反應(yīng)，對(duì)陽性孔
進(jìn)一步鑒定，篩選出Hg-EDTA能造成強(qiáng)烈抑制作用，EDTA、 Pb-EDTA、
iiZn-EDTA等金屬擎合物無抑制作用的陽性孔，及時(shí)轉(zhuǎn)種并進(jìn)行克隆化， (9)腹水的制備與純化
取8周的BALB/c小鼠，用液體石蠟腹腔注射0.5ml/只，7天后腹腔接種用 無血清培養(yǎng)基稀釋的處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為1 xl(f個(gè)，間隔4天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變 差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為汞螯合 物單克隆抗體，ELISA測(cè)定效價(jià)為1: 20000，分裝，-70匸凍存?zhèn)溆?。用硫?銨沉淀法加蛋白質(zhì)M親和層析柱純化。
實(shí)施例2
(1) 將BSA、 KLH分別溶于pH 9.5的PBS,濃度均為5mg/mL。
(2) 將10mg螯合劑ITCBE溶于0.1 mol/L, pH9.5的磷酸納緩沖溶液，濃 度為20mg/mL。
(3) 半抗原Hg-ITCBE的合成將1000|iL lmg/LHg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至 2000pL 4.6mM螯合劑溶液中，用氨水調(diào)節(jié)pH至7.5,在25°C下，攪拌反應(yīng) 24h。
(4) 免疫原Hg-ITCBE-KLH的合成取3mg半抗原，再加入3mgKLH,并 用氛水調(diào)節(jié)pH至9.0，在25。C攪拌反應(yīng)24h。
(5) 包被抗原Hg-ITCBE-BSA的合成取3mg半抗原，再加入3mg BSA， 并用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0,在25。C攪拌反應(yīng)24h。
(6) 免疫原及抗原的純化偶聯(lián)反應(yīng)后，在4。C下使用Centeicon-30超濾離 心管離心除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。Centeicon-30超濾離心管在^f吏用前，用 100mmol/L。 EDTA和pH7.4的HEPES各清洗3次。順式離心6次，離心力
124500g,每次離心10min，每次添加0.1 mol， pH 9.0HPES的體積依次為2m; 反轉(zhuǎn)離心3次，離心力為800g,每次離心2min,每次添加0.1 mol/L, pH 7.4HEPES的體積依次為200)LiL。
(7) 免疫原及抗原的鑒定將純化后的免疫原及抗原稀釋100倍，用BCA 法測(cè)濃度。對(duì)于BSA及其相應(yīng)的抗原，用0.1 mol/L, pH 7.4HEPES稀釋 lmg/mL，對(duì)于KLH及其相應(yīng)的抗原，用0.1 mol/L， pH 7.4HEPES稀釋 0.5mg/mL,將合成后的半抗原稀釋20倍，在220-310nm的波長下分別對(duì) Hg-ITCBE、載體蛋白以及偶聯(lián)物進(jìn)行掃描，以定性證明抗原合成是否成功用 0.1mol/L、 pH8.5NaHC03溶液將偶聯(lián)物稀釋80倍，用三硝基苯磺酸法(TS)檢 測(cè)偶聯(lián)物和載體蛋白中氨基含量，通過對(duì)比，以制定Hg-ITCBE (ITCBE)與載 體蛋白的偶聯(lián)比用0.1 mol/L, pH 7.4HEPES將偶聯(lián)物稀釋200倍，用石墨 爐原子分光吸收法檢測(cè)偶聯(lián)物中Hg"的含量，
(8) 動(dòng)物免疫選才奪6-8周齡，30g左右的BALB/c小鼠8只，首免用0.9% 氯化鈾注射液稀釋Hg-ITCBE-KLH至lmg/mL,與等體積的完全福氏佐劑混 勻，50叱Hg-ITCBE-KLH/鼠。3周后，用Hg-ITCBE-KLH加等體積的不完全 福氏佐劑混勻，50)igHg-ITCBE-KLH/鼠。再過3周，用0.9%氯化鈾注射液等 體積混勻，50嗎Hg-ITCBE-KLH/鼠。第四次，用0.9%氯化鈾注射液等體積混 勻，50叱Hg-ITCBE-KLH /鼠。
單抗制備過程無菌取BALB / c鼠脾細(xì)胞與SP20骨髓瘤細(xì)胞，以10: 1 混合，1分鐘內(nèi)加入50%PEG融合，120秒內(nèi)加入30 ml 1640培養(yǎng)液靜置10分 鐘，離心，離心沉淀物加入含HAT和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的1640培養(yǎng)液，96 孔培養(yǎng)，Hg-ITCBE-BSA、 ITCBE-BSA包被酶標(biāo)板，初步篩選陽性克隆，然后 利用各種金屬螯合物對(duì)陽性克隆孔進(jìn)一步篩選，移植降植烷處理的BAB/c鼠制備抗體、鑒定。
采用二步篩選法對(duì)細(xì)胞融合和陽性克隆的篩選，包被Hg-ICBE-BSA、 ITCBE-BSA、 BSA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)，篩選出對(duì)Hg-ITCBE-BSA呈 強(qiáng)陽性反應(yīng)，對(duì)ITCBE-BSA、 BSA呈陰性反應(yīng)的陽性孔然后用EDTA、 Hg-EDTA、 Pb-EDTA、 Zn-EDTA、 Mn-EDTA、 Fe-EDTA、 Cd-EDTA等金屬螯 合物竟?fàn)幰种艸g-ITCBE-BSA與陽性孔上清液所含抗體的結(jié)合反應(yīng)，對(duì)陽性孔 進(jìn)一步鑒定，篩選出Hg-EDTA能造成強(qiáng)烈抑制作用，EDTA、 Pb-EDTA、 Zn-EDTA等金屬擎合物無抑制作用的陽性孔，及時(shí)轉(zhuǎn)種并進(jìn)行克隆化，
(9)腹水的制備與純化
取8周的BALB/c小鼠，用液體石蠟腹腔注射0.5ml/只，7天后腹腔接種 用無血清培養(yǎng)基稀釋的處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為 2乂106個(gè)，間隔4天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精 神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為汞 螯合物單克隆抗體，ELISA測(cè)定效價(jià)為1: 20000，分裝，-70。C凍存?zhèn)溆谩?用石克酸銨沉淀法加蛋白質(zhì)M親和層析柱純化。
圖1為實(shí)施例中牛BSA、 Hg-ITCBE及Hg-ITCBE-BSA的紫外掃描圖。如 圖1所示，BSA的最大吸收波長為235nm和280nm, Hg-ITCBE的紫外吸收 在波長240n 280n范圍內(nèi)屬于高吸收值區(qū)域，與BSA相比，Hg-ITCBE-BSA 最大吸收波長和吸收值均發(fā)生變化，在波長240n-280n范圍內(nèi)的吸收值增大， 紫外吸收特征具有BSA和半抗原Hg-ITCBE的吸收特征，定性證明抗原 Hg-ITCBE-BSA合成成功。
圖2為實(shí)施例2中KLH、 Hg-ITCBE及Hg-ITCBE-KLH的紫外掃描圖。如 圖2所示，KLH的最大吸收波長為235nm和280nm， Hg-ITCBE的紫外吸收
14在波長240nm 280nm范圍內(nèi)屬于高吸收值區(qū)域，與KLH相比，Hg-ITCBE-KLH 在最大吸收波長280nm處的吸收值增大，在波長240nm-280nm范圍內(nèi)的吸收 值增大，紫外吸收特征具有KLH和半抗原Hg-ITCBE的吸收特征，定性證明抗 原Hg-ITCBE-KLH合成成功。
圖3為實(shí)施例2中利用Hg-ITCBE-BSA、 ITCBE-BSA包被的二次陽性克隆 的篩選結(jié)果。如圖3所示，陽性克隆孔中的抗體經(jīng)過間接ELISA檢測(cè)，能識(shí) 別抗原Hg-ITCBE-BSA，反應(yīng)的OD值高，呈現(xiàn)強(qiáng)陽性，幾乎無法識(shí)別 ITCBE-BSA，反應(yīng)的OD值很低，接近于0, 呈現(xiàn)陰性，經(jīng)過排除篩選法的鑒 定，證明二次陽性克隆孔中的抗體是汞螯合物特異性的。
圖4為為實(shí)施例2中陽性細(xì)胞抹3C9G12的竟?fàn)幰种平Y(jié)合曲線。如圖4 所示，不同的金屬螯合物或EDTA對(duì)細(xì)胞林3C9G12中的抗體識(shí)別抗原 Hg-ITCBE-BSA的抑制作用不同，只有Hg-EDTA能與Hg-ITCBE-BSA竟?fàn)幗Y(jié) 合3C9G12中的抗體，而EDTA、 Pb-EDTA、 Cd-EDTA、 Zn-EDTA對(duì) Hg-ITCBE-BSA識(shí)別3C9G12中的抗體無抑制作用或抑制作用很低，這進(jìn)一 步說明該孔中的抗體是汞螯合物特異性的。
實(shí)施例3
(1) 將BSA、 KLH分別溶于pH 9.5的PBS,濃度均為6mg/mL。
(2) 將10mg螯合劑ITCBE溶于0.1 mol/L, pH9.5的磷酸納緩沖溶液，濃 度為20mg/mL。
(3) 半抗原Hg-ITCBE的合成將1000pL lmg/LHg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至2000pL 4.6mM螯合劑溶液中，用氨水調(diào)節(jié)pH至7.5,在25。C下，攪拌反應(yīng)36h。
(4) 免疫原Hg-ITCBE-KLH的合成取3mg半抗原，再加入3mgKLH,并 用氛水調(diào)節(jié)pH至9.0,在25。C攪拌反應(yīng)36h。
15(5) 包被抗原Hg-ITCBE-BSA的合成取3mg半抗原，再加入3mg BSA, 并用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0,在25。C攪拌反應(yīng)36h。
(6) 免疫原及抗原的純化偶聯(lián)反應(yīng)后，在4°C下使用centeicon-30超濾離 心管離心除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。Centeicon-30超濾離心管在使用前，用 100mmol/L。 EDTA和pH7.4的HEPES各清洗3次。順式離心6次，離心力4500g， 每次離心lOmin,每次添加0.1 mol， pH 9.0HPES的體積依次為2m;反轉(zhuǎn)離心 3次，離心力為800g,每次離心2min，每次添加0.1 mol/L， pH 7.4HEPES的 體積依次為200jliL。
(7) 免疫原及抗原的鑒定將純化后的免疫原及抗原稀釋100倍，用BCA 法測(cè)濃度。對(duì)于BSA及其相應(yīng)的抗原，用0.1mol/L， pH7.4 HEPES稀釋lmg/mL, 對(duì)于KLH及其相應(yīng)的抗原，用0.1mol/L, pH 7.4HEPES稀釋0.5mg/mL,將合 成后的半抗原稀釋20倍，在220-310nm的波長下分別對(duì)Hg-ITCBE、載體蛋 白以及偶聯(lián)物進(jìn)行掃描，以定性證明抗原合成是否成功用0.1mol/L、 pH8.5 NaHC03溶液將偶聯(lián)物稀釋80倍，用三硝基苯磺酸法(TS)檢測(cè)偶聯(lián)物和載體蛋 白中氨基含量，通過對(duì)比，以制定Hg-ITCBE (ITCBE)與載體蛋白的偶聯(lián)比;用 0.1mol/L， pH7.4HEPES將偶聯(lián)物稀釋200倍，用石墨爐原子分光吸收法檢測(cè) 偶聯(lián)物中Hg"的含量。
(8) 動(dòng)物免疫選擇6-8周齡，30g左右的BALB/c小鼠8只，首免用0.9% 氯化鈾注射液稀釋Hg-ITCBE-KLH至lmg/mL，與等體積的完全福氏佐劑混 勻，50昭Hg-ITCBE-KLH/鼠。3周后，用Hg-ITCBE-KLH加等體積的不完全 福氏佐劑混勻，50昭Hg-ITCBE-KLH/鼠。再過3周，用0.9%氯化^1由注射液等 體積混勻，50昭Hg-ITCBE-KLH/鼠。第四次，用0.9Q/。氯化鈾注射液等體積混 勻，50昭Hg-ITCBE-KLH /鼠，單抗制備過程無菌取BALB/c鼠脾細(xì)胞與SP20骨髓瘤細(xì)胞，以12: 1 混合，1分鐘內(nèi)加入50%PEG融合，120秒內(nèi)加入30 m11640培養(yǎng)液靜置10 分鐘，離心，離心沉淀物加入含HAT和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的1640培養(yǎng)液，96 孔培養(yǎng)，Hg-ITCBE-BSA、 ITCBE-BSA包被酶標(biāo)板，初步篩選陽性克隆，然后 利用各種金屬黯合物對(duì)陽性克隆孔進(jìn)一步篩選，移植降植烷處理的BAB/c鼠制 備抗體、鑒定。在本發(fā)明抗汞螯合物單克隆抗體的制備方法中，細(xì)胞融合的操 作也是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。發(fā)明人還意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì) 胞以12: l混合時(shí)，其融合率^:高了約15%。
采用二步篩選法對(duì)細(xì)胞融合和陽性克隆的篩選，包被Hg-ICBE-BSA、 ITCBE-BSA、 BSA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)，篩選出對(duì)Hg-ITCBE-BSA呈 強(qiáng)陽性反應(yīng)，對(duì)ITCBE-BSA、 BSA呈陰性反應(yīng)的陽性孔然后用EDTA、 Hg-EDTA、 Pb-EDTA、 Zn-EDTA、 Mn-EDTA、 Fe-EDTA、 Cd-EDTA等金屬螯 合物竟?fàn)幰种艸g-ITCBE-BSA與陽性孔上清液所含抗體的結(jié)合反應(yīng)，對(duì)陽性孔 進(jìn)一步鑒定，篩選出Hg-EDTA能造成強(qiáng)烈抑制作用，EDTA、Pb-EDTA、Zn-EDTA 等金屬螯合物無抑制作用的陽性孔，及時(shí)轉(zhuǎn)種并進(jìn)行克隆化，
(9)腹水的制備與純化
取8周的BALB/c小鼠，用液體石蠟腹腔注射0.5ml/只，7天后腹腔接種用 無血清培養(yǎng)基稀釋的處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為5 乂106個(gè)，間隔4天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變 差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為汞螯合 物單克隆抗體，ELISA測(cè)定效價(jià)為1: 5000,分裝，-70"凍存?zhèn)溆谩Ｓ昧蛩?銨沉淀法加蛋白質(zhì)M親和層析柱純化。實(shí)施例4
偶聯(lián)物鑒定所得的偶聯(lián)物進(jìn)行紫外掃描分析見圖1，與載體蛋白KLH (BSA)相比，Hg-ITCBE-KLH、 Hg-ITCBE-BSA的紫外吸收光譜均攜帶了半抗原 Hg-EDTA的紫外吸收特征，證明偶聯(lián)成功。
實(shí)施例5
單抗針對(duì)汞整合物決定簇的鑒定部分強(qiáng)陽性孔上清1: 4稀釋，用 Hg-ITCBE-BSA 、 ITCBE-BSA分別包被酶標(biāo)板進(jìn)行ELISA檢測(cè)，其中 Hg-ITCBE-BSA偶聯(lián)物的OD45()值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過ITCBE-BSA的OD45Q值，并且 ITCBE-BSA、 BSA的OD45o非常低，幾乎為0。說明該克隆的產(chǎn)生的抗體是針 對(duì)汞螯合物決定簇的，特異性強(qiáng)。該克隆命名為3C9G12。
表l:用Hg-ITCBE-BSA、 ITCBE-BSA、 BSA對(duì)部分強(qiáng)陽性克隆分泌抗體 進(jìn)行ELISA篩選的結(jié)果
12 3456
3C9A4 3C9A1 3C9D6 3C9F13C9F103C9G1
45 697
Hg-ITCBE-B: 2.0303 0.4687 2.60572.45221.22932.4671
ITCBE-BSA 0.2466 0.0832 0.70080.34930.20580.0569
BSA0.005 0.005 0.0050.0050.0050.005
差值 1.7837 0.3855 1.90492.10291.02352.4102
實(shí)施例6
單克隆抗體特異性鑒定梯度稀釋Hg-EDTA、 Pb-EDTA、 Zn-EDTA、
18Cd畫EDTA、 Mn-EDTA、 Cu-EDTA、 EDTA;包被抗原Hg-ITCBE-BSA， lOO^L/ 孔，4。C吸附過夜洗板3次，加入100pLl。/oBSA封閉，37。C溫育lh，洗板 3次加入100pL金屬整合物〈或EDTA)稀釋液和100pL單克隆抗體稀釋液(l: 4000)， 37。C2h,洗板3次加入1: 2000稀釋的酶標(biāo)二抗〈羊抗鼠IgG-H), 370溫育45min,洗板3次，加底物反應(yīng)，30min后終止反應(yīng)，檢測(cè)OD45q。分 別作抑制曲線，根據(jù)擬合曲線計(jì)算半數(shù)抑制率，然后計(jì)算金屬螯合物的交叉反 應(yīng)率〈交叉反應(yīng)性=產(chǎn)生50%抑制時(shí)Hg-EDTA的濃度/產(chǎn)生50%抑制時(shí)的其它 金屬接合物的濃度)，見表2。
3C9G12細(xì)胞抹產(chǎn)生的抗體除了 Hg-EDTA夕卜，對(duì)幾種結(jié)構(gòu)相似的Pb-EDTA、 Zn-EDTA、 Cd-EDTA、島位-EDTA、 Cu-EDTA或螯合劑EDTA基本無交叉反應(yīng)
見圖4。
表2與各種金屬螯合物的交叉反應(yīng)性
金屬螯合物交叉反應(yīng)性(％)
Hg-EDTA100
Pb畫EDTA<0.1
Zn-EDTA<0.1
Cd-EDTA<0.1
Mn-EDTA<0.1
Cu-EDTA<0.1
EDTA<0.1
實(shí)施例7
檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用EDTA溶液將lmg/mL汞離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋
19100pg/L、 80|ug/L、 60pg/L、 40|ig/L、 20ng/L、 10pg/L、 5昭/L,搖勻，在常溫下反應(yīng)24h,制得Hg-EDTA螯合物標(biāo)準(zhǔn)熔液。包被抗原Hg-ITCBE-BSA(lmg/L),100pL/孔，4DC吸附過夜洗板3次，加入lOO^L 1%BSA封閉，37。C溫育lh，洗板3次加入lOO^L金屬螯合物(EDTA)稀釋液和IOO)liL單克隆抗體稀釋液(l:2000)， 37。C溫育2h，洗板3次；加入1: 2000稀釋的酶標(biāo)二抗〈羊抗鼠IgG-HRP),37。C溫育45m，洗板3次，加底物反應(yīng)，30min后終止反應(yīng)，檢測(cè)OD450。
以O(shè)D45。的OD值為縱坐標(biāo)(Y),汞離子的濃度〈嗎/L)為橫坐標(biāo)(X),建立檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y = -0.0118x +0.7981, R2 = 0.9941。
取湖水為樣品，離心，取上清液體，添加用100mM EDTA溶液稀釋100倍，添加汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，使Hg"濃度為20嗎/L，制備得待檢測(cè)樣品溶液，包被抗原Hg-ITCBE-BSA(lmg/mL), 100nL/孔，4。C吸附過夜洗板3次，加入lOOpL 1%BSA封閉，37。C溫育lh,洗板3次加入lOOpL金屬整合物(EDTA)稀釋液和lOOpiL單克隆抗體稀釋液(l: 2000), 37。C溫育2h,洗板3次加入1: 2000稀釋的酶標(biāo)二抗〈羊抗鼠IgG-HRP), 37。C溫育45mn,洗^反3次，加底物反應(yīng)，30min后終止反應(yīng)，檢測(cè)OD45()為0.4567， 1-0.4567=0.5433,將0.5433代入線性方程Y=-0.0118X+0.7981 ，得到廢水中汞離子的濃度為21.59士1.35嗎/L，回收率達(dá)到108.0±6.75%,準(zhǔn)確度高，可以用于實(shí)際樣品檢測(cè)。
利用國標(biāo)GB/5009.15-2003石墨爐原子分光吸收法^r測(cè)，；險(xiǎn)測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，但檢測(cè)時(shí)間較長，需要48小時(shí)，并且需要消耗大量的樣品，而本發(fā)明中所述的方法檢測(cè)時(shí)間較短，在包被ELISA板已經(jīng)完成的條件下，只需4 6小時(shí)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，并且成本比石墨爐原子分光吸收法要低，所用儀器簡單，無需大型設(shè)備。
本發(fā)明為建立快速檢測(cè)環(huán)境及農(nóng)畜產(chǎn)品體內(nèi)殘留Hg^提供了關(guān)鍵技術(shù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果
1、 利用本發(fā)明中的抗體和檢測(cè)技術(shù)對(duì)農(nóng)畜產(chǎn)品中的汞殘留進(jìn)行檢測(cè)，只需4~6個(gè)小時(shí)即可得出檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)速度快，由于抗體的效價(jià)高，稀釋10000倍以上仍可用于實(shí)際4企測(cè)，4企測(cè)成本低
2、 利用本發(fā)明中的抗體和檢測(cè)技術(shù)對(duì)農(nóng)畜產(chǎn)品中的汞殘留進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與國標(biāo)方法比較，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，很少受其他金屬離子的干擾，假陽性低，檢測(cè)下限可低至0.4路/L,靈敏度高，選擇性強(qiáng)
3、 利用本發(fā)明中的抗體和檢測(cè)技術(shù)對(duì)農(nóng)畜產(chǎn)品中的汞殘留進(jìn)行4全測(cè)，只需一臺(tái)酶標(biāo)儀即可檢測(cè)，簡單易攜，并可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1. 一種單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體對(duì)汞螯合物具有特異性，所述的汞螯合物為汞-1-(4-異硫氨酸芐基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和汞-乙二胺四乙酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體與汞_1_ (4-異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的反應(yīng)的OD45o值為2.4651-2.4691,與1- (4-異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白反應(yīng) 的OD45o值為0.056-0.0057,與牛血清白蛋白反應(yīng)的OD柳值為0-0.005;對(duì)汞-乙二胺四乙酸的交叉反應(yīng)性為100%,對(duì)鉛-乙二胺四乙酸、鋅-乙二胺四乙酸、 鎘-乙二胺四乙酸、4美-乙二胺四乙酸、銅-乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸的交叉 反應(yīng)性均<10%。
3. 一種制備抗汞螯合物單克隆抗體的方法，其特征在于，所述方法包括 下述步驟(1) 制備免疫抗原汞-l- ( 4-異硫氨酸芐基)-乙二胺四乙酸-鑰孔威血藍(lán)素 和包被抗原汞-l- (4-異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白；(2) 將步驟(1)制備的免疫抗原免疫小鼠；(3) 將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合并培養(yǎng)；(4) 采用竟?fàn)幰种品ê桶?:抗原篩選陽性克隆的雜交瘤細(xì)胞； (5 )鑒定上述步驟得到的雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體。
4、 如權(quán)利要求3所述抗汞螯合物單克隆抗體的制備方法，其特征在于， 所述步驟(1)包括下述步驟A、 將牛血清白蛋白、鑰孔戚血藍(lán)素分別溶于pH9.5的磷酸鹽緩沖液，濃 度為4 ~ 6mg/mL;B、 將10mg螯合劑溶于0.1mol/L, pH9.5的磷酸鈉緩沖溶液，濃度為 18-22mg/mL，所述螯合劑為1- (4-異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸；C、 按照1: 1的摩爾比，將螯合劑和Hg"溶液混合，用氨水調(diào)節(jié)pH至 7.0-8.0，在20-30。C下攪拌反應(yīng)12-36小時(shí)，合成半抗原；D、 取步驟C得到的2-4mg半抗原分別與等質(zhì)量的步驟A得到的牛血清白 蛋白和鑰孔戚血藍(lán)素混合，分別用氨水調(diào)pH至8.5-9.5,在20-30。C下攪拌反 應(yīng)12-36小時(shí)，分別合成包被原汞-l- (4-異硫氨酸芐基)-乙二胺四乙酸-牛血 清白蛋白和免疫抗原汞-l- (4-異硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-鑰孔戚血藍(lán)素。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述抗汞螯合物單克隆抗體的制備方法，其特征 在于，所述步驟(3)中，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以5~12: l混合， 1分鐘內(nèi)加入50%聚乙二醇融合，然后在120秒之內(nèi)緩慢加入培養(yǎng)液，靜置10 分鐘，離心，采用常規(guī)方法培養(yǎng)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述抗汞螯合物單克隆抗體的制備方法，其特征在于， 所述免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以12: 1混合。
7、 一種檢測(cè)汞離子濃度的方法，其特征在于，其包括如下步驟(1) 以抗汞螯合物單克隆抗體與抗原反應(yīng)后在450nm的OD值為縱坐標(biāo) Y，以汞離子的濃度為橫坐標(biāo)X，建立檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=-0.0118x + 0.7981,線性相關(guān)系數(shù)112=0.9941;(2) 將待測(cè)樣品螯合螯合劑，所述螯合劑為l-(4-異硫氨酸芐基)-乙二胺 四乙酸；(3) 將抗汞螯合物單克隆抗體與^r測(cè)樣品反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液在450nm的 OD值；(4) 將步驟(3)得到的OD值代入步驟(1)的方程式中，得到檢測(cè)樣 品的汞離子濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗汞螯合物單克隆抗體。所述單克隆抗體對(duì)汞螯合物具有特異性，所述的汞螯合物為汞-1-(4-異硫氨酸芐基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和汞-乙二胺四乙酸。本發(fā)明的單克隆抗體滴度高、特異性強(qiáng)。本發(fā)明還提供一種抗汞螯合物單克隆抗體的制備方法與應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/44GK101486767SQ20091003747
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日
發(fā)明者李志勇, 王小寧, 王菊芳, 黃佳俊 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)