專利名稱：Rna合成－用于反向合成rna的亞磷酰胺，以及在3’-末端合成rna的配體、發(fā)色團(tuán)和修飾物 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新RNA單體亞磷酰胺的合成，以及相應(yīng)的適用于RNA寡核苷酸在 5’一 3’反向上合成的新方法的固體載體。本方法導(dǎo)致非常清潔的寡核苷酸的合成，并使得能在3’ -末端清潔地且有效地引入不同的修飾，從而產(chǎn)生高純度治療級的RNA寡核苷酸。
背景技術(shù)：
確定序列的RNA在3’ 一 5’方向上的合成現(xiàn)在是成熟的，并當(dāng)前用于多種治療級 RNA適體、tRNA、siRNA和生物上有活性的RNA的合成和開發(fā)中。本方法使用具有合適的 N-保護(hù)基的核苷一般是5’ -保護(hù)基，最常見的是二甲氧基三苯基，即DMT基團(tuán)；2’ -保護(hù)基，其中最常見的是叔丁基二甲基甲硅烷基醚；以及，3’ -亞磷酰胺，其中最常見的是氰乙基二異丙基(組分1)。隨后將該組分與帶有適當(dāng)?shù)腘-保護(hù)基的核苷，結(jié)合到固體載體上的核苷的2’或3’琥珀酸酯偶聯(lián)(組分2)。在活化劑的存在下，在溶液相中也實(shí)現(xiàn)了組分 1和5’-OH-正-保護(hù)的-2’，3’ -保護(hù)的-核苷(組分3)的偶聯(lián)，所述活化劑導(dǎo)致二聚和寡聚核苷酸的形成，隨后氧化(3’ 一 5’方向的合成)，也導(dǎo)致了具有3’ -5’ -核苷酸間連接體的保護(hù)二聚核苷的形成，Ogilvie, K. K.，Can. J. Chem.，58，2686，1980 (方案 1)。然而，據(jù)我們所知，尚未實(shí)現(xiàn)在反向(5’ -3’方向)上的RNA合成。已經(jīng)廣泛地開發(fā)了組分1的2’ -甲硅烷基醚，并且發(fā)現(xiàn)其具有不同尋常的穩(wěn)定性。廣泛地研究了甲硅烷基醚的溶劑分解作用，并已知大(bulky)的烷基甲硅烷基醚具有高度的穩(wěn)定性；Bazani, B 禾口 Chvalowski, V Chemistry of Organosilicon compounds, 第1卷，Academic Press, New York, 1965。隨后，Ogilvie及其同事關(guān)于將2，-羥基保護(hù)基用于寡核苷酸的合成完成了大量的研究工作(Ogilvie，K. K.，Sadana, K. L，Thompson, Ε. Α. ， Quilliam, Μ. Α. ， and Westmore, J. B TetrahedronLe Letters,15，2861-2864,1974 ； Ogilvie, K. K. , Beaucage, S. L, Entwistle, D. W. , Thompson, Ε. Α. , Quilliam, Μ. Α. , and Westmore, J. B. J. Carbohydrate Nucleosides Nucleotides,3,197-227,1976 ；Ogilvie, K. K. Proceedings of the 5th International Round Table on Nucleosides,Nucleotides and Their Biological Applications,Rideout,J. L. , Henry,D. W.,禾口 Beacham L. Μ. ,Ill, eds.，Academic, London，第 209—256 頁，1983)。這些研究隨后導(dǎo)致對于溶液相和固相的寡核苷酸合成都適用的方法，以及對具有tRNA的尺寸和性質(zhì)的RNA分子的首次化學(xué)合成的持續(xù)發(fā)展(Usman，N.，Ogilvie, K. K.， Jiang, Μ. -Y. ，and Cedergren, R. J. J. Am. Chem. Soc. 109,7845-7854,1987 ；Ogilvie, K. K.， Usman, N. , Nicoghosian, K,and Cedergren,R. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 5764-5768, 1988 ；Bratty, J. , Wu, Τ. , Nicoghosian, K. , Ogilvie, K. K. , Perrault, J. -P. , Keith,G. and Cedergren，R.，F(xiàn)EBS Lett. 269,60-64,1990) 在隨后的優(yōu)秀出版物中對本文獻(xiàn)進(jìn)行綜述:Gait, Μ. J. , Pritchard, C. and Slim, G. , Oligonucleotide and Their Analogs A Practical Approach(Gait, M. J. ,ed. ), Oxford University Press Oxford,England,第 25-48頁，1991。最近在RNA合成中采用的保護(hù)基為雙O-乙酰氧乙基-氧)甲基(ACE)， Scaringe, S. A. , Wincott, F. E. , Caruthers, M. H. , J. Am. Chem. Soc. , 120 :11820-11821, 1998 ；三異丙基甲硅燒基氧甲基(TOM)Pitsch, S.，Weiss, P. Α.，Jenny, L.，Stutz, Α.， ffu, X.，Helv. Chim. Acta. 84，3773-3795，2001 以及叔丁基二硫代甲基(DTM)(結(jié)構(gòu) 1)， Semenyuk,A. ,Foldesi,A. , Johansson,Τ. ,Estmer—Nilsson, C. , Blomgren, P. , Brannval1, Μ.，Kirsebom，L. Α.，Kwiatkowski，Μ. , J. Am. Che m. Soc.，128 12356-12357，2006，以上都已被引入。然而，這些方法中沒有一個(gè)可以從反向(5’ 一3’方向)進(jìn)行RNA的合成；因此它們?nèi)鄙僭赗NA分子的3’ -末端方便且充分地引入多種配體和發(fā)色團(tuán)的能力，這些通過反向合成都可以實(shí)現(xiàn)。為了體現(xiàn)siRNA的活性，將阿拉伯糖、2’ -脫氧_2’ -氟-β _D_阿拉伯糖核酸 (FANA ；結(jié)構(gòu)2))和2’ -脫氧-4’ -硫-2，-氟-β _D_阿拉伯糖核酸(4’ -硫-FANA ；結(jié)構(gòu) 3) RNA, Dowler, Τ. ，Bergeron, D. ，Tedeschi，Anna-Lisa, Paquet, L. , Ferrari, N. , Damha, Μ. J. , Nucl. Acids Res. , 34，1669—1675，2006。 ￠/1 禾中己經(jīng)開發(fā)了其化學(xué)性質(zhì)的新的2’ -保護(hù)基中，2’ -保護(hù)的-2-氰乙氧基甲基(CEM)(結(jié)構(gòu)4) 顯示出用于制備非常長的RNA，然而其也是以傳統(tǒng)的即3’ 一 5’方向進(jìn)行RNA合成。并且， 通過這些方法產(chǎn)生的RNA的質(zhì)量仍待考察。
權(quán)利要求
1.一種式(1)的亞磷酰胺，
2.一種式(1)的亞磷酰胺
3.—種通過在5 ’ -至3 ’ -方向上成鍵來制備寡核苷酸的方法，所述方法用于合成選自以下結(jié)構(gòu)式的RNA寡聚物
全文摘要
本發(fā)明涉及新型的亞磷酰胺，制備了HPLC純度大于98％以及31PNMR純度大于99％的A-n-bz、C-n-bz、C-n-ac、G-n-ac和U。開發(fā)并公開了新的反向5’→3’合成RNA寡聚物的方法。使用該方法顯示出高質(zhì)量的RNA合成，偶合效率接近99％。
文檔編號C07H21/02GK102439025SQ200980144136
公開日2012年5月2日 申請日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月6日
發(fā)明者D·潘迪, N·P·斯里瓦斯塔瓦, S·C·斯里瓦斯塔瓦, S·P·巴杰帕伊 申請人:坎姆根公司