專利名稱：海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的 制備方法。
背景技術(shù)：
目前就藻類病毒在全球氣候變化、生物地化循環(huán)和有害赤潮生消過程中的生態(tài)學(xué) 作用和意義受到極大關(guān)注。在自然海域中，病毒感染是導(dǎo)致浮游植物裂解和自然死亡的主 要因素之一。高達(dá)0. 3% /d的浮游植物死亡率情況不僅出現(xiàn)在藻類赤潮暴發(fā)后的消亡階 段。由于缺乏用于病毒誘導(dǎo)的宿主死亡率測定的可靠方法，有關(guān)自然海域中病毒對微藻裂 解率的報(bào)道很少，尤其是對由于病毒裂解導(dǎo)致的浮游植物原位損失率知之甚少。目前用于估計(jì)病毒介導(dǎo)的浮游植物死亡率的方法主要有①用透射電鏡觀察被感 染的細(xì)胞，以被感染細(xì)胞出現(xiàn)的頻率為基礎(chǔ)評估病毒介導(dǎo)的死亡率；②是通過病毒總量和 每個(gè)細(xì)胞釋放的病毒粒子數(shù)來計(jì)算細(xì)胞的裂解率，使用這種方法估計(jì)微藻死亡率的前提是 假設(shè)病毒粒子的釋放量是已知的，而且可以將我們感興趣的病毒與樣品中其它病毒區(qū)分開 來；③通過病毒產(chǎn)量估計(jì)病毒誘導(dǎo)的宿主死亡率。采用稀釋技術(shù)推算病毒的產(chǎn)量，但稀釋前 的濃縮步驟比較復(fù)雜，很難在不影響藻類細(xì)胞生理狀態(tài)的情況下濃縮出相對易碎的藻類細(xì) 胞，因此這種技術(shù)遲遲未被用于浮游植物上。目前就病毒對微藻的感染率及導(dǎo)致宿主裂解 率的各種估計(jì)方法都存在不同程度的缺陷，相比而言，采用電鏡技術(shù)以被感染細(xì)胞出現(xiàn)的 頻率為基礎(chǔ)評估病毒介導(dǎo)的死亡率，這種方法最直接、準(zhǔn)確而且不需要對樣品進(jìn)行培養(yǎng)，但 電鏡的制樣和觀察過程仍比較煩瑣，成本也高。在自然水體中，浮游植物病毒種類復(fù)雜多樣，病毒的感染活性、裂解周期、病毒粒 子的釋放量等方面都相差極大，加之高度種內(nèi)特異性和宿主對抗病毒感染的寄生抗性使得 對藻病毒的生態(tài)學(xué)研究顯得更加復(fù)雜。因此，采用一種通用的檢測方法實(shí)現(xiàn)對自然水體中 病毒介導(dǎo)的總的浮游植物死亡率的估計(jì)是不可能的。目前，我們面臨的挑戰(zhàn)是如何結(jié)合現(xiàn) 有方法并發(fā)展更精確、方便可行的方法和技術(shù)，就某種感興趣的病毒與宿主藻系統(tǒng)，建立室 內(nèi)培養(yǎng)條件下病毒對宿主感染和裂解率的精確檢測和估計(jì)方法，并延伸到自然海域中進(jìn)行 校正和改進(jìn)。病毒感染微藻通常是宿主特異性的，有時(shí)甚至只專一地感染一個(gè)宿主株系，而 病毒的感染特性往往取決于病毒顆粒外殼蛋白的結(jié)構(gòu).因此，從病毒外殼蛋白著手有望尋 找出病毒感染檢測的新方法。海洋球石藻是海洋中碳循環(huán)的重要部分，它們吸收海水中的碳，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)轭?似于堅(jiān)硬的輪轂罩的盤狀物，最終沉積海底。該藻在全球廣泛分布，每年都會(huì)發(fā)生無數(shù)次 水華，由于球石藻外覆由特殊成分構(gòu)成的球石粒，因此它的水華能夠?qū)χ車h(huán)境產(chǎn)生諸多 重要影響；其次，由于球石粒的主要成分是碳酸鈣，在它的產(chǎn)生過程中伴隨著二氧化碳的生 成，同時(shí)球石藻還是高產(chǎn)DMSP生產(chǎn)者中最為重要的種類。在發(fā)生大面積的球石藻赤潮時(shí)， 病毒的裂解促使藻細(xì)胞產(chǎn)生的DMSP及釋放到外界的DMS對于局部甚至整個(gè)海域環(huán)境都會(huì) 產(chǎn)生很大影響?？梢?，球石藻類在全球碳循環(huán)中起著重要作用。球石藻中以E. huxleyi最
3為重要，目前已分離到十多株海洋球石藻病毒(EhVs)，均屬于藻類雙鏈DNA病毒，也是迄今 發(fā)現(xiàn)的最大的病毒，其基因組大小在560kb左右，且為裂解性病毒。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種海洋球石藻病毒外殼重組蛋白 原核表達(dá)的制備方法，本發(fā)明的方法能快速、準(zhǔn)確檢測球石藻病毒感染導(dǎo)致的宿主細(xì)胞裂解率。為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，包括如下步驟a)海洋球石藻病毒EhV (分離于挪威海域，由挪威卑爾根大學(xué)生物系微生物研究 所贈(zèng)送)與宿主之間穩(wěn)定感染體系的建立，病毒感染90小時(shí)后取病毒裂解上清液進(jìn)行病毒 的純化與濃縮；b)根據(jù)海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因的全長序列設(shè)計(jì)引物；c)從步驟a)中已提純的海洋球石藻病毒EhV中提取DNA ；d)PCR擴(kuò)增海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因；e)PCR電泳回收產(chǎn)物，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒采 用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切后電泳分析PCR產(chǎn)物并進(jìn)行測序鑒定，海洋球石藻病毒EhV 外殼蛋白基因測序結(jié)果見序列表1。f)選擇與預(yù)期大小相符的條帶進(jìn)行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接質(zhì) 粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組載體；g)將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，挑取單克隆進(jìn)行目的基因 的小量表達(dá)；h)挑取單克隆進(jìn)行目的基因的大量表達(dá)；i)將誘導(dǎo)前的樣品、誘導(dǎo)后及純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)量。所述的純化過程中采用SM緩沖液，其配方為10mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris (三 羥甲基氨基甲烷)，IOmmol/L MgSO4和0. gelatin.(明膠)(購于上海生工AMERSC0分 裝)，pH 7. 5。所述引物采用SEQIDN0. 1和SEQIDN0. 2 ；其核苷酸序列分別為:SEQIDN0.] MCP-F 5' -GACGAATTCCTCTGGATTTGGTGGTGG-3‘(劃線部分為 EcoRI 酶切位點(diǎn))；SEQIDN0. 2 =MCP-R 5' -ACCGCGGCCGCTCAGTTCGAGTATAATA-3 ‘(劃線部分為 NotI 酶切位點(diǎn))。所述PCR的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性1分鐘后進(jìn)行94°C變性15秒、55°C復(fù)性30 秒、68°C延伸2分鐘的30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，保存于4°C。所述步驟e)中大腸桿菌采用DH5ci ；所述步驟g)中大腸桿菌采用BL21 (DE3)。(均 購于碧云天生物技術(shù)研究所)所述的雙酶切采用的酶為EcoRI和NotI (均購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有限 公司)。所述步驟e)中的質(zhì)粒采用pMD19-T作為載體(購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有 限公司)。
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所述步驟f)采用pGEX-4T-3作為表達(dá)載體。(購于GE Healthcare廈門鷺隆生物 科技發(fā)展有限公司)，所述的重組載體為pGEX-4T-3-EhVMCP，含有權(quán)利要求1所述的海洋球 石藻病毒外殼重組蛋白基因的DNA序列。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明基于對病毒主要外殼蛋白(MCP)基因片段的研究分 析得到，EhV與其它藻類雙鏈DNA病毒之間差異甚大，因此，球石藻病毒已被劃分為藻類雙 鏈DNA病毒科中的一個(gè)新的屬(Coccolithovirus)。同時(shí)，不同EhVs株系之間MCP基因 保守區(qū)中某些堿基的變異性也較高。因此，MCP基因已作為一種新的更穩(wěn)定的分子遺傳標(biāo) 記以區(qū)分自然群落中EhVs的不同基因型。雖然，不同的EhVs分離株的MCP基因保守區(qū)域 在核酸序列上存在一定的多樣性，但其推導(dǎo)的對應(yīng)的氨基酸序列的相似性卻非常高，達(dá)到 99% -100%。另外，該類病毒具有獨(dú)特的類似于動(dòng)物病毒而不同于其它藻類病毒的感染方 式，病毒通過細(xì)胞內(nèi)吞作用或是膜融合的方式，將包括外殼蛋白在內(nèi)的整個(gè)病毒顆粒完整 的納入宿主細(xì)胞。基于EhVs外殼蛋白氨基酸保守區(qū)高度的同源性及其獨(dú)特的感染方式使 得MCP可以作為一種蛋白檢測標(biāo)記在自然海域中能夠?qū)hVs與其他的藻類DNA病毒區(qū)分 開來。因此，通過表達(dá)EhVs MCP，建立血清學(xué)方法，將可以替代煩瑣的TEM方法，用以追蹤檢 測自然海域中EhVs的存在、估計(jì)其對宿主的感染率、裂解率及致死情況，為快速、準(zhǔn)確檢測 球石藻病毒感染導(dǎo)致的宿主細(xì)胞裂解率提供新的方法。本發(fā)明所闡述的這種新的利用重組 技術(shù)和原核表達(dá)技術(shù)對一些較難提純的病毒進(jìn)行克隆，制備的方法，使得利用免疫學(xué)方法 檢驗(yàn)出這些病毒導(dǎo)致的宿主細(xì)胞的感染和裂解率變?yōu)榭赡埽栽u估經(jīng)由球石藻細(xì)胞死亡后 沉降到海底的二氧化碳總量及DMS的釋放量，為政府制定二氧化碳排放量規(guī)范以及綜合評 價(jià)球石藻病毒在全球氣候變化中的重要作用提供理論依據(jù)。


圖1是本發(fā)明海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyivirus, EhV)外殼重組蛋白原 核表達(dá)的制備方法的PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖2是本發(fā)明低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法的表達(dá) 及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。圖3是本發(fā)明重組載體的質(zhì)粒構(gòu)建策略圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實(shí)施例1本實(shí)施例主要包括如下步驟來制備海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)。a)海洋球石藻病毒EhV與宿主之間穩(wěn)定感染體系的建立，海洋球石藻病毒(EhV) 接種于海洋球石藻(Emiliania huxleyi, Eh)，90h小時(shí)后取病毒裂解上清液進(jìn)行病毒的純 化與濃縮將病毒裂解液離心除去大的細(xì)胞碎片(1000r/min，4°C離心lOmin)，然后分別經(jīng) 0. 45 μ m和0. 2 μ m無菌濾膜過濾，濾液經(jīng)卷式切向流超濾濃縮至約20_50ml后0. 2 μ m無 菌濾膜過濾，加入終濃度為100g/L的PEG 8000 (聚乙二醇8000)濃縮沉淀病毒，4°C攪拌過 夜。離心收集病毒沉淀，沉淀用SM緩沖液(10mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris, 10mmol/L MgSO4 和0. 1% gelatin, pH 7.5)懸浮并于4°C靜置過夜，PEG 8000反透析濃縮至適當(dāng)?shù)捏w積。取上述病毒濃縮液，與CsCl制成勻漿液(CsClO. 625g/ml)，裝入IOml梯度離心管中，水平轉(zhuǎn) 頭60000r/min，4°C離心24h。小心收集離心后形成的病毒區(qū)帶，于SM緩沖液中透析除去殘 余的CsCl，再用PEG8000濃縮后4°C保存?zhèn)溆谩)根據(jù)海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因的全長序列設(shè)計(jì)引物根據(jù)已報(bào)道的海 洋球石藻病毒(EhV)MCP全長基因(GeneBank登錄號(hào)EU006629)設(shè)計(jì)一對特異引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)中采用的引物為SEQIDN0. 1 =MCP-F 5' -GACGAATTCCTCTGGATTTGGTGGTGG -3‘(劃線部分為 EcoRI 酶切位點(diǎn))；SEQIDN0. 2 =MCP-R 5' -ACCGCGGCCGCTCAGTTCGAGTATA ATA-3 ‘(劃線部分為Not I酶切位點(diǎn))。c)從步驟a)中已提純的海洋球石藻病毒EhV中提取DNA ⑴取150 μ L純化的病 毒液，加入500 μ L 0. 5% SDS (十二烷基磺酸鈉)和終濃度為20 μ g -mL-1的蛋白激酶K(購 于AMERSC0上海生工分裝)，旋渦混合30秒，55°C孵育30min，每IOmin輕輕的旋渦混合一 次。(2)加入80 μ L4. 5Μ的NaCl和65°C預(yù)熱的CTAB溶液，輕輕混勻，65°C恒溫孵育10分鐘。 (3)將樣品取出降至室溫，加入500 μ L體積比為24 1的氯仿-異戊醇(480 μ L 20 μ L) 和60 μ LTris平衡酚(購于Biotech上海生工)輕輕顛倒離心管混勻樣品。(4)室溫下高 速(13. 4Krpm)離心10分鐘。(5)移出最上層部分的水相于新的無菌的離心管中加入0. 6 倍體積的異丙醇，上下輕輕顛倒幾次混勻，于室溫下靜止10分鐘使沉淀形成。(6)全速離 心(13. 4Krpm) 10分鐘，使DNA沉淀下來，取出異丙醇，加入預(yù)冷的70%乙醇500L最高速度 (13. 4Krpm)離心5分鐘(7)加入35mL TE緩沖液(購于碧云天生物技術(shù)研究所)可用無菌 水代替)和終濃度為0. lmg/ml的Rnase37°C孵育2個(gè)小時(shí)，以除去RNA。d) PCR擴(kuò)增海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因PCR反應(yīng)體系為25μ 1，含3μ 1模 板DNA、0.5yl KOD DNA polymerase (KOD DNA聚合酶)(購于TOYOBO廈門鷺隆生物科技發(fā) 展有限公司)、1μ 1 上游引物 SEQIDN0. 1 (IOpmol/μ 1)、1 μ 1 下游引物 SEQIDN0. 2 (IOpmol/ μ 1) ,2. 5μ 1 dNTP(脫氧核苷三磷酸)(2mmol/L)、1· 5μ 1 MgSO4 (25mmol/L)、2· 5 μ 1 10XPCR緩沖液(購于Τ0Υ0Β0廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司)、11 μ 1無菌水。PCR的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性1分鐘后進(jìn)行94°C變性15秒、55 °C復(fù)性30秒、68 °C 延伸2分鐘的30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，保存于4°C。e) EhV MCP的PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物鑒定用設(shè)計(jì)的EhV MCP基因特異性引物 EhV-F和EhV-R進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳，可見大小149 Ibp的特 異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符，結(jié)果見圖1。其中M為DNA Marker (標(biāo)記)(TaKaRa 1 OObpDNALadderMarker 1500,1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100) ； 1，2 為純病 毒擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR電泳產(chǎn)物(與預(yù)期大小相符的條帶)經(jīng)DNA (脫氧核糖核酸)回收試劑盒 回收后，進(jìn)行T-A克隆，所用載體為PMD19-T (購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有限公司)，并 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。加入800μ1 LB (LB培養(yǎng)基)，37°C，150rpm (每分鐘轉(zhuǎn) 數(shù))60min，取200ul涂布至Amp板(氨芐青霉素)板(10mg/ml)，37°C倒置培養(yǎng)過夜，至克 隆長出，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落，采用試劑盒小量提取質(zhì)粒.采用EcoR I和Not I 雙酶切后電泳分析并進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果(見序列表1)證明閱讀框架正確。序列表1 是本發(fā)明海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyivirus,EhV)外殼重組蛋白基因測序結(jié)果表。 利用GeneBank(核酸序列數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行比對，同源性高達(dá)99%以上，結(jié)果證明測定序列為 EhV MCP全序列。得到了含有目的基因片段的重組載體pMD19-T-EhV-MCP。
f)PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后以，用EcoR I和Not I經(jīng)37°C 10小時(shí)雙酶切獲得 1491bp (堿基對)的目的基因片段，與經(jīng)EcoRI和NotI37°C 10小時(shí)雙酶切的pGEX_4T_3表 達(dá)載體以DNA Ligation kit (購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有限公司)16°C，連接16小 時(shí)，之后將保存于_70°C的E. coliDH5a克隆宿主取出冰上放置15min直至全化，將10 μ 1 連接產(chǎn)物加入其中冰上放置30min (需要做陰陽性對照)。42°C熱激90S，迅速轉(zhuǎn)移至冰上 放置2min。加入到含有SOOyL LB培養(yǎng)基的試管中混勻，37°C培養(yǎng)lh。將未離心的菌液 取200 μ L涂存，8000rpm Imin的上清200 μ L涂布，沉淀200 μ L涂布(所有培養(yǎng)基都含有 氨芐青霉素)，37°C倒置培養(yǎng)12h。氨芐抗性篩選得到重組載體pGEX-4T-3-EhV MCP (質(zhì)粒 構(gòu)建圖如圖3)，生物材料分類命名為大腸埃希氏菌(其拉丁文為Escherichia coli)，該 重組菌株于2010年5月24日送中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所)鑒定，證明為存活的重組菌 株，并于2010年5月24日將菌株保藏于該中心，保藏號(hào)為=CGMCC No. 3869。對重組載體進(jìn) 行PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證可見一 1491bp條帶，與預(yù)期大小相符，說明EhV MCP基因已連接到 PGEX-4T-3 載體上。g)將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，挑取單克隆進(jìn)行目的基因的 小量誘導(dǎo)表達(dá)；將構(gòu)建好PGEX-4T-3的重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)(為特 定大腸桿菌名稱)。挑取單克隆，加入IOml Amp抗性/LB液體培養(yǎng)基(1 %蛋白胨，1 % NaCl， 0. 5%酵母提取物；Amp濃度為10mmg/ml)中37°C、180rpm，培養(yǎng)過夜。取3ml菌液離心后去
上清，沉淀備用。誘導(dǎo)表達(dá)另取200 μ 1菌液，加入IOml Amp抗性/LB液體培養(yǎng)基中30°C、180rpm, 3hr，至OD (光密度值)600為0.6。加IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至菌液中，終濃 度為0. 3mM，25°C繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)。取3ml菌液離心棄上清，沉淀備用。將菌體以500 μ IPBS (磷酸鈉緩沖液)重懸，超聲波破碎5min。IOOOOrpm離心lOmin，分別回收上清和沉。 SDS-PAGE的濃度為10%，電泳鑒定表明，目的基因已經(jīng)表達(dá)。h)挑取單克隆進(jìn)行目的基因的大量誘導(dǎo)表達(dá)；挑取單克隆，加入10ml Amp抗性/ LB液體培養(yǎng)基中37°C、ISOrpm，培養(yǎng)過夜。取3ml菌液離心后去上清，沉淀備用。大量誘導(dǎo)表達(dá)另取2ml菌液，加入100ml Amp抗性/LB液體培養(yǎng)基中30°C、 180rpm，3hr，至OD (光密度值)600為0.6。加IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至菌液 中，終濃度為0. 3mM，25°C繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)。離心棄上清，沉淀備用。i)將誘導(dǎo)前的樣品、誘導(dǎo)后及純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)量。將 誘導(dǎo)前的樣品、誘導(dǎo)后及純化后的樣品(包括上清和沉淀)取20 μ 1分別加入20 μ 1 2χ蛋 白 Ioadingbuffer (上樣緩沖液)，配方為 0. lmol/L Tris · Cl pH6. 8，20%甘油，4% SDS， 2% β-巰基乙醇，0.001 %溴酚藍(lán))混勻，95°C變性5分鐘，13000rpm離心15分鐘，留取上 清做SDS-PAGE。凝膠濃度為10%。進(jìn)行SDS-PAGE之后考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明 經(jīng)IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)，含重組載體的菌株特異的產(chǎn)生了一條分子量 為SOkDa(千道爾頓)的條帶(GST標(biāo)簽為26kDa)。此條帶大小與預(yù)期相符(如圖3所示， Fermentas 116. 0，66. 2，45. 0，35. 0,25. 0,14. 4)，1為未誘導(dǎo)的全菌總蛋白；2為誘導(dǎo)的全 菌總蛋白；3為誘導(dǎo)的上清；4為誘導(dǎo)的沉淀；5為洗脫純化蛋白)。對SOkDa的條帶切膠， 電洗脫得到高純度的融合表達(dá)蛋白。[0045序列表[0046<110>申請人的姓名或名稱(集美大學(xué)，劉靜雯)[0047<120>海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法[0048<160>1[0049<210>1[0050<211>1491[0051<212>DNA[0052<213> 海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyi virus)[0053<220>[0054<221>CDS[0055<220>[0056<221>gene[0057<400>1[0058atgtctggatttggtggtggtagttctggagcgggtagtctgacccagttattggcaacg60[0059gggtctatggacgccgcgct 3. C 3. C 3.3.3.3. Cgctacacgtaccttctggaagtcttcgtac120[0060cagaagcactcgcttttcgcgctcgagtcgatcaaccagccattcacaacccaggttcag180[0061tttggggctgagtcgcatattaccgtcaatcgtcaaggcgatttgctatcgtggatgtac240[0062ctcaagattgtcctccctggcctaaaggtccagaaccaggcggacaccgttcagccaact300[0063cagcagtcattcgcgtcgctcgacaacgacgtcgctgcgcaggctgacgtatcgcacgtc360[0064cttccatacattgagggtgcgtacaccgaggcgtccctcaacaccaaggagcagctcatt420[0065gctgaggccaagaactcgtacgaggctgccaagtacaacgctgcgccactcccagtcgct480[0066gcgcagatgcagtcgaccgagatgcccgactttgattatgcgtattggactgaggcgatt540[0067ggctttcacctaattaagcgggcggaatttaaggtcggtggtgccacaattgacaccatt600[0068tggtcggaacttcttttcgcgatggaggagcttatgggccgcgcgggccgccgtcttact660[0069gagaccattggccgtaccctccgccgcccaaccgagctcatgaaggcctcgcgccaggag720[0070cagatcctctacgtcccacttccatggtacttcaccaagcacccatcgcttgcgttccca780[0071CttgttgCggcgacctaccacaacatccagctctgggtgcagtgggcgcagctcaactcg840[0072tgcattatcaagtcgcgctccaacctcgtcgtcctccacgccgagcgtaacgtcccaatt900[0073tcggacgatcacctacgtgcgtcccttgagtgcacgtacgtccacctcgaggcggccgag960[0074cgtgatgcgctcaccgcgaacgctggcacccagctcatcgttcagcaccaggcgcacctc1020[0075cagcaggtctcgtccaacaacgtcaccgcgcgcctcaacttcaacttcccagttcttgag1080[0076ttctactacttcctccgccgtaaggcgaacaaggacgcgggtgatcattttaatttctcg1140[0077ggcattggtggtcgcgatccagtcgtatcggcggagcttctatttaacaacacggcgcgt1200[0078gtcacgcagaagccggcggtatggtggcgtgcggtacaggcgcttcagttccactcgtct1260[0079gcgcccctcaccaacatctactcgtactcgttctcgctctcgccagaggacccaattacc1320[0080ccatcgggttcggccaattt ctcgcgtcta gattccgtcg agcttgcgct aaccctacag1380[0081gacgatttcg gtgccgcgca cgacgcgaac tccgagctct tcgtctttgc gcgctcgtac1440[0082aacattcttaaatttaccaa tggtcttgct ggactattat actcgaactg a1491
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權(quán)利要求
一種海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在于包括如下步驟a)海洋球石藻病毒EhV與宿主之間穩(wěn)定感染體系的建立，病毒感染90小時(shí)后取病毒裂解上清液進(jìn)行病毒的純化與濃縮；b)根據(jù)海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因的全長序列設(shè)計(jì)引物；c)從步驟a)中已提純的海洋球石藻病毒EhV中提取DNA；d)PCR擴(kuò)增海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因；e)PCR電泳回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒采用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切后電泳分析PCR產(chǎn)物并進(jìn)行測序鑒定，海洋球石藻病毒外殼重組蛋白基因測序結(jié)果見序列表1。f)選擇與預(yù)期大小相符的條帶進(jìn)行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組載體；g)將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，挑取單克隆進(jìn)行目的基因的小量表達(dá)；h)挑取單克隆進(jìn)行目的基因的大量表達(dá)；i)將誘導(dǎo)前的樣品、誘導(dǎo)后及純化后的樣品進(jìn)行SDS PAGE鑒定蛋白表達(dá)量。
2.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述的純化過程中采用SM緩沖液，其配方為10mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris, IOmmol/ L MgSO4 和口 0.1% gelatin, pH 7.5。
3.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述引物采用SEQIDN0. 1和SEQIDN0. 2 ；其核苷酸序列分別為SEQIDN0. 1 =MCP-F 5' -GACGAATTCCTCTGGATTTGGTGGTGG-3‘(劃線部分為 EcoRI 酶切 位點(diǎn))；SEQIDN0. 2 =MCP-R 5' -ACCGCGGCCGCTCAGTTCGAGTATAATA-3‘(劃線部分為 Not I 酶 切位點(diǎn))。
4.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述PCR的反應(yīng)條件為940C預(yù)變性1分鐘后進(jìn)行94°C變性15秒、55 °C復(fù)性30秒、68 °C 延伸2分鐘的30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，保存于4°C。
5.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述步驟e)、f)中大腸桿菌采用DH5ci ；所述步驟g)中大腸桿菌采用BL21(DE3)。
6.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述的雙酶切采用的酶為EcoRI和NotI。
7.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述步驟e)中的質(zhì)粒采用PMD19-T作為載體。
8.如權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，其特征在 于所述步驟f)中采用PGEX-4T-3作為表達(dá)載體，所述的重組載體為pGEX-4T-3-EhV MCP, 含有權(quán)利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白基因的DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達(dá)的制備方法，步驟為a)海洋球石藻病毒的純化與濃縮；b)設(shè)計(jì)引物；c)提取DNA；d)PCR擴(kuò)增海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因；e)PCR電泳回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切后電泳分析PCR產(chǎn)物并進(jìn)行測序鑒定；f)通過雙酶切得到目的基因片斷，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組載體；g)目的基因的小量表達(dá)；h)大量表達(dá)；i)SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)量。本發(fā)明獲得了大量純化的重組病毒外殼蛋白，下一步可用于免疫生產(chǎn)抗體，為建立快速、準(zhǔn)確檢測球石藻病毒感染導(dǎo)致的宿主細(xì)胞裂解率的免疫熒光檢測技術(shù)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/01GK101974541SQ20101023650
公開日2011年2月16日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者劉靜雯, 張雅蘭, 董雙林, 鄭天凌 申請人:集美大學(xué)